Автореферат и диссертация по медицине (14.00.31) на тему:Таксономия актиномицетов и поиск продуцентов антибиотиков

1 О Я я ъ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ПО ИЗЫСКАНИЮ НОВЫХ АНТИБИОТИКОВ

На правах рукописи

ТЕРЕХОВА Лариса Петровна

ТАКСОНОМИЯ АКТИНОМИПЕТОВ И ПОИСК ПРОДУЦЕНТОВ АНТИБИОТИКОВ

Специальность 14.00,31 - химиотерапия и антибиотики

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора биологический наук в виде научного доклада

Москва - 1992

Работа выполнена в НИИ по изысканию новых антибиотиков Российской академии медицинских наук

Официальные оппоненты: . доктор медицинских наук член-корр. РАМН Л.П. ИВАНИЦКАЯ

доктор биологических наук профессор Д.Г. ЗВЯГИНЦЕВ доктор биологических наук А.Н. ПОЛИН

Ведущая организация: Научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения концерна "Биопрепарат"

Защита диссертации состоится " " ¿¡¿¿стя^^199 2 г. в часов на заседании Специализированного совета Д.001.05.01 при НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМР по адресу: 119867, Москва, Большая Пироговская, дом 11.

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиоте ке НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук /* Т.А.УСПЕНСКА5

--)

\

Актуальность проблемы.

Несмотря на то, что современная медицина располагает шсокозффективными антибиотиками, она нуждается в новых препаратах : улучшенными фармакологическими свойствами, активных в отношении зироко распространенных устойчивых форм микроорганизмов юзбудителей заболеваний.

Подавляющее большинство практически важных антибиотиков фиродного происхождения выделено из актиномицетов. Литературные занные о получении из культур актиномицетов новых антибиотических !ешеств свидетельствует о том, что их способность к биосинтезу штибиотиков далеко не исчерпана. Актиномицеты синтезируют »нтибиотики с антибактериальным, противоопухолевый,

зротивовирусным, антигрибковым, противопаразитарным действием. Они образуют также ингибиторы ферментов, иммуномодуляторы, гербициды, 1нсектициды.

В последние годы развиваются исследования, связанные с юискон фармакологически активных веществ природного

троисхохдения. Выделены новые соединения, ингибируюшие синтез солестерина в крови, что имеет большое значение для лечения гердечно-сосудистых заболеваий и атеросклероза. Природные антибиотики являются также материалом для получения юлусинтетических производных, обладающих более широким спектром действия и менее токсичных по сравнению с исходными веществами.

Одним из важных и актуальных подходов к повышению эффективности изыскания новых природных биологически активных веществ является использование в процессе -поиска таксономических знаний.

Данные о таксономическом - положении и антибиотических свойствах культур позволяют идентифицировать на ранних этапах поисковой работы продуценты уже известных антибиотиков и отбирать потенциальные продуценты новых антибиотиков. Применение нестандартных методов выделения культур из природных источников способствует изоляции новых форм микроорганизмов, что значительно расширяет возможности поисковой работы.

Большое значение имеет также и обнаружение новых продуцентов известных антибиотиков, важных для практического применения, так

как это позволяет преодолеть патентные барьеры при организации производства этих антибиотиков.

Работа проводилась в соответствии с планом НИР НИИ па изысканию новых антибиотиков РАМН С1966-1991Э , номера государственной регистрации тея 81013995, 810X3996. 01.86.0001349, 01.86.000550, 01.88.0010304, а также по Общесоюзной проблеме «Антибиотики» N 38 на периоды 1981-1985 гг. и 1986-1990 гг. и по Государственным программен в области онкологии СО.69.025 и лейкозов СО.69. 053 на периоды 1975-1980 гг., 1981-1985 гг. и 1986-1990.

Цель и задачи исследования.

Целью работы явилось развитие научных и практических основ поиска продуцентов новых антибиотиков, совершенствование системы классификации и идентификации актиноницетов, разработка новых методов селективного выделения из природных источников актиноницетов редких таксонов.

Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

- Широкомасштабное выделение из природных источников культур актиноницетов и поиск среди них продуцентов новых антибиотиков и новых продуцентов известных антибиотиков, имеющих научное и практическое значение.

- Создание стандартных описаний видов и ключей для идентификации актиноницетов, относящихся к ряду серий рода Streptomyces: Albocoloratus. Chroaiogenes. Chrysomal lus. и Violaceus.

~ Всестороннее изучение рода Actinomadura как одного из перспективных родов актиноницетов для поиска продуцентов новых антибиотиков.

- Изучение корреляций между таксономическим положением культур продуцентов и их способностью к образованию антибиотиков определенных химических групп.

Разработка методов ранней идентификации антибиотиков, продуценты которых часто выделяются из почвенных образцов.

- Изучение чувствительности актиноницетов различных родов к антибиотикам для оценки возможности использования их в качестве селективных агентов при изоляции актиноницетов из природных источников.

- Развитие методов селективного выделения актиноницетов определённых таксонов иэ существующих в природе смешанных юпуляций, расширение набора применяемых селективных агентов, 13бирателъно подавляющих рост тех или иных микроорганизмов, >дноврененное использование нескольких специфических ингибиторов, )блаяающих разный типом действия. Использование при выделении ¡ктиномицетов не только ингибиторов, но и стимуляторов роста, "аэработка и применение комплексных методов, включающих обработку гочвенных образцов и использование селективных сред для выделения истиноницетов иэ естественных мест обитания.

Научная новизна и практическая ценность

В результате проведённых таксономических исследований олучила дальнейшее развитие система классификации актиноницетов ода Streptomyces■ Названия видов приведены в соответствие с [еждународным кодексом номенклатуры бактерий, для ряда видов становлены синонины. созданы стандартные описания видов и пределительные ключи. Описаны и узаконены новые виды рода ЧгерЬотусез.

В процессе поиска новь(х антибиотиков из почвенных образцов взличных географических зон выделены и описаны продуценты новых нтибиотиков: противоопухолевых антибиотиков - беромицина из руппы антрациклинов, антибиотика N 792 из группы безазотистых ксихиноидных соединений, антибактериальных антибиотиков - N 2562 з группы куиерогликозидов, антибиотика К 3802 из группы антибиотиков. Выделены и описаны новые продуценты рифамицина, обрамицина, цефамицина С, пенициллина N. иомицина, рубомицина, арниномицина, азотомицина, лузопептина. гризеовиридина и таницина.

Разработаны методы идентификации антибиотиков группы елиомицина и стрептотрицинов на стадии агаровых культур родуцентов с целью исключения их из дальнейшей иследований по эиску новых антибиотиков.

Разработаны методические подходы поиска продуцентов «тибиотиков среди актиноницетов редких родов. Предложены новые глективные среды для выделения культур редких родов

ктиномицетов. Разработан новый комплексный метод изоляции стиномицетов из почвы, включающий предварительную обработку

почвенных образцов с последующим высевом их на селективные среды < несколькими ингибиторами роста, позволяющий выделять культур! определенных редких родов актиноницетов.

Исследованы морфологические, хенотаксономически<

культуральные и физиологические свойства культур различных видо] рода Actinomadmra. Получены данные, указывающие на необходимост! реклассификации некоторых видов. Описаны и узаконены 6 новых видо] рода Act inomadura. На основании экспериментального материала i оригинальных описаний впервые составлены и опубликованы ключи дл: определения видов этого рода.

Разработаны методические подходы для направленного поиск; антибиотиков из культур рода Actinomadura, включающие метод] преимущественного выделения их из почв на селективных средах данные таксономии для отбора продуцентов и оптимальные условия и: культивирования для первичного обнаружения антибиотнческо] активности.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены или представлены на Симпозиум! по актиноницетам СЯпония. Киото, 1974г.3, на V съезде Всесоюзног< микробиологического общества СЕреван,19753, на Международно! Симпозиуме по нокардиям и стрептомицетан С Варшава, 19773, н< Международной симпозиуме по антибиотикам СВейиар, 19793. на 1 Юбилейной национальной конференции по образованию и применения антибиотиков СНРБ, Разград-Варна,19813, на II Всесоюзной научно| крнференции «Результаты и перспективы научных исследование нив.кробных полисахаридов С Ленинград, 19843, на VII Съезда Всесоюзного микробиологического общества «Достижения микробиологи! - практике» САлма-Ата. 19855, на VI Международном симпозиуне п< биологи» актиноницетов СВНР,Дебрецен, 19853, на Всесоюзно! конференции «Проблемы изыскания и биотехнологии новых антибиотико! СМосква, 19823, на Всесоюзной конференции «Биосинтез вторичны метаболитов» СПущино, 19873, на VII Международной синпозиуне ni биологии актиномицетов СЯпония, Токио,19883, на

Советско—Американском синпозиуме по антибиотикам и хнниотерапщ С Москва, 19883, на II Всесоюзном семинаре «Актуальные направлени! поиска антибиотиков» САлма-Ата, 19893, на Всесоюзной конференци! «Регуляция микробного метаболизма»- СПущино, 19893, на конференци]

- б -

Молекулярная организация никробной клетки» СТбилиси.19893, на " V ехдународной конференции по химии и биотехнологии биологически ктивных продуктов СНРБ, Варна, 1989Э. на VIII Международной инлозиуме по биологии актиноницетов ССША, Мэднсон.Л991.Э.

Работа выполнена в НИИ по изыскании новых антибиотиков PAKf в аборатории изыскания продуцентов. Исследования были начаты под уководстсом Г.О. Гаузе и Т.П. Преображенской. В изучении рода ctinomadura и в разработке методов селективного выделения из риродных источников актиноницетов редких родов участвовал)« отрудники лаборатории продуцентов Института по изысканию иозьк нтибиотиков СНИИНАЭ РАМН O.A. Галатенко, И.В. АлЗвроза, i.A. Руденская. Изучение тейхоевых кислот и некоторых енотаксононических признаков актиноницетов проведено совместно с

• Б. НауиовоЯ и др. сотрудниками МГУ ин. М. В. Ломоносова. Состав енахинонов актиномадур изучен совместно с С. Д. Таптыковой -отрудницей Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, льтраструктура акткнонадур - совместно с Т..в. Куиновой -отрудницей того же Института. Основной вклад в исследования изико-химических свойств и идентификацию выделенных антибиотиков несли сотрудники отдела химии НИИИНА РАМН И.В. Толстых и

• Б. Федорова, некоторые антибиотики были изучены Л. Н. Лысенковой.

По тене диссертации опубликованы 73 научные работы. Вольная асть натериалов"диссертации включена в монографии «Определитель ктиноиицетов» С1983 г.з и «Поиск продуцентов антибиотиков среди ктиноницетов редких родов» С1990 г.Э.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Результаты н обсуждение исследований

1. Таксонония актиноницетов и поиск новых антибиотиков 1.1. Разработка вопросов классификации и идентификации актиноницетов рода Streptomycea

В последние годы происходило интенсивное развитие систематики [ктиноницетов. Наиболее значительными были успехи в области >илогении и классификации этой группы бактерий. Вместе с тен юстояние проблем идентификации, прекде всего на уровне видов, >ставалось неудовлетворительным и не соответствовало требованиян

практики,, в то вреия как идентификация таксона имеет огромно! значение для многих научных и прикладных биологически: исследований.

Особенно остро вопросы видовой идентификации стояли для род; Strteptomyces. представляющего сакую распространенную,

многочисленную и богатую продуцентами антибиотиков группз актиномицетов. Требовали дальнейшего развития и вопрос* классификации зтого рода актиномицетов.

Со времени выхода в свет фундаментальных трудов пс классификации актиномицетов «Вопросы классификаци!

актиномицетов-антагонистов» СГаузе и др. , 1957} и «Лучистые грибки» СКрасильников и др. , 1970}, 8-го издания определител* Берги С1970 к началу 80-х годов значительно увеличился объбг знаний в области таксономии, описаны новые виды актиномицетов, £ том числе и продуценты новых антибиотиков, разработан новьй Международный Кодекс Номенклатуры Бактерий С1978}. Возникла насущная потребность в руководстве, которое отражало бь современное состояние систематики актиномицетов и с помощьх которого иохно было бы сравнительно быстро и легкс идентифицировать культуры актиномицетов.

Одной из первоочередных задач кашей работы была дальнейша? разработка систеиы классификации и создание удобных exet идентификации видов рода Streptomyces как основы новогс определителя актиномицетов.

В работе над проблемой классификации и идентификации рода Streptomyces нами была принята предложенная ранее схема разделения видов этого рода на секции по окраске воздушногс мицелия и на серии по окраске субстратного мицелия СГаузе и др., 1957, Преображенская, 1967}.

Предметом наших исследований служили виды актиномицетов, принадлежащие к четырем сериям двух секций рода Streptomyces. Этс секция Cinereus С воздушный мицелий серый} ■. серии Chrysomal Im Ссубстратный мицелий зеленый:) [321 Chromogenes Ссубстратный мицелий коричневый} [331. и Violaceus Ссубстратный мицелий красный, фиолетовый или синий} [34 J и секция Albus С воздушный мицелий белый}: серия Albocoloratus Ссубстратный мицелий окрашен} [351.

Актиномицеты секции Cinereus являются самой распространенной >уппой актиноницетов и имеют наибольшее видовое разнообразие.

Для стандартных описаний видов был использован минимальный |бор признаков. имеющих диагностическую ценность для ограничения видов : морфологических - форма цепочек спор и фактер поверхности спор и культуральных - окраска воздушного и гбстратного мицелия, наличие растворимых пигментов и меланоидных 1гментов. При описании новых видов или новых комбинаций ;пользовали и физиологические признаки Сспектр потребления зточников углерода).

Всего нами было рассмотрено более 150 видов Свключая подвидыЭ ;тиномицетов рода Streptomyces. Созданы стандартные описания 100 1Дов с указанием антибиотиков, которые они образуют. У штаммов гкоторых видов были изучены и охарактеризованы пигменты. Для аждого вида указан типовой штамм , дана информация о включении в цобренный список названий бактерий С1980Э, приведены ссылки на эигинальные описания видов.

Созданы ключи для определения видов каждой серии, с помощью эторых можно сравнительно быстро определять культуры стиномицетов, выделяемые из природных источников, в том числе >одуценты антибиотиков и других биологически активных веществ.

Названия видов приведены в соответствие с Международным здексои номенклатуры бактерий С1978Э, а также с Одобренным 1ИСКОМ названий бактерий С19805.

На основании оригинальных описаний и экспериментального зучения типовых штаммов для ряда видов установлены синонимы.

Описано 5 новых видов, предложены новые комбинации для 4-х здов, восстановлены названия двух видов СТабл. 1Э. Описания этих 1дов составлены в соответствии с правилами, рекомендованными для тисания новых видов и восстановления названий с тем, чтобы они -штались действительно опубликованными CWane. 1980Э. Они эдержат, помимо признаков, выявляемых на стандартном наборе сред, ризнаки, наблюдаемые при росте на питательных средах, принятых ля изучения стрептомицетов в рамках Международного эксперимента.

Проведено сравнение новых видов и видов, предлагаемых к установлению, с близкими действительно опубликованными видами на зновании фенотипических характеристик и популяционного анализа

Новые вялы и новые комбинации рода ЗЬгорЬотусвБ. вновь описанные в «Определителе актиномицетов» С1983 г.3 и•включении* в Список узаконенных названий бактерий С1986 г.З

Таблица 1

Вид

Предложен -как

Авторы

Типовой отани

Антибиотик

в. аЬгоч^впз

8. саграЫсиз

3. с1пвгеогесЬиз

5. с1Пвгвозр1пиз

сотЬ .<—«©V. зр. поу. зр. поу. ср. nov.

5. соеИсо(1ауиз сотЬ. поу. 5. та1асЬИо1ивсиз пот. гсу-

в. Ina^aeЛitos'pim^я пот. геу.

5. топотус1п1 зр. поу.

5. гиЬгодг1веиз сотЬ. поу.

violaceoruЫ<iuь сотЬ. поу.

5. У1Г1йоЬгиппви5 сотЬ. поу.

РгаоЬгагЬепзкауа вЬ ИНА 1531 ТегвкПога

Махтоуа е{ ИНА 8851

ТегекЛауд

ТегекЬоуц е£ ИНА 5202

РгеоЬгагЬепвкауа

ТегекЬоуа. ИНА 1719

РгеоЬгигЬепзкауа еЬ (За изб

ТвгекЬоуа ИНА 9630

РгеоЬгвгЬ«пакауа еЬ ИНА 739 ТегвкЬоуа

РгеоЬгагЬепзкауа ИНА 316

ТегвкЬоуа

Сливе ИНА 1465

ТегекЬоуа

ТегекЬоуа ИНА 2626

Рге оЪга гЬ епзка у а ИНА 770

Тегек1юуа

ТегекЬоуа ИНМИ 300

N 300 - антиивтаболит лейцина

не получены

пенициллин N

N 1719 СаэотокициЮ

не получены не получены

физиологически активное вещество -стимулятор образования зигот у Нисога1ев

нономицин

продигиозин, стрептотрицины

цинерубин

I

00 I

виридоннцин

штанной изменчивости, который является одним из ваялых греиенных подходов к упорядочению систематики СКузнецов и ibt. . 1978, 1987, Kuznetsov, 1990),

Выявлены «запрещенные признаки». Например, белая окраска ■душного мицелия, а также прямые цепочки спор при любой окраске душного мицелия несовместимы с наличием выростов Сволосков или :овЭ на поверхности спор.

Приведенный в дайной главе материал вошел составной частью а ографию «Определитель актиноницетов» С1983 г.Э [26].

1.2. Изучение корреляций между систематическим полокгниен продуцентов и природяй образуемых ини антибиотиков

Таксономические особенности и антимикробный спектр культуры it возможность на ранней стадии поиска прогнозировать природу ибиотика, образуемого данным штанкон [20, 21, 39, 42].

Используя разработанный в ИНА РАМН метод ранней идентификации дуцентов антибиотиков по таксономическим признакам И иникробному спектру СПреображенская, 1967D, мы получили азательства его эффективности. Прежде всего это данные о ыпой степени совпадения раннего прогноза с результатами ледующей химической идентификации выделенных из него ибиотических веществ СГабл.23.

Например, для культур, умеренно подавляющих рост

мположительных бактерий и обладающих признаками S.variabilis. дварительные предположения об образовании ини антибиотика ппы гелиомицина подтвердились в 100К случаев. Культуры, авляющие рост грамположительных и гранотрицательных бактерий и есенные к S. fradiae, в 95У. случаев образовывали неоницины. дует отметить, что штаммы S. fradiae. образующие тилозин. ичаются от типового пгтамма этого вида. Культуры с широким ктрон действия, отнесенные к S . lavendulae. в 95У. случаев азовывали антибиотики группы стрептотрицинов.

Эти данные подтверждают наличие взаимосвязи между сономическим положением продуцента и способностью к биосинтезу еделённого типа антибиотиков.

Однако, образование антибиотика не является строго оспецифичным. Гак. разные штаммы одного и того же вида могут

Таблица 2.

Взаимосвязь между таксономическим положением продуцентов и природой образуемых антибиотиков

Род. вид Спектр действия Число всего штаммов образуют антибиотики Антибиотики

Streptomyces variabilis гр+- 30 30 Гелиомицины

S. coeruleorubidus rp+- 8 8 Рубомицин

S. rubiginosohelvolus rp+ 17 17 Рубомицин

S. fradiae rp+rp- 18 17 Неоницин

S. lavendulae rp+rp- 20 19 Стрептотрицин!

Streptovertici 11ium netropsis rp+rp 5 5 Нетропсины

hmycolatopsis mediterranei rp+ или H. 6 , a. 6 Рифамицины

Micromonospora spp. rp+rp- - 10 8 Аминогликозидг

Примечания: гр+ - грамполохительные бактерии гр- - грамотрицательные бактерии н.а.- нет активности

образовывать разные антибиотики. Один и тот же антибиотик може синтезироваться штаммами, относящимися к разный таксоноиически группам - видам, родам и даже порядкам. Ниже приведены пример выделенных и описанных нами новых продуцентов известны антибиотиков, которые подтверждают это положение.

Streptomyces cinereospinus sp. nov. Terekhova et al. CSyn. A cin&reoviridis) штамм 1719 - новый продуцент азотомицин Сдиазоиицина ВЭ из группы диазосоединений (31. Итанм 171 отличался существенными таксононическин характеристиками о известного продуцента азотомииина A. ambofaciens Pinnert-Sindic 1954 и был описан нами как новый вид. Название нового вида Í cinereospinus включено в Список узаконенных названий бактери С1986 г.З.

S. rubiginosohelvoJus штамм 3868 - новый продуцеь даунорубицина Срубомицин.а-С) {14]. Из почвенных образцов бьи выделено 17 штаммов, относящихся к виду S. rubiginosohelvolus. i штамма 3868 был выделен противоопухолевый антибноти»

»нтифицированный с даунорубицинон. Показано, что все 17 штанмов >азуют этот антибиотик СТабл.23. Таким образом, образование гнорубицина является неотъемлемым свойством вида 5. biginosohelvolus. К настоящему времени известно более 10 видов за Streptomyces. синтезирующих даунорубицин.

S.griseorubiginosus штамм ИНА 4418 - новый продуцент зтивоопухолевого антибиотика иомицина В из группы плюраницина. змицин В ранее был выделен из S. phaeovertici1 latus.

S. albolongus штамм 4297 - новый продуцент гризеовиридина и иницина. Известные продуценты этих антибиотиков - S. griseus, congolens is и S. griseoviridis.

S. cremeospinus sp. nov. Terekhova штами ИНА 85 - новый эдуцент карминомицина [7]. Впервые карминомицин был выделен из пьтуры актиномицета Actinomadura carminata. Обнаружение нами зого продуцента карминомицина показало, что этот антибиотик эсобны синтезировать акткноницеты не только рода Actinomadura. и Streptomyces.

Streptomyces cinereorectus sp. nov. Terekhova et al. штамм 52 - новый продуцент пенициллина N [5]. Впервые пенициллин N был целен из культуры гриба Cephalosporium sp., позднее - из гиномицетов 5. clavuligerus и S. lipmanii (Higgens et Kastner. ?1) и S. lactamdurans (Nagarajan et al., 1971). Эти виды эептомицетов образуют пенициллин N одновременно с цефамицином. В гсичие от них, штанм 5202 образует только пенициллин N.

Streptomyces fi1ipinensis subsp. cephamycini subsp. nov. rekhova et al. штамм 3916 - новый продуцент цефамицина С [12]. iee цефамицин С был получен из S. clavuligerus, S. lipmanii и S. ctamdurans CHiggens et al., 19713 .

Обнаружение новых продуцентов пенициллина N и цефамицина С ^жнт ещё однин свидетельством того, что эти антибиотики чтезируются не только эукариотами, но и прокариотами и что эсобностью к их биосинтезу обладают разные виды стрептомицетов.

С другой стороны, некоторые культуры актиноницетов способны 1тезировать одновременно несколько антибиотиков, принадлежащих к зным химическим группам. Так, из образца почвы нами был выделен зим актиномицета № 1009 нового вида Streptomyces oeruleoaurantiacus". образующий антибиотики двух разных

химических групп - амицетин из группы пиримидиновых оснований небраиициновый комплекс аииногликозидкых антибиотиков (24 Одновременное образование антибиотиков в таком сочетании одним те и же штанном обнаружено впервые. Известно образование апрамици ■ - компонента небрамицинового комплекса внесте с талисомицином группы Блеоницина культурой Streptoalloteichus hindustanus CTomi et al. 19775.

Однако, во многих случаях разные антибиотики образуют разньвди видами, и новые в таксономическом отношении культуры, такге культуры известных таксонов, но с необычной для данно таксона биологической активностью часто образуют и новые веществ

Следуя этому принципу, им выявили ряд культур ро Streptomyces, образующих новые антибиотики.

S. griseoruber suisp. beromycini штамм 4620 - продуце нового противоопухолевого антибиотика беромицина из груп антрациклинов (21.

■ &. bottropensisr штанм 792, образующий новый противоопухолев антибиотик, близкий к беэазотистым антибиотикам оксихиноидн природы [16 J.

Steptomyces crriseovariabi 1 is штамм 2562 - прадуце антибиотического комплекса, состоящего из двух компонентов груп кунероглшсозидоз. Один из компонентов - антибиотик 2562А идентич хларобиоцину, а второй - антибиотик 2562 В является нов представителем этой группы СЛысенкова, 1980Э [18] .

Многолетний опыт работы в области поцска продуцентов нов антибиотиков доказывает, что таксономические знания способству повышению эффективности поисковой работы. Они дают возможность первых стадиях исследования среди множества выделенных природных субстратов культур выявить и исключить из дальней!! работы культуры-аналоги, распознать продуценты извест> антибиотиков, вылвить новые культуры - потенциальные продуце1 новых антибиотиков.

Использование таксономии ииее.-т большое значение не только ранних, но и на более поздних этапах поисковой работы. Определе! видовой принадлежности культур с привлечением литературных даш об антибиотиках, образуемых этим видом, позволяет сузить к| антибиотических веществ. с которыми сравнивается выделет

гибиоткк, и во многих случаях облегчают решение вопроса о эспективности данного антибиотика для дальнейших следований.

2. Идентификация антибиотиков в экстрактах из агаровых культур продуцентов

Как отмечалось выше, на основании микробиологических данных о ксононическон положении штанна и его антимикробном спектре иозко эгнозировать природу образуемого им антибитика. Однако, для знтификации антибиотика требуется его выделение и изучение зико-химическими нетодами. что связано со значительными гратами труда и времени. Совместно с сотрудниками Отдела химии ИНА РАМН нами разработаны методы быстрой идентификации в страктах из агаровых культур продуцентов антибиотиков лиомицинов (4) и стрептотрицинов (41, 701. Продуценты этих тибиотиков, относящиеся к различным видан, в основной рода rteptomyces, часто встречаются среди выделяемых из почвы тиномицетов.

2.1. Гелионицины

Антибиотик гелиоиицин идентичен резистомицину и близок оцеомицину, от которого отличается лишь пространственным роением. Метод, ранней идентификации этих антибиотиков был зработан совместно с И. Н. Ковшаровой. Метод заключается в ектрофотометрическом определении антибиотиков типа гелиомицина в страктах из культур актиномицетов. выросших на агаровдй среде, и 13ВОЛяет проводить не только качественную, но и глуколичественную оценку содержания гелиомицинов.

Разработанный метод был использован для идентификации юдуцентов гелиомицинов среди выделяемых из почвы культур :тиномицетов. Обнаруженные продуценты антибиотиков типа >лиомицина отнесены к следующим видам: 5. variabilis. S. ïsistornyci ficus, S. f lavo ehromoge nés subsp. heliomycini. S. ^aeochromogenes. Последний ранее не был известен как продуцент :лиомицина.

2.2. Стрептотрицины

Метод выявления стрептотрицинов в экстрактах из агаровых ,гльтур актиномицетов основан на хроматографической и

Результаты идентификации стрвптотрицинов в экстрактах иэ агаровых культур актиномицетов

Таблица 3

Штанм, ВИД

Тест-организмы зоны подавления роста в нн

Выделение на смоле

Компоненты стрептотри-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 КБ-a ХАЛ-2 цинового комплекса

863 Streptomyces luridus 13 25 12 12 15 10 12 0 0 10 •4-' + B.C.D.E.F 1 £

1463 CT luridus 14 20 22 20 17 12 17 2 0 10 + отсутствуют i

1513 s. luridus 15 25 25 22 23 17 23 5 10 8 + + B.C.D

1535 s. luridus 12 16 16 15 20 12 16 5 8 10 + + B.C.D

1616 s. fulvorobous 25 20 22 25 20 10 20 7 5 10 + + отсутствуют

6143 s. roseo1 i 1acinus 10 10 .10 10 0 0 5 0 0 10 + + E.F

6505 s. toxytricini 5 10 12 12 25 18 15 Ö 0 5 + + D.E

7033 s. lavendulae 20 11 12 15 20 20 22 10 0 10 + - отсутствуют

8587 s. pallidoviolaceus 30 30 30 30 15 20 25 5 2 0 + + D.E

Припечанио: 1 - staphylococcus aureus 209Р; 2 - Staphylococcus aureus 209Р/УФ-2; 3 - Micrococcus luteus; 4 - Bacillus subtilis; 3 - Bacillus cereus subap. mycoides R: б - Comamonas terrigena; 7 - Escherichia coli K-13; 8 - Providencia stuartiv. 9 - Pseudomonas aeruginosa-, 10 - Saccharomyces cerevisiae,

ктрофоретической подвижности стрептотрицинов и продуктов их ролиэа. Метод разработан совнестно с И.В. Толстых, М. Ю. ож5новым и М. Г. Бражниковой.

Разработанный метод был применен на начальной стадии поиска ък антибиотиков для идентификации продуцентов стрептотрицнков ди выделяемых из почв культур актиноиицетов, обладающих широким ктром антибактериального действия, т.е. подавляющих рост «положительных к грамотрицателышх бактерий.

В таблице 3 приведен пример использования ■ предложенного ода для исследования 9 штампов актиноннцетов с широким спектром »бактериального действия. У 5 штаммов трех видов s агаровых ьтурах были обнаружены стрептотрицины, Изучение их тематического положения показало, что они относятся к видак S. itricinj Cl т.о. S. luridus СЗ шт. 3 . S. roscolilacinus Cl Э. Первые три вида по литературным данным известии как дуценты стрептотрицинов. Что касается S. roseoliIacinus, то для го вида способность к биосинтезу антибиотиков группы, =птотрицннов обнаружена впервые.

Предложенный метод позволяет не только идентифицировать гптотрицикы в агаровых культурах продуцентов, но и определить компонентный состав. Он помогает также отобрать продуценты ибиотиков, широкого спектра действия, отличающиеся от зптотрицпнов, которые ногут представить интерес.. для ледующего изучения как возможные продуценты новых антибиотиков

3. Поиск продуцентов антибиотиков среди актиноннцетов редких родов

Одним из актуальных направлений поиска антибиотиков является гкание продуцентов среди так называемых редких родов ■!коницетов, к когорьи откосят все роды лор. Actinomycetales, за мочением Streptomyces. В настоящее время их насчитывается более Эти роды называют редкими, поскольку они, по сравнению с »турами рода Streptomyces, значительно реже выделяются из почвы 1ИЦИОНИЫНИ методами и отличаются меньшим видовым разнообразием. >едкнх родов актиноннцетов получены такие важные для недицины 1биотикн как эритромицин, гентаннцин, то.браницин, сизомицин, :омишш, ристоницин , тейкопланпн, карпиншшшш .

Анализ хронологии' открытия прниепяемых в клинике ¡биотиков, получении:: из видор рода Streptomvces и редких родов >ллет очевидную тенденцию возрастания роли последние как

источника антибиотиков, ценных для медицинской практики (45, 5 69).

В связи с изложенным важной задачей является разработка нов методических подходов для выделения из природных субтратов культ редких родов актиноиицетов с целью поиска среди них продуцент новых антибиотиков.

3.1. Разработка селективных методов выделения из почвы актиноиицетов редких родов 3.1.1. Селективные среды

Среди большого разнообразия нетодов. применяемых д выделения микроорганизмов из природных источников, важная ро принадлежит методам селективной изоляции, основанным ингибировании роста нежелательных таксонов и создании тен сам благоприятных условий для развития редких и медленно развивающих культур. Для выделения актиноиицетов редких таксонов из поч особенна благоприятным оказался высев почвенных образцов питательные среды, содерзващие в качестве селективных агент антибиотики или другие ингибиторы роста бактерий и грибов. I ингибировании роста сопутствующей актиномицетан иикрофлс приненяли антибиотики пенициллин, хлорамфеннкол, nojymiiKct циклогексимид, нистатин и др. CNonomura et Ohara. 1971. ürchard Goodfellow. 19743, стрептомицин, ристоницин, брунеониц1 рубокицин, новобиоцин СЛаврова и др. , 1972, Преображенская и д[ 1974Э [9, Ю).

В ранних исследованиях основным подходом к разработ селективных нетодов был эмпирический. В питательные среды bhoci антибиотики в различных концентрациях и по результатам уч( виде-ляющихся мисрооргавизмов и их таксономической идентифика! делали заключение о пригодности тех или иных ингибиторов изоляции определённых групп актиноиицетов.

Бьшо показано, что различные антнбнотнкн способств: преимущественному выделению определенных родов или групп ро актиномнцетов. Так, рубоницик наиболее благоприятен для выделе культур рода Actinomadura.. на среде со стрептомицином преоблад культуры нокардиального типа. новобиоцин способств преимущественному выделен«» кнкромоноспор.

Впоследствии для разработки методов селективной изоляции гиномицетов был использован более объективный подход, основанный предварительно» изучении чувствительности к антибиотикам ?дставителей различных таксонов микроорганизмов и выявлении их »цифических особенностей Сскорость роста, оптимальная шература и др.З. Была исследована возможность использования в честве селективных агентов антибиотиков тобрамицина,гелиомицииа, эксидина, цефтриаксона. налидиксовой кислоты [52. 54, 60, 72).

Для этого предварительно была изучена чувствительность ллекционных культур актиномицетов разных родов и одноклеточных ктерий к этим антибиотикам.

Анализ чувствительности актиномицетов к тобраиицрну показал, о большинство изученных культур рода Streptomyces чувствительны низкин и средним концентрациям С5-30 мкг/илЗ этого антибиотика в еде. Среди .редких родов наиболее устойчивыми к действию браницина оказались представители родов AmycoJatopsjs, tccharopolyspora. Rhodococcus, Promicromonosрога, Actinopianes. и были устойчивы к высоким Сболее 50 мкг/млЗ концентрациям 1брамицина.

К гелиомицину оказались устойчивыми все изученные культуры :тиномицетов и большинство изученных культур бактерий.

К диоксидину большинство стрептокицетов было устойчиво, а >льшая часть представителей редких родов была к нему 'вствительна.

К налидиксовой кислоте в концентрации 10 мкг/мл оказались не гвствительными актиномицеты 22 родов, за исключением некоторых >едставителей родов Act тор ! anes и Micromonospora. Одноклеточные актерии, особенна обладающие стелющимся характером роста, которые атрудняют выделение актиноницетов в чистой культуре, или чувствительны к этой концентрации налидиксовой кислоты.

Полученные результаты позволили предположить возможность гпользования тобрамицина и налидиксовой кислоты с качестве элективных агентов для преимущественного выделения актиномицетов едких родов.

На следующем этапе работы иами были проведены опыты по «делению актиномицетов из почвы на средах с добавлением нгибиторов роста микроорганизмов.

При добавлении в среду тобрамицина в концентрации 10 мкг/мл оличество выделенных представителей редких родов возрастало rs два

раза по сравнению с контролен. Тобрамицин особенн благоприятствовал выделению культур роде

Micromonospora. Aiaycolatapsis. Streptosporangium, Saccharothrix.

Диоксидин при добавлении в среду в концентрации 10 мкг/нл н оказывал существенного влияния на выделение актиномицетов, а концентрации 50 мкг/мл ингибировал рост культур редких родов, н влияя на количество выделяющихся штаммов рода Streptomyces. H один из редких родов не получал преинущества при выделении н среде с диоксидинон по сравнению с контролен. Следовательно диоксидин непригоден для использования в качестве селективног агента при выделении из почвы актиномицетов редких родов.

На среде с цефтриаксоном в концентрациях 10 и 50 мкг/м снижалось количество выделяющихся штаннов актиномицетов ка рода Streptomyces. так и редких родов.

Новобиоцин оказался ценный селективным агентом для выделени из почвы актиномицетов родов Hicromonospora и Amycolatopsi Поэтому новобиоции можно использовать для направленного выделени относящихся к этим родам продуцентов антибиотиков типа гентамицик Сгруппа акиногликозидовЗ, ванкомицина-ристоцетина Сгрупг

гликопептидовЭ и рифаиицина Сгруппа анзамициновЭ.

На среде с новобиоцином нами были изолированы 3 культуры рол Amycolatopsis. образующие антибиотики группы гликопептидоЕ Следует отметить, что продуцент гликопептидного антибиотик эреномицика Amycolatopsis orienta lis subsp. eremomycini бь выделен НА. Свешниковой также на среде с новобиоцином. На этой s среде нани был выделен новый продуцент кетропсина S. misawaens. штамм 4284.

При выделении актиномицетов на среде с налидиксовой кислотс в концентрациях 20 и 50 мкг^ил значительно снижалось количест! одноклеточных бактерий, в то время как число актиномицетс оставалось неизменным по сравнению с контролем. Полност! отсутствовали бактерии со стелющийся характером роста, благода] чему значительно облегчалось поучение актиномицетов в чист< культуре.

Таким образом, для выделения культур редких родов из изученн! ингибиторов роста бактерий целесообразно использовать тобрамици! налидиксовую кислоту и новобиоцин. Диоксидин. цефтриаксон гелиомиичн для этой цели непригодны.

На основании проведённых исследований показана четк.

рреляция нейду данными по чувствительности штаммов актиномицетов ингибиторам роста и результатами выделения актиномицетов из чзы. Предварительное изучение чувствительности штаммов различных дов актиномицетов к ингибитору роста позволяет определить с льшой долей вероятности, какие таксономические группы можно делить с применением данного агента и в каких концентрациях его обходимо для этого использовать.

3.1.2. Предварительная обработка почвенных образцов карбонатом кальция

Для предварительной обработки почвы нами был выбран и дифицирован нетод (Тзао а1.. 1960). который заключается в кубацин образцов почвы с карбонатом кальция во влажных условиях 1]. Указанная обработка почвенных образцов приводила к елнчешш выделяющихся миикроорганиэмов, в том числе тиномицетов, на два порядка по сравнению с их количеством при севе необработанной сухой почвы. Инкубация почвы во влажных ловиях без добавления карбоната кальция также при^дила к еличешпо количества выделяющихся микроорганизмов, но в ачительно меньшей степени С Табл. 4?. Соотношение количества льтур разных родов актиномицетов, выделенных из обработанных рбонатои кальция образцов, оставалось таким же, как и при делении из необработанных образцов. Доля антибиотически активных льтур также не изменялась. Однако, в связи с тем, что при делении из обработанные образцов количество актиномицетов ачительно повышается, то, соответственно, и общее количество тивных культур су ¡цественно увеличивается, и, следовательно, зрастает вероятность обнаружения продуцентов новых антибиотиков.

В литературе имеютсл данные* о влиянии ионов клльцияг на оцессы регуляции у актиномицетов - на способность к образованию здушного мицелия, и на инициацию прорастания спор. Повышение личества выделяемых из почвы культур при еС обработке карбонатом льция может быть связано с увеличением числа проросших спор в пуляции. Повышению числа выяеленных культур может способствовать части и изменение рН почвы в процессе инкубации ей с карбонатом льция во влажной камере.

3.1.3. Комплексный метод выделения из почвы актиномицетов

Обработка почвы карбонатом г.эльция во влажных условиях ачительно увеличивает количество актиномицетов разных родов, что

Г-10

может привести к обнаружению культур, а вычныпч методами выделяющихся из-за небольшой и:: численности в почве. Вместе с те увеличивается количество часто встречающихся и быстро растуи культур актиноницетов и одноклеточных бактерий, что затрудня выделение колоний редких культур актиноницетов в чистой культур Представлялось целесообразным сочетать предварительн обработку почвенных образцов карбонатом кальция с посевон их селективные среды, содержащие ингибиторы роста. Это позволило подавить рост одноклеточных бактерий, а также элиминнроеа нежелательные и направленно выделять нужные таксоны актнномицетс

Била проведена серия опытов по выделению актиноницетов почвы, обработанной карбонатом кальция, и высеянной на селективи среду с налпднксовой кислотой (44. 60). Такая комбинация оказала эффективной для выделения многих родов актиноницетов. Обработ почвенных образцов карбонатом кальция резко увеличивает количест ¡.олокий актиноницетов. включая колонии редких культур СТабл: 4

Налиднг.совая кислота в концентрации 10 и 20 мкг.'нл полное! подавляет рост стелющихся бактерий, особенно затрудняют еыделенне актиноницетов в чистой культуре. тогда как количест актиноницетов остается статистически неизменным. Благодаря эте

Таблица

Выделение актиноницетов на селективной среде с нзлидшссовой кислотой и нистатином из предварительно обработанных карбонагой кальция почвенных образцов

Обработка почвы

нзлимчк-совая кислота нкг.'ил

КОЕ

1 г почвы Сх 10 }

одноклеточные бактерии__ актино-

всего со стелющийся ницеты

ростом

Контроль '.без обработки:) 0

4,3 г 1.4 0.32 ± 0,2

0,66 ±

СаСОэ

во влажных условиях

0 ю 20

24и ±56 1,6 ± 1.5 166

£10 ±92 0 160

206 1 79 О 160

I олонии образующие единиц«.

гло актиноиицетов, выделяющихся из обработанных почвенных разцов на. среде с добавлением налидиксовой кислоты, значительно ше, чей в контроле.

Далее был разработан метод выделения актиноиицетов из почвы, лючающий предварительную обработку почвы карбонатом кальция и сев почвенной суспензии на селективную среду с несколькими тибиотикаии: налидиксовой кислотой СЗ кгк/пЮ. тобрамицином СЗ г/млЭ, леворинон С 50 нкг/нЮ и новобиоцинок С1 ккг/КлЗ. Во ором варианте новобиоцин был заменен на ристоницин СЗ нкгУкЮ. В оих вариантах опьгга оказалось возможным выделить практически все росшие колонии актинокицегов. тогда как в контроле - только 502 ледствие их заражения сопутствующей микрофлорой.

Проведено сравнение эффективности использования

нтетического агара 127 Праузера и органического агара 2 Гаузе в ¡честве основы селективной среды. Применение органического ара 2 -.позволяет выявить большее разнообразие редких родов :тиномицетов Спри использовании одних и тех ' же селективных ■ентовЗ. Синтетический агар 127 с добавлением тобраницина, 1ЛИДИКСОВОЙ кислоты, леворина и ристомицина является гагоприятной селективной средой для выделения из почвы :тиномицетов рода Ргот^сгогпопоарога.

Предложенный комплексный метод может слуяить моделью для ,¡деления из почвы актиноиицетов желаемых таксонов. Изменяя эмлоненты этой модели с условия предварительной обработки эчвенных образцов, используемые селективные агенты с разным типом эйствияЭ можно подобрать условия для направленного выделения ультур разных таксонов актиноиицетов.

3.2. Изучение культур актиноиицетов редких родов -продуцентов антибиотиков

В процессе поиска продуцентов антибиотиков среди ктиномицетов нами были обнаружены культуры, относящиеся к редким одан. которые образуют новые природные соединения или являются овыми продуцентами известных, в том числе важных для медицины нтибиотиков [45, 50, 681.

31герЬоа11оЬе1сЪиз "сгетеиз" ИНА 2242 - продуцент тобраницина з почвенных образцов были изолированы три идентичных по ультуральным и морфологическим признакам культуры актиноиицетов, бладающих широким спектром антибактериального действия. Как было оказано в результате физико-химических исследований сотрудникани

Отдела химии НИИНА .РАИН, все три культуры образовыва. небрамициновый антибиотический комплекс.

Нами был изучен и описан штамм ИНА 2242, синтезируют антибиотик тобраницин - один из компонентов небрамициново комплекса. Шганм ИНА 2212 отличался от известного продуцек тобраницина Streptomyces tenebrarius ÎHiççrens et Kastner. 19675 был описан нани как Streptomyces cremeus subsp. tobramycini subs nov. Позднее штамм ИНА 2242 был изучен по хемотаксономическ критериям, принятым в современной систематике актиномицетов д разграничения родов (55, 68]. в составе клеточной стенки содержал мезо-диаминопимеликовую кислоту и не содеря диагностических Сахаров - арабинозы, галактозы и ксилозы., ч соответствует типу III клеточной стенки по Лешевалье, в качест основных менахинонов имел МХ-9СН42 и МХ-ЮСН^. Совокупное полученных данных показала, что пгтаки ИНА 2242 следует перевес из рода Streptomyces в род Streptoalloteîchus-

Было проведено сравнение штамма ИНА 2242 с другими описаннь в литературе продуцентами небрамицинового комплекса - с икевшии в нашем распоряжении штаммом Streptoalloteîchus hindustanus kl Э1158 и по литературным данным - с Streptomyces tenebrarius А1 17929 fGoodfellow et Сгозз. 1934) и Streptoalloteîchus hindustai ATCC31217 СTomita et al. 1967). Показано, что штамм ИНА 22 существенно не отличается от других продуцентов тобраиицина родовым характериститкам - морфологии воздушного мицелия Снали1 длинных спиральных цепочек спорЭ, морфологии субстратного мицеj Сотсутствке фрагментации, наличие склероциевЭ, типу клеточ1 стенки CHI О и составу менахинонов. Очевидно, что i рассмотренные продуценты тобраницина относятся к одному роду Streptoal loteichus- Штаим ИНА 2242 отличался от штамма АТСС 179; описанного как Streptomyces tenebrarius. вндов1

характеристиками, на основании чего сделано заключение о том, эти продуценты принадлежат к разный видам.

Actinoplanes cyaneus Terekhova et ai. штамм ИНА 156' образующий антибиотик группы целикомицинз (13]. Из образца по Сибири был выделен штамм актиномицета 1569, образующий некоторых средах синий растворимый пигмент. Клеточная сте штамма содержит мезо-ДАПК. ОН-иеэо-ДАПК, арабинозу и. ксило Воздушный мицелий отсутствует. На субстратном мицелии образую сферические спорангии. Споры обладают активной подвижност

ианоидяые пигиенты не образуются. Штамм активен в отношении* амположительных бактерий. По индикаторным сойствам. спектру -лощения и хроматографической подвижности антибиотик, образуемый анион 1569, отнесен к группе целикомицина-актинородтгка-. Штакм ícsh нани как новый вид Actinoplanos cyanaus, который включен в <ски одобренных названий бактерий . 1987 г. СТабл. 63.

Amycolatopsis "asiatica" Terekhova et al. итани ИНА 2739 -здуцент рифамицииа (50, 68]. Из образца почвы нами был злирован щ-анп актиномицета- № 2739. образующий антибиотик, [анкцин В. Гифы воздушного мицелия штамма по всей длине спадались на споры. Гидролизаты целых клеток содержали зо-диаминопимелиновую кислоту, арабимозу и галактозу. По пьтуральным и физиологическим признакам нгтанп 2739 значительно ничался от известного продуцента рифаницкпа В - StTvptomyc&r ocardia) mediterrenei. АТСС 13685. Новый продуцент рифамицина В гамм 2739 был описан нами как новый вид Nocardia asiatica. По зреиенной классификации пор. Actinomycetales оба- продуцента Рамициыа относятся к роду -Дтусо/а ¿орд] д СЛ v medit errarte i и А. siatica'O.

Actinoplanes brasiliensis атаин 3802 - продуцент нового гибактериального антибиотика группы лантибиотиков (53 J. Из »венного образца изолирован штамм актиномицета № 3802, из горого сотрудниками Отдела -химии НИИНА РАМН выделен и гнтифицирован комплекс антибиотиков группы лантибиотиков. гибиотический коиллекс содержит гардикицин СактагардинЭ и новый гибиотик этой же группы. Культура не образует воздушного <елия. На вегетативном ницелии образуются спорангии сферической ^правильной формы. При увлажнении мицелия стенки спорангия зрушаются, освобождая активно движущиеся споры.

В гилролиэатах целых клеток присутствует

so-диаминслгинелиноетая кислота и яоиосахарнды галактоза, глюкоза. Зоза. В препаратах очищенных клеточных стенок содержатся отаминовая кислота, глицин, аланин, тево-дианинопинелиновая :лота и нурамовая кислота. Пептидогликан Alг типа. В ттидогликане, поиино л?95£>-ДАПК, обнаружена в значительно меньших иичествах ££,-ДАПК С приблизительно 10:13.

Преобладающими сахарами в препаратах клеточной стенки штамма DH были галактоза и глюкоза. В качестве киноров содержались «биноза и манноза. Как правило, в клеточных стенках типа II в

существенной количестве содержатся диагностические caxaj арабиноза и ксилоза. У штамма 3802 ксилоза не обнаружена. Следу« ответить. что необычный состав Сахаров клеточных стенок типа II, частности, рода Actinoolanes, уже отмечался в литературе.

4. Изучение рода Actinomadura

Одним из родов актиноннцетов, наиболее перспективных отношениии поиска продуцентов новых антибиотиков является pi Actinomadura- Культуры этого рода образует антибиоти: разнообразного химического строения и биологического действия, актинонадур выделен оригинальный противоопухолевый антибиог каркиноницин группы антрациклинов, нашедший применение недицинской практике СГаузе и др. , 19733, получены уникальн серосодергапяе антибиотики эсперамицины, обладающие чрезвычай высокой противоопухолевой активностью CKonishi et «1. 1985 выделены новые противогрибковые антибиотики бекакокицин относящиеся к бензСсО-нафтаценхинонан, у которых обнаруже активность в отношении вируса иммунодефицита человека CHoshino га!.. 19913 .

Целью наших исследований было совершенствование метод направленного выделения - актинонадур из почвы, \|зучеь хемотаКсономнческих и морфологических признаков и физиологическ свойств, а также способности к -"^юазовани*» антибиотиков у кулы различных видов этого рода.

4.1 Чувствительнсть актиномадур к антибиотикам и негоды селективного выделения их из почвы.

Актинонадуры - относительно медленно растущие никроорганиз! Он'И требуют для своего развития богатых питательных сред, выделения актинонадур из почвы использовались селектитвные ср с антибиотикаки - пенициллином, полиииксинон и нистати CHonomura et Ohara. 1971). стрептомицином. ристоницин брунеокииином и рубоницинон СЛаврова и др. 1972, 19 Преображенская и др. 1974. 19763 и др. Однако, эти ингибиторы б выбраны эмпирически.. Научения чувствительности широкого нае видов актинонадур к различным антибиотикам не проводилось.

В настоящей работе было проведено сравнительное изуче чувствительности большого набора коллекционных и cвeжeвьtдeлe^ из почвы штаниов актинонадур С46 штанное, принадлежащих к виданЗ к антибиотикан кананицину. стрептомицину. рифанпиц>

[ивоницину. брунеокицину, рубомицину и леворину (191. отивогрибковый антибиотик леворин. как и предполагалось, не ■нетал роста ни одного из изученных шганнов даже в саиой высокой гнцентрации - 100 мкг/ил. Минимальные подавляющие концентрации :тальных антибиотиков в отношении различных видов актиномадур [рьировали в широких пределах - от 0,1 до 100 нкг/нл. Выла гнечена высокая чувствительность к этим антибиотикам культур |Дов группы "dassonvillei" по сравнению с остальными изученными ^льтурами. Спектр их чувствительности был близок к таковому у 4Дов Nocardiopsis- Интересно, что вид "dässonvillei" был юследствии переведен s род "Nocardiopsis". Наиболее устойчивым использованным антибиотикам оказался штамм Actinomadura arminata ИНА 4281 - продуцент карминомицина.

Канамицин, стрептомицин, рифампицин, оливомицин и брунеомицин кгибировали рост некоторых видов актиномадур в концентрациях ниже ,1 мкг/"нл. Следовательно, эти антибиотики ногут быть использованы ля выделения лишь некоторых видов актиномадур, которые к ним стойчивы.

Наибольшая избирательность ингибируюкего действия обнаружена рубомицина. В концентрациях ниже 10 мкг/ил рубомицин не нгибировал ни одного из изученных видов актиномадур, в то время ак подавлял рост большей части культур рода Streptomyces. На (сновании полученных данных рубомицин в концентрациях ниже 10 |кг/ил рекомендован к использованию в качестве селективного ¡гейта для направленного выделения культур рода Actinomadura.

4.2. Тонкое строение культур рода Actinomadura

В данной работе впервые было изучено тонкое строение типовых итампов трех видов, входивших в состав рода Actinomadura•■ А. carmínate ИНА 4281. A. polychroma ИНА 275S и A. citrea ИНА 1849 (35, 36J. В 1991 году в результате ревизии рода Actinomadura вид Д. polychroma был переведен в род Microtetraspora С «Toppenstedt et al., 19913. В этот же род, по нашену мнению, следует перевести и Л. carmina ta.

В электронном микроскопе JEM-100 изучали препараты-отпечатки и тонкие срезы воздушного мицелия.

Впервые продемонстрирована ультраструктура псевдоспорангиев -спорулирующих образований. описанных для некоторых видов зктикакзлур CNonomura et Ohara. 1971Э. Псевдоспорангии

представляют собой один оборот плотносагатой спирали из 6-8 спор, концевой спорой, привыкающей к противоположной стороне спирали. Образование спор в псевдоспорангиях происходит при поной расщепленных септ, свойственных спорулируювдин гифаи нноги актиноницетов.

У культур A. carmínate и A. polychroma, образующи псевдоспорангии, установлено сходство в строении септ вегетативнь гиф к некоторые различия в строении клеточных стенок. Так, у / caminata клеточная стенка более плотная и с большим числон слоев а у A. polychroma - рыхлая,-.с волнистым фибриллярным наружнь слоен.

Еще раз подтверждено наличие у актиномадур многослойных Сн менее 5 слоёвЭ клеточных стенок на примере таковых у вегетативны гиф штаммов A. citrea 1849 и A. caminata 4281. Толщин клеточных стенок колебалась от 200 до 400 А°.

Клеточная стенка спорулирующих гиф и спор Л. citrea окруяен поверхностным чехлом, состоящим из округлых структур, напонинающи виноградные гроздья. Эти структуры ответственны за бородавчаты силуэт спор. Подобное строение поверхностного чехла было описан ранее у Л. verrucosospora ССоина и др. 19755. Штамм 1849 A. citre сходен с А. verrucosospora и строением «гантелевидной споруляционной септы.

Отмечено большое разнообразие в строении септ вегетативны гиф изученных актиномадур. У A. polychroma обнаружены клетки делящиеся септани в разных направлениях.

Внутреннее строение клеток изученных культур - обычное дл клеток актиноницетов.

4.3. Биохимические характеристики культур рода Actinomadura и близкого к нему рода Nocardiopsis.

В соврменной систематике актиноницетов и родственны организмов широкое применение получили методы хинического анализа позволяющие определить аминокислотный и углеводный состав клеточной стенки и различные классы липидов клетки Сжирны* кислоты, включая миколовые кислоты, фосфолипиды, ненахиноньО. Эт: данные в настоящее время включаются в описания новых родов i видов, используются при упорядочении гетерогенных таксонов Публикации по анализу жирных кислот, полярных липидов ненахинонов, нумерическому анализу фенотипических признаков

1К-ДНК и ДНК-РНК гибридизации и секвенированию 16S РНК тцетельствовапп о гетерогенности рода Actinomadura и юбходиности его таксономической ревизии.

Данная работа была предпринята в то время, когда род ?tinomadura еще не подвергся таксономической ревизии и включал >лее 50 видов. Провести таксономическую ревизию рода долгое время ( представлялось возможным в связи с недостаточной изученностью югих видов.

4.3.1. Наличие галактозы в гидролизатах целых клеток актинонадур

Для рода ctinomadura характерно наличие в гидролизатах ;лых клеток мадурозы и отсутствие ксилозы и арабинозы. У многих гамнов найдена галактоза. Для того, чтобы оценить диагностическое <ачение галактозы для этого рода, нами было проведено изучение зстава Сахаров в гидролизатах целых клеток типовых штаммов и эежевыдзленных из почвы культур актинонадур С 81 штанм 21-го видаЭ 37), Галактоза была обнаружена у 75 штаммов. Штаммы одного и того з вида различались по наличию или отсутствию галактозы, ледовательно. присутствие галактозы не имеет диагностического качения для p. Actinomadura.

4.3.2. Тейхоевые кислоты

Тейхоезые кислоты - углеводсодержаиие полимеры клеточной тенки многих гранположительных бактерий. Они участвуют в ыполнении важных физиологических функций, связанных с регуляцией аботы автолитических ферментов, ионным обменом и другими важными роцессами жизнедеятельности клетки. Большинство представителей ода Streptomyces содержат в составе клеточной стенки тейхоевые ислоты . Эти полимеры были найдены также у Streptovertici 1 lium, \rthrobacter и ActinopJanes С Наумова и др. 1980, 1990Э.

В данной работе впервые было проведено исследование аспространенности тейхоевых кислот у штаммов различных видов рода Ictinomadura (32, 33, 38. 49, 591.

Исследование 30 штаммов, относящимся к 25 видам рода Ictinomadura. показало, что все они содержат в составе клеток ейхоевые кислоты. Как и у других родов актиноиицетов тейхоевые :ислоты актинонадур принадлежат к двум типам - глицеринтейхоевым | рибиттейхоевым.

Y 6 штаммов 4-х видов обнаружены рибиттейхоевые кислоты: citrea СЗ шт.Э, A. luteoiluorescens cl шт.3, A. pelletieri Cl шт и A. verrucosospora Cl шт.З. Кроме того, эти культуры содержали небольших количествах и глицеринтейхоееые кислоты.

Подавляющее большинство изученных видов содерж глицеринтейхоевые кислоты, что характерно и для представител других родов пор. ActinomycetaJes. У A. polуchroma ИНА 2755 и carminata ИНА 4281 обнаружены тейхоевые кислоты, которые .имеют качестве гликозильного заместителя моносахарид О-кетил-галакто СнадурозуЭ.

Разные штаммы одного и того же вида содержали один и тот тип тейхоевых кислот. Так, все i штамма А. .сгетеа содержа атипичную глицеринтейхоевую кислоту , а 3 штамма A. citrea рибиттейхоевую. Интересно, что у близкого к A. citrea вида luteof1uorescens также обнаружена рибиттейхоевая кислота. Подобь закономерность отмечалась ранее и у разных штаинов одного ву рода Streptomyces СНауиова и др. , 198CD.

Весьма вероятно, что наличие определенного типа тейхоеЕ кислот у актиномицетов является признаком, специфичным для вида, s некоторых случаях может оказаться полезным дололнигельь критерием для таксономических целей.

4.3.3. Состав менахинонов.

Состав менахинонов- был изучен у 13 штаммов С12 видов и подвидэ рода Actinomadura и 9 шганнов С9 видовЗ рода Nocardiop. [66, 63). Показана гетерогенность этих родов по сост; менахинонов СТабл. 5Э.

Культуры актинонадур содержали менахиноны с 9 изопренов! звеньями разной степени насыщенности. У Л. coeruleoviolace помимо МХ-9СН^Э присутствовал в больших количествах MX-1GCH Этот вид позднее был переведён в род Saccharothrix CKroppenst et al- , 19913.

Отмечены возрастные «Изменения в составе менахинонов в стор увеличения числа гидроизопреновых звеньев в боковой цепи, отнечалось и для представителей рода Streptomyces CSaddler et а 1985).

Исследованные штаммы рода Nocardiopsis разбиты на 3 гру (39|. В первую группу вошли №. dassonvillei и N. antarcticus. которых обнаружены менахиноны с 1Û изопреновыми единицами

зличной степенью гидрированности - МХ-ЮСН -НвЭ. Вторую группу 'ставили N. africana. N. atra, N. coeruleofusca. N. flava. N. mgispora, N. syringae. у которых выявлены МХ-ЭСН^-Н^Э. Третья руппа представлена N. trehalosei с MX-llClO. Это разделение на >уппы видов fíocardiopsis поллноетью подтвердилось

;зультатами изучения пептидогликана, фосфолипидов и тейхоевых юлот [56). Впоследствии виды второй группы N. coeruleoíusca. N. lava и N. syringae были переведены в род Saccharothrix С Grund et roppenstedt. 19903 .

4.3.4. Состав липидов

Состав жирных кислот и фосфолипидов был изучен у 70 штамнов Э видов рода Actinomadura. На основами полученных данных сследованные культуры разделены на 2 группы. В первую группу отли следующие виды: A. madurae, Д. citrea. A. coerulea. А. rernea. A. fulvescens. A. kijaniata, A. lívida. А. uteofluorescens. A. macra. A. malachitica, A. pelletieri. А. \mbrina. A. uncinate. A. verrucosospora ' и Д. ■inacea. характеризующиеся Р I типом фосфолипидов С азотсодержащие оппоненты отсутствуют^, основными жирными кислотами - 16:0, 18:1, 8-.0, 10-Ке-18:0 и соотношением 10-Ме-18:0 >10-Кэ-17:0. Вторую руппу составили виды Л. pusilla, A. carminata, А. zoeruleoviolacea, A. cremen subsp. rifamycini. A. fastidiosa. А. ferruginea. A. libanotica. "A. luzonensis", A. polychroma, Д. -ecticatena. A. roseola. A. roseoviolacea. A. rubra. A. aalmonea.

spiralis и A. turkmeniaca. Эта группа характеризуется наличиен' s составе фосфолнпидов фосфатидилэтанолаиина и ряда ^идентифицированных азотсодержащих компонентов CP IY тип росфолипидовЭ. В составе жирных кислот преобладают isro-16:1. i: 16: 0, 10-Ме-17:0 и у большинства штаннов 10-Ме-17:0>10-Ме-18: О.

Результаты исследования состава менахннонов, фосфолнпидов и жирных кислот показали необходимость разделения рода Actinomadura на два самостоятельных рода. Ревизия рода, в результате которой большая группа «ультур была переведена в род Microtetraspora на основании, главным образом, совокупности хекотаксононических признаков, осуществлена в 1990 г. CKroppenstedt et al. 19903.

4.4. Сравнительные исследования Actinomadura citrea, A.luteofluorescens и "Streptomycoides glaucoflavus"

В 1984 г. был описан новый род актиномицет

"Streptomycoides" С Zhang et al.. 1984Э . По приведённый в описан

таксономическим характеристикам этот род близок к ро

Actinomadura. Типовой вид нового рода "S. glaucoflavus"

фенотипическим признакам сходен с A. citrea и A. luteofluorescer.

Сравнительные иследования типовых штаммов "S. glaucoflavus" J

6161. А. citrea АТСС 27687 и Л. luteof1uorescens XFO 130

показало, что все три штамма не отличаются по морфологически

культуральныи и физиологическим свойствам [73]. Они были такж

очень близки и по хемотаксономическин характеристика

Пептидогликан клеточных стенок всех трех штаммов бьш Alг типа

содержал мезо-ДАПК и небольшие колличествр Li-ДАПК. Гидролиза

целых клеток содержали надурозу. галактозу и глюкозу. В соста

клеточных стенок обнаружена рибиттейхоевая кислота

аниносахарными заместителями. Преобладающими менахинонами бы

МЧ-9СН D. В составе фосфолипидов присутствов,

<s

аинноацилдифосфотидилглицерин СТип F1 фосфолипидовЭ. Полученн: результаты показывают, что изученные штаммы принадлежат к ро, Actinomadura и относятся к одному виду. Предлагает! реклассифицировать "S. glaucoflavus" и A. citrea как luteofluorescens.

4.5. Описания новых видов актиномадур.

В результате таксономического изучения выделенных из по1 культур актиномицетов выявлены штаммы, отнесённые к ро, Actinomadura, которые отличались от известных видов этого рода были описаны нами как новые виды С Табл. 6Э. Названия всех видо! за исключением описанного недавно вида Л. uncinata. были внесены Список узаконенных названий бактерий С1987 г.3.

4.6. Физиологические свойства актиномадур

Одной из задач нашей работы явилось изчение физнологическ! свойств актиномадур и определение их устойчивости к различи! ингибиторам роста для оценки пригодности этих характеристик дз дифференциации видов и выявления оптимальных услов1 культивирования [67J. С этой целью 105 штаммов, относящихся к с видам, были изучены по 198 признакам, таким, как использование

НОВЫ? ЫИ.ЦЫ ^илоо <. яиммми и — -----------

Вид Авторы Год Типовой

описания штамм

АсИпотадига соеги1еоу!о1асеа * РгеоЬгагЬепзкауа ТегекЬоуа еЬ 1976 113] ИНА 3564

АсЬ1потайига (и1уезсепз ТегекЬоУа, Са1а1епко et РгеоЬгагЬепзкауа 1982 (23) ИНА 3321

АсИпотавига ро1усЪг ота * * Galatвnko. ТегекЬоУа, РгеоЬгагИгпзкауа 1981 125] ИНА 2735

АсЫпотайига гесЫсаЬепа ТегекЬоуа. РгеоЬгагЬепикауа е£ 1964 (31) ИНА 7071

АсНпота&ига Ьигктепхасъ *" ТвгекЪоуа. ва2а±епко е£ РгеоЬгагЬепзкауа 1982 (23) ИНА 3344

АсИпотайига итЬппа ва1аСепко, ТегекЬоуа еЬ РгеоЬгагЬепзкауа 1981 (25) ИНА 2309

АсЬгпотайига "ипсгпа£а" ва1аСепко, ТегвкЬоУа вt Нис1епзкауа 1989 (581 ИНА 471

АсСгпор1ипез суапеиз ТегекЬоуа. РгеоЬгагЬепзкауа 1977 113) ИНА 1569

Примечания: 1. Все виды, за исключением АсИпота<1игй "ипслпаСа". включены в Список N 23 узаконенных названий бактерий С1987 г

2. После ревизии рода АсЫпотайига (Кгоррепз1ес1 et а!., 1991) виды, обозначенные знаком *. переведены в род ЗассНагоЪг1х. ** - в род ШсгоЬвЬ га 5 рог а

качестве источников питания Сахаров, спиртов, органических кисл и аминокислот, образование кислот из Сахаров и спиртов, разложен и гидролиз различных веществ, отношения к температурным факторам pH среды.

Полученные данные показали, что актиномадуры используют качестве источников питания широкий спектр органическеих вещест Более 59'Л исследованных штаммов потребляют глюкозу, мальтоз сахарозу, более SOX ~ адонит. арабинозу, наннит, сорбит, рамноэ Менее lOSí штаммов утилизируют целлюлозу. Более 90Я культ образуют кислоты из адонита. арабинозы. глюкозы, ксилозы сахарозы. Большинство актинонадур потребляют аминокислоты качестве источников азота и углерода, однако утилизируют их мен активно, чей сахара и спирты. В отличие от аминокислот друг органические кислоты потребляются актинонадураки незначительн Большинство штаммов не используют такие кислоты как аскорбинову винную, налеиновую. налоновую. Ни один из штамнов не использое капроновую и щавелевую кислоты.

Все исследованные штаммы растут в интервале темпера! 22-37°. при pH 7, выдерживают до NaCl в среде. Лишь отдела штанны способны развиваться при pH 5 и 9 и концентрации NaCi 60j 6/í. При 55°С отмечался рост только одного штамма - Л. fastidio: выделенного из вод горячего источника. Дополнителы

диагностическим признаком для разделения близких видов moi служить лишь спектры потребления Сахаров и спиртов. В отделы редких случаях для дифференциации некоторых близких видов moi служить и другие признаки. Так, гидролиз крахмала мо: применяться при идентификации штамнов . занимающих промежуточ! положение между видами Д. citrea и A. coeruleé. Все исследован! штаммы вида Л. citrea гидролизуют крахмал, а штаммы вида coorulea - не гидролизуют. Такие признаки как потребле: органических кислот, аминокислот, образование кислот из Сахаров спиртов являются либо общими для культур всех видов рода. л носят ярко выраженный штаммоспецифичный характер.

4.7. Изучение способности различных видов рода Actinomadura к образованию антибиотиков

Целью данного этапа работы Был направленный поиск продуцен антибиотиков среди культур рода Actinomadura и анализ взаиносв

жду видовой принадлежностью актинонадур и химической природой разуеных ими антибиотиков [17, 43, 69, 711.

Из почвенных образцов различных географических зон. обранных с учетом закономерностей распространения актиномадур в чвах (47, 651, было выделено 1550 штаммов рода Actinomadura. несенных к 25 видам. Антибиотически активными при льтивировании на твердой питательной среде оказались 660 штампов З/О. Из 43 штаммов актиномадур сотрудниками Отдела химии НИИНА МН были выделены антибиотические вещества, изучены их зико-хинические свойства и проведено сравнение с известными тибиотиками.

Из штамма № 308 описанного нами нового вида A. recticatena ill выделен антибиотик, который по данным, полученным >трудниками Отдела химиотерапии РАИН,, высоко эффективен при чении экспериментальных опухолей мышей, подавляет развитие :мфаденоза NK/LY на 86-909S, саркомы 180 - на 84-96Х, [мфосаркомы ЛИ0-1 - на 70Н, аденокарциномы Эрлиха - на 80-87^. [тибиотик 308 идентичен антибиотику ВВМ-928 СлузопептинуЭ из >уппы ЦШСЛОПб ИТ ИД 0В. Высокая противоопухолевая активность.

Таблица 7

Антибиотики, выделенные из культур различных видов рода Actinomadura

Вцды Число Антибио- Антибиотики

изученных тическая штаммов активность

. carminata . rubra . madura . sp. rxov. . rect¿catena . fu 1vescens

. cremea

. verrucosospora . сitrea

4 гр+ , on _ 3 rp+

3 rp +

2 rp+

6 rp+

2 f"P+. on

2 rp +

5 rp+. on 2 rp+. on 2 rpi. on

кармкнокицин

мадуромицин

продигиозины

продигиозины

лузопептины

новые природные соединения

не идентифицированы с известными

группа эсперамицинов

группа эспераннцинов

ауреотршшны

способность прочно связываться с ДНК путей бифункциональног интеркалирования, отсутствие ниело-, нефро- и гепато- токсичност предполагают дальнейшее изучение этих антибиотиков и их аналогов.

Научный интерес представляют также антибиотики, образуеиь: штаммами ИНА 3321 и ИНА 3832 описанного нами нового вида Л fulvescens. Они обладают антибактериаьной активностью in vitro имеют оригинальные спектральные характеристики, позволяющи предположить новизну их структуры (61).

Из А. verrucosospora 23541 и A. citrea 16033 выделен противоопухолевые антибиотики группы эспераиицинов. Антибиотик этой группы считаются перспективными для клинического применения.

Прослеживалась определённая взаимосвязь между видово принадлежностью актиномадур и химической природой образуемых им антибиотиков. Так, все изученные штаммы A. carminat> образовывал карминоиицин, Д. rubra - надураницины. A.madura - продигиозинм, А recticatena зр. nov. - лузопептшш, Д. fuívescens sp. nov. близкие антибиотики, представляющие собой новые природньп соединения С Табл. 7Э.

Можно заключить, что для ряда видов рода Actinomadura характерно образование определенных антибиотиков.

В результате изчения большого числа штаммов рода Actinomadur

представителей различных видов подобраны уславт культивирования, наиболее благоприятные для первичного обнаружены! антибиотической активности у культур этого рода в процессе поиск, новых антибиотиков [57, 67, 71].

Заключение

Итогом многолетних исследований, основные результаты которьо представлены в данной работе, явилось дальнейшее развитие системь поиска продуцентов антибиотиков среди актиномицетов на основ« совершенствования классификации и идентификации актиномицетов, разработки методических подходов к поиску антибиотиков среди редких родов актиномицетов, создании новых методов селективного выделения актиномицетов из природных источников.

Разработанные стандартные описания видов и ключи для и> идентификации, предложенные новые методы выделения актиномицетоЕ из почвенных образцов и созданная в результате широкомасштабного выделения актиномицетов из почв коллекция культур актиномицетоЕ широко используются в работе Института по изысканию новых антибиотиков РАМН и других научных учреждений.

выводы

X. На основании сравнительного экспериментального изучения ювых вгтаннов и с учбтом оригинальных описаний видов составлены стандартной схене описания 100 видов рода Streptomyces, [надлежащих к сериян Albocoldratus. Chyrysomallus. Chromogenes и ilaceus. Описания включают ограниченное число легко

>еделяемых признаков, достаточных для дифференциации видов -иномицетов, и содержат сведения об антибиотиках, выделенных из iHHOB данного таксона. Упорядочена ноненклатура в соответствии с фекенными требованиями, для ряда видов установлены синонимы.

Созданы ключи для идентификации видов исследованных серий >ептомицетов.

2. Из почвенных образцов различных географических зон далены культуры актиноиицетов рода Streptomyces - продуценты !ых противоопухолевых антибиотиков: беромицина, принадлежащего к шпе антрациклинов, антибиотика N 792, близкого к безазотистым гяинениям оксихнноидной природы и антибактериального антибиотика Ï562B, относящегося к группе кумерогликозидов, а также новые эдуценты известных антибиотиков: азотомицина, даунорубицина, >минокицина, ионицина В, пеницилллина N. цефаницина С, {зеовиридина и этамицина.

3. Разработаны методы идентификации антибиотиков группы пионицина и стрептотрицинов в экстрактах из агаровых культур эдуцентов на ранней стадии работы по поиску новых антибиотиков.

4. Описаны и узаконены Свключеньг в Одобренные списки званий бактерий? новые виды рода Streptomyces - 5. atrovirens.

carpaticus, S. cinereorectus, S. cinereospinus, S. lachitospinus, S. monomycini. S. violaceorubidus. рода tinCimadura - A. coeruleoviolacea. A. fulvescens. A. polychroma. recticatena. A. turkmeniaca, A. umbrina и рода Actinoplanes -cyaneus.

5. Среди выделенных из почвы культур редких родов тиномицетов отобрана культура Actinoplanes brasi1iensis. из торой выделен новый антибиотик N 3802 из группы лантибиотиков. явлены и описаны новые продуценты антибиотиков рифамицина В Iycolatopsis (Nocardia) "asiatîca" sp. nov., тобраницина rept-oal loteichus "cremeus" sp. nov.. целнконицина - Actinoplanes

cyaneus. лузопептина - Act inomadura recticatena sp. nov. На штам

- продуценты рифамицина и тобрамицина получены авторск свидетельства.

6. Проведены электронно-микроскопические исследован типовых штампов Act inomadura carminata. A. polychrome, образуют псевдоспорангии, и A. citrea с короткими цепочками спор. Вперв продемонстрирована ультраструктура псевдоспорангиев. Показано, ч псевдоспорангии представляют собой один оборот плотносжат спирали из спор с гладкой поверхностью. Образование спор псевдоспорангиях происходит с помощью расщепленных споруляционн септ, свойственных спорулирующнм гифам многих актиномицето Отмечено большое разообразие в строении септ вегетативных г изученных актиномадур и деление клеток в различных направления Тонкое строение спор, споруляционних септ, клеточных стенок поверхностного чехла A. citrea подобно таковому

исследованной ранее A verrucosospora.

7. Впервые изучено распространение тейхоевых кислот штампов различных видов рода Actinomadura. Тейхоевые кислоты бы обнаружены у всех 30 исследованных штаммов. Подавляющ большинство штаммов содержало глицеринтейхоевые кислоты, ь штамм

- рибиттейхоевые кислоты. В составе глнцеринтейхоевых кислот carminata и Д. polychroma в качестве гликозильного заместите впервые обнаружена мадуроза. Итанны одного вида содержали один тот же тип тейхоевых кислот. Это позволяет предполагать, ч наличие определённого типа тейхоевых кислот являет видоспецифичным признаком, который может быть исполльзован к дополнительный таксономический критерий.

8. Исследование состава менахинонов у видов poi Actinomadura и Nocardiopsis выявило возрастные изменения в соста менахинонов в сторону увеличения числа изопреновых звеньев боковой цепи. Это свидетельствуют о том, что при изучен состава менахинонов у микроорганизмов для получения сопостави!^ результатов необходимо использовать культуры, находящиеся в оди и той же фазе роста.

9. Изучение физиологических свойств культур различных ей/ рода Actinomadura показало, что большинство признаков являют штамиоогтрпифичнмми и не могут 5мть иеполь.зояаны лля дифференцмаг Ридов этого рода. Лишь некоторые ИЗ НИХ, такие как спектр

- 37 -

:pgбдения Сахаров и спиртов, могут служить дополнительными гактериетиками видов актиномадур. Вместе с тем, большой набор шологических признаков в совокупности с морфологическими и Еьтуральшат признаками мохет быть использован для разделения :ьтур нэ только на уровне вида, но и рода.

10. Установлено, что виды Actinomadura citrea, uteo fluoresceins и "Streptomycoides glaucof lavus" не имеют ,ественных различий по норфологическин, биохиичееким Стип тидогликана, состав диагностнчскик Сахаров, менахинонов, фолипидов, тип тейхоевой кислотьО, культуралышм и зиологическим признакам. Предлагается объединить их в один вид

luteofluorescens.

11. Установлено наличие выраженной взаимосвязи между видовой :надлежностью культур рода Actinomadura и способностью к ¡синтезу антибиотиков определенных групп. Так, для Л. carmmata |актерно образование карминомицинов, A. rubra - мадураминин'-п. madura - продигиоэинов, A. rect ¡catena - лузопептинов, А. -rucosospora - эсперамицинов.

12. Для выделения культур актикомицетов редких родов из почв >аботаны селективные среды с антибиотиками ристоншшном, Зомицинон, налидиксовой кислотой, тобрлмицинои. Показано, что зличные антибиотики способствуют выделению актиномпц^тов ^еделбнных родог.'.

13. Разработан комплексный метод выделения актиномицетов чких таксонов из лочвн, сочетающий• предварительную обработку чвенного образца карбонатом калльция с последующим высевом чвенной суспензии п.э селективную среду с несколькими тибиотиками. Обработка гючвы карбонатом кальции способствует зкому увеличению количеств.* выделяющихся мнуроорганизипв, лючая актиноиицеты разных родов, а внесенные в среду ингибиторы ста элиминируют микроорганизмы нежелательных такеинои.

- 38 -

Список основных опубликованных работ по теме диссертации

1. Преображенская Т.П., Терехова J!. П., Ковшарова И. 1 Киевская J1.H. , Максинова Т. С. Новый вид Actinomyces atrovirens его антибиотические свойства. /V Антибиотики - 1971 - № 12 с. 1059-1064.

2. Гаузе Г.ф. , Максинова Т. С., Ольховатова 0.J Терехова Л.П., Кочеткова Г.В., Ильченко Г.Б. 0бразова1 антибиотика бероницина культурой Actinomyces griseoruber v< beromycini var.nov. // Антибиотики - 1972 - № 1 - с. 8-11.

3. Коробкова Т.П., Терехова JI. П. , Максинова Т. С Кочеткова Г.В., Ольховатова 0.Л., Ильченко Г.Б., Преобрагенск Т.П., Гаузе Г.Ф. Образование антибиотика 1719 культур Actinomyces cinereoviridis sp. nov. ss Антибиотики - 1972 - № 8 с. 683-689.

4. Терехова, JI. П. , Ковшарова И.Н. , Преображенская Т. Г Прощлякова В.В., УЭеолина P.C.. Нечаева Н.П. , Успенская Т. А Максинова Т.С. Идентификация антибиотиков группы гелиомици на стадии агаровых культур. s/ Антибиотики - 1973 № 5 с. 457-461.

5. Чугасова В.А., Терехова Л.П., Федорова Г.Б. Образован антибиотика пенициллина N новый видон актиномицета Actinomyc cinereorectus. ss Антибиотики - 1974 - № 3 - с. 195-198.

6. Preobrazhenskaya T.P. , Lavrova N.V. , Sveshnikc M.A. .Terekhova L.P. New speciec of the genus Actmomadut isolated from soll. // The Actlnomycetologist - № 24. - Pc Congress SympoBium on actinomycetes: Abstracts.- Kyoto. Septemt 8-9, 1974.

7. Гаузе Г.ф,, Терехова Л.П., Максимова Т.С., Ольховато О. Л.,Лаврова Н.В. , Брахникова М.Г. , Константинова Н.В. , Мьшенце Т. М. . Олсуфьева E.H. Новый продуцент карминомицина Actinomyc cremeospinus sp. nov. - Антибиотики - 1975 - № 5 - с. 389-393.

8. Преображенская Т.П., Терехова JÎ. П., Козлова А. H Егорова С.А. Образование Actinomyces œalachitospinus s nov., физиологически активного вещества, стимулирующе формирование зигот у Mucorales. ss Микробиология - 1973 - в. 4 -с. 641-643.

9. Преображенская Т.П., Лаврова Н.В., Свешникова M.А Терехова J1. П. Применение селективных сред с антибиотиками д выделения из почвы актиномицетов. ~\1 съезд Всесоюзно:

эобиологического общества: Тезисы докладов,- Ереван, 1975

гг.

10. Preobrazhenskaya Т.P.. Sveshnikova М.А. , Terekhova L.P., rmonova N.T. Selective isolation of soil actinomycetea. // In: cardia and Streptomyca"Intern. Syrop. on Nocardia and eptomyces. - Warsaw 1976. - Ed. Mordarski M. et al., 119-124.

11. Преображенская Т.П., Терехова Jl.П., Лайко А. В. , эзнева Т. И. , Зенкова В. А., Блинов Н. 0. Новый вид inomadura coeruleoviolacea sp nov. и его антагонистические йства. X/ Антибиотики - 1976 - Н° 9 - с. 779-784.

12. Гаузе Г.®., Чугасова В. А., Терехова Д. П.. Лоиакина Н.Н. , црова Г.Б. Новый продуцент цефаницина С Streptomyces ipinensis var. cephamycini var. nov. //Антибиотики - 1976 - H° 12 . 1059-1062.

13. Терехова Л.П., Садикова О.А., Преображенская Т.П. Новый Actinoplane3 cyaneus sp.nov. и его антагонистические свойства.

нтибиотики - 1977 - № 12 - с. 1059-106Э.

14. Лапчинская О. А. , Сабурова Т.П., Синягина О. Л. , стантинова Н.В., Оиличева В.А., Нечаева Н.П. , Терехова Л. П., лина Р.С. Спонтанная и индуцированная изменчивость Actinomyces 'iginosohelvolus. ss Антибиотики - 1975 - № 1.2 - с. 1061-1065.

15. Preobrazhenskaya Т.P., Sveshnikova И.А., Terekhova L.P. for identification of the species of the genus Actinomadura.

liology of the actinomycetes and related organisms - 1977 - v.12 1 - p. 30-3B.

16. Федорова Г.Б. , Лаврова M. ф. , Ломакина Н.Н. , Терехова ., Иваницкая Л.П., Макухо Л.В. Новый антибиотик, азуеныП Actinomyces bottrcpensis. //Антибиотики - 1977 - № 1 -3-7.

17. Preobrazhenskaya Т.P.. Sveshnikova М.А.. Maximova T.S.. lovatova 0.L,. Chormonova N.T., Terekhova L.P. Antibiotic iperties of actinomadura. // Intern. Symp. on Antibiot.: ¡tracts. - Weimar. 1979 - № E-2.

18. Гаузе Г. Ф. , Терехова Л. П., Преображенская Т.П., I.Коробкова. Образование антибиотика 2562 культурой актиноницета -eptomyces griseovariabi 1 is- У у Антибиотики - 1977 - № 9, 643-647.

19. Терехова Л. П., Галатенко О.А., Преображенская Т.П.

Чувствительность актиномицетоэ рода Actinomadura к некотог антибиотикам. /У Антибиотики - 1981 - № 5 - с. 345-349.

20. Терехова Л.П. , Преображенская Т.П. Значение таксонов актиномицетов для изыскания новых антибиотиков. ss Антибиот^ СНРБЭ - 1982 - с. 16-19.

21. Terekhova L.P.. Preobrazhenskaya Т.Р. Importance actinomycetes taxonomy for the search of new antibíotics. í Judi lee National Conf. on the Production and Applic. of t Antibiotlca, Bulgaria: Summaries. - 21-26 Sept. 1981 - p. 6.

22. Галатенко o.A-, Терехова Л.П., Преображенская Т.П. Ное виды актинонадур, выделенные из почвы Туркмении, и антибиотические свойства. /у Антибиотики - 1981 - № 11

с. 803-807.

23. Терехова Л.П., Галатенко О.А., Преображенская Т.П. Ное виды Actinomadura fulvescenes sp. nov. и Actinomadura turkmenic sp.nov. и их антагонистические свойства. ^Антибиотики - 1982^ № - р. 87-92.

24. Гаузе Г.а., Преображенская Т.П., Терехова Л. П. , Максим Т.е., Аверичева Л.Н. Образование антибиотиков из труп пиринидиновых оснований и группы аниногликозидов культур Streptomyces coeruleoaurantiacus sp. nov. ss Антибиотики - 19 -№ 4-е. 3-7.

25. Галатенко О.А., Преображенская Т.П., Терехова Л.П Борисова В.Н., Федорова Г.Б. Распространение актиномицетов ро Actinomadura в светло-каштановых почвах Волгоградск области. /V Антибиотики - 1982 - № 11 - с. 3-10.

26. Гаузе Г. Ф. , Преображенская Т.П., Свешникова М. А Терехова Л.П. Определитель актиномицетов. Роды Streptomyce streptoverticillium, Chainia. // М. «Наука» - 1983.

27. Терехова Л.П. , Максимова Т. С. Серия Chrysoma1lus. // кн.: «Определитель актиномицетов. Роды Streptomyce Streptoverticillium. Chainia». - М., 1983 - с. 77-84.

28. Терехова Л.П. Серия Chromogenes. // Тан же - с. 85-101.

29. Терехова Л.П. Серия Violaceus. ss Так же - с. 102-120

30 Терехова Л.П. Серия Albocoloratus.// Тан же - с. 176-18

31 Гаузе Г.Ф.. Терехова Л.П., Галатенко О.А., Преображенска Т.П., Борисова В.Н. , Федорова Г.Б. Новый вид Actinomadt recticatena sp. nov. и его антагонистические свойства. У Антибиотики - 1984 - № 1 - с. 3-7.

32. Потехина. Наумова И, Б., Терехова J1. П.. Преображенская

Тейхоевые кислоты актинонадур. II Всесоюзная конференция

ультаты и перспективы научных исследований никробных сахаридов» - тезисы докладов - Ленинград. 1984 - с. 40-41.

33. Потехина Н. В. . Терехова JI. П. . Преображенская Т.П.. ова И.Б. Распространение тейхоевых кислот в представителях

Actinomadura.// Микробиология - 1985 - т. 54 вып. 4

45-548.

34. Таптыкова С.Д., Терехова Л.П.. Аданин В.И. Состав хинонов у Nocardiopsis spp. В кн. : «Достижения обиологии - практике» - • VII съезд Всесоюзного никробиол. ства: Тезисы докладов - Изд. «Наука» Каз. ССР. - 1985 - т. 1 -8.

35. Куимова Т.ф., Терехова Л.П. Тонкое строение некоторых в рода Act inomadura. ss Микробиология - 1986 - т. 55 - вып. 6

996-999.

36. Kuimova T.F.. Тегеkhova L.P. The fine structure of :nomadura spp. // International Symposium on the Bioloqy of nomycetes: Abstracts.- Debrecen. Hungary. 1936 - № P-208.

37. Terekhova L.P.. Preobrazhenskaya T.P.. Galatenko O.A. irrence of galactose in the whole cell hy(lrolvsat.e3 of Inomadura strains. // The Actinomycetes - 1985-1996 - v. 19 -: - p. 73-81.

38. Naumova I.В.. Potekhina N.V.. Terekhova L.P.. >brazhenskaya T.P.. Djgimbay K. Cell wall polvol phosphate Triers of bacteria belonging to the genus Act inomadura. // iogical. biocbem. and biomed. aspects of actinomycetes.-:eedings of the 6 Int. Symposium on Actinomvcetes biolouv. ).- Ed. Szabo G. et al. Akad. Kiado, Budapest. 1986 - Part В -561-566.

39. Терехова, Свешникова M.A., Преображенская Т.П.. Проблемы зичного отбора продуцентов новых антибиотиков. Доклады :ок>зиой конференции «Проблемы изыскания и биотехнологии новых 1биотиков», 1982.- В кн.: «Механизмы йиосинтезп антибиотиков», «■ка» - 1986 - с. 140-148.

40. Naumova I.B.. Potekhina H.V.. Digimbay С., Shashkov A. Terekhova L.P. . Preobrazhenskaya T.P. Cell wall polymers Actinomadura carmínate INA 4281. // Archives of Microbiology 1986 - v. 146 - p. 256-262.

41. Терехова JI. П. , Новоженов И. Ю. , Толстых И. В. Идентифика антибиотиков группы стрептотрицинов на стадии агаровых культур. Всесоюзная конференция «Биосинтез вторичных метаболитов»: Тез докладов - Пущино, 1987 - с. 92.

42. Преображенская Т.П., Терехова Л.П. Значение системах актиноиицетов для ранней идентификации продуцентов в проце поиска новых антибиотиков. Всесоюзная конференция «Биосин вторичных метаболитов»: Тезисы докладов - Пущино. 1987 - с. 1143. Терехова JI. П. . Галагенко О. А.. Преображенская Т

Направленный поиск продуцентов антибиотиков среди актиномадур. Антибиотики - 1988 - № 12. с. 930-934.

44. Алферова И. В. . Терехова Л.П.. Праузер X. Селектив среда с налидиксовой кислотой для выделения актиноиицетов продуцентов антибиотиков. Первый советско-американс синпозиуи по антибиотикам и химиотерапии: Тезисы докладо Москва, 1988 - с. 5-6.

45. Терехова Л.П. , Преображенская Т.П., Галатенко О. А. По новых антибактериальных антибиотиков из редких ро актиноиицетов. уу Там же - о. 59-61.

46. Алферова И.В., Терехова Л.П. Применение мет обогащения почвы карбонатом кальция с целью выделе актиноиицетов. /у Антибиотики и химиотерапия - 1988 - № 12 с. 888-890.

47. Galatenko О.Д., Preobrazhenskaya Т.Р., Terekhova L Distribuí ion of actinomycetes in soil. // Seventh Inte Symposium on biology of actinomycetes - ISBA'88: Abstracta Tokyo, Japan, 1988 - № 1-34. p. 101.

48. Naumova I.B.. Streshinskaya G.M., Terekhova L. Shashkov A.S. Cell wall polymers of Actinomadura polychroma.

id. - № 1-26. p. 97.

49. Потехина H.B. , Наумова И.В., Пашков А.С., Терехова Л.П. йхоевая кислота в клеточной стенке Actinomadura сгетва ИНА 292

Всесоюзная конференция «Регуляция микробного метаболизма» зисы докладов. — Пупино.1989 — с. 17.

50. Терехова Д.П., Преобрахенская Т.П., Галатенко О.А. Поиск вых антибактериальных антибиотиков из редких родов тиномицетов. у у Антибиотики и химиотерапия - 1989 - № 5 -

390-394.

51. Стрешинская Г.М. , Тульская Е. М. . Терехова JI. П. . Галатенко А., Преображенская Т.П. Некоторые хеиотаксономические критерии да Nocardicpsis. // ДАН СССР - 1989 - N° 2 - с. 477-480.

52. Галатенко О.А. , Терехова Л.П., Алферова И.В., эображенская Т.П. Изучение возможности использования Зрамицина, лонгацефа и диоксидина в качестве селективных гитов. уу II Всесоюзный семинар «Актуальные направления поиска гибиотиков» — Тезисы докладов - Алма-Ата, 1989.

53. Лайко А. В. . Терехова Л. П. , Сумарукова И. Г. , Толстых И. А. . гтчанова У. А.. Федорова Г. Б., Архангельская Н.М. , Малкова И. А. $ый антибиотик-полипептид, образуемый культурой актинсницета. у у i же.

54. Терехова Л.П,, Галатенко О.А. . Алфёрова И. А. Принципы активного выделения продуцентов антибиотиков уу Таи же.

55. Терехова Л.П., Галатенко О.А., Преображенская Т.П. 1ьтуры редких родов актииомицетов - продуцентов антибиотиков >раницина и зреномицина. у У Там же.

56. Терехова Л.П., Галатенко О.А., Толстых И.В., Олльховатова I. . Малкина Н. Д. , Рубцова Е.В. Образование антибиотиков ¡личными видами рода "Actinomadura" у у Гам же.

57. Руденская Ю. А., Терехова Л.П. Влияние неорганических шей различных элементов на рост и образование антибиотиков у гьтур рода Actinomadura. /у Там же.

58. Галатенко О.А.. Терехова Л.П. . Руденская Ю.А. , Евтушенко [. , Акимов В.Н. Новый вид Actinomadura uncinata. // робиология - 1989 - т. 58 - вып. 6 - с. 1007-1013.

59. Потехина Н.В.. Терехова Л.П. , Наумова И. Б. Полимеры [еточной стенки Actinomadura сгетеа. уу Микробиология — 1989 -

- 44т. 38 - вып.З - с. 4,52-456.

60. Алферова И. В. . Терехова Л.П.. Праузер X. Селективн среда с налидиксовой кислотой для выделения актиноиицетов продуцентов антибиотиков. У/ Микробиология - 1989 - N 5 -344-348.

61. Збарский В.Б.. Галатенко О.А. . Терехова Л. Г Ольховатова 0.Л.. Иалкина Н.Д. , Рубцова Е.В.. Толстых И. Антибиотики, образуеиые Actinomadura fulvescens. // Антибиотик! хиниотерапия - 1989 - № 12 - с. 883-885.

62. Taptykova S.D.. Terekhova L.P., Adanín V.M. Menaquini composition of Nocardiopsis spp. // F.E.C.S. Fifth Internat. Coi on Chemistry and biotechnol. of biologically active product; Conf. Proc.- Varna. Bulgaria. 1989 - vol. 4.- p. 452-454.

63. Таптыкова С. Д.. Терехова Л.П., Аданин В.М. Сос-менахинонов у Nocardiopsis spp. и некоторых Actinomadura spp. Микробиология - 1990 - т. 89 - вып. 4 - с. 647-650.

64. Терехова Л.П. , Галатенко О. А., Алферова И. Использование селективных сред для выделения актиноиицетов. у у кн. : «Поиск продуцентов антибиотиков среди актиноиицетов ред! родов»- Алма-Ата, «Гылым» - 1990 - с. 5-12.

65. Галатенко 0. А. , Преображенская Т.П., Терехова Л, Направленное выделение актинонадур из различных почв, у/ Тан же с. 13-19.

66. Терехова Л.П. , Алферова И. В. Комплексный нетод выделе] из почвы актиновицетов-антагонистов. /у Тан же - с. 20-28.

67. Руденская Ю. А. Терехова Л.П.. Галатенко 0 Физиологические свойства актинонадур. уу Там же -с.66-69.

68. Терехова Л.П., Галатенко О.А., Преображенская Т Антибактериальные антибиотики из культур редких ро, актиноиицетов. уу Тан se - с. 70-75.

69. Терехова Л.П., Галатенко О.А., Преображенская Т Образование антибиотиков культурами рода Actinomadura. // Там - с. 76-82.

70. Терехова Л. П., Новоженов М. Ю. , Толстых И. В., Бражник* М.Г. Ранняя идентификация антибиотиов группы стрептотрицин УУ Антибиотики и химиотерапия - 1991 - № 3 - с. 15-17.

71. Терехова Л.П. , Галатенко О.А. , Преображенская Т.

стых И. В., Ольховатова O.JI. , Малкима Н.Д. , Рубцова Е. В. Виды a Actinomadura как продуценты антибиотиков. /V Антибиотики и иотерапия - 1991 - № 1 с.' 3-5.

72. Терехова Л. П., Галатенсо O.A., Алферова И. В., сбразенская Т.П. Сравнительная оценка некоторых ингибиторов та бактерий в качестве селективных агентов для выделения иноницетов. //Антибиотики и хиниотерапия - 1991- № 10 - с. 3-8.

73. Terekhova L.P.. Galatenko O.A., Rudenskaya Yu. A., nova I.B., Streah i nakaya G.M.. Tulskaya E.M. Proposal of las3ification of Act inomadura citrea and "Streptomycoides ucoflavus" аз Act inomadura luteofluorescens. // Internat. Symp. Biology of Actinomycetes - ISBA 1991: Abstracts - Wisconsin, ison. USA, 1991.

Сдано в набор ц.08.92 В начать 11.08.92

фармат 60x901/16 Печать офсвтдая

Усл. печ. л. 3,0 Усл. хр.-отт. 3,12 Уч.-изд. л. 2,6 5

Тир. ЮО эхэ. Зак. 4150

Производственно—вадательскиЯ комбинат ВИНИТИ 140010, Люберцы 10, Московской обл., Октябрьский проспект, 403