Поиск микробных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов и противогрибковых антибиотиков

Тренин, Алексей Сергеевич

Диссертации по медицине → Химиотерапия и антибиотики

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.07) на тему:Поиск микробных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов и противогрибковых антибиотиков

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Тренин, Алексей Сергеевич Москва 2012 г.

Ученая степень: доктора биологических наук

ВАК РФ: 14.03.07

Автореферат диссертации по медицине на тему Поиск микробных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов и противогрибковых антибиотиков

На правах рукописи

ТРЕНИН АЛЕКСЕИ СЕРГЕЕВИЧ

ПОИСК МИКРОБНЫХ МЕТАБОЛИТОВ - ИНГИБИТОРОВ БИОСИНТЕЗА СТЕРОЛОВ И ПРОТИВОГРИБКОВЫХ АНТИБИОТИКОВ.

14.03.07 - химиотерапия и антибиотики

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 2 2С72

Москва-2012

005012708

Работа выполнена в Федеральном Государственном Бюджетном Учреждении "Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе" Российской академии медицинских наук (директор - член-корреспондент РАМН, профессор A.A. Фирсов)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

Заслуженный деятель науки РФ Е.П. Феофилова

доктор биологических наук М.В. Бибикова '

доктор биологических наук Л.Г. Стоянова

Ведущее учреждение:

Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи" Минздравсоцразвития России.

часов на

заседании диссертационного совета Д 001.005.01 ФГБУ "НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе" РАМН по адресу: 119021, г. Москва, Большая Пироговская ул., д. 11

Зашита диссертации состоится « ¿^и^- » /У?2012 г. в ч заседании диссертационного совета Д 001.005.01 ФГБУ "НИИ по изы

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного Бюджетного Учреждения "НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе" РАМН.

« Л

Автореферат разослан «_ /У »^/¿W 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы. Инфекционные заболевания, по-прежнему, остаются угрозой, являясь основной причиной смертности в развивающихся странах и серьезной проблемой для передовых стран [Jones et al., 2011]. Ухудшение экологической обстановки, эпидемия ВИЧ, широкое использование трансплантационной и противораковой терапии, рост числа хирургических вмешательств, широкое и необоснованное использование антибиотиков приводит к появлению заболеваний, с трудом поддающихся лечению существующими лекарственными препаратами [Livermore, 2011]. Наблюдается стремительный рост заболеваемости глубокими (инвазивными) микозами, протекающими крайне тяжело и характеризующимися высокой смертностью [Blyth et al., 2010]. Противогрибковых препаратов относительно немного и они, как правило, высокотоксичны. Необходимы новые более совершенные противогрибковые антибиотики [Ruiz-Camps, Cuenca-Estrella, 2009]. Актуальной и нерешенной до сих пор проблемой здравоохранения являются сердечно-сосудистые заболевания на почве атеросклероза [Thompson et al., 2010], борьба с которыми в последнее время стала более эффективной благодаря применению ингибиторов биосинтеза холестерина [Corsini, Ceska, 2011]. Создаваемые на основе микробных биологически активных продуктов, эти препараты нередко обладают также способностью к противоопухолевому и противогрибковому действию [Soeda et al., 2011].

Несмотря на ведущийся в развитых странах широкий скрининг антибиотиков, число новых препаратов, прошедших всесторонние испытания и рекомендованных к клиническому использованию, с каждым десятилетием снижается [Berdy, 2005, Freire-Moran et al., 2011]. Существующие подходы трудоемки и не позволяют обеспечить должной эффективности поисковых исследований [Clardy et al., 2009]. Методология поисковых работ нуждается в серьезном усовершенствовании.

Новая методология поиска, подразумевающая разработку современных тестов и создание рациональной схемы их использования, а также изучение биологически активных соединений, получаемых путем направленной химической трансформации генно-инженерных производных антибиотиков, могут существенно повысить эффективность поисковых работ и обеспечить создание новых лекарственных препаратов.

Цель и задачи исследования.

Цель исследования состояла в разработке новой методологии поиска биологически активных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов (ИБС) и новых противогрибковых антибиотиков, в проведении поиска, изучении физико-химических и биологических свойств полученных препаратов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие

основные задачи:

• разработать новые методы поиска ИБС, основанные на использовании микробных культур и линий клеток млекопитающих, разработать модели, пригодные к использованию на различных этапах поисковых работ;

• изучить возможность использования в поисковых исследованиях различных способов "активизации" микробных продуцентов с целью усиления их способности к образованию антибиотиков и определить возможность применения дополнительных способов очистки микробных метаболитов для быстрого тестирования в биологических и биохимических тестах;

• на основе использования новых моделей разработать схему поиска микробных метаболитов, обладающих гиполипидемическим и противогрибковым действием и провести широкий поиск таких метаболитов среди продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, изучить способность к образованию ИБС у актиномидетов;

• провести выделение, очистку и химическую идентификацию выявленных биологически активных соединений, изучить их механизм действия;

• провести поиск соединений, обладающих выраженной противогрибковой активностью, среди производных полиеновых антибиотиков, препаратов группы олигомицина, а также производных трисиндолилметана - аналогов антибиотика турбомицина. В экспериментах in vitro изучить их противогрибковое действие. Научная новизна работы.

Впервые предложен методологический подход для поиска ИБС, основанный на использовании оригинальных специально разработанных микробных моделей -бактериальной культуры Halobacterium salinarum и грибной культуры Acremonium fusidioides, а также культур клеток млекопитающих - человеческих злокачественных лимфобластов MOLT-4 и клеток гепатобластомы G2. Разработанные модели предложены в виде микрометодов и применимы на начальных этапах поисковых работ. Микробные модели использованы в модификации, позволяющей проводить поиск ингибиторов, как ранних, так и поздних этапов биосинтеза стеролов.

Предложена новая схема поиска ИБС, основанная на применении оригинальных моделей поиска, с обязательным отбором на начальном этапе микробных метаболитов, обладающих противогрибковой активностью.

Впервые установлено, что способностью к образованию ингибиторов ранних этапов биосинтеза стеролов (включая действие ГМГ-КоА редуктазы) обладают не только грибы, но и многие актиномицеты, что позволило расширить область поиска подобных метаболитов.

Впервые предложена "активизация" микробных продуцентов путем получения, регенерации и УФ-облучения протопластов на начальных этапах поиска. Метод

рекомендован, главным образом, для культур с затрудненным спорообразованием.

Впервые разработаны и применены в поисковых исследованиях новые оригинальные методы работы с культурами - продуцентами антибиотиков и образуемыми ими микробными метаболитами. Химические методы выделения дополнены микро- и ультрафильтрацией, очисткой с помощью скоростного центрифугирования, а также лиофилизацией культуральной жидкости.

Впервые изучены отдельные аспекты механизма действия ИБС, полученных в НИИНА им. Г.Ф.Гаузе, в том числе антибиотиков №№ 199 (аскофуранон), 86 (энниатин В) и 1132 (хлоротрицин). Показано комплексное воздействие аскофуранона на синтез и метаболизм липидов в клетке: одновременное подавление синтеза холестерина, эфиров холестерина, триглицеридов, и фосфолипидов. Наибольший гиполипидемический эффект энниатина В связан с подавлением синтеза эфиров холестерина.

Впервые в экспериментах in vitro изучена противогрибковая активность новых полусинтетических производных полиеновых антибиотиков, препаратов группы олигомицина и синтетических производных трисиндолилметана - аналогов антибиотика турбомицина. В каждой группе антибиотиков выявлены закономерности "структура-активность".

Впервые в экспериментах in vitro у солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия -аналогов антибиотика турбомицина А выявлено выраженное противогрибковое действие. Показано, что введение алкильных заместителей и длина углеродных цепей играют ключевую роль в достижении наивысшей активности этих соединений.

Научно-практическое значение.

Разработана система поиска ИБС среди продуктов микробного вторичного метаболизма у представителей различных таксонов (плесневые и мицелиальные грибы, актиномицеты), проведен поиск таких ингибиторов. Выявлена способность актиномицетов к продукции ИБС. Разработанные модели и схема поиска ИБС внедрены в поисковую работу НИИНА им.Г.Ф.Гаузе.

Выделены и изучены микробные метаболиты - ИБС, обладающие гиполипидемическим и противогрибковым действием, принадлежащие к различным классам химических соединений. Выявлены препараты, подавляющие ранние и поздние этапы биосинтеза стеролов.

Получены новые сведения о гиполипидемическом действии аскофуранона и энниатина В. В микробных моделях показана способность антибиотика 1709 (группа амфомицина) к подавлению ранних, а у антибиотика 1132 (хлоротрицин) поздних этапов биосинтеза стеролов.

Выявлена высокая противогрибковая активность антибиотика 4883 (группа ирумамицина), позволяющая рассматривать этот препарат в качестве перспективного

противогрибкового лекарственного средства.

В экспериментах in vitro изучена противогрибковая активность свыше 60 производных полиеновых антибиотиков. Выявленные закономерности "структура-активность", позволили осуществить направленную химическую трансформацию препаратов. Получены соединения, превосходящие по своей активности в опытах in vitro и in vivo известный противогрибковый препарат амфогерицин В. ДМАЭ-амид S44HP (2) и его водорастворимая глутаматная соль (2G) отобраны для углубленного доклинического изучения.

В экспериментах in vitro у солей трис(1-алкил;:ндол-3-ил)метилия - аналогов антибиотика турбомицина А выявлено выраженное противогрибковое действие. Наиболее активные производные, длина алкильной цели которых составляет С4-С5, превосхбдят по своей активности амфотерицин В.

Получен патент, подготовлены Методические указания по изучению противогрибковой активности фармакологических веществ (2011г., в печати).

Личный вклад соискателя. Соискателю принадлежит определяющая роль в постановке целей и задач проводимых исследований, выборе основных направлений в работе, анализе и обобщении полученных результатов. Соискатель лично усовершенствовал микробиологические методы работы с продуцентами биологически активных соединений и микробными тест-культурами, разработал новые оригинальные модели и схему поиска микробных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов, провел изучение механизма действия отобранных антибиотиков, принимал участие во всех экспериментальных исследованиях и подготовке научных публикаций, выступал с докладами на конференциях и международных симпозиумах.

Апробация диссертации.

Апробация проведена 25 ноября 2011 года на совместном заседании Ученого Совета НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН, Проблемной комиссии №42.01 по противоопухолевым и противовирусным антибиотикам Межведомственного Научного Совета по антибиотикам, Диссертационного Совета (Д 001.005.01) НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН.

атеросклероза, посвященной 100-летию со дня рождения А.Л.Мясникова (Москва, 1999), на 6-м Международном форуме "Биотехнология и современность", С-Петербург, 2005), на 5-м Московского международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), на междисциплинароном микологическом форуме (Москва, 2009, 2010), Российско-Индийском симпозиуме по гликопептидным антибиотикам (Москва, 2011).

Публикации. По итогам исследований в отечественных и международных журналах, материалах конференций опубликовано 36 печатных работ, в том числе5 обзоров, 17 статей, 17 тезисов, 1 методические рекомендации и 1 патент на изобретение.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 351 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания используемых в работе методов, раздела, состоящего из 3-х глав материалов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 484 источника. Работа содержит 60 рисунков и 25 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Обзор литературы включает 3 раздела, содержащие: 1) описание основных достижений в изучении микробного вторичного метаболизма и в проведении поиска биологически активных соединений, возможные направления и перспективы поиска, 2) детальное описание микробных метаболитов - ИБС, их химического разнообразия и особенностей механизма действия, 3) современные возможности в' области противогрибковой терапии и основные направления в создании новых противогрибковых лекарственных средств.

Материалы и методы исследования.

Микробные штаммы, культуры клеток, условия выращивания. Работу проводили с микробными продуцентами антибиотиков - культурами актиномицетов и несовершенных грибов, свежевыделенных из природных источников (почва, морская вода), и культурами высших грибов, полученных из Коллекции культур лаборатории биосинтеза биологически активных соединений НИИНА им. Г.Ф.Гаузе.

В качестве тест-культур использованы: Staphylococcus aureus АТСС 21027 (=209 Р), Bacillus subtilis АТСС 6633, Micrococcus luteus АТСС 9341, Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Candida albicans ATCC 14053, Candida tropicalis ATCC 750, Cryptococcus humicolus ATCC 9949, Aspergillus niger ATCC 16404, Fusarium oxysporum VKM F-140 (= CMI, IMI 90473), Fusarium proliferatum ATCC 12616, необходимые для выявления антибиотической активности штаммов-продуцентов и определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) различных препаратов антибиотиков. Для разработки моделей поиска ИБС использованы штаммы микробных культур Acremonium fusidioides (Fusidium

coccineum Fuckel ATCC 14700) и Halobacterium salinarum (Я halobium ATCC 29341), а также клетки млекопитающих - культура злокачественных человеческих лимфобластов MOLT-4 и культура клеток гепатобластомы G2.

Культуры актиномицетов и несовершенных грибов, свежевыделенные из природных источников с использованием агаризованных питательных сред - Гаузе 1 и Гаузе 2 (актиномицеты), а также сусло-агара и кислого агара Чапека (рН 6,5-6,7) (несовершенные грибы), в дальнейшем выращивали в жидких питательных средах, разработанных в НИИНА им. Г.Ф.Гаузе и используемых для выращивания микробных продуцентов [Гаузе и др., 1983]. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащих 50 - 200 мл питательной среды, на качалках при 28°С влечение 3-11 суток, а также в стерильных плоскодонных 6- 24- и 96-луночных пластиковых планшетах "Flow", Великобритания, "Costar", Франция, "Медполимер", С-Пб., без встряхивания в термостате при 28°С в течение 3-9 суток.

При выращивании продуцентов на плотных питательных средах антибиотическую активность определяли методом штриха на агаровой среде, при выращивании в жидких средах - методом диффузии в агаре.

Получение и регенерация протопластов. Культуры свежевыделенных из почвы продуцентов антибиотиков выращивали в жидкой питательной среде Гаузе-2 в присутствии 1,8-2% глицина в течение 16-18 ч при 28°С. Затем клетки ресуспендировали в модифицированной среде Р с высоким содержанием сахарозы [Тренин, Дудник, 1984], содержащей лизоцим (2,5-5 мг/мл), и инкубировали при 31°С в течение 1,5-2 ч. Выход протопластов составлял 99,9 %.

Регенерацию протопластов осуществляли путем высева суспензии протопластов на содержащую сахарозу и бычий сывороточный альбумин среду регенерации, предварительно обезвоженную на 1-5% от ее начальной массы [Тренин и др., 2001].

При УФ-облучении протопластов перед высевом на среду регенерации использовали облучатель БУФ-15 (интенсивность облучения 50 эрг/мм2сек) в течение 5-40 сек. Выживаемость протопластов после облучения составляла от 0,005 до 50 %.

Вариабельность культур, образовавшихся после регенерации как облученных, так и не облученных протопластов, оценивали путем высевов на агаризованные питательные среды суспензии спор конкретных клонов, или коротких фрагментов мицелия, получаемых при обработке культуры ультразвуком. Результаты подвергали статистической обработке [Жукова и др., 1978], изменчивость штаммов представляли с доверительным уровнем 95%.

Препараты антибиотиков, реактивы и материалы. В работе использовали препараты антибиотиков зарубежных и отечественных компаний, а также антибиотики, полученные непосредственно в НИИНА им. Г.Ф. Гаузе, РАМН, в т.ч. производные полиеновых антибиотиков, производные олигомицина и синтетические аналоги антибиотика турбомицина.

Используемый в работе препарат лактона DjL-мевалоновой кислоты ("Sigma", США) подвергали сапонификации - выдерживали в слабо щелочной среде для получения кислотной формы: 1 М раствор лактона в 0,1 н NaOH инкубировали при 50°С в течение 2 часов, либо при 37°С в течение 4 часов.

Контрольными препаратами служили ловастатин ("MSD", США) и амфотерицин В ("Sigma", США).

Выделение и очистка антибиотиков. Культуральную жидкость (к.ж.) и мицелий продуцентов разделяли фильтрацией или центрифугированием. Выделение антибиотиков из фильтрата к.ж. проводили сорбцией на смоле Амберлит XAD-2, или экстракцией этилацетатом при кислом (4,0) и нейтральном значениях pH. Полученный после упаривания в вакууме осадок растворяли в небольшом объеме 60% ЕЮН. Экстракцию антибиотиков из мицелия проводили 80% ЕЮН.

Хроматографическую очистку и разделение компонентов перспективных препаратов проводили методом колоночной хроматографии. Определяли физико-химические характеристики "полученных соединений. Для идентификации выделенных антибиотических веществ использовали компьютерную базу данных природных биологически активных веществ (BNPD), разработанную Я. Берди (Венгрия).

Микро- и ультрафильтрационная очистка к.ж. продуцентов. Для очистки методом ультрафильтрации применяли предварительное дифференциальное центрифугирование к.ж. с отсечением фрагментов, превышающих .1000 S (центрифуга "Beckman JB-21", Австрия, ротор JA-20, 18 тыс. об/мин, 60 мин) и 6 S (ультрацентрифуга "Beckman L 5-65", Австрия, ротор Ti 50.2, 40 тыс. об/мин; 19 час., 10°С). При получении проб, объем которых не превышал 1 мл, использовали микроцентрифугу "ELMIMF-05", Латвия (10.000 об/мин, 2 раза по 25 мин).

Ультрафильтрацию под давлением проводили с использованием ультрафильтров с НПМВ, от 100 тыс. до 10 тыс. Д ("Millipore", США, "Владипор", РФ). Ультрафильтрацию с применением центрифугирования проводили в центрифуге "Beckman JB-21", Австрия (ротор JA-20, 18 тыс. об/мин, 60 мин) в патронах-UFC-2 и в микроцентрифуге "ELMI MF-05", Латвия (10.000 об/мин, 40 мин) в патронах UFC-3 ТТК 00 и UFC-3 TGC 00 с НПМВ 30.000 и 10.000 Д ("Millipore", США).

Прошедшую ультрафильтрационную обработку к.ж. стерилизовали фильтрацией через фильтры Sterivex, "Millipore", США с диаметром пор 0,22 мкм и концентрировали лиофилизацией на установке SUE 300 Q, "Heto", Швеция.

Определение МПК противогрибковых антибиотиков.Для определения МПК противогрибковых антибиотиков использовали метод, рекомендованный Национальным Комитетом Клинических Лабораторных Стандартов США [NCCLS, М27-А, М38-А] в варианте микрометода. Использованы следующие штаммы дрожжей: С. albicans АТСС 14053, С. tropicalis АТСС 750, С. humicolus АТСС 9949 и несовершенных грибов: A. niger АТСС 16404, F. oxysporum VKM F-140 (= CMI, IMI 90473) и F. proliferation АТСС 12616.

Культивирование проводили в 96-луночных планшетах в среде RPMI 1640 (ICN Biomedicals Inc., USA) с L-глютамином, без бикарбоната натрия, с добавлением 0,165 М морфолинпропансульфоновой кислоты (MOPS) (pH 7.0). Концентрация инокулята при засеве составляла 1-5 х 103 клеток/мл для дрожжевых культур и 0,4-5 х 104 клеток/мл для грибов. Тестируемые вещества, растворенные в ДМСО или в воде (для водорастворимых соединений), в виде серии двукратных разведений добавляли из расчета, чтобы конечная концентрация препаратов составляла от 16 до 0,03 мкг/мл

при концентрации растворителя (ДМСО) 1%. Каждый препарат в эксперименте присутствовал не менее, чем в трех повторах. В панель эксперимента в качестве контроля включали лунки, не содержащие тестируемых препаратов или растворителя.

Планшеты инкубировали при 35°С (для С. humicolus - 25°С) без встряхивания. Оценку роста культур проводили визуально по наличию осадка в лунках. МПК противогрибковых препаратов считывали после 24 час культивирования для дрожжей и 48 час культивирования для грибов. МПК определяли как минимальную концентрацию препарата, полностью предотвращающую рост тест-организма.

Модели поиска ингибиторов биосинтеза стеролов.

1. Микробная модель A. fusidioides. Культупу A. fusidioides выращивали при 28°С в питательной среде Гаузе 2 (в г/л: глюкоза - 10, пептон - 5,0, триптон - 5,0, NaCl - 5,0, СаС03 - 2,5, рН 7,0-7,2) в атмосфере повышенной влажности в 6-, 24- и 96-луночных стерильных полиститроловых планшегах, ("Flow", Великобритания, "Costar", Франция, "Медполимер", С-Пб.). Объем проб составил, соответственно, 1 мл, 0,5 мл и 200 мкл. Продолжительность выращивания - 3-6 сут.

Исследуемые препараты, полученные из к.ж. и мицелия продуцентов в виде спиртовых растворов, вносили в среду культивирования A. fusidioides серией последовательных трехкратных разведений. Препарат в каждой концентрации вносили в 3-6 повторах. Конечное содержание этанола в эксперименте не превышало 1%. Препарат мевалоновой кислоты вносили в конечной концентрации 1-10 мМ непосредственно в питательную среду в начале культивирования. Рост тест-культуры в планшетах оценивали визуально, а также по сухому весу мицелия.

Продукцию фузидина вьивляли методом диффузии в агаре с помощью культуры В. subíilis АТСС 6633. Концентрацию препаратов в экспериментах с A. fusidioides, как и во всех других используемых моделях, рассчитывали в мкг/мл (для очищенных препаратов) и в единицах культуральной жидкости (ед. к.ж.) (для первичных экстрактов антибиотиков).

2. Микробная модель Н. salinarum. Культуру Н. salinarum выращивали в питательных средах с повышенным содержанием NaCl. Постановку экспериментов проводили в среде следующего состава (в %): NaCl-18,0; MgS04x7H20-0,l; K2HP04-0,1; дрожжевой экстракт-1,0; вода-до 100; рН-7,0-7,2, в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах для иммунологических реакций с круглым дном ("Медполимер", С-Пб.). Начальная оптическая плотность посевного материала, контролируемая в микрокалориметре МКМФ-1 (Россия), составляла 0,005 - 0,015 (в 1 см кюветах при 570 нм). Объем питательной среды в каждой лунке (пробе) составлял 150 мкл. Инкубирование проводили в атмосфере повышенной влажности при 37°С в течение 5-22 сут.

Исследуемые препараты, полученные из к.ж. и мицелия продуцентов в виде спиртовых растворов, вносили в среду культивирования Н. salinarum серией последовательных двух- и трехкратных разведений. Анализировали также непосредственно к.ж. продуцентов, прошедшую стерилизационную обработку микрофильтрацией. Конечное содержание этанола в эксперименте не превышало 2%. Препарат мевалоновой кислоты вносили в конечной концентрации 1-10 мМ непосредственно в питательную среду в начале культивирования.

Оценку роста проводили визуально по размеру плотного осадка красного цвета на дне лунки, а также фотометрически с помощью микроплейтфотометра ИФКО-2 (Россия) после перемешивания содержимого лунок.

3. Модель MOLT-4. Культуру злокачественных человеческих лимфобластов MOLT-4 [Minowada et al., 1972] выращивали в среде RPMI-1640 ("Sigma", США) с глутамином (1%) с добавлением сыворотки крупного рогатого скота (10%) и гентамицина (80 мг/л) при 37°С в увлажненной атмосфере 5% С02.

С целью тестирования препаратов клетки MOLT-4 помещали в 96-луночные планшеты для иммунологических реакций («Медполимер», С-Пб) в количестве 2x10 клеток на лунку и перед внесением препаратов выращивали при 37°С в увлажненной атмосфере 5% С02 в течение 20-24 часов. Тестируемые препараты карминомицина, ловастатина и мевалоной кислоты, приготовленные в соответствующих разведениях, добавляли к культуре клеток MOLT-4. Конечный объем проб составлял 100 мкл, а концентрация спирта не превышала 2%. Инкубацию с препаратами проводили в увлажненной атмосфере 5% С02 при 37°С в течение двух суток.

Выживаемость клеток MOLT-4 определяли с помощью МТТ-теста [Twentyman, Luscombe, 1987]. Развитие окраски регистрировали путем измерения оптической плотности при длине волны 540 им непосредственно в лунках планшета с. домощью сканирующего оптического микропроцессорного компаратора КОМП-1--"Шкеу" (Россия). Все эксперименты ставили не менее чем в 3-х повторностях.

4. Модель Hep G2. Культуру клеток гепатобластомы G2 [Craig Cooper, 1988] выращивали в минимальной среде Игла ("Flow", Великобритания) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мкг/мл канамицина и 4 мМ L-глутамина при 37°С в С02-инкубаторе в атмосфере 95% воздуха и 5% С02. Для постановки экспериментов клетки переносили в 24-луночные планшеты - ("Flow", Великобритания) с плотностью 2x105 клеток на лунку (0,5 мл) и выращивали до достижения ими состояния субконфлуентного монослоя. Непосредственно перед внесением антибиотиков осуществляли кратковременную (1 час) инкубацию в бессывороточной среде. Дальнейшую инкубацию клеток проводили в среде Игла, содержащей 5 мкКи/мл натрия (2-14С) уксуснокислого (удельная активность 40,6 Ки/моль) в присутствии или в отсутствии тестируемых микробных метаболитов. Исследуемые препараты вносили в виде спиртовых растворов одновременно с радиоактивным предшественником из расчета 2,5 мкл на 0,5 мл среды.

После инкубации в течение 3 час в С02-инкубаторе клетки дважды промывали холодным фосфатным буфером Дюльбекко. Липиды экстрагировали смесью гексан-изопропанол (3:2), полученные растворы упаривали в атмосфере азота. Холестерин (ХС) и липиды различных классов разделяли методом ТСХ на пластинах "Silufol" (Чехия) в системе: гексан - диэтиловый эфир - уксусная кислота (75:20:1). Участки пластин, содержащие эфиры холестерина, ХС, триглицериды, фосфолипиды и свободные жирные кислоты, вырезали и помещали в толуоловый сцинтиллятор. Измерение радиоактивности проводили на счетчике Rack Betta 2 ("LKB Wallac", Швеция). Включение |4С-ацетата в липиды разных классов представляли в пересчете на 1 мг клеточного белка, определяемого по Лоури. За 100% принимали уровень

включения радиоактивных предшественников в клетках контрольных лунок, содержавших 0,5% этанола и не содержащих тестируемых препаратов.

Цитотоксичность антибиотиков определяли окрашиванием клеток Hep G2 0,5% раствором трипанового синего, а также изучая воздействие препаратов на синтез белка. В последнем случае клетки Hep G2 инкубировали с препаратами антибиотиков в течение 3-х часов в присутствии 5 мкКи/мл 14С-лейцина (удельная активность 135 Ки/моль). После отмывания клеток от не включившегося радиоактивного предшественника 0,1 M холодным фосфатным буфером (рН 7,0) их лизировали, добавляя 0,1 н NaOH. Клеточный белок осаждали 10% ТХУ, дважды промывали и ресуспендировали в фосфатном буфере. Измерение радиоактивности проводили в диоксановом сцинтилляторе ЖС-8.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием компьютерных программ Statgraf л Microsoft Excel, рассчитывая средние арифметические значения, доверительные интервалы и стандартное отклонение. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента (Р<0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 1. Разработка методов поиска микробных метаболиюв - ингибиторов биосинтеза стеролов (ИБС) и других биологически активных соединений.

1.1. Создание модели поиска на основе грибной культуры A.fusidioides.

Модель основана на способности гриба A. fusidioides продуцировать антибиотик стероидной структуры фузидин (фузидиевая кислота), удобно выявляемый благодаря наличию антибиотической активности. Биосинтез фузидина в организме гриба-продуцента и синтез холестерина (ХС) в организме человека протекают по мевалонатному пути и полностью совпадают вплоть до стадии формирования сквалена (рис.1).

Активный рост тест-культуры A. fusidioides начинался на 2-е сутки и заканчивался примерно к 4-5-м суткам эксперимента. Одновременно с началом роста отмечено образование культурой фузидина. Наиболее ощутимо фузидин накапливался к 4-6 суткам эксперимента (рис. 2, кривая а). Внесение ловастатина (2,5-10 мкг/мл) приводило к подавлению продукции фузидиевой кислоты, наиболее заметному в течение первых 4 суток культивирования, происходившему при отсутствии подавления роста тест-культуры (рис.2, кривые b,c,d).

Внесение в тест-систему препарата экзогенной мевалоновой кислоты - одного из основных интермедиатов биосинтеза стеролов в количестве 2-10 мМ приводило к возобновлению культурой A. fusidioides синтеза фузидина, несмотря на присутствие ловастатина (5, 10 мкг/мл) (рис.3).

Рис.1. Биосинтез холестерина, эргостерола и антибиотика фузидина [составлено по Ланчини, Паренти, 1985, МйвщисЫ й а1., 2009].

ацетил-КоА

ацетоацетил-КоА -

н0соон ,он н н ^ мевалонат

нзс ^.Э-КоА

ГМГ-КоА

Г'МГ-КоА пе^ктта

геранилпирофосфат \

СН3 __

1 н,Т

-А Ьн3

но холестерин

Клетки млекопитаюших

сн,

( н,[ !

-Д. сн,

сн/

.XXX эргостерол СН^^СН) II

И Ч^соон

™зГ о.

РЬ|

м, ;

фузидин

А.]из1с1Ш(1ез

Кривые а, Ь, с и с! - продукция фузидина при содержании в среде ловастатина (мкг/мл): 0 (а), 2,5 (Ь), 5 (с), 10 ((1); кривая е - рост культуры

Время (сутки)

Рост,

сухой вес (мг/мл)

Рис.2. Влияние ловастатина на образование культурой Л/имЛок/ея антибиотика

Рис.3. Влияние мевалоновой кислоты на продукцию культурой А.]\\lsidioides антибиотика фузидина (время инкубации 4 суток)

Концентрация ловастатина (в мкг/мл):

йь

□ о

□ 5

а ю

О мМ 1 мМ 2 мМ 3 мМ U мМ Содержание мевалоновой кислотм

Аналогичный эффект мевалоновой кислоты наблюдался при испытании многих микробных метаболитов (рис,4 а,б) и свидетельствовал о подавлении ими начальных (т.е. до образования мевалоната) этапов биосинтеза стеролов. Ингибирующее действие других метаболитов, напротив, в присутствии мевалоновой кислоты не снималось (рис.4в).

Рис.4. Влияние мевалоновой кислоты на продукцию культурой А. fusidioides фузидина в присутствии экстрактов, полученных из к.ж. штаммов 8(3) (а), 1248/00 (б) и 5422 (в)

Концентрация препаратов (ед. кж/мл)

Ьт

О 0,01 О 0,03 El 0,1

а о.з

О мМ 3 мМ О мМ 3 мМ ОмМ 3 иМ

Содержание мевалоновой кислоты

Предложенная тест-система была применена для исследования 1130 штаммов актиномицетов и плесневых грибов, проявивших на предварительных этапах исследования противогрибковую активность. У 610 штаммов (54%) выявлено подавление биосинтеза фузидина. 415 штаммов такой способностью не обладали. У 105 штаммов (9%) снижение продукции фузидина сопровождалось подавлением

роста тест-культуры, что препятствовало их корректному тестированию в модели А. fusidioid.es (рис.5).

Подавление биосинтеза фузидина снималось в присутствии экзогенной мевалоновой кислоты у 232 штаммов (38% всех активных штаммов), что явилось доказательством воздействия образуемых ими метаболитов на ранние этапы биосинтеза стеролов (включая этап ГМГ-КоА-редуктазы). Другие 378 культур, по-видимому, являются продуцентами метаболитов, воздействующих на поздние этапы биосинтеза стеролов (рис. 5).

Таким образом, ИБС при использовании модели А. fusidioides выявляются как соединения, снижающие продукцию фузидина при отсутствии заметного влияния на рост продуцента. Рассматриваемая модель пригодна для работы с грубо очищенными экстрактами, полученными из к.ж. и мицелия микроорганизмов-продуцентов, и может быть с успехом использована на начальных этапах поиска. Возможность применения в микробной модели А. fusidюides мевалоновой кислоты позволяет уже на начальных этапах поиска успешно выявлять метаболиты, способные к подавлению ранних этапов биосинтеза ХС.

1.2. Бактериальная культура Я. яаНпагит как модель поиска ИБС.

Выбор Н.яаИпагит в качестве модели для отбора ИБС основан на том, что у этой культуры биосинтез стеролов протекает по мевалонатному пути, аналогичному пути биосинтеза в организме млекопитающих, для роста культуры требуются высокое содержание №С1 и для поддержания целостности клеток в таких условиях им необходима полноценная липидная мембрана. Подавление биосинтеза стеролов и связанное с этим нарушение целостности клеточных мембран приводит к лизису клеток.

Активный рост Я хаНпагит начинался на 2-3 сутки культивирования. Внесение ловастатина в тест-систему приводило к подавлению или задержке роста тест-культуры. Наблюдаемый эффект зависел от концентрации антибиотика и возрастал с увеличением дозы препарата (рис.6, кривые Ь,с, II, е).

Внесение в тест-систему препарата экзогенной мевалоновой кислоты приводило к возобновлению роста культуры Я. .уаИпагит, несмотря на присутствие ловастатина (рис.6, сопоставление кривых Г и «1). Мевалонат (3 мМ) снимал подавляющее действие ловастатина вплоть до концентрации последнего 2,5-5 мкг/мл (6-12 мкМ).

Рис.5. Способность микробных штаммов-продуцентов к подавлению биосинтеза стеролов в модели А. fusidioides

нгибито! ранних этапов

Рис. 6. Рост Я. заИпагит в присутствии ловастатина и мевалоната. (Концентрация ловастатина (мкг/мл): 0 (а), 0,3 (Ь), 0,6 (с), 1,25 (с1,1), 2,5 (е). Концентрация мевалоната (мМ): 0 (а, Ь, с, (1, е), 3 (ВД

18 20

Время (сутки)

Предложенная тест-система была применена для исследования свыше 2000 штаммов актиномицетов и плесневых грибов, проявивших на предварительных этапах исследования противогрибковую активность. У большинства метаболитов (1500 штаммов или 75%) выявлена способность к подавлению роста Я. ьаИпагит.

Подавление роста Я. ¡аИпагит снималось в присутствии экзогенной мевалоновой кислоты у 200 штаммов (13% от числа активных штаммов), что было доказательством воздействия образуемых ими метаболитов на ранние этапы биосинтеза стеролов. Оставшиеся 1300 культур, по-видимому, образуют метаболиты, действующие на поздние этапы биосинтеза стеролов (рис.7).

Рис.7. Способность микробных штаммов- 50 продуцентов к подавлению биосинтеза

стеролов В модели Я. ЗаИпагит Ингибиторы _

ранних Ингибиторы этапов ___________- биосинтеза стеролов

Таким образом, ИБС при использовании модели Н.яаИпагит выявляются как соединения, подавляющие рост тест-культуры. Рассматриваемая модель пригодна для работы с грубо очищенными экстрактами, полученными из к.ж. и мицелия микроорганизмов-продуцентов, фильтратами к.ж. и может быть с успехом использована на начальных этапах поиска. Возможность применения в микробной модели Н.заИпагит мевалоновой кислоты позволяет уже на начальных этапах поиска успешно выявлять метаболиты, способные к подавлению ранних этапов биосинтеза стеролов.

Применение модели для поиска противоопухолевых антибиотиков. Для

широкого и полноценного использования Я. ¡аПпагит в поисковой работе

необходимо было определить чувствительность этой культуры к различным антибиотикам и, соответственно, вьиснить возможность применения разработанной модели для поиска соответствующих биологически активных веществ, в том числе, возможно, не относящихся непосредственно к группе ИБС.

С этой целью было изучено действие на указанную модель 52 антибиотиков, относящихся к различным классам биологически активных соединений. В подавляющем большинстве антибиотики не проявляли высокой активности в отношении микробной модели Н. salinarum. Практически неактивны ингибиторы синтеза белка и ингибиторы биосинтеза клеточной стенки (МПК свыше 130, 250 и 600 мкМ). Слабой активностью (МПК 20-60 мкМ) обладали ингибиторы ДНК-зависимой РНК-полимеразы рифамицин SV и рифампицин и такие дезорганизаторы мембран, как полимиксин В, амфотерицин В и нистатин. Вместе с тем заметная активность обнаружена у грамицидина S, амфомицина и новобиоцина (МПК 3-6 мкМ).

Высокой активностью в отношении Я. salinarum обладает ловастатин (МПК 3 мкМ), а также противоопухолевые антибиотики митомицин С, стрептонигрин (брунеомицин), актиномицин D, антрациклиновые антибиотики карминомицин и ногаламицин (МПК, соответственно, 1,4; 2; 2; 2; и 4 мкМ). В отличие от ловастатина, действие указанных препаратов не снимается в присутствии мевалоновой кислоты.

Таким образом, изучение различных препаратов позволяет считать бактериальную модель Н. salinarum полезной для поиска не только ИБС, но также ряда других биологически активных соединений, в первую очередь противоопухолевых антибиотиков.

1.3. Выявление гиполипидемической активности с использованием культуры человеческих злокачественных лимфобластов MOLT-4.

Поскольку отдельные микробные метаболиты ИБС способны к противоопухолевому действию [Ahem et al., 2011], а модель Я. salinarum предоставляет возможность наряду с ними отбирать также противоопухолевые антибиотики, необходимо было изучить воздействие на опухолевые клетки со стороны ИБС и сопоставить полученные сведения с действием противоопухолевых антибиотиков. При наличии в арсенале поисковой работы метода, основанного на использовании опухолевых клеток, появляется возможность более эффективного поиска собственно противоопухолевых антибиотиков, а также детальной оценки механизма действия отбираемых ИБС.

В качестве такой модели была использована культура опухолевых клеток -злокачественных Т-лимфобластов человека MOLT-4, традиционно применяемая в экспериментальной онкологии для оценки противоопухолевой активности, токсичности противоопухолевых препаратов и выяснения их механизма действия.

Пригодность указанной культуры для решения задач, связанных с отбором ингибиторов биосинтеза стеролов, была оценена в ряде экспериментов с использованием ингибитора ГМГ-КоА редуктазы ловастатина и известного противоопухолевого антибиотика карминомицина, а также их рекомбинации с основным интермедиатом биосинтеза ХС - мевалоновой кислотой.

Испытание мевалоновой кислоты показало, что в диапазоне концентраций 1-5 мМ сколь-нибудь существенного влияния на рост клеток МОЬТ-4 она не оказывает.

При изучении ловастатина показано его цитотоксическое действие, наиболее выраженное при использовании антибиотука в концентрации 20 мкг/мл (50 мкМ) и

Концентрация ловастатина (мкг/мл)

Одновременное внесение препаратов приводило к снятию цитотоксического действия ловастатина. Мевалонат в концентрации 3 мМ (но не 1 или 5 мМ) предохранял клетки от цитотоксического действия ловастатина вплоть до концентрации последнего 40 мкг/мл (100 мкМ) (рис.8, кривая 2).

Неспособность ловастатина к подавлению клеток МОЬТ-4 в присутствии мевалоновой кислоты свидетельствует о том, что выявленный цитотоксический эффект ловастатина является результатом подавления этим препаратом ГМГ-КоА редуктазы.

Цитотоксический эффект, вызываемый карминомицином, был хорошо заметен при использовании препарата в значительно меньшей концентрации (0,08мкг/мл, 0,15 мкМ) (рис.9, кривая 1). Снятия цитотоксического действия карминомицина при внесении мевалоновой кислоты не происходило. Более того, сам мевалонат в концентрации 7 мМ достоверно подавлял рост клеток (рис.9, начальная точка кривой 2). Выявленная цитотоксичность мевалоната добавлялась к цитотоксичности карминомицина во всем диапазоне концентраций последнего (0,04-0,65 мкг/мл, 0,081,12 мкМ) и приводила к снижению числа жизнеспосоных клеток (рис.9, кривая 2).

Таким образом, в то время как цитотоксическое действие ловастатина, проявляющееся при использовании высоких концентраций препарата, полностью устраняется в присутствии мевалоната, цитотоксическое действие противоопухолевого антибиотика карминомицина мевалонат не снимает.

Полученные данные позволяют сделать вывод о

целесообразности применения культуры человеческих злокачественных Т-лимфобластов MOLT-4 в поисковой работе в качестве модели для уточнения способности отбираемых препаратов к противоопухолевому действию и выявлению срели них как

ингибиторов биосинтеза стеролов, так и собственно противоопухолевых антибиотиков.

1.4. Оценка гиполипидемического действия и отбор активных соединений с

использованием культуры клеток Hep G2.

Печень выполняет основную регуляторную роль в обмене липопротеидов и является главным производителем и поставщиком ХС в другие органы и ткани. Поэтому при оценке синтеза ХС клетки этого органа представляют наибольший интерес. Они традиционно применяются в биохимических и молекулярно-биологических исследованиях для изучения разнообразных клеточных процессов, связанных с биосинтезом ХС, в т.ч. для оценки действия различных гиполипидемических препаратов. В данном исследовании предлагается применение культуры клеток Hep G2 для поиска новых биологически активных соединений.

Культивирование клеток Hep G2 проводили в присутствии содержащих микробные метаболиты тестируемых препаратов, полученных из к.ж. и мицелия продуцентов. О способности изучаемых препаратов к подавлению биосинтеза ХС и липидов судили по подавлению ими включения 14С-ацетата в ХС и отдельные фракции липидов. Отбирали препараты, у которых подавление синтеза ХС и эфиров холестерина (ЭХ) не сопровождалось подавлением включения 14С-лейцина в белок и 14С-ацетата в фосфолипиды, т.е. не было связано с проявлением токсичности.

Испытание в модели Hep G2 показало, что многие тестируемые препараты подавляют синтез фосфолипидов (рис.10). Подобный эффект наблюдался, как

Рис.9. Влияние мевалоната на подавление роста клеток МОЬТ-4 карминомицином.

Содержание мевалоната (в мМ): О (кривая 1) и 7 мМ (кривая 2)

0,1 0,2 0,3 0,4 0,S 0,6 0,7 Концентрация карминомицина (мкг/мл)

Рис.10. Влияние препаратов 13/88 (а), 5300 (б), 85/88 (в), 199/89 (г), 86/88 (д), 5134 (е) на синтез липидов в культуре клеток Нер G2. Ось абсцисс: Концентрация препарата (ед. кж/мл).

Ось ординат: Включение 14С-ацетата во фракции ХС (1), ЭХ (2), триглицеридов (3), свободных жирных кислот (4) и фосфолипидов (5), включение иС-лейцина в белок (6) (в % от контроля)

0 .......1 ........ ........ о ........ .......1 ........ о I ........

правило, при исследовании экстрактов с невысокой степенью разведения (в 3-10 раз), содержащих чрезмерно высокую концентрацию разнообразных примесей, нередко цитотоксического характера, испытание которых в клетках Hep G2 приводило также к резкому подавлению синтеза белка (рис.Юг, кривая 6). При уменьшении концентрации препаратов, т.е. их разведении в 50-100 раз, появлялась возможность корректного анализа действия препаратов на синтез других классов липидов. Подавление синтеза ХС, ЭХ, и триглицеридов под воздействием большинства метаболитов происходило в клетках, вполне сохраняющих свою жизнеспособность, при относительно небольшом ингибировании синтеза белка.

По своему воздействию многие изученные препараты оказались похожи на ловастатин: подавление синтеза ХС у них доминирует (рис.10 а-в). Как и ловастатин, они не оказывают заметного подавляющего действия на образование триглицеридов,

фосфолипидов, свободных жирных кислот и ЭХ. Вызываемое ими подавление включения ,4С-ацетата в ЭХ не превышает 15-30 % на фоне 50% снижения синтеза ХС и является, несомненно, прямым следствием подавления синтеза ХС.

Одновременно выявлены вещества, заметно отличающиеся от ловастатина по способности подавлять синтез ХС, ЭХ и триглицеридов (рис.10 г-е). Уже на уровне первичных экстрактов, полученных из к.ж. продуцентов, антибиотики 86/88 и 5134 обнаруживают основную особенность своего механизма действия - более сильное подавление синтеза ЭХ (кривая 2), по сравнению с ХС (кривая 1) (рис.10 д,е).

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что культура клеток Hep G2 может быть использована не только для оценки механизма действия различных препаратов, но также для проведения успешного скрининга новых ингибиторов биосинтеза стеролов. С помощью описываемой модели изучено 150 культур почвенных микроорганизмов, обладавших противогрибковым действием. У 15 - 20 % штаммов выявлены вторичные метаболиты, воздействующие на синтез липидов.

Разработанная тест-система, позволяющая уже на ранних этапах скрининга выявлять некоторые особенности механизма действия отбираемых гиполипидемических препаратов, дает хорошую возможность отбирать микробные метаболиты, обладающие разным характером гиполипидемического действия.

1.5. Новые подходы к работе с микроорганизмами - продуцентами и

продуктами их жизнедеятельности, стимуляция продуцентов к образованию

биологически активных метаболитов.

Применение новых оригинальных методов культивирования микроорганизмов. Для выращивания микробных культур использованы стерильные пластиковые планшеты. Культивирование микроорганизмов в минимальных объемах позволило снизить расход питательных сред и отказаться от использования специальных аэрирующих приборов (качалки и пр.). Для разлива питательных сред, содержащих микробный инокулюм, и внесения испытуемых веществ применены автоматические многоканальные дозаторы.

Использование микрометодов позволило разработать новые микробные тест-системы поиска ИБС, требующие выполнения большого количества манипуляций и значительного числа повторов, необходимых для проведения статистической обработки получаемых результатов.

Новые подходы к выделению продуктов микробного вторичного метаболизма. С целью повышения эффективности поисковых исследований были разработаны схемы частичной очистки к.ж. продуцентов, подразумевающие широкое применение микро- и ультрафильтрации.

Первая схема очистки включала в себя подготовительные процедуры в виде осаждения крупных механических примесей центрифугированием (2500(^, 60 мин) с отсечением частиц крупнее 10008 и микрофильтрацию. Дальнейшая ультрафильтрация под давлением приводила к отсечению всех высокомолекулярных соединений крупнее 10000 Дальтон. По второй схеме, благодаря отсечению путем центрифугирования (150000х& 19 час) фрагментов, превышающих бв, проводилась ультрафильтрация с использованием центрифужныхъ патронов, ускоряющая процесс очистки. Проводимая на конечном этапе очистки стерилизационная фильтрация ' устраняла микробную контаминацию и давала возможность проведения анализа полученных проб методами, чувствительными к микробному заражению. Лиофилизация позволяла провести концентрирование биологически активных микробных метаболитов. С помощью описанных методов проведена очистка к.ж. свыше 300 новых микробных продуцентов антибиотиков. Полученные концентраты проявили высокую биологическую активность.

Применение известных методов в новой схеме очистки биологически активных микробных метаболитов способствовало не только ускорению процесса очистки, но и ускорило тестирование препаратов. Таким образом, предложенный подход может быть рекомендован в качестве эффективного дополнения к классическим методам химического выделения и очистки антибиотиков.

Изменение свойств микробных продуцентов путем использования методов клеточной инженерии. Целью настоящих исследований явилось использование процедуры получения и регенерации протопластов на начальных этапах поисковых работ для "активизации" микробных продуцентов, раскрытия их потенциальных возможностей к биосинтезу антибиотиков.

В настоящем исследовании проведена работа со свежевыделенной из почвы культурой АтусоШор.^з <теп1аИ$ гиЬэр. егетотусМ ИНА 238, продуцирующей гликопептидный антибиотик эремомицин. Рассев исходной культуры А.опеМаШ ИНА 238 на плотной питательной среде свидетельствует о ее однородности по культурально-морфологическим признакам и по уровню продукции антибиотика эремомицина (коэффициент изменчивости СУ=25,7) (рис.11 а). Продуктивность исходной культуры составила 65 мкг/мл.

Для повышения активности использовали комбинированную обработку, состоящую в получении протопластов, воздействии на них невысоких доз УФ-облучения (500 эрг/км2) и последующую регенерацию протопластов.

Появляющуюся при протопластировании нестабильность (СУ=45,0 или 64,9) (рис.11 б,г) устраняли с помощью стабилизирующего отбора. Стабильные варианты (СУ=26,1) (рис.11в) были использованы для повторного протопластирования, что

позволило поднять продукцию эремомицина до 450-520 мкг/мл, т.е. повысить антибиотическую активность исходной культуры в 7-8 раз (рис. 11 д).

30 20

1,96а-+1,96а

№

СУ=25.7

СУ=45.0

СУ=26.1

Рис. 11. Изменчивость культуры А. опепкЛи продуцента эремомицина при комбинированном использовании метода УФ-облучения протопластов и стабилизирующего отбора (по оси абсцисс - активность культуры (в %), по оси ординат - количество вариантов (в %)

а - исходный штамм 238; б - штамм 357 Р, получен путем УФ-облучения протопластов исходного штамма

1 - спорообразующие колонии;

2 - колонии, не образующие спор; в - штамм 16-357 Р, стабилизированный; г - протопласты штамма 16-357 Р

после УФ-облучения и регенерации; д - штамм 44 РР, получен путем УФ-облучения протопластов штамма 16-357 Р, стабилизированный.

К -I СУ=64.9

П-ггк_

В ходе продуцентом активные способность

экспериментов с эремомицина многие варианты утрачивали к спорообразованию

СУ=27.2

40 80 120 160 200 240 280 320 ЗбО 400 440 480

(рис.116), что было серьезным препятствием для дальнейшей эффективной селекционной работы с ними. Метод протопластирования, позволял применять УФ-облучение в работе с аспорогенными формами актиномицетов.

Таким образом, метод протопластирования оказался полезен в работе со свежевыделенными из почвы штаммами, проблема повышения продуктивности которых стоит с особой остротой. Использование протопластирования в сочетании с УФ-облучением позволяет избежать отбраковки потенциальных продуцентов перспективных антибиотиков.

2. Поиск ИБС, изучение механизма действия отобранных соединений.

2.1. Поиск ИБС с использованием разработанных моделей.

2.1.1. Схема поиска, оценка эффективности разработанных моделей.

В создании эффективной схемы поиска биологически активных соединений необходимо строго оценивать все позитивные и негативные качества разработанных моделей, в т.ч. уровень их надежности, чувствительности, трудоемкости, а также возможность использования на ранних этапах отбора.

Большинство предложенных нами моделей (за исключением MOLT-4) применимы для оценки грубо очищенных препаратов культуральной жидкости и мицелия продуцентов и, таким образом, могут использоваться на начальных этапах отбора. Вместе с тем предложенные модет обладают серьезными отличиями.

Модель с применением клеток Hep G2 широко используется в мировой практике для оценки синтеза ХС, обладает высокой точностью благодаря количественному анализу биосинтеза липидов в клетке. Она демонстрирует высокую надежность. С ее помощью можно не только эффективно отбирать собственно ингибиторы биосинтеза ХС и ингибиторы АХАТ, но также проводить детальный анализ механизма действия таких метаболитов. Вместе с тем указанная модель предъявляет повышенные требования к очистке тестируемых препаратов и, в силу достаточно высокой трудоемкости, не позволяет проводить скрининг одновременно большого числа соединений.

Модель с использованием человеческих злокачественных лимфобластов MOLT-4, оценивающая ингибиторы биосинтеза ХС по подавлению ими роста культуры, значительно проще, но для собственно поисковых исследований, по-видимому, не вполне пригодна, поскольку не обладает необходимой чувствительностью. Такую модель логично использовать для уточнения и анализа действия уже отобранных достаточно хорошо очищенных соединений.

Значительно удобнее для поиска ИБС, особенно на начальном этапе исследований, оказываются микробные модели, практически не дающие ложно-отрицательных результатов, однако различающиеся по своей способности к отсеву соединений, не имеющих гиполипидемической активности.

Для выявления этих отличий было проведено сопоставление активности микробных метаболитов, проверенных одновременно в микробных моделях и в культуре Hep G2 (табл.1).

Микробные модели проявили высокую надежность: все метаболиты, активные в тесте Hep G2, оказались активными в микробных моделях, а среди метаболитов, неактивных в микробных моделях (68 - в модели A. fusidioides и 45 - в модели Я. salinarum), не было ни одного, который бы проявил свою активность в тесте Hep G2. Следовательно, микробные модели A. fusidioides и Я. salinarum не дают ложно-

отрицательных результатов, их применение практически не вызывает неправомерного отсева потенциально перспективных культур.

Табл. 1. Распределение активных и неактивных штаммов в микробных тестах в сравнении с результатами их испытания в модели Hep G2.

Хо п/п Модель поиска Число штаммов-продуцентов

Наименование модели Отбор ингибито ров биосинтеза активные неактивные всего % активных в тесте Hep G2 от числа активных в микробном тесте % ложно-положите льных результат ов

1 2 3 4 5 6 7 8

1 A. fusidioides стеролов 34 68 102 - 29

HepG2 ХС 24(34-10) 78 (68+10) 71 -

2 Н. salinarum стеролов 65 45 110 - 62

Hep G2 ХС 25 (65-40) 85(45+40) 38 -

Из 34 штаммов, активных в микробной модели A. fusidioides, способностью к подавлению биосинтеза ХС в клетках Hep G2 обладали метаболиты 24-х штаммов. Экстракты 10 штаммов, активных в микробном тесте, не подавляли включения С-ацетата в ХС фракцию в клетках Hep G2. Таким образом, при оценке биосинтеза ХС число ложно-положительных результатов теста A. fusidioides составило 29%.

Из 65 штаммов, активных в микробной модели Н. salinarum, способностью к подавлению биосинтеза ХС в клетках Hep G2 обладали метаболиты 25, штаммов. Активность 40 штаммов в тесте Hep G2 не подтвердилась. Таким образом, у значительно более простой с точки зрения технического исполнения бактериальной модели Н. salinarum процент ложно-положительных результатов выше и сотавляет 62%. Следовательно, тест Н. salinarum способствует отбору большого числа разнообразных соединений, не имеющих прямого отношения к ингибированию биосинтеза ХС.

В сравнении с тестом Hep G2 обе микробные модели позволяют отбирать не только ингибиторы биосинтеза ХС, но и ингибиторы биосинтеза других стеролов. Кроме того, модель Н. salinarum позволяет проводить отбор противоопухолевых антибиотиков.

Таким образом, несмотря на то, что обе микробные модели могут быть использованы на начальных этапах отбора, их тщательное сопоставление позволяет вскрыть серьезные различия между ними и прийти к выводу о целесообразности использования бактериальной модели Н. salinarum на более ранних, по сравнению с

А. /ш1(Ио'Ж5, этапах отбора (рис.12). В таком случае достигается значительная экономия ресурсов, а главное - возникает возможность проведения одновременного отбора как ИБС, в том числе ингибиторов поздних этапов синтеза, среди которых могут быть потенциальные противогрибковые препараты, так и противоопухолевых антибиотиков.

Рис.12. Биологические модели в поиске ИБС.

Отбор штаммов,

обладающих противогрибковой активностью

................а..................

Использование бактериальной модели Н. salinarwn

_1_

Использование микробной

модели A. fusidioides

Я1

Использование культуры клеток

HepG2 _-

При отборе ингибиторов ранних этапов биосинтеза ХС оба микробных теста обладают равной ценностью, поскольку в варианте использования мевалоновой кислоты позволяют дать быстрый и обоснованный ответ относительно способности испытуемых метаболитов подавлять ранние этапы биосинтеза стеролов (включая ГМГ-КоА редукгазу) без привлечения дополнительных дорогостоящих методов.

Проявление противогрибковой активности культур в отношении хотя бы одного из трех грибных штаммов: A. niger, F. oxysporum или С. albicans позволяет повысить вероятность обнаружения ИБС до 28-42% (табл.2). Без предварительного определения противогрибковой активности выделяемых штаммов, вероятность обнаружения среди них продуцентов ИБС не превышает 2-5%.

Приведенные факты свидетельствуют о целесообразности использования в первичном скрининге ИБС специального предварительного этапа (этап 0) (рис.12), основанного на выявлении у продуцентов противогрибковой активности.

Табл. 2. Способность к подавлению биосинтеза стеролов у микробных штаммов, обладающих противогрибковой активностью

Микроорганизмы Число штаммов с противогрибковой активностью Из них продуцентов ИБС

Грибы 127 54 (42 %)

Актиномицеты 110 31 (28%)

Примечание: общее число протестированных штаммов грибов и актиномицетов 5000.

Разработанные нами модели поиска ИБС оригинальны и принципиально отличаются от моделей поиска, предложенных другими исследователями [Endo, 1980, Kumagai et al., 1990, Ikeura et al., 1988, Баранова и др., 2002, Бибикова и др., 2004, Чмель и др., 2004]. Используемая нами культура Я. salinarum, в силу особенностей метаболизма архебакгерий, обладает целым рядом важных преимуществ, в частности,

высокой чувствительностью к ИБС, а также простотой в использовании и возможностью визуальной оценки подавляющего действия отбираемых ингибиторов. Ее сочетание с моделями A. fusidioides, MOLT 4 и Hep G2 дает возможность судить о механизме действия отбираемых соединений.

2.1.2. Проведение поиска, микроорганизмы-продуценты, химическое

разнообразие отобранных ингибиторов.

Скрининг, проведенный с помощью разработанной нами схемы поиска ИБС, включающей на начальном этапе обязательный отбор штаммов, обладающих противогрибковой активностью, показал, что способностью к продукции ИБС обладают различные микроорганизмы: не только несовершенные грибы, но также многие актиномицеты и отдельные представители высших базидиальных грибов.

Многие микроорганизмы образуют ингибиторы ранних этапов мевалонатного синтеза (вплоть до этапа работы ГМГ-КоА редуктазы включительно). Испытание таких метаболитов в микробных моделях (Я salinarum, A. fusidioides) показало, что их действие снимается при добавлении мевалоновой кислоты. Актиномицеты, обладающие такой способностью, прежде были не известны. Как показали результаты наших исследований, среди ИБС актиномицетного происхождения до ля ингибиторов ранних этапов биосинтеза стеролов достигает 38%.

Препараты, выделенные в ходе поиска ИБС, относятся к разным классам химических соединений и могут быть условно разделены на три основные группы: линейные, циклические и поликонденсированные.

Линейные антибиотики (86-1, 8(3)-1, 8(3)-2, 13/88-1, 199/88, 4297-1) характеризуются наличием ароматических групп и непредельных связей. Антибиотик

4279-1 отнесен к группе туникамицина. Антибиотик 199/88, образуемый культурой гриба Paecilomyces variotii Bainier 199, содержащий два кольца - бензольное с пятью заместителями и тризамещенное фурановое кольцо, был идентифицирован как аскофуранон (рис.13).

Рис.13. Химическая структура антибиотика 199/88 (аскофуранон)

Многие выделенные в ходе исследований соединения относятся к группе циклических препаратов, в т.ч. депсипептидный антибиотик 86-2, образуемый культурой гриба ИНА F-86 Fusarium lateritium Nees var. stilboides (Wr.) Bilai, циклическая структура которого образована тремя пептидными и

Рис.14. Химическая структура антибиотика 86-2 (86/88)

тремя сложноэфирными связями, определенный как эиниатин В (рис.14).

К макроциклическим антибиотикам отнесены препарат 770, содержащий 3

двойные связи, и 1132/93, образуемый актиномицетным штаммом БНерЮтусез

Ьаагпет 'к, определенный как хлоротрицин (рис.15).

К третьей группе - поликонденсированных антибиотиков относятся антибиотики

55-А и 13/88-2. (рис.16,17). рис 16 Предполагаемая структура

антибиотика 55-А (55/90)

г, ,с V -соои

Рис.15. Химическая структура

антибиотика 1132/93

(хлоротрицин)

V—т-х-о—^.-"-г-сн, он W^-oh

Рис. 17. Предполагаемая структура антибиотика 13/88-2 л

"Хг

2. Изучение механизма действия отобранных ИБС. 2.2.1. Механизм действия антибиотика 199 (аскофуранон).

Антибиотик 199 оказывал выраженное воздействие на синтез липидов в культуре клеток Hep G2 (рис.18).

Рис.18. Влияние препарата 199 на синтез липидов в культуре клеток Hep G2.

Включение 14С-ацетата клетками Hep G2 в состав ХС(1), ЭХ(2), Тгл(З), СвЖК(4), ФЛ(5) и включение UC-лейцина в общий белок (6).

-t-

12 3

Концентрация антибиотика (мкг/мл)

Наиболее сильно препарат подавлял биосинтез ХС (ИК50400 нг/мл или 1,0 мкМ), уступая при этом ловастатину (ИК5о 0,2 мкМ), а также снижал включение С-ацетата во фракцию ЭХ. В отличие от ловастатина аскофуранон подавлялся синтез триглицеридов (Тгл) (ИК50 900 нг/мл или 2,2 мкМ) и фосфолипидов (ФЛ) (ИК501,2 мкг/мл или 2,5 мкМ), способствовал резкому уменьшению содержания в клетках свободных жирных кислот (СвЖК).

В отличие от ловастатина, для которого подавление синтеза ЭХ связано с уменьшением синтеза ХС, являющегося основой для образования эфиров, ингибирование синтеза ЭХ аскофураноном оказывается во многом следствием уменьшения другого составляющего компонента в синтезе ЭХ - СвЖК. Уменьшением содержания жирных кислот можно объяснить также подавление синтеза ФЛ. В свою очередь наличие самих СвЖК в клетке во многом определяется процессами синтеза Тгл, подавленного в присутствии аскофуранона.

Подавление синтеза ЭХ, ХС, Тгл и ФЛ под воздействием аскофуранона происходит в клетках, вполне сохраняющих свою жизнеспособность, что подтверждается экспериментами с витальными красителями, а также относительно небольшим ингибированием синтеза белка (рис.18, кривая 6).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о комплексном воздействии аскофуранона на процессы синтеза и метаболизма липидов в клетке. Подавление синтеза Тгл и ФЛ, выраженное уже при использовании низких концентраций аскофуранона, является, по-видимому, характерной чертой механизма действия этого антибиотика. Вместе с тем наиболее сильно аскофуранон подавляет синтез ХС.

2.2.2. Механизм действия антибиотика 86/88 (энниатин В).

Наиболее активно антибиотик 86/88 подавляет включение 14С-ацетата во фракции ЭХ (ИК50 600 нг/мл или 1 мкМ) и Тгл (ИК50 8 00 нг/мл), в несколько меньшей степени - во фракции ХС (ИК50 1,1 мкг/мл) и СвЖК (ИК50 1,3 мкг/мл). В наименьшей степени антибиотик оказывает воздействие на синтез ФЛ (рис.19). Наблюдаемое подавление синтеза ЭХ, ХС, и Тгл происходит в клетках, вполне сохранивших свою жизнеспособность, о чем свидетельствуют эксперименты с витальными красителями, а также относительно небольшое ингибирование синтеза белка (рис. 19, кривая 6).

Подавление синтеза ЭХ под воздействием 86/88 может быть в первую очередь связано с подавлением ацилирующих ферментов, в частности, АХАТ [Тотоёа е1 а1., 1992], но также в немалой степени быть следствием снижения содержания СвЖК, количество которых во многом связано с процессами синтеза Тгл.

Рис.19. Влияние препарата 86/88 на синтез липидов в культуре клеток Hep G2.

Включение мС-ацетата во фракции ХС(1), ЭХ(2), Тгл(З), СвЖК(4) и ФЛ(5), а также включение "С-лейцина в белок (6).

Основной эффект антибиотика 86/88 (энниатина В) в культуре клеток Hep G2 -подавление синтеза ЭХ является, по-видимому, следствием не только ингибирования АХАТ, но также результатом снижения содержания в клетках СвЖК, вызываемого подавлением синтеза Тгл.

2.2.3. Механизм действия антибиотиков 55,1132,1709 и других биологически

активных метаболитов актиномицеткого и грибного происхождения.

С помощью микробных моделей, а также в культуре клеток гепатобластомы G2 в системе in vitro изучены гиполипидемические свойства ряда ИБС, в том числе антибиотиков грибного (55/90) и актиномицетного происхождения (1132, 1709/02, 4883а). Проявляя гиполипидемическую активность, указанные препараты значительно различаются по своим физико-химическим свойствам и отнесены к разным классам химических соединений.

Антибиотик 1132 (хлоротрицин) (рис.15) подавлял рост бактериальной культуры Н. salinarum, в высокой концентрации вызывал ее лизис, в микробной модели А. fusidioides подавлял продукцию фузидина. Внесение мевалоновой кислоты на характер описываемых процессов влияния не оказывало. Таким образом, антибиотик 1132 отнесен к группе ингибиторов поздних этапов биосинтеза стеролов.

Стероидный антибиотик 55/90 (рис.16), отобран с помощью микробных моделей H.salinarum и A. fusidioides. Поскольку внесение экзогенной мевалоновой кислоты приводило к снятию подавляющего действия антибиотика, сделан вывод о его влиянии на один из начальных (включая стадию ГМГ-КоА редуктазы) этапов

биосинтеза сгеролов. Аналогичный вывод на основании изучения в модели H.salinarum с использованием мевалоновой кислоты сделан относительно отдельных компонентов антибиотика 1709/02 (продуцент Sírepíomyces sp.), отнесенного к группе амфомицина.

При проведении скрининга ИБС среди низкомолекулярных продуктов жизнедеятельности высших грибов выявлена гиполипидемическая активность у отдельных представителей двух видов базидиомицетов - Lentinus edodes (шиитаке) и Ganoderma lucidum (лакированный трутовик). Экстракты, полученные из к.ж. и мицелия одного из штаммов L.edodes (штамм 15), вызывали подавление роста микробной культуры H.salinarum, которое снималось в присутствии мевалоновой кисиоты, свидетельствуя, тем самым, о подавлении препаратами начальных стадий биосинтеза стеролов, предшествующих образованию мевалоната. Снятия подавляющего действия экстрактов, полученных из к.ж. G. lucidum,в присутствии мевалоновой кислоты не наблюдалось.

Выявленная ингибиторная активность, по-видимому, не связана с образованием культурой Ledodes антибиотиков лентинамицина В и лентинацина (эритаденина).

Тег факт, что способность к подавлению биосинтеза стеролов обнаружена лишь у отдельных штаммов испытанных культур, свидетельствует о том, что способность базидиомицетов к образованию ИБС является, по-видимому, штаммоспецифичной.

2.2.4. Антибиотик 4883 - препарат, обладающий высокой противогрибковой

активностью.

Способностью к подавлению поздних этапов биосинтеза стеролов обладали свыше половины всех отобранных ИБС. Высокая противогрибковая активность'при этом была обнаружена лишь у единичных препаратов, среди которых наибольшей активностью обладает антибиотик 4883 (= ИНА 1278), образуемый мутантным штаммом Sírepíomyces roseoßavus arai (Sírepíomyces sp. № 1278), отнесенный к 20-ти членным макролиДам группы ирумамицина (рис. 20).

наблюдалось в концентрации 4 мкг/мл, а в более высоких концентрациях - лизис тест-культуры. Подавление роста Н. ¡аПпагит, вызываемое антибиотиком 4883, не

он

Рис. 20. Предполагаемая структура h,ncoo антибиотика 4883.

Антибиотик 4883 уже в низкой концентрации (0,4 мкг/мл) вызывал частичное подавление роста культуры Н. 5аИпагит. Полное подавление

снималось в присутствии мевалоновой кислоты, что говорит о неспособности препарата к подавлению ранних этапов биосинтеза стеролов.

Антибиотик 4883 обладает высокой активностью в отношении мицелиальных грибов A. niger, F. oxysporum (МПК, соответственно, 1 и 4 мкг/мл) и умеренной активностью в отношении дрожжей С. albicans и С. humicolus (МПК 8мкг/мл). На дрожжевые культуры антибиотик 4883 действует как фунгистатик. По уровню активности в отношении мицелиальных грибов указанный препарат сопоставим с амфотерицином В (амф В).

3. Отбор противогрибковых антибиотиков среди полусинтетических препаратов, а также соединений, получаемых путем полного химического синтеза. 3.1. Отбор производных и выявление взаимосвязи "структура-активность" в группе антибиотиков полиенов.

Для структуры полиеновых антибиотиков характерно наличие макролакгонового кольца с системой сопряженных двойных связей и присоединенного к кольцу сахарного остатка. Система конъюгированных двойных связей придает ригидность соответствующей части кольца я обусловливает ее гидрофобность (рис.21). По этому участку молекулы происходит основное взаимодействие полиенов со стеролами клеточных мембран (у грибов - с эргостеролом) с образованием пор, через которые происходит истечение ионов, приводящее к гибели клеток возбудителя. Противоположная гидрофильная часть кольца располагается внутри поры и принимает активное участие в ее функционировании. Боковые СООН-группа и аминосахар также необходимы для образования полноценно функционирующих пор, поскольку способны к дополнительному взаимодействию со стеролами мембран, а также к взаимодействию с другими молекулами антибиотика в процессе формирования поры. Перспективы в разработке полиенов, обладающих более высокой активностью и одновременно меньшей токсичностью, связаны с проведением модификаций как в области лактонового кольца, его гидрофильной и гидрофобной части, так и по боковым группам.

Проведенная в НИИНА им. Г.Ф.Гаузе совместно с Норвежским университетом г. Тронхейм разработка новых препаратов полиенового ряда, преследовала цель совмещения двух подходов - генно-инженерного, с помощью которого были получены структуры, обладающие серьезными изменениями в лактоновом кольце, и химического, подразумевающего дальнейшее преобразование по боковым участкам молекулы антибиотика химическими методами. Химическая модификация проведена сотрудниками лаборатории химической трансформации антибиотиков НИИНА им. Г.Ф.Гаузе под руководством проф. М.Н.Преображенской.

Результаты изучения способности новых антибиотиков к противогрибковому действию были положены в основу дальнейших химических преобразований, т.е.

проводилась направленная химическая модификация антибиотиков и отбор среди них наиболее перспективных препаратов.

Рис.21. Амф В, 844НР, В8С005 и направления их химической модификации.

3.1.1. Противогрибковая активность генно-модифицированных производных нистатина.

Изучение 9 генно-инженерных аналогов полиенового антибиотика нистатина, показало, что различия в противогрибковой активности полиенов зависят в первую очередь от строения их лактонового кольца, малейших преобразований в котором достаточно для значительного изменения противогрибкового действия. Например, у производного В8С002, а также сходных с ним ВЭСООЗ и В8С018, имеющих смещение и инверсию одной из ОН-групп в гидрофильной части кольца (СЮ—>С9), противогрибковая активность по сравнению с исходным антибиотиком нистатином А! заметно снижена. Полное отсутствие указанной ОН-группы, напротив, приводит к повышению активности (В8С022 и В8С019), также как и замена гидроксила в положении С5 на кетоновую группу (В8С013 и В8С020).

Значительному повышению активности способствует появление дополнительной двойной связи (С28-С29) в гидрофобной области кольца (BSG022, BSG019, BSG013, BSG020), характерной для амф В (гептаен) и отсутствующей у нистатина (диен-теграен). Наибольшая активность выявлена у соединений S44HP и BSG005, обладающих аналогией с амф В в структуре своей гидрофобной части, и имеющих гидрофильную зону лактонового кольца, свойственную нистатину (рис.21). Эти генно-модифицированные производные нистатина послужили основой для дальнейшей разработки большинства химически модифицированных препаратов. 3.1.2. Противогрибковая активность химически модифицированных производных антибиотиков полиенов.

Сайтами для проведения химических модификаций генно-инженерного препаратов (рис.21) явились наружные группы их молекул: карбоксильная группа в положении С16 (1) и аминогруппа аминосахара (2) у S44HP, а также аминогруппа аминосахара (2) у BSG005. Путем замещения по одному из сайтов модификации были получены монозамещенные производные. Проведение замещений по обоим сайтам модификации позволило получить дизамещенные производные.

Проведено сопоставление противогрибковой активности свыше 40 химически моно- и ди-модифицированных производных. Соединения, получаемые в результате модификаций по боковым группам, сильно различаются по своей противогрибковой активности, уступают (10, 11, 14), сохраняют, или даже несколько превосходят исходный препарат S44HP (амиды 5-8 и N-алкил-производное 12) (табл.3). Амиды, обладающие полярными группами в амидной группировке (ОН, NH2 или СООН), например, амиды с метиловым эфиром L или DL-серина, или амид с этиловым эфиром глицина (8), были значительно более активными по сравнению с амидами с метиловым эфиром L-аланина (9) или L-валина. Размер заместителя, несущего полярную группу, также, по-видимому, имеет значение. Например, несущие относительно короткие заместители амид S44HP (2), метиламид S44HP (3) или 2-гидроксиэтиламид (4) менее активны, чем 3-гидроксипропиламид S44HP (5).

Среди производных, имеющих замены по аминосахару, высокой активностью обладает производное 12. Соединения с ароматическими заместителями (11, 15), оказались менее активными.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о чрезвычайной важности боковых групп: от их размера и наличия в них полярных заместителей зависит противогрибковая активность полиеновых антибиотиков.

В дальнейшей работе в качестве основы для создания дизамещенных производных были взяты проявившие высокую противогрибковую активность монозамещенные амиды 5-7, у которых следовало провести дополнительную модификацию по аминосахару, а также 2 малоактивных монозамещенных производных по сахару -

соединения 14 (LCTA 1353) и 15 (LCTA 1475) (табл.3). Активность последних соединений планировалось поднять за счет проведения дополнительной модификации по группировке С16 путем получения хорошо зарекомендовавших себя амидов ДМАЭ, ДМАП и гидроксипропиламида.

Табл.3. Противогрибковая активность химических производных антибиотика

S44HP в сравнении с исходным препаратом и амф В.

№п соеди нение LCTA Название соединения МПК, мкг/мл. Тест организм

C.albicans АТСС 14053 С. humicolus АТСС 9949 A.niger АТСС 16404 F.oxysporwn VKM F-140

Амф В 1 1 1 4

1 S44HP 1 1 I 4

Производные с замещением по СООН группе

г 130S амид 2 2 4 4

3 1325 метиламид 2 1 2 8

4 1304 2-гидроксиэтиламид 2 4 4 4

5 13SI 3-гидроксипропиламид 1 1 2 2

6 1480 З^Ы,Ы-димешламино) этил амид (ДМАЭ-амид) 0,5 0,5 1 . 1

7 1350 3 чК.К-димегилам ино) пропил амид (ДМАП-амид) 1 1 2 ' 2

S 1327 амид с этиловым эфиром глицина 1 1 2 4

9 1330 амид с межловым эфиром аланина 2 2 4 8

10 1309 1-[1,1-ди- (гидроксиметил)]этил амед 4 4 4 16

Производные с замещением по аминосахару

И 1328 N-(4-N,N- диметиламино)бензил S44HP 2 2 4 >16

12 1352-II N,N-6hc-(3 -ам инопрогщл) S44HP 1 1 1 1

13 1331 Производное антибиотика и D- галактозы 1 1 2 8

14 1353 ЫЧЬ-лизил) S44HP 8 8 16 >16

15 1475 Ы-(4-ам ином етил)бензоил S44HP 2 2 4 16

Сопоставление активности монозамещенных амидов и полученных из них дизамещенных производных показало, что наибольшей активностью обладают исходные амиды, получившие в табл.4 новые обозначения - 2 (ЬСТА 1480), 3 (ЬСТА 1350) и 4 (ЬСТА 1351), а также полученные из них И-фруктопиранозильные (2а, За) и И-тагатопиранозильные соединения (2Ь).

В противоположность этому И-фруктопиранозильное производное 3-гидроксипропиламида 844НР (4а), несущее ту же замену по аминосахару, что и

активные соединения 2а и За, продемонстрировало резкое падение активности по сравнению с исходным антибиотиком.

Табл.4. Противогрибковая активность ди-замещенных производных в44НР в сравнении с соответствующими монозамещенными препаратами 2, 3,4, исходным препаратом 544НР и амф В________

МПК, мкг/мл

Наимено вание по замещен ию в С16 Соединение Изменение поС-16 он :'^4CONHR1 гдеЫ1 Изменение по аминосах^ру где R2 nh"r2 с. albicans С. humicolus А. niger F. oxysporum

ДМАЭ амиды 1 (LCTA-1480) Н 0,5 0,5 1 1

2а фрукгопиранозил 0,5 I 1 2

2Ь тагатопиранозил 0,5 1 1 2

ДМАП амиды 3 (LCTA-1350) 1 Н 1 1 2 2

За фрукгопиранозил 1 1 1 4

ЗЬ тагатопиранозил 1 2 2 4

Гидрокси пропил амиды 4 (LCTA-1351) /V^oh Н 1 1 2 2

4а фрукгопиранозил 4 4 4 16

1 (S44HP1 1 1 1 4

Амф В 1 1 1 4

К разному эффекту приводила дополнительная модификация по группировке С16 у малоактивных соединений 14 и 15. У соединения 14 (LCTA 1353) она позволяла многократно усилить противогрибковое действие (ДМАП-амид соединения 14 имел МПК 1-2 мкг/мл), в то время как при получении аналогичных амидов у антибиотика 15 (LCTA 1475) противогрибковая активность практически не изменялась. 3.1.3. Противогрибковое действие водорастворимых солей, активность перспективных соединений.

С целью улучшения терапевтических свойств полиенов, повышения степени их гидрофильности были получены водорастворимые соли генно-инженерных препаратов, а также их химических производных, проявивших высокую противогрибковую активность in vitro.

Получение солей (L- и D-глутамат, L-глюкуронат, L-гидроксисукцинат, дихлорацегат), как правило, не приводило к существенному изменению противогрибковой активности, остававшейся на уровне активности исходных соединений. Исключением стали L-аспаргатные соли препаратов S44HP и BSG 019, гидрохлорид BSG 005 (снижение активности в 2 раза), а также метансульфонатная соль BSG 005 (снижение в 4 раза). Одним из наиболее активных препаратов in vitro стал препарат 2G - L-глутаматная соль соединения LCTA-1480 (ДМАЭ-амид S44HP).

Препарат 2G, наряду с исходным соединением 2 (ДМАЭ-амид S44HP), а также дизамещенным производным 2а (фруктопиранозил ДМАЭ-амид S44HP) и другом монозамещенным производным 3 (ДМАП-амид S44HP) (табл.4), был отобран для испытания in vivo.

Испытания на животных, проведенные в лаборатории химиотерапии и фармакологии НИИНА им. Г.Ф.Гаузе под руководством к.м.н. И.Д.Трещалина, подтвердили высокую противогрибковую активность всех указанных соединений, оказавшихся также значительно менее токсичными по сравнению с амф В и исходные препаратом S44HP. LDS0 у препаратов 2 и 2G составляла, соответственно, 32,2 и 22,1 мг/кг в сутки, в то время как у амф В и S44HP она была, соответственно 2,8 и 2,2 мг/кг. Препараты 2 и 2G активно подавляли развитие кандидозного сепсиса у мышей.

3.1.4. Выявление взаимосвязи "структура-активность" при сопоставлении производных, получаемых путем проведения однотипных химических замещений.

Значение структуры лактонового кольца для активности полиеновых антибиотиков, продемонстрированное при сравнении генно-инженерных производных, подтверждается также при анализе активности однотипных производных, полученных у амф В и препарата S44HP, различающихся между собой расположением гидроксильных радикалов в гидрофильной части кольца (рис.21). Анализ большого числа производных, полученных при проведении модификаций по боковым сайтам, показал, что однотипные замещения в молекулах этих антибиотиков не всегда приводят к сходному изменению активности: противогрибковая активность при модификации S44HP снижается реже.

При сопоставлении производных S44HP и BSG005, отличающихся наличием СООН/СНз-групп в положении С16, выявлено, что при проведении однотипных замещений у этих антибиотиков могут быть достигнуты кардинально противоположные результаты (табл.5).

Например, присоединение к аминосахару диметиламинобензильной группировки вызывает относительно небольшое снижение активности S44HP (строка 1, соединение 1328), в то время как у аналогичного производного BSG005 (1457) оно приводит к практически полной утрате активности. Присоединение к аминосахару двух аминопропильных группировок с образованием бис-3-аминопропильного производного позволяет усилить активность препарата S44HP (1352-II) (строка 2), но при этом вызывает резкое падение активности соответствующего производного BSG005 (1483). Введение в аминогруппу аминосахара Ы,Ь-лизина, вызывая резкое снижение активности препарата S44HP (1353), способно даже несколько усилить активность антибиотика BSG005 (1462) (строка 3). Наблюдаемое при этом падение

активности в ряду антибиотика 844НР удается компенсировать проведением дополнительной модификации в области СООН-группы путем создания ДМАП-амида (1476) (строка 4).

Табл.5. Противогрибковая активность производных антибиотика 844НР и ВЙОООЗ

в сравнении с исходными соединениями и амф В.

№ стр. ки Название произвол ных Изменение по амино Произ водные МПК, мкг/мл. Тест организм Произ водные В8С005 №ЬСТА

сахару Я', Я" 844НР, Л ЬСТА С а!Ысат С йшшаЛш А пщег Еохуърогит

Амф В 1 1 1 4

контроль Н,Н в44НР 1 1 1 4

контроль Н,Н 1 1 2 2 В5С005

Производные с замещением по аминосахару

н7Х 1328 2 г 4 >16

1 диметиламин о)бензил у 16 >16 >16 >16 1457

Ы,Ы-6исЧЗ-аминопро пил) < < 1352-П 1 1 1 1

2 ин, «чн, а 8 8 8 1483

н. ИаМ^^СО- 1353 8 8 16 >16

3 НЬ-лизил * 1 1 1 2 1462

Ди-замещенное (ДМАП-амид)

4 >3,Ь-лизил н, Т нн, X" . ^✓■^сон* и 147б' 1 1 1 2

Наблюдаемые отличия свидетельствуют о значении боковых радикалов и особой роли С16-боковой группы в действии полиеновых антибиотиков, активность которых зависит, по-видимому, не столько от типа радикалов в соответствующих сайтах молекулы, сколько от их способности обеспечить общую структуру молекулы антибиотика, наиболее подходящую для проявления его противогрибковых свойств.

3.2. Отбор противогрибковых антибиотиков среди полусинтетических производных олигомицина и синтетических производных трисиндолилметана. 3.2.1. Отбор противогрибковых антибиотиков и выявление взаимосвязи "структура-активность" в группе полусинтетических производных олигомицина.

Олигомицины - макролидные антибиотики, содержащие 26-членное лактоновое кольцо, объединенное с бициклической спирокетальной системой, сходные по химической структуре с вентурицидином, оссамицином, апоптолидином и

цитоварицином (рис.22). Относятся к группе препаратов - ингибиторов АТФ-синтазы, участвующей в синтезе, а во многих организмах и в утилизации АТФ, влияющей на обеспечение энергией транспорта ионов [Hong, Pedersen, 2008]. Обладают противоопухолевой активностью, проявляют способность к индуции апоптоза, в отличие от большинства других сходных с ними по химической структуре препаратов, проявляют высокую активность в отношении отдельных видов грибов.

Рис.22. Химическая структура олигомицина А (1) и его производных - препаратов

Изучено противогрибковое действие полученных в НИИНА им. Г.Ф.Гаузе химических производных олигомицина А (1), имеющих отличия в структуре лактонового кольца - оксим олигомицина (2), производного олигомицина с гетероциклом (3), бромолигомицина, несущего Вг в положении С16 (4), и олигомицина А-0 (5), детальная разработка которых была проведена впервые (рис.22, табл.6).

Олигомицин проявляет высокую активность в отношении мицелиальных грибов, особенно A.mger (МПК 0,125 мкг/мл), причем намного превосходит амф В. В действии на дрожжи антибиотик проявляет определенную специфику, вызывая лишь временную задержку роста, заметную при небольших сроках инкубации (табл.6). Увеличение срока инкубации приводит к активному росту дрожжевых культур и, следовательно, к значительному возрастанию МПК препарата.

Изменение в структуре антибиотиков приводит к снижению их противогрибкового действия. По сравнению с олигомицином его производные 2 и 4 практически полностью лишены противогрибковой активности. Производные 3 и 5, при, на первый взгляд, более

LCTA 1484 (2), LCTA 1487 (3), LCTA 1841 (4) и LCTA 1862 (5).

серьезных отличиях в химической структуре, сохраняют активность как в отношении дрожжевых культур (гл. образом С. китШш), так и в отношении

Табл.6. Противогрибковая активность производных олигомицина в сравнении с исходным соединением и амф В.

№ соеди Название МПК, мкг/мл. Тест организм

п/г нения LCTA соединения С albicans * С humicolus * A. niger F. oxysporum

- амф В 0,5 0,25 0,5 2

1 - олнгомнцнн А 4 (>16) 2 (4) 0,125 1

2 1484 оксим олигомицина 16 (>16) 8 (16) >16 >16

3 1487 производное с гегероциклом 4 (>16) 4 (8) 2 >16

4 1841 бромолигомицин >16 (>16) 2 (16) >16 >16

5 1862 олигомнции А-0 >16 (>16) 2 (16) 4 >16

* Оценка роста дрожжей С. albicans и С. humicolus - через 24 часа; в скобках через 48 часов. Оценка роста грибов A. niger и F. oxysporum - через 48 часов

Изучение препарата 5 в Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, проведенное под руководством проф. В.Н.Даниленко, показало его неспособность к подавлению АТФ-синтазы S. fradiae [Lysenkova et al., 2010], что позволяет высказать предположение об отсутствии прямой связи между противогрибковым действием антибиотиков олигомициновой группы и подавлением ими АТФ-синтазы. По-видимому, активность производных олигомицина в отношении грибов связана с подавлением ими каких-либо других процессов, возможно, в первую очередь, с действием на мембрану клеток.

3.2.2. Отбор противогрибковых антибиотиков и выявление взаимосвязи "структура-активность" в группе синтетических производных трисиндолилметана.

Соединения, имеющие в качестве основы фрагмент трифенилметана, нередко обладают противоопухолевой, антибактериальной или противогрибковой активностью [Palchaudhuri et al., 2008]. Большой интерес представляют также соединения, в которых трифенилметильный фрагмент заменен на индольные кольца, такие как антибиотики турбомицин А и В, ароматические группы которых связаны воедино центральным атомом углерода, имеющим одну незаполненную связь, что позволяет говорить об этих антибиотиках и их аналогах, как о триарильных катионах. Недавно турбомицин А и В были получены с помощью меггагеномного подхода путем клонирования в Е. coli генетического материала, содержавшегося в образцах почвы [Gillespie et al., 2002, Handelsman, 2004, Brady et al., 2009]. В НИИНА им. Г.Ф.Гаузе турбомицин и его

производные получены путем химического синтеза, разработаны их водорастворимые соли [Ъаугепоу е( а1., 2010]. Необходимо было установить, обладают ли указанные соединения противогрибковым действием и провести отбор наиболее активных препаратов (табл.7).

Табл.7. Противогрибковая активность солей Производных трис(1 -алкилиндол-3-ил)метилия в сравнении с турбомицином А (1а) и амф В.

в А

№ соеди нения Название соединения МПК, мкг/мл. Тест организм

С. albicans С. humicolus A. niger F.oxysporum

амф В 1 1 1 4

бриллиантовый зеленый 1 2 0,25 1

1а турбомицин А >16 >16 >16 >16

lb метальное производное 1а >16 >16 >16 >16

1с этильное производное 1 а 4 >16 16 >16

Id проглшьное производное 1а 1 2 2 8

le бутильное производное 1а 1 2 1 2

If пентильное производное 1а 1 1 1 2

le гексильное производное 1а 2 2 2 4

lh бензильное производное 1а 2 4 2 4

1¡ децильное производное 1 а >16 >16 >16 >16

lk диметиламинопропильное производное 1а >16 >16 >16 >16

В экспериментах in vitro у солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия - аналогов антибиотика турбомицина А, выявлено выраженное противогрибковое действие зависящее от длины алкильной цепи (сам турбомицин А неактивен) (табл.7). Наиболее активные производные, длина алкильной цепи которых составила С4-С5, не уступают и даже превосходят (If) по своей активности амф В. Они практически не уступают бриллиантовому зеленому, также взятому в качестве препарата сравнения, и являются перспективными соединениями для углубленного изучения in vivo. При изучении производных трисиндолилметана - аналогов антибиотика турбомицина А противогрибковая активность этой группы соединений была выявлена впервые.

В экспериментах с Я. salinarum обнаружено, что ряд солей производных трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия обладают способностью к подавлению роста этой тест-культуры. Наиболее сильно рост Я. salinarum подавляли соединения le и If (МПК 8 мкг/мл). В отличие от ловастатина, подавление роста Я. salinarum, вызванное солями трисиндолилметилия, не снималось, а в случае соединений le и If даже усиливалось в

X- = MeS03- Для lk:

х=сг

присутствии мевалоновой кислоты. Полученные результаты позволили выдвинуть предположение о наличии у этих веществ противоопухолевого действия.

Изучение действия производных трисиндолилметилия на различные линии опухолевых клеток, проведенное в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН РАН в лаборатории проф. В.М.Бухмана, выявило корреляцию, совпадающую с действием на грибные культуры, свидетельствующую об общности механизмов цитотоксичности указанных соединений для клеток про- и эукариот. В экспериментах на мышах показано противоопухолевое действие соединения lf in vivo.

Таким образом, противоопухолевое действие солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия, предстказанное на основании результатов, полученных в бактериальном тесте Я. salinarum, нашло свое подтверждение, а сам тест продемонстрировал свою пригодность к поиску противоопухолевых антибиотиков.

Заключение

В настоящем исследовании проведен поиск биологически активных соединений среди микробных метаболитов, а также полусинтетических антибиотиков (полиены, олигомицины) и соединений, получаемых путем полного химического синтеза (аналоги антибиотика турбомицина).

Для повышения эффективности поисковых исследований предложены новые подходы, направленные на усовершенствование методов работы с микробными продуцентами и образуемыми ими микробными метаболитами, разработаны новые модели поиска ИБС, основанные на использовании микробных культур и линий клеток млекопитающих. Одна из предложенных моделей (Я. salinarum) позволяет проводить также поиск противоопухолевых соединений, как среди микробных метаболитов, так и среди препаратов, получаемых химическим синтезом, что показано на примере трисиндолилметанов. Все оригинальные микробные модели разработаны в варианте микрометодов, что позволяет резко интенсифицировать проведение отбора новых препаратов.

В результате широкого поиска ИБС среди природных метаболитов показано, что отобранные ИБС отличаются большим разнообразием по химической структуре и механизму действия. Выявлены препараты, обладающие выраженным гиполипидемическим действием.

Среди микроорганизмов, способных синтезировать ИБС, до 35-43% штаммов образуют ингибиторы ранних этапов мевалонатного синтеза, Актиномицеты, обладающие такой способностью, прежде были не известны.

Отдельные препараты проявили значительную противогрибковую активность. Наиболее высокой она оказалась у препарата 4883, отнесенного к группе антибиотика ирумамицина.

Изучение противогрибковых антибиотиков среди производных полиенов,

олигомицинов, а также солей трисиндолилметилия - аналогов антибиотика турбомицина, позволило выявить закономерности "структура-активность", и провести направленную химическую модификацию этих препаратов. В результате получены антибиотики, превосходящие по своей активности in vitro и in vivo амф В.

Проведенные исследования позволяют заключить, что в поисковой работе необходим комплексный подход, направленный на проведение анализа свойств микробных продуцентов, совершенствование методов выделения и идентификации образуемых ими вторичных метаболитов, одновременное изучение как химических, так и биологических свойств выделяемых соединений с целью выявления основных закономерностей их механизма действия и взаимосвязи "структура - активность".

ВЫВОДЫ

1. Предложена новая современная методология поиска микробных метаболитов -ИБС, обладающих гиполипидемическим и противогрибковым действием, основанная на использовании оригинальных тест-моделей - микроорганизмов Acremonium fusidioides, Halobacterium salinarum и культур клеток - человеческих злокачественных лимфобластов MOLT-4 и гепатобластомы G2 с обязательным предварительным отбором на начальном этапе микробных метаболитов, обладающих противогрибковой активностью.

2. Разработаны и применены в поисковых исследованиях оригинальные методы работы с культурами продуцентов антибиотиков. Предложен новый подход к "активизации" микробных продуцентов на начальных этапах поиска путем получения, регенерации и УФ-облучения протопластов. Усовершенствованы методы выявления биологически активных микробных метаболитов в культуральной жидкости с применением микро- и ультрафильтрации, скоростного центрифугирования и лиофилизации.

3. На основе созданной схемы изыскания ИБС проведен широкий поиск антибиотиков, обладающих гиполипидемическим и противогрибковым действием, среди различных штаммов грибов и актиномицетов. Установлено, что способностью к образованию ИБС обладают не только несовершенные грибы, но и актиномицеты. Выделены ИБС, принадлежащие к различным классам химических соединений. Изучен механизм действия препаратов, подавляющих как ранние (включая действие ГМГ-КоА редуктазы), так и поздние этапы биосинтеза стеролов.

4. Получены новые сведения о характере гиполипидемического действия антибиотиков аскофуранона и энниатина В. Показано комплексное воздействие аскофуранона на синтез и метаболизм липидов в культуре клеток гепатобластомы G2. Аскофуранон подавляет одновременно синтез холестерина, эфиров холестерина, триглицеридов и фосфолипидов, снижает содержание свободных жирных кислот. Гиполипидемический эффект энниатина В в большей степени связан с подавлением

синтеза эфиров холестерина.

5. Выявлена высокая противогрибковая активность in vitro у антибиотика 4883 (группа ирумамицина), демонстрирующая перспективность его дальнейшего изучения как возможного лекарственного средства.

6. Проведен поиск соединений, обладающих противогрибковым действием, среди полусинтетических производных полиеновых антибиотиков, разработанных на основе генно-модифицированных аналогов нистатина, препаратов группы олигомицина и синтетических производных трисиндолилметана - аналогов антибиотика турбомицина. Для каждой группы антибиотиков выявлены закономерности "структура-активность". Среди полиеновых антибиотиков обнаружены соединения, превосходящие по активности in vitro и in vivo амфотерицин В. Производное ДМАЭ-амид S44HP (2) и препарат его водорастворимой глутаматной соли (2G) отобраны для углубленного доклинического изучения.

7. В экспериментах in vitro у солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия - аналогов антибиотика турбомицина А выявлено выраженное противогрибковое действие, которое зависит от длины алкильной цепи. Производные, длина алкильной цепи которых составляет С4-С5, превосходят по своей активности амфотерицин В и являются перспективными соединениями для углубленного изучения in vivo.

Список опубликованных работ.

1. Trenin A.S. Modern microbiological method in monitoring growth and secondary metabolism of microbial strains. // 7-th Intern. Congress on Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology, 12-15 Sept. 1993. - London - Great Britain, 1993.-Abstr.P.43.

2. Тренин A.C. Быстрые методы и автоматизация в микробиологии и иммунологии // Антибиотики и химиотерапия. - 1994. т.39. - №9-10. - с.59-62.

3. Trenin A.S., Tostykh I.V., Zenkova V.A., Terekhova L.P., Galatenko О.A. Actinomycetes as possible producers of inhibitors of cholesterol synthesis. // Theses of the 9-th International Symposium on the Biology of Actinomycetes, 10-15 July 1994. -Moscow, 1994.-P.171.

4. Trenin A.S. Automation of microbiological methods in screening of Actinomycetes producing biologically active substances. // Theses of the 9-th International Symposium on the Biology of Actinomycetes, 10-15 July 1994. -Moscow, 1994. -P.172.

5. Trenin A.S., Laiko A.V., Fedorova G.B. UV-irradiation and regeneration of protoplasts of Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini for increasing of eremomycin production. // Theses of the 9-th International Symposium on the Biology of Actinomycetes, 10-15 July 1994. - Moscow, 1994. - P.193.

6. Trenin A.S. Microbial test system for screening of secondary metabolites inhibiting cholesterol biosynthesis. // International Conference on Microbial Secondary Metabolism, 5-8 Oct. 1994. - Interlaken, 1994. - Abstr. P.4.

7. Тренин A.C. Проблемы микробного вторичного метаболизма на международной конференции в г. Интерлакине (Швейцария) // Антибиотики и химиотерапия. -1995. т.40. - №3. - С.57-62.

8. Тренин A.C., Терехова Л.П., Толстых И.В., Зенкова В.А., Федорова Г.Б., Катруха Г.С., Косых В.А. Новый микробный продуцент антибиотика аскофуранона, обладающего гиполипидемическим действием. // Липопротеиды и атеросклероз: Тез. докл. симпозиума. - С-Пб., 1995. - С. 110.

9. Тренин A.C. Резистентность к гликопептидным антибиотикам // Антибиотики и химиотерапия. - 1996, т.41. - №5. - С.49-60.

10. Тренин A.C., Олсуфьева Е.А. Механизм резистентности к гликопептидным антибиотикам как основа создания новых производных, способных к преодолению резистентности // Биоорганическая химия. - 1997. т.23. - №11. -С.851-867.

11. Терехова JUT., Тренин A.C., Озерская С.М., Руденская Ю.А., Максимова Т.С., Катруха Г.С., Толстых И.В., Зенкова В.А., Федорова Г.Б., Потапова Н.П., Косых В.А. Образование аскофуранона культурой гриба Paecilomyces variotii Bainier 199 // Микробиология. - 1997. т.66. - №5. - С.611-615.

12. Катруха Г.С., Тренин A.C., Толстых И.В., Жухлистова Н.Е., Зенкова В.А., Куляева В.В'. Вторичные микробные метаболиты, обладающие гиполипидемическими свойствами: выделение, структура и биологические свойства. // Тез. докл. 2-го съезда биохимического общества РАН, 19-23 мая 1997г., Москва. -М., 1997. - ч.2. - с.435-436.

13. Тренин A.C., Катруха Г.С. Антибиотики - ингибиторы биосинтеза холестерина // Хим.-фарм. ж-л. - 1997. т.31. - №9. - с.5-16.

14. Тренин A.C. Вторичные метаболиты грибов - ингибиторы биосинтеза стеролов // Прикладная биохимия и микробиология. - 1998. т.34. - №2. - с.131-138.

15. Катруха Г.С., Толстых И.В., Жухлистова Н.Е., Зенкова В.А., Куляева В.В., Тренин A.C. Потенциальные средства лечения и профилактики атеросклероза на основе вторичных микробных метаболитов. // Тез. докл. I Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, посвященной 100-летию со дня рождения А.Л.Мясникова, 8-9 июня 1999г., Москва. -М., 1999. - с.151-152.

16. Тренин A.C., Цвигун Е.А., Терехова Л.П., Толстых И.В., Зенкова В.А., Катруха Г.С. Микробные модели в поиске ингибиторов биосинтеза атеросклероза. // Тез. докл. 1 Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, посвященной 100-летию со дня рождения А.Л.Мясникова, 8-9 июня 1999г., Москва. - М., 1999. -с. 167.

17. Леонтьева О.В., Тренин A.C., Бухман В.М., Дудник Ю.В. Цитотоксичность мевалоната, ловастатина и карминомицина в отношении человеческих злокачественных Т-лимфобластов MOLT-4 in vitro // Антибиотики и химиотерапия. - 1999. т.44. -№2. - с. 13-18.

18. Тренин A.C. Гиполипидемическое действие аскофуранона в культуре клеток гепатобластомы G2 // Антибиотики и химиотерапия. - 1999. т.44. - №9. - с.7-9.

19. Тренин A.C., Толстых И.В., Терехова Л.П., Зенкова В.А., Макарова М.О., Гладких Е.Г., Бычкова О.П., Катруха Г.С., Дудник Ю.В. Гиполипидемическое

действие антибиотика 86/88 (энниатина В) в культуре клеток гепатобласгомы G2 // Антибиотики и химиотерапия. - 2000. т.45. - №4 - с.6-9.

20. Тренин A.C., Федорова Г.Б., Лайко A.B., Дудник Ю.В. Увеличение продукции эремомицина в результате регенерации и УФ-облучения протопластов Amycolalopsis orientalis subsp. eremomycini // Антибиотики и химиотерапия. -2001. Т.46. -№3 -с.6-11.

21. Тренин A.C., Терехова Л.П., Толстых И.В., Зенкова В.А., Федорова Г.Б., Катруха Г.С. Отбор микробных вторичных метаболитов - ингибиторов биосинтеза холестерина с помощью культуры клеток гепатобласгомы G2 И Антибиотики и химиотерапия. - 2003. Т.48. - №1. - с.3-8.

22. Тренин A.C. Твердофазная система РНК-зависимой ДНК-полимеразы в поиске антибиотиков - потенциальных ингибиторов ВИЧ. // Биотехнология и современность: Тез. докл. 6-го международного форума, 1-2 июня 2005, Санкт-Петербург. - С-Пб., 2005. - с.39-40.

23. Тренин A.C., Дудник Ю.В. Твердофазная система РНК-зависимой ДНК-полимеразы в поиске антибиотиков - потенциальных ингибиторов ВИЧ // Антибиотики и химиотерапия. - 2005. т.50. -№10-11, с.4-12.

24. Терехова Л.П., Галатенко O.A., Тренин A.C., Толстых И.В., Зенкова В.А.,. Жухлистова Н.Е, Ольховатова О.Л., Малкина Н.Д., Бойкова Ю.В., Устинова Е.В., Катруха Г.С. Выделение и изучение антибиотика ИНА-1132 (хлоротрицина), образуемого штаммом Streptomyces baarnensis Ii Антибиотики и химиотерапия. -2008. Т.53.-№7-8-с.3-7.

25. Preobrazhenskaya M.N., Olsufyeva E.N., Solovieva S.E., Tevyashova A.N., Reznikova M.I., Luzikov Y.N.,. Terekhova L.P., Trenin A.S., Galatenko O.A., Treshalin I.D., Mirchink E.P., Bukhman V.M., Sletta H„ Zotchev S.B. Chemical modification and biological evaluation of new semi-synthetic derivatives of 28, 29-didehydro nystatin Al (S44HP), a genetically engineered anti-fungal polyene macrolide antibiotic // Journal of Medicinal Chemistry. -2009. v.52. -N.l. - P.189-196.

26. Тренин A.C., Зотчев С.Б. , Олсуфьева E.H., Тевяшова А.Н., Соловьева С.Е., Принцевская С.С., Галатенко O.A., Преображенская М.Н. Новые противогрибковые антибиотики, полученные на основе химической модификации полиеновых макролидов: отбор и изучение взаимосвязи структура - активность. // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Тез. 5-го Московского международного Конгресса 16-20 марта 2009. - М., 2009. - ч.1. - с.86.

27. Принцевская С.С., Соловьева С.Е., Тевяшова А.Н., Тренин A.C., Олсуфьева E.H., Зотчев С.Б., Преображенская М.Н. Двойная химическая модификация генноинженерного полиенового макролида - попытка улучшения свойств противогрибкового препарата. // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Тез. 5-го Московского международного Конгресса 16-20 марта 2009. -М., 2009. - ч.1.-С.191.

28. Тевяшова А.Н., Соловьева С.Е., Олсуфьева E.H., Тренин A.C., Галатенко O.A., Зотчев С.Б., Преображенская М.Н. Химическая модификация генно-инженерных полиеновых макролидов - новый путь получения более эффективных противогрибковых препаратов. // Биотехнология: состояние и перспективы

развития: Тез. 5-го Московского международного Конгресса 16-20 марта 2009. -М.,2009.-Ч.1.-С.211.

29. Тренин A.C., Зотчев С.Б., Олсуфьева E.H., Тевяшова А.Н., Соловьева С.Е., Принцевская С.С., Галагенко O.A., Преображенская М.Н. Создание новых противогрибковых препаратов на основе химической трансформации антибиотиков-макролидов, полученных генно-инженерной модификацией нистатина. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. Межд. научно-практич. реценз. ж-л. Труды междисципл. микол. форума, раздел: Перспективные антимикотики и фунгициды. -2009. - №2. - с.155-156.

30. Тренин A.C., Соболева Н.Ю., Автономова A.B., Цвигун Е.А., Федорова Г.Б., Катруха Г.С., Исакова Е.Б., Бухман В.М., Краснопольская JI.M. Анализ антибиотических свойств штаммов Lentinus edodes: Выявление антимикробной, гиполипидемической и противоопухолевой активности. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. Межд. научно-практич. реценз. ж-л. Труды междисципл. микол. форума, раздел: Новые грибные биотехнологии в медицине и народном хозяйстве. - 2009. - №2.-- с.216-217.

31. Preobrazhenskaya M.N., Olsufyeva E.N., Tevyashova A.N., Printsevskaya S.S., Solovieva S.E., Reznikova M.I., Trenin A.S., Galatenko O.A., Treshalin I.D., Pereverzeva E R., Mirchink E.P., Zotchev S.B.. Synthesis and study of the antiftmgal activity of new mono- and di-substituted derivatives of a genetically engineered polyene antibiotic 28, 29-didehydro nystatin Al (S44HP) // J. Antibiot (Tokyo). - 2010. V.63. -N.2 - P.55-64.

32. Тренин A.C., Лавренов C.H., Преображенская М.Н. Фунгицидное действие новых производных трииндолилметана: роль n-алкильных заместителей в проявлении активности препаратов. Иммунопатология, аллергология, инфектология. Межд. научно-практич. реценз. ж-л. Труды междисципл. микол. форума, раздел: Новые антимикотики и перспективные фунгициды - 2010. - №1. - с.229.

33. Тренин A.C., Цвигун Е.А., Соболева Н.Ю., Автономова A.B., Краснопольская Л.М. Антимикробная и гиполипидемическая активность штаммов Lentinus edodes и Ganoderma lucidum. Иммунопатология, аллергология, инфектология. Межд. научно-практич. реценз. ж-л. Труды междисципл. микол. форума, раздел: Грибные биотехнологии в медицине и промышленности. -2010. - №1. - с.270.

34. Степанова Е.В., Штиль A.A., Лавренов С.Н., Бухман В.М., Иншаков А.Н., Мирчинк Е.П., Тренин A.C., Галатенко O.A., Исакова Е.Б., Глазунова В.А., Деженкова Л.Г., Соломко Э.Ш., Быков Е.Е., Преображенская М.Н.. Соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия - новый класс противоопухолевых соединений // Известия Академии наук. Серия химическая. - 2010. - №12. - с.1-9.

35. Преображенская М.Н., Лавренов С.Н., Мирчинк Е.П., Тренин A.C. Замещенные в индольном ядре производные трииндолилметанов, способ их получения и их антибактериальная и противогрибковая активность // Патент РФ № 2388749 на изобретение от 10 мая 2010 г.

36. Кубанова A.A., Степанова Ж.В., Гуськова Т.А., Пушкина Т.В., Крылова Л.Ю., Шилова И.Б., Тренин A.C.. Методические указания по изучению противогрибковой активности фармакологических веществ. 2011. (в печати).

Подписано в печать: 25.01.2012 Объем: 2,5 усл.п.л. Тираж: 150 экз. Заказ № 25 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Страстной бульвар, д. 6, стр. 1 (495) 978-43-34; www.reglet.ru

Оглавление диссертации Тренин, Алексей Сергеевич :: 2012 :: Москва

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Микробный вторичный метаболизм и поиск биологически активных соединений.

Микробные метаболиты - ингибиторы биосинтеза стеролов (ИБС), их химическое разнообразие, особенности механизма действия.

Современные возможности противогрибковой терапии, основные направления в создании новых препаратов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Разработка методов поиска микробных метаболитов - ИБС и других биологически активных соединений.

1.1. Создание модели поиска на основе грибной культуры Асгетопшт иь idioid.es.

1.2. Бактериальная культура На1оЬас1ег'шт заИпагит как модель поиска ИБС.

1.3. Выявление гиполипидемической активности с использованием культуры человеческих злокачественных лимфобластов МОЕТ-4.

1.4. Оценка гиполипидемического действия и отбор активных соединений с использованием культуры клеток гепатобластомы в2.

1.5. Новые подходы к работе с микроорганизмами — продуцентами и продуктами их жизнедеятельности, стимуляция продуцентов к образованию биологически активных метаболитов.

Введение диссертации по теме "Химиотерапия и антибиотики", Тренин, Алексей Сергеевич, автореферат

Актуальность проблемы.

Инфекционные заболевания, по-прежнему, остаются угрозой, являясь основной причиной смертности в развивающихся странах и серьезной проблемой для передовых стран [Jones et al., 2011]. Ухудшение экологической обстановки, эпидемия ВИЧ, широкое использование трансплантационной и противораковой терапии, рост числа хирургических вмешательств, широкое и необоснованное использование антибиотиков приводит к появлению заболеваний, с трудом поддающихся лечению существующими лекарственными препаратами [Monnet et al., 2010, Livermore, 2011]. Лекарственная устойчивость становится одной из основных проблем современной медицины [Magiorakos et al., 2009, 2011].

Наблюдается стремительный рост заболеваемости глубокими (инвазивными) микозами, протекающими крайне тяжело и характеризующимися высокой смертностью [Blyth et al., 2010]. Противогрибковых препаратов относительно немного и они, как правило, высокотоксичны. Необходимы новые более совершенные противогрибковые антибиотики [Ruiz-Camps, Cuenca-Estrella, 2009, Thompson et al., 2009].

Актуальной и нерешенной до сих пор проблемой здравоохранения являются сердечно-сосудистые заболевания на почве атеросклероза [Thompson et al., 2010], борьба с которыми в последнее время стала более эффективной благодаря применению ингибиторов биосинтеза холестерина [Corsini, Ceska, 2011]. Создаваемые на основе микробных биологически активных продуктов, эти препараты нередко обладают также способностью к противоопухолевому и противогрибковому действию [Gauthaman et al., 2009, Soeda et al., 201 1].

Несмотря на ведущийся в развитых странах широкий скрининг антибиотиков, число новых препаратов, прошедших всесторонние испытания и рекомендованных к клиническому использованию, с каждым десятилетием снижается [Berdy, 2005, Demain, Sanchez, 2009, Freire-Moran et al., 2011]. Существующие подходы трудоемки и не позволяют обеспечить должной эффективности поисковых исследований [Clardy et al., 2009]. Методология поисковых работ нуждается в серьезном усовершенствовании [Coates, Hu, 2007, Clatworthy et al., 2007, Aminov, 2010, Brötz-oesterhelt, Sass, 2010].

Необходим целенаправленный отбор, учитывающий принадлежность препаратов к определенному классу химических соединений, особенности биосинтеза, потенциальную биологическую роль в физиологии микроорганизмов-продуцентов и целый ряд других факторов, способных кардинальным образом влиять на эффективность и конечный результат поиска [Сазыкин и др., 2002, Koehn, 2008, Schopfer et al., 2009].

Факторы, заложенные в методологию поиска, неравноценны и обладают разной значимостью на различных этапах исследования [Singh, Pelaez, 2008, Zanella et al., 2010].

Поиск и ранняя идентификация природных соединений, ориентированные на химические характеристики препаратов, их принадлежность к определенным, заранее намеченным классам химических соединений, т.е. проведение т.н. "химического" скрининга [Berrue et al., 2011], существенно повышают эффективность поисковых работ, однако в наибольшей степени проявляют себя в поиске аналогов уже известных препаратов [Blondelle, Lohner, 2010].

Для эффективного обнаружения принципиально новых биологически активных соединений, необходим подход, направленный в первую очередь на выявление их биологической активности. Поиск новых антибиотиков, ориентированный на механизм действия отбираемых соединений, широко используется в мировой практике, приносит успех, позволяет создавать лекарственные препараты, становящиеся родоначальниками новых классов биологически активных соединений (противоопухолевые антибиотики, антибиотики-иммуномодуляторы, гиполипидемические препараты и др.) [Demain, Sanchez, 2009, Donadío et al., 2010a, Ь].

Эффективный поиск, направленный на выявление биологической активности соединений, возможен лишь при наличии в практике лаборатории соответствующих биологических и биохимических моделей поиска. От их чувствительности, надежности, пригодности к использованию для анализа биологически активных метаболитов, прошедших лишь начальные этапы химической очистки на ранних этапах поисковых работ, зависит конечный результат исследований - выявление новых биологически активных соединений [Alksne, Dunman, 2008].

Поскольку практически невозможно создание единого универсального теста, отвечающего одновременно всем критериям, модели разрабатываются для каждой конкретной, отличной от других по механизму действия, группы антибиотиков. Как правило, требуется создание комплекса тестов, обладающих разной эффективностью на разных этапах поиска, и разработка наиболее эффективной схемы их применения.

Новая методология поиска, подразумевающая разработку современных тестов и создание рациональной схемы их использования, а также изучение биологически активных соединений, получаемых путем направленной химической трансформации генно-инженерных производных антибиотиков, могут повысить эффективность поисковых работ и обеспечить создание новых лекарственных препаратов.

Все вышеизложенное определило актуальность исследования, его цели и задачи.

Цель работы. Целью настоящего исследования является разработка новой методологии поиска биологически активных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов (ИБС) и новых противогрибковых антибиотиков, проведение поиска, изучение физико-химических и биологических свойств полученных препаратов.

Основные задачи исследования;

• Разработать новые методы поиска ИБС, основанные на использовании микробных культур и линий клеток млекопитающих, разработать модели, пригодные к использованию на различных этапах поисковых работ.

• Изучить возможность использования в поисковых исследованиях различных способов "активизации" микробных продуцентов с целью усиления их способности к образованию антибиотиков и определить возможность применения дополнительных способов очистки микробных метаболитов для быстрого тестирования в биологических и биохимических тестах.

• На основе использования новых оригинальных моделей разработать схему поиска микробных метаболитов, обладающих гиполипидемическим и противогрибковым действием и провести широкий поиск таких метаболитов среди продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, изучить способность к образованию ИБС у актиномицетов.

• Провести выделение, очистку и химическую идентификацию выявленных биологически активных соединений, изучить их механизм действия.

• Провести поиск соединений, обладающих выраженной противогрибковой активностью, среди производных полиеновых антибиотиков, препаратов группы олигомицина, а также производных трисиндолилметана - аналогов антибиотика турбомицина. В экспериментах in vitro изучить их противогрибковое действие.

Научная новизна работы.

Впервые предложен новый методологический подход для поиска ИБС, основанный на использовании оригинальных специально разработанных микробных моделей - бактериальной культуры На1оЬас(егшт заЛпагит и грибной культуры Асгетотит а также культур клеток млекопитающих - человеческих злокачественных лимфобластов МОЬТ-4 и клеток гепатобластомы 02. Разработанные модели предложены в виде микрометодов и применимы на начальных этапах поисковых работ. Микробные модели использованы в модификации, позволяющей проводить поиск ингибиторов, как ранних, так и поздних этапов биосинтеза стеролов.

Впервые создана схема поиска ИБС, основанная на применении оригинальных моделей поиска, с обязательным отбором на начальном этапе микробных метаболитов, обладающих противогрибковой активностью.

Впервые предложена "активизация" микробных продуцентов путем получения, регенерации и УФ-облучения протопластов на начальных этапах поиска. Метод рекомендован главным образом для культур с затрудненным спорообразованием.

Впервые изучены отдельные аспекты механизма действия ИБС, полученных в НИИНА им. Г.Ф.Гаузе, в том числе антибиотиков №№ 199 (аскофуранон), 86 (энниатин В) и 1132 (хлоротрицин). Показано комплексное воздействие аскофуранона на синтез и метаболизм липидов в клетке: одновременное подавление синтеза холестерина, эфиров холестерина, триглицеридов, и фосфолипидов, снижение содержания свободных жирных кислот. Наибольший гиполипидемический эффект энниатина В связан с подавлением синтеза эфиров холестерина.

Впервые в экспериментах in vitro изучена противогрибковая активность новых полусинтетических производных полиеновых антибиотиков, препаратов группы олигомицина и синтетических производных трисиндолилметана -аналогов антибиотика турбомицина. В каждой группе антибиотиков выявлены закономерности "структура-активность".

Впервые в экспериментах in vitro у солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия аналогов антибиотика турбомицина А выявлено выраженное противогрибковое действие. Показано, что введение алкильных заместителей и длина углеродных цепей играют ключевую роль в достижении наивысшей активности этих соединений.

Научно-практическое значение.

Выделены и изучены микробные метаболиты - ИБС, обладающие гиполипидемическим и противогрибковым действием, принадлежащие к различным классам химических соединений. Выявлены препараты, подавляющие ранние (включая действие ГМГ-КоА редуктазы) и поздние этапы биосинтеза стеролов.

Получены новые сведения о гиполипидемическом действии аскофуранона и энниатина В. В микробных моделях показана способность антибиотика 1709 к подавлению ранних (включая действие ГМГ-КоА редуктазы), а у антибиотика 1132 (хлоротрицин) поздних этапов биосинтеза стеролов.

Выявлена высокая противогрибковая активность антибиотика 4883 (группа ирумамицина), позволяющая рассматривать этот препарат в качестве перспективного противогрибкового лекарственного средства.

В экспериментах in vitro изучена противогрибковая активность свыше 60 производных полиеновых антибиотиков. Выявленные закономерности "структура-активность", позволили осуществить направленную химическую трансформацию препаратов. Получены соединения, превосходящие по своей активности в опытах in vitro и in vivo известный противогрибковый препарат амфотерицин В. ДМАЭ-амид S44HP (2) и его водорастворимая глутаматная соль (2G) отобраны для углубленного доклинического изучения.

В экспериментах in vitro у солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия -аналогов антибиотика турбомицина А выявлено выраженное противогрибковое действие. Наиболее активные производные, длина алкильной цепи которых составляет С4-С5, превосходят по своей активности амфотерицин В.

Получен патент "Замещенные в индольном ядре производные трииндолилметанов, способ их получения и их антибактериальная и противогрибковая активность"; Патент № 2388749 на изобретение; Зарегистрирован в РФ 10 мая 2010.

Подготовлены Методические указания по изучению противогрибковой активности фармакологических веществ (2011г., в печати).

Апробация диссертации.

Основные положения диссертации доложены на конференции "Мембранные процессы в биотехнологии, медицине и пищевой промышленности" (Москва, 1991), на 7-м Международном конгрессе "Быстрые методы и автоматизация в микробиологии и иммунологии" (Лондон, 1993), на 9-м международном симпозиуме "Биология актиномицетов" (Москва, 1994 г.), на Международной конференции "Микробный вторичный метаболизм" (Швейцария, Интерлакен, 1994), на симпозиуме "Липопротеиды и атеросклероз", С-Петербург, 1995), на 2-м съезде Биохимического общества РАН (Москва, 1997), на 1-ой Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, посвященной 100-летию со дня рождения А.Л.Мясникова (Москва, 1999), на 6-м Международном форуме "Биотехнология и современность", С-Петербург, 2005), на 5-м Московского международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), на междисциплинароном микологическом форуме (Москва, 2009, 2010), Российско-Индийском симпозиуме по гликопептидным антибиотикам (Москва, 2011).

Список опубликованных работ.

9. Тренин A.C. Резистентность к гликопептидным антибиотикам // Антибиотики и химиотерапия. - 1996, т.41. - №5. - С.49-60.

11. Терехова Л.П., Тренин A.C., Озерская С.М., Руденская Ю.А., Максимова Т.С., Катруха Г.С., Толстых И.В., Зенкова В.А., Федорова Г.Б., Потапова Н.П., Косых В.А. Образование аскофуранона культурой гриба Paecilomyces variotii Bainier 199 //Микробиология. - 1997. т.66. - №5. - С.611-615.

12. Катруха Г.С., Тренин A.C., Толстых И.В., Жухлистова Н.Е., Зенкова В.А., Куляева В.В. Вторичные микробные метаболиты, обладающие гиполипидемическими свойствами: выделение, структура и биологические свойства. // Тез. докл. 2-го съезда биохимического общества РАН, 19-23 мая 1997г., Москва. - М., 1997. - ч.2. - с.435-436.

13. Тренин A.C., Катруха Г.С. Антибиотики - ингибиторы биосинтеза холестерина // Хим.-фарм. ж-л. - 1997. т.31. - №9. - с.5-16.

15. Катруха Г.С., Толстых И.В., Жухлистова Н.Е., Зенкова В.А., Куляева В.В., Тренин A.C. Потенциальные средства лечения и профилактики атеросклероза на основе вторичных микробных метаболитов. // Тез. докл. 1 Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, посвященной 100-летию со дня рождения А.Л.Мясникова, 8-9 июня 1999г., Москва. - М., 1999. - сЛ 51-152.

16. Тренин A.C., Цвигун Е.А., Терехова Л.П., Толстых И.В., Зенкова В.А., Катруха Г.С. Микробные модели в поиске ингибиторов биосинтеза атеросклероза. // Тез. докл. 1 Всероссийской конференции по проблемам атеросклероза, посвященной 100-летию со дня рождения А.Л.Мясникова, 89 июня 1999г., Москва. -М., 1999.-с. 167.

19. Тренин A.C., Толстых И.В., Терехова Л.П., Зенкова В.А., Макарова М.О., Гладких Е.Г., Бычкова О.П., Катруха Г.С., Дудник Ю.В. Гиполипидемическое действие антибиотика 86/88 (энниатина В) в культуре клеток гепатобластомы G2 // Антибиотики и химиотерапия. - 2000. т.45. -№4 - с.6-9.

20. Тренин A.C., Федорова Г.Б., Лайко A.B., Дудник Ю.В. Увеличение продукции эремомицина в результате регенерации и УФ-облучения протопластов Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini II Антибиотики и химиотерапия. - 2001. т.46. - №3 - с.6-11.

21. Тренин A.C., Терехова Л.П., Толстых И.В., Зенкова В.А., Федорова Г.Б., Катруха Г.С. Отбор микробных вторичных метаболитов - ингибиторов биосинтеза холестерина с помощью культуры клеток гепатобластомы G2 // Антибиотики и химиотерапия. - 2003. т.48. - №1. - с.3-8.

22. Тренин А.С. Твердофазная система РНК-зависимой ДНК-полимеразы в поиске антибиотиков - потенциальных ингибиторов ВИЧ. // Биотехнология и современность: Тез. докл. 6-го международного форума, 1-2 июня 2005, Санкт-Петербург. - С-Пб., 2005. - с.39-40.

23. Тренин А.С., Дудник Ю.В. Твердофазная система РНК-зависимой ДНК-полимеразы в поиске антибиотиков - потенциальных ингибиторов ВИЧ // Антибиотики и химиотерапия. - 2005. т.50. -№10-11, с.4-12.

24. Терехова Л.П., Галатенко О.А., Тренин А.С., Толстых И.В., Зенкова В.А.,. Жухлистова Н.Е, Ольховатова О.Л., Малкина Н.Д., Бойкова Ю.В. , Устинова Е.В., Катруха Г.С. Выделение и изучение антибиотика ИНА-1132 (хлоротрицина), образуемого штаммом Streptomyces baarnensis II Антибиотики и химиотерапия. - 2008. т.53. - №7-8 - с.3-7.

25. Preobrazhenskaya M.N., Olsufyeva E.N., Solovieva S.E., Tevyashova A.N., Reznikova M.I., Luzikov Y.N.,. Terekhova L.P., Trenin A.S., Galatenko O.A., Treshalin I.D., Mirchink E.P., Bukhman V.M., Sletta H., Zotchev S.B. Chemical modification and biological evaluation of new semi-synthetic derivatives of 28, 29-didehydro nystatin A1 (S44HP), a genetically engineered anti-fungal polyene macrolide antibiotic // Journal of Medicinal Chemistry. - 2009. v.52. - N.l. -P.189-196.

26. Тренин A.C., Зотчев С.Б. , Олсуфьева Е.Н., Тевяшова А.Н., Соловьева С.Е., Принцевская С.С., Галатенко О.А., Преображенская М.Н. Новые противогрибковые антибиотики, полученные на основе химической модификации полиеновых макролидов: отбор и изучение взаимосвязи структура - активность. // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Тез. 5-го Московского международного Конгресса 16-20 марта

2009.-М., 2009. - ч.1.-С.86.

28. Тевяшова А.Н., Соловьева С.Е., Олсуфьева E.H., Тренин A.C., Галатенко O.A., Зотчев С.Б. , Преображенская М.Н. Химическая модификация генно-инженерных полиеновых макролидов - новый путь получения более эффективных противогрибковых препаратов. // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Тез. 5-го Московского международного Конгресса 16-20 марта 2009. - М., 2009. - ч. 1. - с.211.

29. Тренин A.C., Зотчев С.Б., Олсуфьева E.H., Тевяшова А.Н., Соловьева С.Е., Принцевская С.С., Галатенко O.A., Преображенская М.Н. Создание новых противогрибковых препаратов на основе химической трансформации антибиотиков-макролидов, полученных генно-инженерной модификацией нистатина. // Иммунопатология, аллергология, инфектология. Межд. научно-практич. реценз. ж-л. Труды междисципл. микол. форума, раздел: Перспективные антимикотики и фунгициды. - 2009. - №2. - с. 155-156.

31. Preobrazhenskaya M.N., Olsufyeva E.N., Tevyashova A.N., Printsevskaya S.S., Solovieva S.E., Reznikova M.I., Trenin A.S., Galatenko O.A., Treshalin I.D., Pereverzeva E.R., Mirchink E.P., Zotchev S.B. Synthesis and study of the antifungal activity of new mono- and di-substituted derivatives of a genetically engineered polyene antibiotic 28, 29-didehydro nystatin AI (S44HP) // J. Antibiot (Tokyo). - 2010. V.63. -N.2 - P.55-64.

32. Тренин A.C., Лавренов C.H., Преображенская M.H. Фунгицидное действие новых производных трииндолилметана: роль n-алкильных заместителей в проявлении активности препаратов. Иммунопатология, аллергология, инфектология. Межд. научно-практич. реценз. ж-л. Труды междисципл. микол. форума, раздел: Новые антимикотики и перспективные фунгициды -2010. -№1. -с.229.

34. Степанова Е.В., Штиль A.A., Лавренов С.Н., Бухман В.М., Иншаков А.Н., Мирчинк Е.П., Тренин A.C., Галатенко O.A., Исакова Е.Б., Глазунова В.А., Деженкова Л.Г., Соломко Э.Ш., Быков Е.Е., Преображенская М.Н. Соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия - новый класс противоопухолевых соединений // Известия Академии наук. Серия химическая. - 2010. - №12. -с.1-9.

Патент РФ № 2388749 на изобретение от 10 мая 2010 г. 36. Кубанова A.A., Степанова Ж.В., Гуськова Т.А., Пушкина Т.В., Крылова Л.Ю., Шилова И.Б., Тренин A.C. Методические указания по изучению противогрибковой активности фармакологических веществ. 2011. (в печати).

Внедрение.

Получен патент № 2388749 на изобретение {заявка на патент РФ №2008116170) Преображенская М.Н., Лавренов С.Н., Мирчинк Е.П., Тренин A.C. Замещенные в индольном ядре производные трииндолилметанов, способ их получения и их антибактериальная и противогрибковая активность. Зарегистрирован в РФ 10 мая 2010.

Подготовлены Методические указания по изучению противогрибковой активности фармакологических веществ. (2011г., в печати).

Разработанные модели и схема поиска ИБС внедрены в поисковую работу НИИНА им.Г.Ф.Гаузе.

Объем и структура диссертации.

Заключение диссертационного исследования на тему "Поиск микробных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов и противогрибковых антибиотиков"

ВЫВОДЫ.

1. Предложена новая современная методология поиска микробных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов, обладающих гиполипидемическим и противогрибковым действием, основанная на использовании оригинальных тест-моделей - микроорганизмов Асгетолшт /т1сИо1с1е8, На1оЬас1егшт ьаИпагит и культур клеток - человеческих злокачественных лимфобластов МОЬТ-4 и гепатобластомы 02 с обязательным предварительным отбором на начальном этапе микробных метаболитов, обладающих противогрибковой активностью.

3. На основе созданной схемы изыскания ингибиторов биосинтеза стеролов проведен широкий поиск антибиотиков, обладающих гиполипидемическим и противогрибковым действием, среди различных штаммов грибов и актиномицетов. Установлено, что способностью к образованию ингибиторов биосинтеза стеролов обладают не только несовершенные грибы, но и актиномицеты. Выделены ингибиторы биосинтеза стеролов, принадлежащие к различным классам химических соединений. Изучен механизм действия препаратов, подавляющих как ранние (включая действие ГМГ-КоА редуктазы), так и поздние этапы биосинтеза стеролов.

7. В экспериментах in vitro у солей трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия - аналогов антибиотика турбомицина А выявлено выраженное противогрибковое действие, которое зависит от длины алкильной цепи. Производные, длина алкильной цепи которых составляет С 4—С5, превосходят по своей активности амфотерицин В и являются перспективными соединениями для углубленного изучения in vivo.

Благодарность.

Автор выражает свою искреннюю признательность за проведение совместных исследований: сотрудникам лаборатории таксономического изучения и коллекции культур микроорганизмов НИИНА им.Г.Ф.Гаузе и ее руководителю профессору Л.П.Тереховой за проведение начального этапа отбора ингибиторов биосинтеза стеролов, связанного с выделением культур актиномицетов и плесневых грибов из природных источников, исследованием их культуральных и биохимических свойств, изучением антибиотического спектра; сотрудникам лаборатории биосинтеза биологически активных соединений НИИНА им.Г.Ф.Гаузе и ее руководителю д.б.н. Л.М.Краснопольской за проведение начальных этапов отбора ингибиторов биосинтеза стеролов и противогрибковых антибиотиков, образуемых высшими грибами; сотрудникам лаборатории селекции НИИНА им.Г.Ф.Гаузе и ее руководителю д.б.н. О.А.Лапчинской за изучение физиологии штамма 4883 -продуцента антибиотика ирумамицина и образуемых им биологически активных метаболитов; сотрудникам лаборатории химического изучения биологически активных соединений НИИНА им.Г.Ф.Гаузе и ее руководителю профессору Г.С.Катрухе за проведение химического выделения, очистки и идентификации вторичных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов, а также противогрибковых антибиотиков, изучение их физико-химических свойств и установление химической структуры; сотрудникам лаборатории химиотерапии НИИНА им.Г.Ф.Гаузе и ее руководителю к.м.н. И.Д.Трещалину за изучение токсичности полиеновых антибиотиков и производных трисиндолилметана и изучение их активности in vivo; сотрудникам лаборатории химической трансформации антибиотиков НИИНА им. Г.Ф.Гаузе и ее руководителю профессору М.Н.Преображенской за разработку новых полусинтетических производных, проведение направленной химической трансформации полиеновых антибиотиков, производных олигомицина и трисиндолилметана. профессору В.Н.Даниленко (Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Москва) за проведение биосинтеза и изучение молекулярных основ механизма действия производных олигомицина; профессору В.М.Бухману (РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН РАН, Москва) за изучение противоопухолевого действия производных трисиндолилметана -аналогов антибиотика турбомицина А; профессору А.А.Штилю (РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН РАН, Москва) за изучение механизма гибели клеток и изучение апоптоза, вызываемого производными трисиндолилметана; профессору С.Б.Зотчеву (Норвежский университет, г. Тронхейм) за разработку генно-инженерных производных антибиотиков полиенов, а также фирме Biosergen AS, Норвегия и Норвежскому Совету по науке за поддержку этих исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микроорганизмы являются практически неисчерпаемым источником лекарственных соединений [Сазыкин и др., 2002, Феофилова, 2004, Bérdy, 2005, Clardy et al., 2009]. В процессе поиска и выделения новых микробных вторичных метаболитов удается получать соединения, обладающие принципиально новой химической структурой и механизмом действия [Bérdy, 2005, Clardy et al., 2006, Coates, Hu, 2007, Sunazuka et al., 2008, Genilloud et al., 2011]. Большинство антибиотиков были получены путем выделения микроорганизмов из природных мест обитания, главным образом из почвы, и последующего культивирования в лабораторных условиях с получением целевого продукта [Chu et al., 1996, Clardy et al., 2006, 2009, von Bubnoff, 2006].

Настоящее исследование в значительной степени ориентировано на поиск биологически активных соединений природного происхождения. Выявление новых антибиотиков - ИБС явилось результатом изучения в первую очередь микробных продуцентов, главным образом актиномицетов и несовершенных грибов, свежевыделенных из почвы. Активные штаммы-продуценты были обнаружены также при оценке коллекционных культур высших грибов. Большое внимание уделено отбору высоко активных противогрибковых полусинтетических антибиотиков (полиены, олигомицины), а также синтетических аналогов природного антибиотика турбомицина.

Для повышения эффективности поисковых исследований предложены новые подходы, направленные на усовершенствование методов работы с микробными продуцентами и образуемыми ими микробными метаболитами. Существующие микробиологические методы дополнены новыми современными методами культивирования микробных продуцентов и микробных тест-культур. Предложен новый подход к "активизации" микробных продуцентов путем получения, регенерации и УФ-облучения протопластов. В работе с микробными метаболитами при их выделении из культуральной жидкости химические методы выделения дополнены микро- и ультрафильтрацией, скоростным центрифугированием и лиофилизацией.

Поскольку успешный поиск антибиотиков возможен лишь при условии разработки соответствующих тест-моделей, позволяющих делать корректные выводы о механизме действия испытуемых соединений, представлены новые оригинальные методы поиска микробных метаболитов - ИБС.

В основе биологических моделей такого поиска использованы микробные культуры А. /ш'1с1ю¡с1ез и Н. ьаИпатт и культуры клеток млекопитающих - человеческих злокачественных лимфобластов МОЬТ-4 и гепатобластомы 02. Использование тест-микроорганизма Н. БаИпагит оказалось эффективным для отбора не только ИБС, но также противоопухолевых соединений, причем как среди микробных метаболитов, так и среди препаратов, получаемых химическим синтезом (трисиндолилметаны). Все оригинальные микробные модели разработаны в варианте микрометодов, что позволило резко интенсифицировать проведение отбора.

Ориентация на механизм действия отбираемых соединений, разработка соответствующих моделей поиска и рациональной схемы их применения позволили провести широкий поиск ИБС среди природных метаболитов. Показано, что отобранные ингибиторы отличаются большим разнообразием как по химической структуре, так и по механизму действия. Выявлены ингибиторы с выраженным гиполипидемическим действием.

Существенному повышению эффективности поиска ИБС способствует выявление противогрибковой активности, проводимое на начальном этапе работ. Предварительный отбор штаммов по противогрибковой активности позволил резко повысить вероятность обнаружения ИБС.

Проведенный поиск показал, что способностью к продукции метаболитов - ИБС обладают многие микроорганизмы - плесневые грибы, многие актиномицеты и высшие базидиальные грибы.

Среди микроорганизмов, способных синтезировать ИБС, до 35-43% штаммов образуют ингибиторы ранних этапов мевалонатного синтеза (вплоть до этапа работы ГМГ-КоА редуктазы включительно). Актиномицеты, обладающие такой способностью, прежде были не известны.

Выявленные ИБС обладают разнообразными биологическими свойствами. Некоторые из них представляют интерес в качестве противогрибковых и противоопухолевых средств. Отдельные соединения проявили значительную противогрибковую активность. Наиболее высокой она оказалась у антибиотика 4883, отнесенного к группе ирумамицина.

Полученные сведения свидетельствуют о разнообразии ИБС по химической структуре, механизму действия и источникам их получения. По-видимому, образование ИБС является весьма распространенным свойством в микробном мире.

Изучение противогрибкового действия соединений, полученных химическим путем - химически модифицированных производных полиенов, олигомицинов, а также получаемых полным химическим синтезом солей трисиндолилметилия - аналогов антибиотика турбомицина, позволило выявить строгую взаимосвязь "структура-активность", что способствовало проведению направленной химической модификации этих соединений. В результате получены антибиотики, превосходящие по своей активности in vitro и in vivo амфотерицин В. В классе производных трисиндолилметана противогрибковая активность была выявлена впервые.

Проведенные исследования продемонстрировали, что наилучшим для достижения позитивных результатов в поисковой работе является комплексный подход, направленный на проведение всестороннего анализа свойств микробных продуцентов, совершенствование методов выделения и идентификации образуемых ими вторичных метаболитов, а также одновременное изучение их химических и биологических свойств с целью выявления основных закономерностей механизма действия и взаимосвязи "структура - активность".

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2012 года, Тренин, Алексей Сергеевич

1. Автономова A.B., Краснопольская Л.М., Максимов В.Н. Оптимизация состава питательной среды для погружённого культивирования Ganoderma lucidum(Curt.:Fr.)P.Karst // Микробиология. 2006. т.75. - №2. - С. 186-192.

2. Баранова, H.A.; Крейер, В.Г.; Ландау, Н.С.; Егоров, Н.С. Метаболиты микромицетов ингибиторы роста и биосинтеза стеринов у дрожжей // Антибиотики и химиотерапия. - 2002. т.47. - №1. - С.3-6.

3. Бибикова М.В. Статины. Применение и перспективы // Фармацевтический вестник. 2003. - №4. - С.30.

4. Бибикова М.В., Бондарева Н.С. Препараты микробного происхождения для лечения атеросклероза // Антибиотики и химиотерапия. 1998. т.43. - №8. -С.34-39.

5. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Катлинский A.B. и др. Влияние природных гиполипидемических соединений на формирование биоплёнок штаммами рода Pseudomonas // Антибиотики и химиотерапия. 2009. т.54. -№1-2. - С.10-13. (а)

6. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Катлинский A.B., Пужевская Т.О. Продуценты гиполипидемических соединений с антиоксидантной активностью // Антибиотики и химиотерапия. 2009. т.54. - №7-8. - С.3-7. (Ь)

7. Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э., Тертов В.В. и др. Отбор природных иммуносупрессоров по способности к модификации синтеза стеролов клетками гепатоцитов // Антибиотики и химиотерапия. 2003. т.48. - №8. -С.3-6.

8. Бибикова М.В., Носик Д.Н., Лобыч O.A. и др. Влияние природных гиполипидемических соединений на вирус иммунодефицита человека // Антибиотики и химиотерапия. 2004. т.49. - №1. - С. 14-16. (а)

9. Бибикова М.В., Рыбакова A.M., Востров С.Н. и др. Система поиска природных иммуносупрессоров // Антибиотики и химиотерапия. 1991. -т.36. - №3. -С. 17-20.

10. Ю.Бибикова М.В., Чмель Я.В., Спиридонова И.А., Катлинский A.B.

11. Бухман В.М., Трещалина Е.М., Краснопольская Л.М. и др. Получение и биологические свойства водных экстрактов и их композиций из мицелия базидиомицетов // Антибиотики и химиотерапия. 2007. т. 52. - №1-2. -С.4-9.

12. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А. и др. Определитель актиномицетов: роды Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia. М.: Наука, 1983.-246 с.

13. И.Гейл Э., Кандлифф Э., Рейнолдс П., Ричмонд М., Уоринг М. Молекулярные основы действия антибиотиков. М.: Мир, 1975. - 500 с.

14. Грацианский H.A. Статины как противовоспалительные средства // Кардиология. 2001. - №12. - С. 14-26.

15. Грацианский Н. А. Уроки церивастатина и результаты исследования "Защита сердца" // Consilium medicum. 2003. - № 3. - С. 139-143.

16. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: Изд. МГУ, 2005. - 600 с.

17. Егоров Н.С., Баранова H.A., Крейер В.Г. Микробные ингибиторы ферментов биосинтеза и этерификации холестерина // Антибиотики и химиотерапия. -1999. т.44. № 5. - С.38-43.

18. Ершов Ю. В. Метилэритритолфосфатный (немевалонатный) путь биосинтеза изопреноидов. // Успехи биологической химии. 2005. - т. 45. - С.307—354.

19. Ершов Ю. В. 2-с-метилэритритфосфатный путь биосинтеза изопреноидов как мишень при поиске новых антибиотиков, гербицидов и иммуномодуляторов (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. -2007. т.43. № 2. - С.133-157.

20. Жукова P.A., Коммунарская А.Д., Пронина М.И. и др. Методы селекции продуцентов антибиотиков и ферментов Л.: Медицина, 1978. - 160 с.

21. Захарова Т.М., Белова Т.С., Даниленко В.Н. Изучение влияния протопластирования на антибиотическую активность продуцента эритромицина // Антибиотики и химиотерапия. 1990. т.35. - №1. - С.3-4.

22. Исаева Л.М., Воейкова Т.А. Разработка системы протопластирования у штаммов Streptomyces aureofaciens продуцентов хлортетрациклина // Антибиотики и химиотерапия. - 1990. т.35. - №12. - С.26-29.

23. Катлинский A.B., Сазыкин Ю.О., Бибикова М.В., Орехов С.Н. Антифунгальные агенты. Новые предпосылки их создания и новые трудности // Антибиотики и химиотерапия. 2003. т.48. - №9 - С.20-27.

24. Климов А.Н. К патогенезу атеросклероза. //В кн.: «Атеросклероз. Проблемы патогенеза и терапии» А.Н. Климов, Е.В. Шляхто. С-Пб.: Медицинская литература, 2006. - 248 с.

25. Климов А. Н., Нагорнев В. А. Взгляд на решение проблемы атеросклероза // Вестник Российской Академии медицинских наук. 1999. - №9. - С.33-37.

26. КлимовА.Н., Нагорнев В.А. Эволюция холестериновой концепции атерогене за: от Аничкова до наших дней // Медицинский Академический журнал -2001. т.1. №3 - С.23-32.

27. Крейер В.Г., Выборных С.Н., Баранова H.A., Егоров Н.С. Влияние ловастатина на синтез стеринов и резистентность дрожжей к полиеновым антибиотикам// Антибиотики и химиотерапия. 1993. т.38. - №10. - С. 16-19.

28. Ландау К.С., Баранова H.A., Крейер В.Г. и др. Действие ловастатина ингибитора синтеза стеринов на рост дрожжей // Микробиология. 1991. т. 60. - №3.-С.479-484.

29. Ланчини Д., Паренти Ф. Антибиотики. М.: Мир, 1985. - 272 с.

30. Лаврентьева Г.И., Овсянко A.B. Использование метода протопластирования в селекции продуцента олеандомицина // Антибиотики и химиотерапия. -1990. т.35. №4. - С. 17-20.

31. Ломовская Н.Д. Генетика актиномицетов рода Streptomyces продуцентов биологически активных веществ. // В кн.: «Генетика промышленных микроорганизмов и биотехнология» - М.: Наука, 1990. - С.35-62.

32. Люцканова Д.Г., Стоилова-Дишева М.М., Пелтекова В.Т. Увеличение продукции тилозина у производственного штамма Streptomyces fradiae II Прикладная биохимия и микробиология. 2005. т. 41. - № 2. - С. 189-193.

33. Маланичева И.А., Козьмян Л.И., Белова А.Ю., Дудник Ю.В. Использование метода слияния и регенерации протопластов для поиска продуцентов антибиотиков среди неактивных штаммов стрептомицетов // Антибиотики и химиотерапия. 1993. т.38. - №6. - С.8-11.

34. Маланичева И.А., Козьмян Л.И., Дудник Ю.В. и др. Слияние протопластов штаммов Streptomyces fradiae, продуцентов неомицина и тилозина // Антибиотики и химиотерапия. 1992. т.37. - №10. - С.3-7. (Ь)

35. Потапов В.Д., Бахтеева И.В., Борзенков В. Н. и др. Действие фосмидомицина на развитие некоторых инфекций у мышей // Антибиотики и химиотерапия. 2003. т.48. - №2. - С.9-12.

36. Репин B.C., Смирнов В.Н. Фундаментальные науки против атеросклероза. -М., 1989.- 79 с.

37. Сазыкин Ю.О., Бибикова М.В., Грамматикова Н.Э. и др. Механизм биологической активности макролидных антибиотиков — ингибиторов FoFl-АТФазы // Антибиотики и химиотерапия. 2003. т.48. -№12. - С.33-39.

38. Сазыкин Ю.О., Бибикова М.В., Иванов В.П. и др. Технология скрининга вторичных микробных метаболитов: к эволюции методологии // Антибиотики и химиотерапия. 2002. т.47. - №10. - С.25-31.

39. Скала Л.З., Нехорошева А.Г., Винокуров А.Е, Лукин И.Н. Современные технологии в клинической микробиологии и химиотерапии.

40. Автоматизированное рабочее место врача-микробиолога, химиотерапевта и эпидемиолога" // Клиническая лабораторная диагностика. 2001. - №12. -С.25-32.

41. Соловьева С.Е., Олсуфьева E.H., Преображенская М.Н. Химическое модифицирование противогрибковых макролидных полиеновых антибиотиков // Успехи химии. 2011, т.80. - №2. - С.115-138.

42. Степанова Е.В., Штиль A.A., Лавренов С.Н. и др. Соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия новый класс противоопухолевых соединений // Известия Академии наук. Серия химическая. - 2010. - № 12. - С. 1 -9.

43. Стоянова Л.Г. Новые бактериоцины лактококков и их практическое использование // Автореферат диссертации докт. биол. наук. М.: 2008.

44. Стоянова Л. Г., Левина Н.В. Регуляция синтеза бактериоцина рекомбинантного штамма Lactococcus lactis subsp. ¡actis F-116 компонентным составом среды // Микробиология. 2006. - т.75. - №3. -С.286 -291.

45. Стоянова Л.Г., Егоров Н.С., Фёдорова Г.Б. и др. Сравнение свойств бактериоцинов, образуемых штаммами Lactococcus lactis subsp. lactis разного происхождения II Прикладная биохимия и микробиология. 2007. - т. 43. - № 6. - С.677-684.

46. Стоянова Л.Г., Сультимова Т. Д., Нетрусов А. И. Влияние фосфата и углеводов на синтез низина Lactococcus lactis subsp. lactis штамм 194 // Вестник Московского Университета, сер. Биология. 2003. Т. 16. - №4. -С. 17-22.

47. Страйер Jl. Биохимия. В 3-х томах. М.: Мир, 1984. - 940 с.

48. Стулин И. Д., Белоусов Ю. Б., Лысейко Н. В. И др. Эволюция каротидного атеросклероза под влиянием терапии аторвастатином по данным дуплексного исследования // Журнал неврологии и психиатрии. 2007. т.107. - №11. - С.31—35.

49. Тренин A.C., Дудник Ю.В. Регенерация протопластов Nocardia orientalis // Антибиотики и химиотерапия. 1984. т.29. - №7 - С.495-500.

50. Тренин A.C., Катруха Г.С. Антибиотики ингибиторы биосинтеза холестерина // Хим.-фарм. ж-л. - 1997. т.31. - №9. - С.5-16.

51. Феофилова Е.П. Клеточная стенка грибов. М.: Наука, 1983. - 230 с.

52. Чмель Я. В., Бибикова М.В., Спиридонова И.А. и др. Скрининг природных соединений с гиполипидемической активностью // Антибиотики и химиотерапия. 2004. т.49. - № 8-9. - С.8-12. (Ь)

53. Шенин Ю.Д., Белахов В.В. Амфотерицин В: свойства, химическое строение, поиск производных // Антибиотики и химиотерапия. 1997. т.42. - №4. -С.34-45.

54. Шенин Ю.Д., Белахов В.В. Синтез и противогрибковая активность п-бензильных производных амфотерицина В // Хим.-фарм. ж-л. 2007. т. 42. -№7. - С.20-24.

55. Agarwal В., Bhendwal S., Halmos B. et al. Lovastatin augments apoptosis induced by chemotherapeutic agents in colon cancer cells // Clin. Cancer Res.1999. V.5. N.8. - P.2223-2229.

56. Ahern T.P., Pedersen L., Tarp M. et al. Statin Prescriptions and Breast Cancer Recurrence Risk: A Danish Nationwide Prospective Cohort Study // J. Natl. Cancer Inst. 2011 Aug 2. Epub. ahead of print. Режим доступа: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21813413.

57. Aliff T.B., Maslak P.G., Jurcic J.G. et al. Refractory Aspergillus pneumonia in patients with acute leukemia: successful therapy with combination caspofungin and liposomal amphotericin // Cancer. 2003. V.97. - N.4. - P. 1025-1032.

58. Alberts A.W., Chen J., Kuron G et al. Mevinolin: a highly potent competitive inhibitor of hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase and a cholesterol-lowering agent // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1980. V.77. N.7. - P.3957-3961.

59. Alksne L.E., Dunman P.M. Target-based antimicrobial drug discovery // Methods Mol. Biol.-2008. V.431. P.271-283.

60. Amano S.I., Sakurai Т., Endo K. et al. A cryptic antibiotic triggered by monensin // J. Antibiot (Tokyo). 2011 - Jul 27. Epub. ahead of print. Режим доступа: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21792210.

61. Amet Т., Nonaka M., Dewan M.Z. et al. Statin-induced inhibition of HIV-1 release from latently infected U1 cells reveals a critical role for proteinprenylation in HIV-1 replication // Microbes Infect. 2008. V.10. - N.5. - P.471-480.

62. Aminov R.I. The role of antibiotics and antibiotic resistance in nature // Environ. Microbiol.-2009. V.l 1. N.12. - P.2970-2988.

63. Aminov R.I. A brief history of the antibiotic era: lessons learned and challenges for the future // Front. Microbiol. 2010. V. 1. - Article 134. - P. 1 -7.

64. Anderson J.B. Evolution of antifungal-drug resistance: mechanisms and pathogen fitness // Nat. Rev. Microbiol. 2005. V.3. - N.7. - P.547-556.

65. Aoki Y., Yoshihara F., Kondoh M. et al. Ro 09-1470 is a selective inhibitor of P-450 lanosterol C-14 demethylase of fungi // Antimicrob. Agents Chemother.-1993. V.37. N.12. - P.2662-2667.

66. Aparicio J.F., Caffrey P., Gil J.A., Zotchev S.B. Polyene antibiotic biosynthesis gene clusters // Appl. Microbiol . Biotechnol. -2003. V.61. N.3. - P. 179-188.

67. Arai M., Tomoda H., Okuda T. et al. Funicone-related compounds, potentiators of antifungal miconazole activity, produced by Talaromyces flavus FKI-0076 // J. Antibiot (Tokyo). 2002. V.55. - N.2. - P. 172-180.

68. Assmus В., Urbich C., Aicher A. et al. HMG-CoA reductase inhibitors reduce senescence and increase proliferation of endothelial progenitor cells via regulation of cell cycle regulatory genes // Circ Res. 2003. V.92. - N.9. - P. 1049-1055.

69. Baginski M., Sternal K., Czub J., Borowski E. Molecular modelling of membrane activity of amphotericin B, a polyene macrolide antifungal antibiotic // Acta Biochim. Pol. 2005. V.52. -N.3. - P.655-658.

70. Balkis M.M., Leidich S.D., Mukherjee P.K., Ghannoum M.A. Mechanisms of fungal resistance: an overview//Drugs. -2002. V.62. -N.7. -P. 1025-1040.

71. Baltz R.H., Stonesifer J. Phenotypic changes associated with loss of expression of tylosin biosynthesis and resistance genes in Streptomyces fradiae II J.Antibiot.(Tokyo). 1985. V.38. - N.9. - P.1226-1236.

72. Baran M., Borowski E., Mazerski J. Molecular modeling of amphotericin B-ergosterol primary complex in water II // Biophys. Chem. 2009. V.141. - N.2-3. - P.162-168.

73. Bellamine A., Mangla A.T., Dennis A.L. et al. Structural requirements for substrate recognition of Mycobacterium tuberculosis 14a-demethylase: implications for sterol biosynthesis // The Journal of Lipid Research. 2001. V.42. - P.128-136.

74. Beltrametti F., Barucco D., Rossi R. et al. Protoplast fusion and gene recombination in the uncommon Actinomycete Planobispora rosea producing GE2270 // J. Antibiot (Tokyo). 2007. V.60. - N.7. - P.447-454.

75. Bentley S.D., Chater K.F., Cerdeno-Tarraga A.M. et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2) // Nature. -2002. V.417. -N.6885. P. 141-147.

76. Berrue F., Withers S.T., Haltli B. et al. Chemical screening method for the rapid identification of microbial sources of marine invertebrate-associated metabolites // Mar Drugs. -2011. V.9. N.3 - P.369-381.

77. Blanc M., Hsieh W.Y., Robertson K.A. et al. Host defense against viral infection involves interferon mediated down-regulation of sterol biosynthesis // PLoS Biol.- 2011. V.9. N.3. - P.l-19. - Режим доступа: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21408089.

78. Blondelle S.E., Lohner K. Optimization and high-throughput screening of antimicrobial peptides // Curr. Pharm. Des. 2010. V. 16. - N.28. - P.3204-3211.

79. Blows W.M., Foster G., Lane S.J. et al. The squalestatins, novel inhibitors of squalene synthase produced by a species of Phoma. V. Minor metabolites // J. Antibiot (Tokyo). 1994. V.47. - N.7. - P.740-754.

80. Blum A., Simsolo C., Hasin Y. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a (HMG-CoA) reductase inhibitors (statins), atherosclerosis and coronary syndromes // Atherosclerosis. 2004. V. 175. - N. 1. - P. 1-5.

81. Blum D.J., Ко Y.H., Hong S. et al. ATP synthase motor components: proposal and animation of two dynamic models for stator function // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. V.287. - N.4. - P.801-807.

82. Bobek P., Hromadova M., Ozdin L. Oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) reduces the activity of 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase in rat liver microsomes // Experientia. 1995. V.51. -N.6. - P.589-591.

83. Bode H.B., Bethe B., Hofs R., Zeeck A. Big effects from small changes: possible ways to explore nature's chemical diversity // Chembiochem. 2002. V.3. - N.7. - P.619-627.

84. Borgos S.E., Tsan .P, Sletta H. et al. Probing the structure-function relationship of polyene macrolides: engineered biosynthesis of soluble nystatin analogues // J. Med. Chem. 2006. V.49. - N.8. - P.2431 -2439.

85. Borowski E. Novel approaches in the rational design of antifungal agents of low toxicity // Farmaco. 2000. V.55. - N.3. - P.206-208.

86. Brady S.F., Bondi S.M., Clardy J. The guanacastepenes: a highly diverse family of secondary metabolites produced by an endophytic fungus // J. Am. Chem. Soc. 2001. V.123. - N40. - P.9900-9901.

87. Brady S.F., Simmons L., Kim J.H., Schmidt E.W. Metagenomic approaches to natural products from free-living and symbiotic organisms // Nat. Prod. Rep. -2009. V.26. N. 11. - P. 1488-1503.

88. Brajtburg J., Powderly W.G., Kobayashi G.S., Medoff G. Amphotericin B: current understanding of mechanisms of action // Antimicrob. Agents Chemother. 1990. V.34. - N.2. - P. 183-188.

89. Brautaset T., Sletta H., Nedal A. et al. Improved antifungal polyene macrolides via engineering of the nystatin biosynthetic genes in Streptomyces noursei II Chem. Biol.-2008. V.15. -N.l 1.-P.l 198-1206.

90. Brotz-Oesterhelt H., Sass P. Postgenomic strategies in antibacterial drug discovery // Future Microbiol. 2010. V.5. - N. 10. - P. 1553-1579.

91. Brouwer A.E., van Kan H.J., Johnson E. et al. Oral versus intravenous flucytosine in patients with human immunodeficiency virus-associatedcryptococcal meningitis // Antimicrob. Agents Chemother. 2007. V.51. - N.3. -P.1038-1042.

92. Brown A. G., Smale T. C., King T. J. et al. Crystal and molecular structure of compactin, a new antifungal metabolite from Penicillium brevicompactum II J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 1976. - P.l 165-1170.

93. Brown M.S., Goldstein J. L. Atherosclerosis. Scavenging for receptors // Nature. 1990. V.343. -N.6258. - P.508-509.

94. Brown M.S., Goldstein J.L. The SREBP pathway: regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor // Cell. -1997. V.89. N.3. - P.331-340.

95. Brusselmans K., Timmermans L., Van de Sande T. et al. Squalene synthase, a determinant of Raft-associated cholesterol and modulator of cancer cell proliferation // J. Biol. Chem. 2007. V.282. - N.26. - P. 18777-18785.

96. Budzikiwicz H., Eckau H., Ehrenberg M. Bis (3-indolyl-)-3Hindolyliden-methan, ein von Saccharomyces cerevisiae Gebildeter Farbstoff. // Tetrahedron Lett. 1972. V.36. - P.3807-3810.

97. Bugg T.D., Braddick D., Dowson C.G., Roper D.I. Bacterial cell wall assembly: still an attractive antibacterial target // Trends Biotechnol. 2011. V.29. -N.4. -P.167-173.

98. Bui N.K., Turk S., Buckenmaier S. et al. Development of screening assays and discovery of initial inhibitors of pneumococcal peptidoglycan deacetylase PgdA // Biochem. Pharmacol. -2011. V.82. N.l.- P.43-52.

99. Burton P.M., Swinney D.C., Heller R. et al. Azalanstat (RS-21607), a lanosterol 14 alpha-demethylase inhibitor with cholesterol-lowering activity // Biochem. Pharmacol. 1995. V.50. - N.4. - P.529-544.

100. Byrne B., Carmody M., Gibson E. et al. Biosynthesis of deoxyamphotericins and deoxyamphoteronolides by engineered strains of Streptomyces nodosus II Chem. Biol. 2003. V. 10. - N. 12. - P. 1215-1224.

101. Cabrera J.A., Bolds J., Shields P.E. et al. Isoprenoid synthesis in Halobacterium halobium. Modulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a concentration in response to mevalonate availability // J. Biol. Chem. 1986. V.261. - N8. - P.3578-3583.

102. Cafforio P., Dammacco F., Gernone A., Silvestris F. Statins activate the mitochondrial pathway of apoptosis in human lymphoblasts and myeloma cells // Carcinogenesis. 2005. V.26. - N.5. - P.883-891.

103. Caffrey P., Aparicio J.F., Malpartida F., Zotchev S.B. Biosynthetic engineering of polyene macrolides towards generation of improved antifungal and antiparasitic agents // Curr. Top. Med. Chem. 2008. V.8. - N.8. - P.639-653.

104. Calo D., Kaminski L., Eichler J. Protein glycosylation in Archaea: sweet and extreme // Glycobiology. 2010. V.20. - N.9. - P. 1065-1076.

105. Cappelletty D., Eiselstein-McKitrick K. The echinocandins // Pharmacotherapy. 2007. V.27. - N.3. - P.369-388.

106. Carrillo-Muñoz A.J., Giusiano G., Ezkurra P.A., Quindós G. Antifungal agents: mode of action in yeast cells // Rev. Esp. Quimioter. 2006. V.19. - N.2. -P.130-139.

107. Challis G.L., Hopwood D.A. Synergy and contingency as driving forces for the evolution of multiple secondary metabolite production by Streptomyces species // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2003. V.100. Suppl. 2. - P. 14555-14561.

108. Chan K.K., Oza A.M., Siu L.L. The statins as anticancer agents // Clin. Cancer Res.-2003. V.9. N.l. - P.10-19.

109. Chandrasekar P. Management of invasive fungal infections: a role for polyenes // J. Antimicrob. Chemother. 2011. V.66. - N.3. - P.457-465.

110. Chapman S.W., Sullivan D.C., Cleary J.D. In search of the holy grail of antifungal therapy // Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 2008. V.l 19. - P. 197215.

111. Charbonneau C., Fournier I., Dufresne S. et al. The interactions of amphotericin B with various sterols in relation to its possible use in anticancer therapy // Biophys. Chem. 2001. V.91. - N.2 - P. 125-133.

112. Chen L., Liu W., Hu X. et al. Citrinin derivatives from the marine-derived fungus Penicillium citrinum II Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 2011. V.59. - N.4. - P.515-517. (a)

113. Chen S.C., Slavin M.A., Sorrell T.C. Echinocandin antifungal drugs in fungal infections: a comparison // Drugs. 2011. V.71. - N.l. - P.l 1-41. (b)

114. Chen X., Wei P., Fan L. et al. Generation of high-yield rapamycin-producing strains through protoplasts-related techniques // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2009. V.83. -N.3. P.507-512.

115. Cheng T.J., Wu Y.T., Yang S.T. et al. High-throughput identification of antibacterials against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the transglycosylase // Bioorg. Med. Chem. 2010. V.l 8. - N.24. - P.8512-8529.

116. Chu D.T., Plattner J.J., Katz L. New directions in antibacterial research // J. Med. Chem. 1996. V.39. - N.20. - P.3853-3874.

117. Clatworthy A.E., Pierson E., Hung D.T. Targeting virulence: a new paradigm for antimicrobial therapy // Nat. Chem. Biol. 2007. V.3. - N.9. - P.541 -548.

118. Clardy J., Fischbach M.A., Currie C.R. The natural history of antibiotics // Curr. Biol.-2009. V. 19. N.l 1. - P.437-441.

119. Clardy J, Fischbach M.A, Walsh C.T. New antibiotics from bacterial natural products // Nat. Biotechnol. 2006. V.24 - N. 12. - P. 1541 -1550.

120. Clerihew L., Austin N., McGuire W. Systemic antifungal prophylaxis for very low birthweight infants: a systematic review // Arch. Dis. Child. Fetal. Neonatal. Ed.-2008. V.93. -N.3. P. 198-200.

121. Clinkenbeard K.D., Sugiyama T., Moss J. et al. Molecular and catalytic properties of cytosolic acetoacetyl coenzyme A thiolase from avian liver // J. Biol. Chem. 1973. V.248. -N.7. - P.2275-2284.

122. Coates A.R., Hu Y. Novel approaches to developing new antibiotics for bacterial infections // Br. J. Pharmacol. 2007. V. 152. - N.8. - P. 1147-1154.

123. Cochran K.W. Medicinal effects // In "The biology and cultivation of edible mushrooms" Eds. S.T.Chang, W. Hayes. New York: Academy Press, 1978. -P. 169-187.

124. Corsini A., Ceska R. Drug-drug interactions with statins: will pitavastatin overcome the statins' Achilles' heel? // Curr. Med. Res. Opin. -2011. V.27. -N.8. P. 1551-1562.

125. Cowen L.E., Anderson J.B., Kohn L.M. Evolution of drug resistance in Candida albicans // Annu. Rev. Microbiol. 2002. V.56. - P. 139-165.

126. Craig W.Y., Cooper A.D. Effects of chylomicron remnants and (3-VLDL on the class and composition of newlly secreted lipopriteins by Hep G2 cells // J. Lipid Res. 1988. V.29. - P.299-308.

127. Cuthbert J.A., Lipsky P.E. A product of mevalonate proximal to isoprenoids is the source of both a necessary growth factor and an inhibitor of cell proliferation // Trans. Assoc. Am. Physicians. 1991. V. 104. - P.97-106.

128. Czub J., Baginski M. Modulation of amphotericin B membrane interaction by cholesterol and ergosterol a molecular dynamics study // J. Phys. Chem. B. -2006. V.l 10. -N.33. - P.16743-16753.

129. Das A., Davis M.A., Tomoda H. et al. Identification of the interaction site within acyl-CoA:cholesterol acyltransferase 2 for the isoform-specific inhibitor pyripyropene A//J. Biol. Chem. -2008. V.283. -N. 16. P. 10453-10460.

130. Demain A.L., Adrio J.L. Strain improvement for production of pharmaceuticals and other microbial metabolites by fermentation // Prog. Drug. Res. 2008. V.65.- N.251. P.253-89.

131. Demain A.L., Sanchez S. Microbial drug discovery: 80 years of progress. J. Antibiot (Tokyo). 2009. V.62. - N. 1. - P.5-16.

132. DeVito J.A., Mills J.A., Liu V.G. et al. An array of target-specific screening strains for antibacterial discovery // Nat. Biotechnol. 2002. V.20. - N.5. - P.478-483.

133. Dieting U., Trauthwein H., Zimmermann H. High-throughput screening in the climatic chamber // Elements Degussa Sei News. 2005. V. 11. - P. 14-18.

134. Dimitroulakos J., Thai S., Wasfy G.H. et al. Lovastatin induces a pronounced differentiation response in acute myeloid leukemias // Leuk. Lymphoma. 2000. V.40. - N.l-2. - P. 167-178.

135. Donadio S., Maffioli S., Monciardini P. et al. Sources of novel antibiotics -aside the common roads // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V.88. - N.6. -P.1261-1267. (a)

136. Donadio S., Maffioli S., Monciardini P. et al. Antibiotic discovery in the twenty-first century: current trends and future perspectives // J. Antibiot (Tokyo).- 2010. V.63. N.8. - P.423-430. (b)

137. Dothager R.S., Putt K.S., Allen B.J. et al. Synthesis and identification of small molecules that potently induce apoptosis in melanoma cells through G1 cell cycle arrest // J. Am. Chem. Soc. 2005. V.127. - N.24. - P.8686-8696.

138. Dougherty T.J., Barrett J.F., Pucci M.J. Microbial genomics and novel antibiotic discovery: new technology to search for new drugs // Curr. Pharm. Des. -2002. V.8. -N. 13. P. 1119-1135.

139. Duetz W.A., Witholt B. Effectiveness of orbital shaking for the aeration of suspended bacterial cultures insquare-deepwell microtiter plates // Biochem. Eng. J.-2001. V.7.-P.113-115.

140. Dufresne C., Wilson K.E., Singh S.B. et al. Zaragozic acids D and D2: potent inhibitors of squalene synthase and of Ras farnesyl-protein transferase // J. Nat. Prod. 1993. V.56. - N. 11. - P. 1923-1929.

141. Eichler J. Facing extremes: archaeal surface-layer (glyco)proteins // Microbiology. 2003. V. 149. - N. 12. - P.3347-3351.

142. Eichler J., Adams M.W. Posttranslational protein modification in Archaea // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2005. V.69. - N.3. - P.393-425.

143. Eichler J., Maupin-Furlow J., Soppa J. Archaeal protein biogenesis: posttranslational modification and degradation // Archaea. 2010. Sep 30. - pii: 643046. - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2948886.

144. Endo A. Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent that specifically inhibits 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase // J. Antibiot (Tokyo). -1980. V.33. N.3. - P.334-336.

145. Endo A. Compactin (ML-236B) and related compounds as potential cholesterol-lowering agents that inhibit HMG-CoA reductase // J. Med. Chem. -1985. V.28. N.4. - P.401 -405.

146. Endo A., Hasumi K., Negishi S. Monacolins J and L, new inhibitors of cholesterol biosynthesis produced by Monascus ruber H J. Antibiot (Tokyo). -1985. V.38. -N.3. -P.420-422. (a)

147. Endo A., Hasumi K., Yamada A. et al. The synthesis of compactin (ML-236B) and monacolin K in fungi // J. Antibiot (Tokyo). 1986. V.39. - N. 11. - P. 16091610.

148. Endo A., Kuroda M. Citrinin, an inhibitor of cholesterol synthesis // J. Antibiot (Tokyo). 1976. V.29. - N.8. - P.841-843.

149. Endo A., Kuroda M., Tsujita Y. ML-236A, ML-236B, and ML-236C, new inhibitors of cholesterogenesis produced by Penicillium citrinium // J. Antibiot (Tokyo). 1976. v.29. -N.12. - P. 1346-1348.

150. Endo A., Negishi Y., Iwashita T. et al. Biosynthesis of ML-236B (compactin) and monacolin K // J. Antibiot (Tokyo). 1985. V.38. -N.3. - P444-448. (b)

151. Endo A., Yamashita H., Naoki H. et al. Microbial phosphorylation of compactin (ML-236B) and related compounds // J. Antibiot (Tokyo). 1985. V.38. - N.3. - P.328-332. (c)

152. Espinel-Ingroff A. Novel antifungal agents, targets or therapeutic strategies for the treatment of invasive fungal diseases: a review of the literature (2005-2009) // Rev. Iberoam. Micol. 2009. V.26. - N. 1. - P. 15-22.

153. Fajardo A., Martinez J.L. Antibiotics as signals that trigger specific bacterial responses // Curr. Opin. Microbiol. 2008. V.l 1. -N.2. - P. 161 -167.

154. Farese R.V. Jr. The nine lives of ACAT inhibitors // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol.-2006. V.26.-N.8. P. 1684-1686.

155. Faust J., Krieger M. Expression of specific high capacity mevalonate transport in a Chinese hamster cell variant // J. Biol. Chem. 1987. V.262. - N.5. - P. 19962004.

156. Ferrand S., Tao J., ShenX. et al. Screening for mevalonate biosynthetic pathway Inhibitors using sensitized bacterial strains // J. Biomol. Screen. 2011. V.16. - N.6. - P.637-46.

157. Fischbach M.A., Clardy J. One pathway, many products // Nat. Chem. Biol. -2007. V.3. N.7. - P.353-355.

158. Fitch M.E., Mangels A.R., Altmann W.A., El Hawary M., Qureshi A.A., and Elson C.E. Microbiological screening of mevalonate-suppressive minor plant constituents // J. Agric. Food Chem. 1989. V.37. - P.687-691.

159. Freire-Moran L., Aronsson B., Manz C. et al. Critical shortage of new antibiotics in development against multidrug-resistant bacteria-Time to react is now // Drug Resist. Updat. 2011. V. 14. - N.2. - P. 118-124.

160. Fukuda T., Hasegawa Y., Hagimori K. et al. Tensidols, new potentiators of antifungal miconazole activity, produced by Aspergillus niger FKI-2342 // J. Antibiot (Tokyo). 2006. V.59. - N.8. - P.480-485.

161. Fukuda T., Hasegawa Y., Sakabe Y. et al. Citrinamides, new potentiators of antifungal miconazole activity, produced by Penicillium sp. FK1-1938 // J. Antibiot (Tokyo). 2008. V.61. - N.9. - P.550-555.

162. Fukuda T., Matsumoto A., Takahashi Y., et al. Phenatic acids A and B, new potentiators of antifungal miconazole activity produced by Streptomyces sp. K03-0132// J. Antibiot (Tokyo). 2005. V.58. - N.4. - P.252-259. (a)

163. Gauthaman K., Fong C.Y., Bongso A. Statins, stem cells, and cancer // J. Cell Biochem. 2009. V. 106. - N.6. - P.975-983.

164. Genilloud O., González I., Salazar O. et al. Current approaches to exploit actinomycetes as a source of novel natural products // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2011. V.38. - N.3. - P.375-389.

165. Georgopapadakou N.H., Bertasso A. Effects of squalene epoxidase inhibitors on Candida albicans // Antimicrob. Agents Chemother. 1992. V.36. N.8. -P.1779-1781.

166. Gillespie D.E., Brady S.F., Bettermann A.D. et al. Isolation of antibiotics turbomycin a and B from a metagenomic library of soil microbial DNA // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V.68. - N.9. - P.4301-4306.

167. Girmenia C., Martino P. New antifungal drugs and new clinical trials: interpreting results may be difficult // Curr. Opin. Oncol. 2003. V.15. - N.4. -P.283-288.

168. Goldstein J.L., Brown M.S. Regulation of the mevalonate pathway // Nature. -1990. V.343. -N.6257. P.425-430.

169. Gower T.L., Graham B.S. Antiviral activity of lovastatin against respiratory syncytial virus in vivo and in vitro // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. V.45. -N.4. - P. 1231-1237.

170. Haendeler J., Hoffmann J., Diehl J.F. et al. Antioxidants inhibit nuclear export of telomerase reverse transcriptase and delay replicative senescence of endothelial cells // Circ. Res. 2004. V.94. - N.6. - P.768-775.

171. Hamano Y., Dairi T., Yamamoto M. et al. Growth-phase dependent expression of the mevalonate pathway in a terpenoid antibiotic-producing streptomyces strain // Bioscience Biotechnol. Biochemistry. 2002. V.66. - N.4. - P.808-819.

172. Handelsman J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. V.68. - N.4. - P.669-685.

173. Hasumi K., Arahira M., Sakai K., Endo A. Irreversible inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase by phenicin (phoenicine) // J. Antibiot (Tokyo). 1987. V.40. - N.2. - P.224-226.

174. Hatori H., Sato B„ Sato I. et al. FR901512, a novel HMG-CoA reductase inhibitor produced by an agonomycetous fungus no. 14919. II. Biological profiles // J. Antibiot (Tokyo). 2004. V.57. - N.6. - P.390-393. (b)

175. Hatori H., Shibata T.,Nishikawa M. et al. FR171456, a novel cholesterol synthesis inhibitor produced by Sporormiella minima No. 15604. II. Biological activities // J. Antibiot (Tokyo). 2004. V.57. - N.4. - P.260-263. (c)

176. Haustedt L.O., Mang C., Siems K., Schiewe H. Rational approaches to natural-product-based drug design // Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2006. V.9. - N.4. - P.445-462.

177. Hayes M. V. The squalestatins, novel inhibitors of squalene synthase produced by a species of Phoma. 1. Taxonomy, fermentation, isolation, physico-chemical properties and biological activity // J. Antibiot (Tokyo). 1992. V.45. - N.5. -P.639-647.

178. Hendrickson L., Davis C.R., Roach C. et al. Lovastatin biosynthesis in Aspergillus terreus: characterization of blocked mutants, enzyme activities and a multifunctional polyketide synthase gene // Chem. Biol. 1999. V.6. - N.7. -P.429-439.

179. Herbrecht R., Denning D.W., Patterson T.F. et al. Voriconazole versus amphotericin B for primary therapy of invasive aspergillosis // N. Engl. J. Med. -2002. V.347. N.6. - P.408-415.

180. Hindier K., Cleeland C.S., Rivera E., Collard C.D. The role of statins in cancer therapy // Oncologist. 2006. V.l 1. - N.3. - P.306-315.

181. Hong S., Pedersen P.L. ATP synthase and the actions of inhibitors utilized to study its roles in human health, disease, and other scientific areas // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2008. V.72.-N.4.-P.590-641.

182. Hopwood D.A. Genetic studies with bacterial protoplasts // Annu. Rev. Microbiol. 1981. V.35.-P.237-272.

183. Hopwood D.A. Forty years of genetics with Streptomyces: from in vivo through in vitro to in silico // Microbiology. 1999. V.145. - N.9. - P.2183-2202.

184. Hopwood DA. Cracking the polyketide code // PLoS Biol. 2004. V.2. - N.2. - E35. - P.0166-0169. - Режим доступа: 10.1371/journal.pbio.0020035 -PMID: 14966534.

185. Hopwood D.A., Bibb M., Chater K.F. et al. Genetic manipulation of Streptomycetes. A laboratory manual. Norwich, UK: The John Innes Foundation, 1985. - 68p.

186. Horton J.D., Goldstein J.L., Brown M.S. SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver // J. Clin, invest. -2002. V. 109. N.9. - P.l 125-1131.

187. Hosokawa Т., Suzuki K. , Okutomi T. et al. Effect of ascofuranone on serum lipids of rats fed a cholesterol rich diet // Jpn. J. Pharmacol. 1975. V.25. - N.l. -P.35-39.

188. Hu Y., Shamaei-Tousi A., Liu Y., Coates A. A new approach for the discovery of antibiotics by targeting non-multiplying bacteria: a novel topical antibiotic for staphylococcal infections // PLoS One. 2010. V.5. - N.7. - P.el 1818.

189. Ikeura R., Murakawa S., Endo A. Growth inhibition of yeast by compactin (ML-236B) analogues // J. Antibiot (Tokyo). 1988. V.41. - N.8. - P.l 148-1150.

190. Inoue M., Nakada M. Structure elucidation and enantioselective total synthesis of the potent HMG-CoA reductase inhibitor FR901512 via catalytic asymmetric Nozaki-Hiyama reactions // J. Am. Chem. Soc. 2007. V.129. - N.l4. - P.4164-4165.

191. Issat Т., Nowis D., Legat M. et al. Potentiated antitumor effects of the combination treatment with statins and pamidronate in vitro and in vivo // Int. J. Oncol. -2007. v.30. -N.6. -P.1413-1425.

192. Iwasaki S., Omura S. Search for protein farnesyltransferase inhibitors of microbial origin: our strategy and results as well as the results obtained by other groups // J. Antibiot (Tokyo). 2007. v.60. - N. 1. - P. 1 -12.

193. Jiang H., Hutchinson C.R. Feedback regulation of doxorubicin biosynthesis in Streptomyces peucetius H Res. Microbiol. 2006. V.157. - N.7. - P.666-674.

194. Jiang Z., Zheng X., Lytle R.A. et al. Lovastatin-induced up-regulation of the ВНЗ-only protein, Bim, and cell death in glioblastoma cells // J. Neurochem. -2004. V.89. -N.l. P. 168-178.

195. Joly V., Bolard J., Yeni P. In vitro models for studying toxicity of antifungal agents // Antimicrob. Agents Chemother. 1992. V.36. - N.9. - P. 1799-1804.

196. Jones C.A., Sidebottom P.J., Cannell R.J. et al. The squalestatins, novel inhibitors of squalene synthase produced by a species of Phoma. III. Biosynthesis // J. Antibiot (Tokyo). 1992. V.45. - N9. - P. 1492-1498.

197. Joshua H., Schwartz M.S., Wilson K.E. L-669,262, a potent HMG-CoA reductase inhibitor//J. Antibiot (Tokyo). 1991. V.44. - N.3. - P.366-3 70.

198. Joubert A., Calmes B., Berruyer R. et al. Laser nephelometry applied in an automated microplate system to study filamentous fungus growth // Biotechniques. 2010. V.48. - N.5. - P.399-404.

199. Kadam S., Poddig J., Humphrey P. et al. Citrinin hydrate and radicinin: human rhinovirus 3C-protease inhibitors discovered in a target-directed microbial screen // J. Antibiot (Tokyo). 1994. V.47. - N.7. - P.836-839.

200. Kahan B.D. Forty years of publication of transplantation proceedings—the second decade: the cyclosporine revolution // Transplant. Proc. -2009. V.41. -N.5. P.1423-1437.

201. Kahlon A.K., Roy S., Sharma A. Molecular docking studies to map the binding site of squalene synthase inhibitors on dehydrosqualene synthase of Staphylococcus aureus // J. Biomol. Struct. Dyn. -2010. V.28. N.2. - P.201-210.

202. Kamigaki M., Sasaki T., Serikawa M. et al. Statins induce apoptosis and inhibit proliferation in cholangiocarcinoma cells // Int. J. Oncol. -2011. V.39. N.3. -P.561-568.

203. Kasai Y., Matsumori N., Umegawa Y. et al. Self-assembled amphotericin B is probably surrounded by ergosterol: bimolecular interactions as evidenced by solid-state NMR and CD spectra // Chemistry. -2008. V.14. N.4. - P. 11781185.

204. Kato J.Y., Funa N., Watanabe H. et al. Biosynthesis of gamma-butyrolactone autoregulators that switch on secondary metabolism and morphological development in Streptomyces // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2007. V.104. -N.7. P.2378-2383.

205. Kaufman D.A. Prevention of invasive Candida infections in preterm infants: the time is now // Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2008. V.6. - N.4. - P.393-399.

206. Kaufman D.A., Manzoni P. Strategies to prevent invasive candidal infection in extremely preterm infants // Clin. Perinatol. 2010. V.37. - N.3. - P.611-628.

207. Kawashima A., Nakamura Y., Ohta Y. et al. New cholesterol biosynthesis inhibitors MC-031 (O-demethylchlorothricin), -032 (O-demethylhydroxychlorothricin), -033 and -034 // J. Antibiot (Tokyo).- 1992. V.45. N.2. - P.207-212.

208. Kleinkauf H., von Dohren H. Linking peptide and polyketide biosynthesis // J. Antibiot (Tokyo). 1995. V.48. -N.7. - P.563-567.

209. Klimov A.N., Nagornev V.A. Evolution of cholesterol concept of atherogenesis from Anitchkov to our days // Pediatr. Pathol. Mol. Med. 2002. V.21. - N.3. - P.307-320.

210. Kluepfel D., Surendra N., Vezina S., Vezina C. Antimycin A components. 1 .Isolation and biological activity // J. Antibiotics (Tokyo). 1970. V.23. - N.2. -P.75-80.

211. Kobayashi K., Nishino C., Ohya J. et al. Oligomycin E, a new antitumor antibiotic produced by Streptomyces sp. MCI-2225 // J. Antibiot (Tokyo). 1987. V.40. - N.7. - P.1053-1057.

212. Koehn F.E. High impact technologies for natural products screening // Prog. Drug Res. 2008. V.65. - P. 177-210.

213. Koehn F.E, Carter G.T. Rediscovering natural products as a source of new drugs // Discov. Med. 2005. V.5. - N26. - P. 159-164.

214. Komagata D., Yamashita H., Endo A. Microbial conversion of compactin (ML-236B) to ML-236A // J. Antibiot (Tokyo). 1986. V.39. - N.ll. - P. 15741577.

215. Kotowska M. Application of molecular biology for the discovery of biosynthetic genes of polyketide and peptide antibiotics produced by actinomycetes // Postepy Biochem. 2005. V.51. - N.3. - P.345-352.

216. Kuchta T., Leka C., Farkas P. et al. Inhibition of sterol 4-demethylation in Candida albicans by 6-amino-2-n-pentylthiobenzothiazole, a novel mechanism ofaction for an antifungal agent // Antimicrob. Agents Chemother. 1995. V.39. -N.7. -P.1538-1541.

217. Kuhnt D., Anke T., Besl H. et al. Antibiotics from basidiomycetes. XXXV11. New inhibitors of cholesterol biosynthesis from cultures of Xerula melanotricha Dorfelt // J. Antibiot (Tokyo). 1990. V.43. - N. 11. - P. 1413-1420.

218. Kumagai H., Tomoda H., Omura S. Method of search for microbial inhibitors of mevalonate biosynthesis using animal cells // J. Antibiot (Tokyo). 1990. V.43. - N.4. - P.397-402.

219. Kumagai H., Tomoda H., Omura S. Biosynthesis of antibiotic 1233A (F-244) and preparation of 14C.1233A // J. Antibiot (Tokyo). 1992. V.45. - N.4. -P.563-567.

220. Kuroda M., Endo A. Inhibition of in vitro cholesterol synthesis by fatty acids // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V.486. - N. 1. - P.70-81.

221. Kurtz M.B., Douglas C., Marrinan J. et al. Increased antifungal activity of L-733,560, a water-soluble, semisynthetic pneumocandin, is due to enhanced inhibition of cell wall synthesis // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. V.38. -N.12. - P.2750-2757.

222. Kuzuyama T. Mevalonate and nonmevalonate pathways for the biosynthesis of the isoprenoid units // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. V.166. - N.8. -P.1619-1627.

223. Laatsch H., Kellner M., Wolf G. et al. Oligomycin F, a new immunosuppressive homologue of oligomycin A // J. Antibiot (Tokyo). 1993. V.46. - N.9. - P. 1334-1341.

224. Laezza C., Fiorentino L., Pisanti S. et al. Lovastatin induces apoptosis of k-ras-transformed thyroid cells via inhibition of ras farnesylation and by modulating redox state //J. Mol. Med. (Berl). 2008. V.86. - N.12. - P.1341-1351.

225. Lancini G., Parenti F., Gallo G.G. Antibiotics a multidisciplinary approach. -New York: Plenum Press, 1995. - 278p.

226. Lavrenov S.N., Luzikov Y.N., Bykov E.E. et al. Synthesis and cytotoxic potency of novel tris(l-alkylindol-3-yl)methylium salts: role of N-alkyl substituents // Bioorg. Med. Chem. 2010. V.18. -N.18. - P.6905-6913.

227. Lee T.J., Holtz W.J., Smith R.L. et al. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors. 8. Side chain ether analogues of lovastatin // J. Med. Chem. 1991. V.34. - N.8. - P.2474-2477.

228. Leeds J.A., Schmitt E.K., Krastel P. Recent developments in antibacterial drug discovery: microbe-derived natural products—from collection to the clinic // Expert. Opin. Investig. Drugs. -2006. V.15. -N.3. P.211-226.

229. Leon C., Hill J.S., Wasan K.M. Potential role of acyl-coenzyme A:cholesterol transferase (ACAT) Inhibitors as hypolipidemic and antiatherosclerosis drugs // Pharm. Res. 2005. V.22. -N.10. - P. 1578-1588.

230. Lepesheva G.I., Ott R.D., Hargrove T.Y. et al. Sterol 14alpha-demethylase as a potential target for antitrypanosomal therapy: enzyme inhibition and parasite cell growth // Chem. Biol. 2007. V. 14. - N. 11. - P. 1283-1293.

231. Lepesheva G.I., Waterman M.R. Sterol 14alpha-demethylase cytochrome P450 (CYP51), a P450 in all biological kingdoms // Biochim. Biophys. Acta. 2007. V. 1770. - N.3. - P.467-477.

232. Lepre F., Campbell B., Crane S., Hickman P. Low-dose sustained release nicotinic acid (Tri-B3) and lipoprotein (a) // Am. J. Cardiol. 1992. V.70. - N. 1. -P.133.

233. Letscher-Bru V., Herbrecht R. Caspofungin: the first representative of a new antifungal class // J. Antimicrob. Chemother. 2003. V.51. - N.3. - P.513-521.

234. Li J.W., Vederas J.C. Drug discovery and natural products: end of an era or an endless frontier? // Science. 2009. V.325. - N.5937. - P. 161-165.

235. Li Y.C., Fung K.P., Kwok T.T. et al. Mitochondria-targeting drug oligomycin blocked P-glycoprotein activity and triggered apoptosis in doxorubicin-resistant HepG2 cells // Chemotherapy. 2004. V.50. - N.2. - P.55-62.

236. Lindsey S., Harwood H.J. Jr. Inhibition of mammalian squalene synthetase activity by zaragozic acid A is a result of competitive inhibition followed by mechanism-based irreversible inactivation // J. Biol. Chem. 1995. V.270. -N.16. - P.9083-9096.

237. Liu C.I., Liu G.Y., Song Y. et al. A cholesterol biosynthesis inhibitor blocks Staphylococcus aureus virulence // Science. 2008. V.319. - N.5868. - P. 1391 -1394.

238. Liu S., Rodriguez A.V., Tosteson M.T. Role of simvastatin and methyl-beta-cyclodextrin corrected. on inhibition of poliovirus infection // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006. V.347. - N. 1. - P.51 -59.

239. Livermore D.M. Discovery research: the scientific challenge of finding new antibiotics // J. Antimicrob. Chemother. 2011. V.66. - N.9. - P. 1941 -1944.

240. Lombó F., Menéndez N., Salas J.A., Méndez C. The aureolic acid family of antitumor compounds: structure, mode of action, biosynthesis, and novel derivatives // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V.73. -N.l. - P. 1-14.

241. López-Martínez R. Candidosis, a new challenge // Clin. Dermatol. 2010. V.28. - N.2. - P. 178-184.

242. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall N.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent// J. Biol. Chem. 1951. V. 193. - N.l - P.265-275.

243. Luo Y., Ding X., Xia L. et al. Conditions for protoplast preparation of spinosyn-producing strain and the physiological properties of protoplast-regenerated strains. // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2009. V.25. - N.3.-P.360-367.

244. Lüttgen, H., Rohdich, F., Herz, S. et al. Biosynthesis of terpenoids: YchB protein of Escherichia coli phosphorylates the 2-hydroxy group of diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol II Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2000. V. 97.-N.3. - P. 1062-1067.

245. Lysenkova L.N., Turchin K.F., Danilenko V.N. et al. The first examples of chemical modification of oligomycin A // J. Antibiot (Tokyo). -2010. V.63. -N.l. P.17-22.

246. Ma S.M., Li J.W., Choi J.W. et al. Complete reconstitution of a highly reducing iterative polyketide synthase // Science. 2009. V.326. - N.5952. -P.589-592.

247. Magae J., Hosokawa T., Ando K. et al. Antitumor protective property of an isoprenoid antibiotic, ascofuranone // J. Antibiot (Tokyo). 1982. V.35. - N.l 1. -P.1547-1552.

248. Magae J., Nagai K., Ando K. et al. Effects of an antitumor agent, ascofuranone, on the macromolecular syntheses of intact cells // J. Antibiot (Tokyo). 1983. V.36. - N.7. - P.892-899.

249. Magae J., Nagai K., Suzuki S. et al. Macrophage-specific effect on lipid metabolism by an antibiotic, ascofuranone // J. Antibiot (Tokyo). 1987. V.40. -N.2. - P.202-208.

250. Magae J., Suzuki S., Nagai K. et al. In vitro effects of an antitumor antibiotic, ascofuranone, on the murine immune system // Cancer Res. 1986. V.46. - N.3. -P.1073-1078. (b)

251. Magiorakos A.P., Suetens С., Boyd L. et al. National hand hygiene campaigns in Europe, 2000-2009 // Euro Surveill. 2009. V.14. - 1.17. - art.5 - Режим доступа: http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId= 19190.

252. Magi его wska-Jung M., Cefa'i D., Marrakchi H. et al. In vitro determination of antiviral activity of MS8209, a new amphotericin В derivative, against primary isolates of HIV 1 //Res. Virol. 1996. V.147.-N.5.-P.313-318.

253. Malina H., Tempete C., Robert-Gero M. Enhanced sinefungin production by medium improvement, mutagenesis, and protoplast regeneration of Streptomyces incarnatus NRRL 8089 // J. Antibiot (Tokyo). 1985. V.38. - N.9. - P. 12041210.

254. Marcone G.L., Carrano L., Marinelli F., Beltrametti F. Protoplast preparation and reversion to the normal filamentous growth in antibiotic-producing uncommon actinomycetes // J. Antibiot (Tokyo). 2010. V.63. - N.2. - P.83-88.

255. Marr K. Combination antifungal therapy: where are we now, and where are we going?//Oncology. 2004. V.18. -N.13. - Suppl. 7. - P.24-29.

256. Martinez L.R., Ntiamoah P., Casadevall A., Nosanchuk J.D. Caspofungin reduces the incidence of fungal contamination in cell culture // Mycopathologia. -2007. V.164. N.6. P.279-286.

257. Marwali M.R., Rey-Ladino J., Dreolini L. et al. Membrane cholesterol regulates LFA-1 function and lipid raft heterogeneity // Blood. 2003. V. 102. - N. 1. - P.215-222.

258. Mathew B.P., Nath M. Recent approaches to antifungal therapy for invasive mycoses // Chem. Med. Chem. 2009. V.4. - N.3. - P.310-323.

259. Matsukuma S., Ohtsuka T., Kotaki H. et al. A new series of natural antifungals that inhibit P450 lanosterol C-14 demethylase. I. Taxonomy, fermentation, isolation and structural elucidation // J. Antibiot (Tokyo). 1992. V.45. - N.2. -P.151-159.

260. Matsumori N., Sawada Y., Murata M. Large molecular assembly of amphotericin В formed in ergosterol-containing membrane evidenced by solidstate NMR of intramolecular bridged derivative // J. Am. Chem. Soc. 2006. V.128. - N.36. - P.l 1977-11984.

261. Matsuoka S., Ikeuchi H., Umegawa Y. et al. Membrane interaction of amphotericin В as single-length assembly examined by solid state NMR for uniformly 13C-enriched agent // Bioorg. Med. Chem. -2006. V.14. N.19. -P.6608-6614.

262. Mazerski J., Bolard J., Borowski E. Effect of the modifications of ionizable groups of amphotericin В on its ability to form complexes with sterols in hydroalcoholic media//Biochim. Biophys. Acta. 1995. V.1236. - N.l. - P. 170176.

263. McAnally J.A., Gupta J., Sodhani S. et al. Tocotrienols potentiate lovastatin-mediated growth suppression in vitro and in vivo // Exp. Biol. Med. 2007. V.232. - N.4. - P.523-531.

264. Mejía A., Barrios-González J., Viniegra-González G. Overproduction of rifamycin В by Amycolatopsis mediterranei and its relationship with the toxic effect of barbital on growth//J. Antibiot (Tokyo). 1998. V.51.-N.l. - P.58-63.

265. Meletiadis J., Meis J.F., Mouton J.W., Verweij P.E. Analysis of growth characteristics of filamentous fungi in different nutrient media // J. Clin. Microbiol. 2001. V.39. - N.2. - P.478-484.

266. Méndez C., Künzel E., Lipata F. et al. Oviedomycin, an unusual angucyclinone encoded by genes of the oleandomycin-producer Streptomyces antibioticus ATCC11891 // J. Nat. Prod. 2002. V.65. - N.5. - P.779-782.

267. Menys V.C., Durrington P.N. Squalene synthase inhibitors // Br. J. Pharmacol.- 2003. V.139. -N.5. -P.881-882.

268. Metcalf S.C., Dockrell D.H. Improved outcomes associated with advances in therapy for invasive fungal infections in immunocompromised hosts // J. Infect. -2007. V.55. N.4. - P.287-299.

269. Middleton R.F., Foster G., Cannell R.J. et al. Novel squalestatins produced by biotransformation // J. Antibiot (Tokyo). 1995. V.48. - N.4. - P.311 -316.

270. Minowada J., Onuma T., Moore G.E. Rosette-forming human lymphoid cell lines. I. Establishment and evidence for origin of thymus-derived lymphocytes // J. Natl. Cancer Inst. 1972. V.49. - N.3. - P.891-895.

271. Mistefa O., Stenius U. Statins inhibit Akt/PKB signaling via P2X7 receptor in pancreatic cancer cells // Biochem. Pharmacol. 2009. V.78. - P.l 115-1126.

272. Mitsuguchi H., Seshime Y., Fujii I. et al. Biosynthesis of Steroidal Antibiotic Fusidanes: Functional Analysis of Oxidosqualene Cyclase and Subsequent Tailoring Enzymes from Aspergillus fumigates II J. Am. Chem. Soc. 2009. V. 131. -N.18.-P.6402-6411.

273. Mishra N.N., Prasad T., Sharma N. et al. Pathogenicity and drug resistance in Candida albicans and other yeast species. A review // Acta Microbiol. Immunol. Hung. 2007. V.54. - N.3. - P.201-235.

274. Mo H., Elson C.E. Studies of the isoprenoid-mediated inhibition of mevalonate synthesis applied to cancer chemotherapy and chemoprevention // Exp. Biol. Med.- 2004. V.229. N.7. - P.567-585.

275. Moen M.D., Lyseng-Williamson K.A., Scott L.J. Liposomal amphotericin В: а review of its use as empirical therapy in febrile neutropenia and in the treatment of invasive fungal infections // Drugs. 2009. V.69. -N.3. - P.361-392.

276. Mohan K.V., Muller J., Atreya C.D. Defective rotavirus particle assembly in lovastatin-treated MA 104 cells // Arch. Virol. 2008. V.153. - N.12. - P.2283-2290.

277. Mohr J., Johnson M., Cooper T. et al. Current options in antifungal pharmacotherapy. 1 // Pharmacotherapy. 2008. V.28. -N.5. - P.614-645.

278. Molinari G. Natural products in drug discovery: present status and perspectives // Adv. Exp. Med. Biol. 2009. V.655. - P. 13-27.

279. Möller С., Slack M. Impact of new technologies for cellular screening along the drug value chain // Drug Discov. Today. 2010. V.l 5. - N.9-10. - P.384-390.

280. Monnet D.L. Raising awareness about prudent use of antibiotics: a necessity for the European Union // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2010. V.28. - Suppl. 4. P.l-3.

281. Moore R.D., Bartlett J.G., Gallant J.E. Association between Use of HMG. CoA Reductase Inhibitors and Mortality in HIV-infected Patients // PLoS One. -2011. V.6. N.7. - P. e21843. - Режим доступа: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21765919.

282. Morris M.I., Villmann M. Echinocandins in the management of invasive fungal infections, Part 2 // Am. J. Health Syst. Pharm. 2006. V.63. -N. 19. - P. 18131820.

283. Moy T.I., Conery A.L., Larkins-Ford J. et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model // ACS Chem. Biol. 2009. V.4. - N.7. - P.527-533.

284. Moyad M.A., Klotz L.H. Statin Clinical Trial (REALITY) for Prostate Cancelan Over 15-Year Wait is Finally Over Thanks to a Dietary Supplement // Urol. Clin. North Am. 2011. V.38. - N.3. - P.325-331.

285. Murakawa S., Sakai K., Endo A. Isolation of 3 alpha-hydroxy-3,5-dihydro ML-236C (sodium salt) from paecilomyces viridis L-68 // J. Antibiot (Tokyo). 1994. V.47. -N.l. -P.108-109.

286. Murray C.J., Lopez A.D. Mortality by cause for eight regions of the world: Global Burden of Disease Study // Lancet. 1997. V.349. - N.9061. - P. 12691276.

287. Naeger-Murphy N., Pile J.C. Clinical indications for newer antifungal agents // J. Hosp. Med. 2009. V.4. - N.2. - P. 102-111.

288. Naghavi M., Libby P., Falk E. et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I // Circulation.-2003. V. 108.-N. 14. P. 1664-1672. (a)

289. Naghavi M., Libby P., Falk E. et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part II // Circulation. 2003. V.108. - N.l5. - P. 1772-1778. (b)

290. Nakakita, Y., Nakagawa M., Sakai H. Isolation of oligomycin A as a result of screening for antagonists of lipids // J. Antibiotics. 1980. V.33. - N.5. - P.514-516.

291. Nakamura S. Total synthesis of the squalene synthase inhibitor zaragozic acid C // Chem. Pharm. Bull (Tokyo). -2005. V.53. N.l. - P. 1-10.

292. Natesan S.K., Chandrasekar P.H., Alangaden G.J., Manavathu E.K. Fluvastatin potentiates the activity of caspofungin against Aspergillus fumigatus in vitro // Diagn. Microbiol. Infect Dis. 2008. V.60. - N.4. - P.369-373.

293. Nedal A., Sletta H., Brautaset T. et al. Analysis of the mycosamine biosynthesis and attachment genes in the nystatin biosynthetic gene cluster of Streptomyces noursei ATCC 11455 // Appl. Environ. Microbiol. -2007. V.73. -N.22. P.7400-7407.

294. Neumann A., Baginski M., Czub J. How do sterols determine the antifungal activity of amphotericin B? Free energy of binding between the drug and its membrane targets // J. Am. Chem. Soc. 2010. V.132. -N.51. - P. 18266-18272.

295. Netherland C., Thewke D.P. Rimonabant is a dual inhibitor of acyl CoA:cholesterol acyltransferases 1 and 2 // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2010. V.398. N.4. - P.671-676.

296. Nishida H., Ohnishi Y., Beppu Т., Horinouchi S. Evolution of gamma-butyrolactone synthases and receptors in Streptomyces // Environ. Microbiol. -2007. V.9. N.8. - P.1986-1994.

297. Nosanchuk J.D. Current status and future of antifungal therapy for systemic mycoses // Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 2006. V. 1. - N.l. - P.75-84.

298. Nosanchuk J.D., Casadevall A. Impact of melanin on microbial virulence and clinical resistance to antimicrobial compounds // Antimicrob. Agents Chemother. -2006. V.50.-N.l 1.-P.3519-3528.

299. Novgorodov S.A., Gudz T.I., Mohr Yu.E. et al. ATP-synthase complex: the mechanism of control of ion fluxes induced by cumene hydroperoxide in mitochondria // FEBS Lett. 1989. V.247. - N.2. - P.255-258.

300. Nucci M., Marr K.A. Emerging fungal diseases // Clin. Infect. Dis. -2005. V.41. -N.4. P.521-526.

301. Odds F.C. Genomics, molecular targets and the discovery of antifungal drugs // Rev. Iberoam. Micol. 2005. V.22. - N.4. - P.229-237.

302. Ogawa H., Hasumi K., Sakai K. et al. Pannorin, a new 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor produced by Chrysosporium раппогит/П. Antibiot (Tokyo). 1991. V.44. - N.7. - P.762-767.

303. Ohshiro T., Matsuda D., Nagai K. et al. The selectivity of beauveriolide derivatives in inhibition toward the two isozymes of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase // Chem. Pharm. Bull (Tokyo). 2009. V.57. - N.4. - P.377-381.

304. Ohshiro T., Rudel L.L., Omura S., Tomoda H. Selectivity of microbial acyl-CoA: cholesterol acyltransferase inhibitors toward isozymes // J. Antibiot (Tokyo). 2007. V.60. - N. 1. - P.43-51.

305. Okanishi M., Suzuki N., Furuta T. Variety of hybrid characters among recombinants obtained by interspecific protoplast fusion in streptomycetes // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1996. V.60. - N.8. - P. 1233-1238.

306. Okanishi M., Yamaura Y., Furuta T. Variety of intracellular products among recombinants obtained by interspecific protoplast fusion in streptomycetes // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997. V.61. - N.4. - P.748-751.

307. Olano C., Méndez C., Salas J.A. Molecular insights on the biosynthesis of antitumour compounds by actinomycetes // Microb. Biotechnol. 2011. V.4. -N.2. - P.144-164.

308. Omura S. Philosophy of new drug discovery // Microbiol. Rev. 1986. V.50. -N.3. - P.259-279.

309. Omura S., Tanaka Y., Nakagawa A. et al. Irumamycin, a new antibiotic active against phytopathogenic fungi // J. Antibiot (Tokyo). 1982. V.35. - N.2. -P.256-257.

310. Omura S., Tanaka Y., Takahashi Y. et al. Irumamycin, an antifungal 20-membered macrolide produced by a Streptomyces. Taxonomy, fermentation and biological properties//J. Antibiot (Tokyo). 1984. V.37. - N.12. - P. 1572-1578.

311. Omura S., Tomoda H., Kumagai H. et al. Potent inhibitory effect of antibiotic 1233A on cholesterol biosynthesis which specifically blocks 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthase // J. Antibiot (Tokyo). 1987. V.40. - N.9. -P.1356-1357.

312. O'Sullivan J., Phillipson D.W., Kirsch D.R. et al. Lanomycin and glucolanomycin, antifungal agents produced by Pycnidiophora dispersa. I. Discovery, isolation and biological activity // J. Antibiot (Tokyo). 1992. V.45. -N.3. - P.306-312.

313. Palacios D.S., Anderson T.M., Burke M.D. A post-PKS oxidation of the amphotericin B skeleton predicted to be critical for channel formation is not required for potent antifungal activity // J. Am. Chem. Soc. 2007. V.129. - N.45.- P.13804-13805.

314. Palchaudhuri R., Hergenrother P.J. Triphenylmethylamides (TPMAs): Structure-activity relationship of compounds that induce apoptosis in melanoma cells // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008. V. 18. - N.22. - P.5888-5891.

315. Palchaudhuri R., Nesterenko V., Hergenrother P.J. The complex role of the triphenylmethyl motif in anticancer compounds // J. Am. Chem. Soc. 2008. V.130.-N.31.-P.10274-10281.

316. Panda D., Rathinasamy K., Santra M.K., Wilson L. Kinetic suppression of microtubule dynamic instability by griseofulvin: implications for its possible use in the treatment of cancer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2005. V.102. N.28. -P.9878-9883.

317. Park J.K., Sakai K., Ogawa H. et al. Chrysosporin, a new inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase produced by Chrysosporium pannorum II J. Antibiot (Tokyo). 1993. V.46. - N.7. - P. 1170-1172.

318. Pathania R., Brown E.D. Small and lethal: searching for new antibacterial compounds with novel modes of action // Biochem. Cell Biol. 2008. V.86. - N.2.- P.111-115.

319. Pelaez F. The historical delivery of antibiotics from microbial natural products-can history repeat? // Biochem. Pharmacol. 2006. V.71. - N.7. - P.981-990.

320. Pojer F., Ferrer J-L., Richard S.B. et al. Structural basis for the design of potent and species-specific inhibitors of 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA synthases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2006. V.103. N.31. - P.l 149111496.

321. Ponpipom M.M., Girotra N.N., Bugianesi R.L. et al. Structure-activity relationships of CI and C6 side chains of zaragozic acid A derivatives // J. Med. Chem.- 1994. V.37.-N.23. P.4031-4051.

322. Rahman H., Austin B., Mitchell W.J. et al. Novel anti-infective compounds from marine bacteria // Mar Drugs. 2010. V.8. - N.3. - P.498-518.

323. Raina S., De Vizio D., Odell M. et al. Microbial quorum sensing: a tool or a target for antimicrobial therapy? // Biotechnol. Appl. Biochem. 2009. V.54. -N.2. - P.65-84.

324. Rajnisz A., Solecka J., Kurzatkowski W. Properties of Saccharopolyspora erythraea strains after protoplast regeneration // Folia Microbiol (Praha). 2005. V.50. -N.l. -P.13-18.

325. Ramsden N.L., Buetow L., Dawson A. et al. A structure-based approach to ligand discovery for 2C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase: a target for antimicrobial therapy // J. Med. Chem. -2009. V.52. N.8. - P.2531-2542.

326. Rasko D.A., Sperandio V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease //Nat. Rev. DrugDiscov. 2010. V.9. -N.2. -P.l 17-128.

327. Rathinasamy K., Jindal B., Asthana J et al. Griseofulvin stabilizes microtubule dynamics, activates p53 and inhibits the proliferation of MCF-7 cells synergistically with vinblastine // BMC Cancer. 2010. V. 10. - P.213.

328. Récamier K.S., Hernández-Gómez A., González-Damián J., Ortega-Blake 1. Effect of membrane structure on the action of polyenes: I. Nystatin action incholesterol- and ergosterol-containing membranes // J. Membr. Biol. -2010. V.237. -N.l. P.31-40.

329. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Approved Standard. NCCLS Document M27-A. // NCCLS: Wayne, PA, 1997,- ISBN 1-56238-328-0.

330. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi. Approved Standard. NCCLS Document M38- A. // NCCLS: Wayne, PA, 2002. ISBN 1-56238-470-8.

331. Repko E.M., Maltese W.A. Post-translational isoprenylation of cellular proteins is altered in response to mevalonate availability // J. Biol. Chem. 1989. V.264. - N. 17. - P.9945-9952.

332. Rohmer M. A mevalonate independent route to asoprenoid diphosphate // In "Comprehensive Natural Products Chemistry" Eds. D.Barton, K.Nakanishi. -Oxford: Pergamon, 1999. V.2. - P.45-67.

333. Rohmer M., Knani M., Simonin P. et al. Isoprenoid biosynthesis in bacteria: A novel pathway for the early steps leading to isopentenyl diphosphate // Biochem. J. 1993. V.295. -N.2. - P.517-524.

334. Ruiz B. Carbon source regulation of antibiotic production // J. Antibiot (Tokyo). 2010. V.63. -N.8. - P.442-459.

335. Ruiz B., Chávez A., Forero A. et al. Production of microbial secondary metabolites: regulation by the carbon source // Crit. Rev. Microbiol. 2010. V.36. - N.2. - P.146-167.

336. Ruiz-Camps I., Cuenca-Estrella M. Antifungals for systemic use // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2009. V.27. - N.6. - P.353-362.

337. Saag M.S., Graybill R.J., Larsen R.A. et al. Practice guidelines for the management of cryptococcal disease. Infectious Diseases Society of America // Clin. Infect. Dis. 2000. V.30. N.4. -P.710-718.

338. Sanchez S., Demain A.L. Metabolic regulation and overproduction of primary metabolites // Microb. Biotechnol. 2008. V.l. -N.4. - P.283-319.

339. Sánchez S., Chávez A., Forero A. et al. Carbon source regulation of antibiotic production // J. Antibiot (Tokyo). 2010. V.63. - N.8. - P.442-459.

340. Sasaki H., Hosokawa T., Sawada M., Ando K. Isolation and structure of ascofuranone and ascofranol, antibiotics with hypolipidemic activity // J. Antibiot (Tokyo). 1973. V.26. - N.l 1. - P.676-680.

341. Sawada M., Hosokawa T., Okutomi T., Ando K. Hypolipidemic property of ascofuranone//J. Antibiot (Tokyo). 1973. V.26. - N.l 1.-P.681-686.

342. Schirmer A., Gadkari R., Reeves C.D. et al. Metagenomic analysis reveals diverse polyketide synthase gene clusters in microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissoluta II Appl. Environ. Microbiol. -2005. V.71. N.8. - P.4840-4849.

343. Schneider P., Misiek M., Hoffmeister D. In vivo and in vitro production options for fungal secondary metabolites // Mol. Pharm. 2008. V.5. - N.2. -P.234-242.

344. Schopfer U., Engeloch C., Hohn F. et al. Hypothesis-driven screening // Methods Mol. Biol. 2009. V.575. - P.297-316.

345. Schwartz R.E., Dufresne C., Flor J.E. et al. Restricticin, a novel glycine-containing antifungal agent // J. Antibiot (Tokyo). 1991. V.44. - N.5. - P.463-471.

346. Seco E.M., Fotso S., Laatsch H., Malpartida F. A tailoring activity is responsible for generating polyene amide derivatives in Streptomyces diastaticus var. 108//Chem. Biol.-2005. V.12.-N.10.-P.1093-1101.

347. Seiki S., Frishman W.H. Pharmacologic inhibition of squalene synthase and other downstream enzymes of the cholesterol synthesis pathway: a new therapeutic approach to treatment of hypercholesterolemia // Cardiol. Rev. 2009. V.17. -N.2. - P.70-76.

348. SerizawaN., Nakagawa K., Hamano K. et al. Microbial hydroxylation of ML-236B (compactin) and monacolin K (MB-530B) // J. Antibiot (Tokyo). -1983. V.36. N.5. - P.604-607. (a)

349. Serizawa N., Nakagawa K., Tsujita Y. et al. 3 alpha-Hydroxy-ML-236B (3 alpha-hydroxycompactin), microbial transformation product of ML-236B (compactin) // J. Antibiot (Tokyo). 1983. V.36. - N.5. - P.608-610. (b)

350. SerizawaN., Nakagawa K., Tsujita Y. et al. 6 alpha-Hydroxy-iso-ML-236B (6 alpha-hydroxy-iso-compactin) and ML-236A, microbial transformation products of ML-236B // J. Antibiot (Tokyo). 1983. V.36. - N.7. - P.918-920. (c)

351. Serizawa N., Serizawa S., Nakagawa K. et al. Microbial hydroxylation of ML-236B (compactin). Studies on microorganisms capable of 3 beta-hydroxylation of ML-236B // J. Antibiot (Tokyo). 1983. V.36. - N.7. - P.887-891. (d)

352. Shellman Y.G., Ribble D., Miller L. et al. Lovastatin-induced apoptosis in human melanoma cell lines // Melanoma Res. 2005. V. 15. - N.2. - P.83-89.

353. Shimada Y., Morita Т., Sugiyama K. Dietary eritadenine and ethanolamine depress fatty acid desaturase activities by increasing liver microsomal phosphatidylethanolamine in rats // J. Nutr. 2003. V.133. - N.3. - P.758-765.

354. Shiomi M., Yamada S., Amano Y. et al. Lapaquistat acetate, a squalene synthase inhibitor, changes macrophage/1 ipid-rich coronary plaques of hypercholesterolaemic rabbits into fibrous lesions // Br. J. Pharmacol. 2008. V.l 54. - N.5. - P.949-957.

355. Shord S.S., Chan L.N., Camp J.R. et al. Effects of oral clotrimazole troches on the pharmacokinetics of oral and intravenous midazolam // Br. J. Clin. Pharmacol. -2010. V.69. -N.2. P.160-166.

356. Silva L., Coutinho A., Fedorov A., Prieto M. Competitive binding of cholesterol and ergosterol to the polyene antibiotic nystatin. A fluorescence study // Biophys. J. 2006. V.90. - N. 10. - P.3625-3631.

357. Singh S.B., Barrett J.F. Empirical antibacterial drug discovery—foundation in natural products // Biochem. Pharmacol. 2006. V.71. - N.7. - P. 1006-1015.

358. Singh S.B., Pelaez F. Biodiversity, chemical diversity and drug discovery // Prog. Drug Res. 2008. V.65. - N. 141. - P. 143-174.

359. Singh S.B., Young K. New antibiotic structures from fermentations // Expert Opin. Ther. Pat. -2010. V.20. -N.10. P.1359-1371.

360. Sioud M., Baldacci G., Forterre P., de Recondo A.M. Antitumor drugs inhibit the growth ofhalophilic archaebacteria//Eur. J. Biochem. 1987. V.l69. -N.2. -P.231-236.

361. Slawiriska A., Kandefer-Szerszeri M. The anticancer properties of statins // Postepy Hig Med. Dosw. (online). 2008. V.62. - P.393-404.

362. Smondyrev A.M., Berkowitz M.L. Molecular dynamics simulation of the structure of dimyristoylphosphatidylcholine bilayers with cholesterol, ergosterol, and lanosterol // Biophys. J. 2001. V.80. N.4. - P. 1649-1658.

363. Song Y., Lin F.Y., Yin F. et al. Phosphonosulfonates are potent, selective inhibitors of dehydrosqualene synthase and staphyloxanthin biosynthesis in Staphylococcus aureus // J. Med. Chem. 2009. V.52. -N.4. - P.976-988.

364. SoppaJ. From genomes to function: haloarchaea as model organisms // Microbiology. 2006. V.152. - Pt.3. - P.585-590.

365. Sunazuka Т., Hirose Т., Omura S. Efficient total synthesis of novel bioactive microbial metabolites//Acc. Chem. Res.-2008. V.41.-N.2. P.302-314.

366. Sunazuka Т., Tsuzuki K., Kumagai H et al. Synthesis of 1233 A analogs and their inhibitory activity against hydroxymethylglutaryl coenzyme A synthase // J. Antibiot (Tokyo). 1992. V.45. - N.7. - P.l 139-1147.

367. Sutherlin A., Hedl M., Sanchez-Neri B. et al. Enterococcus faecalis 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthase, an enzyme of isopentenyl diphosphate biosynthesis // J. Bacteriol. 2002. V.184. -N.15. - P.4065-4070.

368. Taoufiq Z., Pino P., N'dilimabaka N. et al. Atorvastatin prevents Plasmodium falciparum cytoadherence and endothelial damage // Malar J. -2011. V.10. -N.52. P.1-9. Режим доступа: http://www.malariajournal.eom/content/10/l/52.

369. Tapia P. C.V. An update on antifungal susceptibility testing // Rev. Chilena Infectol. -2009. V.26. -N.2. -P.:144-150.

370. Taylor P.L., Wright G.D. Novel approaches to discovery of antibacterial agents // Anim. Health Res. Rev. 2008. V.9. - N.2. - P.237-246.

371. Tenchov В., Vescio E.M., Sprott G.D. et al. Salt tolerance of archaeal extremely halophilic lipid membranes // J. Biol. Chem. 2006. V.281. - N.l5. -P.10016-10023.

372. Thompson C. J., Ward J. M., Hop wood D.A. Cloning of antibiotic resistance and nutritional genes in streptomycetes // J. Bacteriol. 1982. V.151. - N.2. -P.668-677.

373. Thompson G.R. The proving of the lipid hypothesis // Curr. Opin. Lipidol. -1999. V.10. -N.3. P.201-205.

374. Thompson G.R. Management of dyslipidaemia // Heart. 2004. V.90. - N.8. -P.949-955.

375. Thompson G.R., Naoumova R.P. Novel lipid-regulating drugs // Expert Opin. Investig. Drugs. 2000. V.9. - N.l 1. - P.2619-2628.

376. Thompson G.R., Catapano A., Saheb S. et al. Severe hypercholesterolemia: therapeutic goals and eligibility criteria for LDL apheresis in Europe // Curr. Opin. Lipidol. 2010. V.21. - N.6. - P.492-498.

377. Thompson G.R. 3rd, Cadena J., Patterson T.F. Overview of antifungal agents // Clin. Chest Med. 2009. V.30. -N.2. - P.203-215.

378. Tierney K.J., Block D.E., Longo M.L. Elasticity and phase behavior of DPPC membrane modulated by cholesterol, ergosterol, and ethanol // Biophys. J. 2005. V.89. -N.4. - P.2481-2493.

379. Tiwari K., Gupta R.K. Rare actinomycetes: a potential storehouse for novel antibiotics // Crit. Rev. Biotechnol. 2011 May 27. - Epub. ahead of print -Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21619453.

380. Tomoda H., Huang X-H., Cao J. et al. Inhibition of acyl-CoA: cholesterol acyltransferase activity by cyclodepsipeptide antibiotics // J. Antibiot (Tokyo). -1992. V.45. -N.10. P.1626-1632. (a)

381. Tomoda H., Kumagai H., Tanaka H., Omura S. Specific binding of beta-lactone 1233A to 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase // J. Antibiot (Tokyo). 1993. V.46. -N.5. - P.872-874.

382. Tomoda H., Kumagai H., Tanaka H., Omura S. F-244 specifically inhibits 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A synthase // Biochim. Biophys. Acta.1987. V.922. N.3. - P.351-356.

383. Tomoda H., Nishida H., Huang X-H. et al. New cyclodepsipeptides, enniatins D, E and F produced by Fusarium sp. F0-1305 // J. Antibiot (Tokyo). 1992. V.45. -N.8. - P. 1207-1215. (b)

384. Tournu H., Serneels J., Van Dijck P. Fungal pathogens research: novel and improved molecular approaches for the discovery of antifungal drug targets // Curr. Drug Targets. 2005. V.6. - N.8. - P.909-922.

385. Trenin A.S. Modern microbiological method in monitoring growth and secondary metabolism of microbial strains. // 7-th Intern. Congress on Rapid Methods and Automation in Microbiology and Immunology, 12-15 Sept. 1993. -London, GB, 1993. Abstr.P.43.

386. Trenin A.S. Automation of microbiological methods in screening of Actinomycetes producing biologically active substances. // Theses of the 9-th International Symposium on the Biology of Actinomycetes, 10-15 July 1994. -Moscow, 1994. P. 172. (a)

387. Trenin A.S. Microbial test system for screening of secondary metabolites inhibiting cholesterol biosynthesis. // International Conference on Microbial Secondary Metabolism, 5-8 Oct. 1994. Interlaken, 1994. - Abstr.P.4. (b)

388. Tsunakawa M., Kotake C., Yamasaki T. et al. New antiviral antibiotics, cycloviracins B1 and B2. II. Structure determination // J. Antibiot (Tokyo).1992. V.45. -N.9. P. 1472-1480.

389. Twentyman P.R., Luscombe M. A study of some variables in a tetrazolium dye (MTT) based assay for cell growth and chemosensittivity // Br. J. Cancer. -1987. V.56. N.3. - P.279-285.

390. Uotani K.,Naganawa H., Kondo S. et al. Structural studies on ebelactone A and B, esterase inhibitors produced by actinomycetes // J. Antibiot (Tokyo).1982. V.35. N.l 1. - P. 1495-1499.

391. Ura H., Obara Т., Nishino N. et al. Cytotoxicity of simvastatin to pancreatic adenocarcinoma cells containing mutant ras gene // Jpn. J. Cancer Res. 1994. V.85. - N.6. - P.633-638.

392. Van der Pyl D., Inokoshi J., Shiomi K. et al. Inhibition of farnesyl-protein transferase by gliotoxin and acetylgliotoxin // J. Antibiot (Tokyo). 1992. V.45. -N.l 1. - P.1802-1805.

393. Ventosa A.,Nieto J.J., Oren A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V.62. - N.2. - P.504-544.

394. Walker L.A., Gow N.A., Munro C.A. Fungal echinocandin resistance // Fungal Genet. Biol. 2010. V.47. -N.2. -P.l 17-126.

395. Walker L.A., Munro C.A., de Bruijn I. et al. Stimulation of chitin synthesis rescues Candida albicans from echinocandins // PLoS Pathog. 2008. V.4. - N.4. - P.el 000040. - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18389063

396. Wang I.K., Lin-Shiau S.Y., Lin J.K. Induction of apoptosis by lovastatin through activation of caspase-3 and DNase II in leukaemia HL-60 cells // Pharmacol. Toxicol. 2000. V.86. - N.2. - P.83-91.

397. Wanke M., Skorupinska-Tudek K., Swiezewska E. Isoprenoid biosynthesis via 1 -deoxy-D-xylulose 5-phosphate/2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate (DOXP/MEP) pathway // Acta Biochim. Pol. 2001. V.48. -N.3. - P.663-672.

398. Wasser SP, Weis AL. Therapeutic effects of substances occurring in higher Basidiomycetes mushrooms: a modern perspective // Crit. Rev. Immunol. 1999. V.19. - N1. - P.65-96.

399. Weber J. ATP synthase the structure of the stator stalk // Trends Biochem. Sci. - 2007. V.32. - N.2. - P.53-56.

400. Wejde J., Hjertman M., Carlberg M. et al. Dolichol-like lipids with stimulatory effect on DNA synthesis: substrates for protein dolichylation? // J. Cell Biochem. 1998. V.71. -N.4. - P.502-514.

401. Wilding E.I., Brown J.R., Bryant A.P. et al. Identification, evolution, and essentiality of the mevalonate pathway for isopentenyl diphosphate biosynthesis in gram-positive cocci // J. Bacteriol. 2000. V.l 82. -N.15. - P.4319-4327. (a)

402. Wilding E.I., Kim D.Y., Bryant A.P. et al. Essentiality, expression, and characterization of the class II 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase of Staphylococcus aureus II J. Bacteriol. -2000. V.l82. N.18. - P.5147-5152. (b)

403. Wilson I.D. Drugs, bugs, and personalized medicine: pharmacometabonomics enters the ring // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2009. V.l06. N.34. - P. 1418714188.

404. Wong W.W., Tan M.M., Xia Z. et al. Cerivastatin triggers tumor-specific apoptosis with higher efficacy than lovastatin // Clin. Cancer Res. -2001. V.7. -N.7. P.2067-2075.

405. Wong W.W., Clendening J.W., Martirosyan A. et al. Determinants of sensitivity to lovastatin-induced apoptosis in multiple myeloma // Mol. Cancer Ther. 2007. V.6. - N.6. - P.1886-1897.

406. Yamamoto I., NakagawaM., Hayakawa Y. et al. Hydroxychlorothricin, a new antitumor antibiotic //J. Antibiot (Tokyo). 1987. V.40. - N10. - P. 1452-1454.

407. Yamashita H., Tsubokawa S., Endo A. Microbial hydroxylation of compactin (ML-236B) and monacolin K // J. Antibiot (Tokyo). 1985. V.38. -N.5. - P.605-609.

408. Yamazaki H., Omura S., Tomoda H. 6'-Hydroxy-3'-methoxy-mitorubrin, a new potentiator of antifungal miconazole activity, produced by Penicillium radicum FKI-3765-2 // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 2010. V.58. - N.6. - P.829-832.

409. Yang P.W., Li M.G., Zhao J.Y. et al. Oligomycins A and C, major secondary metabolites isolated from the newly isolated strain Streptomyces diastaticus II Folia Microbiol. (Praha). -2010. V.55.-N.l. -P.10-16.

410. Yarbrough G.G., Taylor D.P., Rowlands R.T. et al. Screening microbial metabolites for new drugs-theoretical and practical issues // J. Antibiot (Tokyo). -1993. V.46. N.4. - P.535-544.

411. Yim G., Wang H.H., Davies J. Antibiotics as signalling molecules // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2007. V.362. - N.1483. - P.l 195-1200.

412. Zanella F., Lorens J.B., Link W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 2010. V.28. -N.5. -P.237-245.

413. Zhang B., Watts K.M., Hodge D. et al. A second target of the antimalarial and antibacterial agent fosmidomycin revealed by cellular metabolic profiling // Biochemistry. 2011. V.50. - N.l7. - P.3570-3577.

414. Zhao G., Lin X., Dou W. et al. Use of the smart tongue to monitor mold growth and discriminate between four mold species grown in liquid media // Anal. Chim. Acta. 2011. V.690. - N.2. - P.240-247.

415. Zhou Q., Liao J.K. Rho kinase: an important mediator of atherosclerosis and vascular disease // Curr. Pharm. Des. 2009. V. 15. - N.27. - P.3108-3115. (a)

416. Zhou Q., Liao J.K. Statins and cardiovascular diseases: from cholesterol lowering to pleiotropy // Curr. Pharm. Des. 2009. V.15. - N.5. - P.467-478. (b)

417. Zhou Q., Liao J.K. Pleiotropic effects of statins. Basic research and clinical perspectives // Circ. J. 2010. V.74. - N.5. - P.818-826.

418. Zotchev S.B. Polyene macrolide antibiotics and their applications in human therapy // Curr. Med. Chem. 2003. V.10. - N.3. - P.211-223.

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.07) на тему:Поиск микробных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов и противогрибковых антибиотиков

Автореферат диссертации по медицине на тему Поиск микробных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов и противогрибковых антибиотиков

Оглавление диссертации Тренин, Алексей Сергеевич :: 2012 :: Москва

Введение диссертации по теме "Химиотерапия и антибиотики", Тренин, Алексей Сергеевич, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Поиск микробных метаболитов - ингибиторов биосинтеза стеролов и противогрибковых антибиотиков"

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2012 года, Тренин, Алексей Сергеевич

Похожие научные работы

Каталог диссертаций