Автореферат и диссертация по медицине (14.03.07) на тему:Изучение биологической активности природных гиполипидемических соединений

На правах рукописи

ГОТОВЦЕВА Варвара Юрьевна

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРИРОДНЫХ ГИПОЛИПИДЕМИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ

Специальности: 14.03.07 - Химиотерапия и антибиотики, 03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

6 MAP 2913

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2013

005050434

005050434

Работа выполнена на кафедре «Экологическая и промышленная биотехнология» Московского государственного университета инженерной экологии и ООО «Виорин» (ранее - сектор коллекции культур Государственного научного центра по антибиотикам).

Научные руководители доктор биологических

наук

Бибикова Маргарита Васильевна

кандидат биологических наук Кустова Надежда Алексеевна

Официальные оппоненты доктор биологических

наук

Лапчинская Ольда Анастасьевна кандидат биологических наук Сергеева Алла Владимировна

Ведущая организация

Химический факультет Московского государственного университета имени М.В Ломоносова

Защита диссертации состоится » 2013 г. в ^на заседании

диссертационного совета Д 001.005.01 при Научно-исследовательском институте по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН по адресу: 119021, Москва, ул. Большая Пироговская, дом 11

Тел./факс: (499) 245-0295

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Научно-исследовательском институте по изысканию новых антибиотиков им. Г.ФГаузе РАМН

Автореферат разослан «^У»201 Зг. Ученый секретарь

диссертационного совета, /Я (-А—ч В.И. Пономаренко

кандидат фармацевтических наук /

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Важнейшим событием в лечении сердечнососудистых заболеваний явилось открытие и внедрение в лечебную практику группы лекарственных средств, продуцируемых микроорганизмами - статинов, способных снижать уровень холестерина в крови пациентов. При этом оказалось, что статины и их полусинтетические аналоги являются биологически активными соединениями, проявляющими значительный плейотропный эффект — выступают в роли иммуносупрессоров нового типа и являются низкоактивными фунгицидными антибиотиками. Показано, что ловастатин способен модулировать длину теломеров лимфоцитов у пациентов, длительно принимавших препарат (ВгоиПейе, 2007). Также, согласно последним исследованиям, гиполипидемические препараты из группы статинов, а именно ловастатин, могут применяться в комплексном лечении рака, значительно облегчая симптомы и останавливая распространение опухоли (СаШгеП, 2009, Чочиева, 2006).

Из литературных данных известно, что специфические ингибиторы теломеразной активности (ТА) в клинике не применяются, но спрос на такие соединения для науки и практики очень велик, поэтому поиск и получение модуляторов образования теломеразы является весьма перспективным.

Гиполипидемические препараты в высокой концентрации ингибируют образование биопленок (Пужевская и др., 2009) и могут применяться в комплексной терапии после некардиологических операций для предотвращения различных инфекций, в том числе псевдомонадных, а также проявляют антиоксидантную активность (Пужевская, 2009). В связи с плейотропностью эффектов гиполипидемических соединений при длительном применении препаратов группы статинов в высокой дозе часто происходит развитие побочных эффектов в виде гиперферментемии, миопатии, рабдомиолиза. Эти данные определяют необходимость поиска новых природных соединений, проявляющих гиполипидемическую активность с улучшенными свойствами; с другой стороны, поиск новых гиполипидемических соединений можно рассматривать и как метод поиска природных соединений, затрагивающих различные стороны биогенеза живой клетки, специфичность и перспективность которых раскрываются при их детальном и всестороннем исследовании.

В лаборатории коллекции культур Государственного научного центра антибиотиков (ГНЦА) были выделены и отобраны штаммы микроорганизмов, продуцирующие метаболиты, ингибирующие синтез холестерина в клетках гепатоцитов человека по включению меченого Н3 ацетата в холестерин, при контроле отсутствия или небольшого снижения его включения в белок (Бибикова и др., 2003). Эффективность комплексных препаратов была оценена на кроликах с экспериментальной гиперхолестеринемией. Было показано, что

эти препараты в значительно меньших концентрациях, чем субстанция ловастатина, ингибировали синтез общего холестерина, синтез триглицеридов, увеличивали уровень липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) и снижали уровень липопротеидов низкой плотности (ЛПНП).

Исходя из всего вышесказанного, можно заключить, что широкое исследование биологического потенциала природных соединений, проявляющих гиполипидемические свойства, на наличие антибиотической активности, способность ингибировать механизм кворум-сснсинг (quorum sensing, QS) бактерий и влияние на фермент теломеразу, является важным и перспективным направлением и определяет актуальность данной работы.

Целью работы являлось изучение биологической активности комплексных природных соединений с гиполипидемической активностью, продуцируемых актиномицетами.

В связи с поставленной целью основные задачи исследования были сформулированы следующим образом.

1. Изучение антибиотического спектра исследуемых соединений.

2. Оценка спектра антигрибковой активности штамма №59.

3. Изучение действия комплексных природных соединений на образование бактериальных аутоиндукторов.

4. Определение влияния изучаемых соединений на экспрессию факторов вирулентности ряда бактерий и образование бактериальных биопленок.

5. Оценка совместного действия изучаемых соединений с гентамицином.

6. Изучение действия соединений на фермент теломеразу и возможности ингибирования опухолевых процессов.

7. Изучение морфологической изменчивости отобранных штаммов.

8. Проведение первоначальной селекции отобранных штаммов-продуцентов.

9. Подбор питательных сред (из числа известных) для изучаемых штаммов и разработка рецептуры питательной среды для глубинного культивирования.

Научная новизна работы. Впервые показано, что природные комплексные соединения с гиполипидемической активностью, продуцируемые актиномицетами, проявляют широкий спектр биологической активности.

Изучен антибиотический спектр природных гиполипидемических соединений, показаны их антифунгальные и антибактериальные свойства.

Впервые изучено влияние комплексных природных гиполипидемических соединений на образование бактериальных аутоиндукторов, отобраны штаммы, оказывающие воздействие на экспрессию факторов вирулентности бактерий (например, образование пиоцианина клиническим штаммом Pseudomonas aeruginosa 71) и ингибирующие образование биопленки штаммом Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853.

Отобран штамм актиномицета, продуцирующий, предположительно, новое природное соединение, эффективно ингибирующее теломеразную активность в лизатах клеток опухолевых линий (Jurkat, рак молочной и предстательной железы).

Разработаны методы выделения и очистки ингибитора теломеразы. Получены физико-химические характеристики ингибитора, позволяющие оценить соединение как новый ингибитор ТА.

Практическая значимость работы. На основании результатов исследования биологического действия комплексных препаратов было отобрано несколько перспективных соединений — природных ингибиторов QS, а также было получено новое соединение - ингибитор ТА.

Полученные данные показывают, что отобранные штаммы и продуцируемые ими соединения являются перспективными для разработки и создания эффективных средств антибактериальной терапии, а также высокоспецифичных противоопухолевых препаратов. Они также могут быть использованы и для фундаментальных исследований в области коммуникаций бактерий и изучения опухолевых процессов.

Апробация работы и публикации по теме исследования. Результаты исследований доложены на конференциях: Московской международной научно-практической конференции "Биотехнология: экология крупных городов" (Москва, Россия, 2010); 5-ой международной конференции «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnology for Medicine» (GPBNM-2010, St.Pctersburg-Kizhi-Mandrogy-Valaam-Kovenets- St.Petersburg, Russia); 14й и 15й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущи но, Россия, 2010, 2011); 1-ой международной научно-практической конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, Россия, 2010); 22nd International Congress on Anti-Cancer Treatment, (Paris, France, 2011); VI Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, Россия, 2011); 5th European Young Investigator Conference (Frankfurt-Oder/Slubice, Germany/Poland, 2011).

Работа была отмечена медалями на Конкурсах молодых ученых, проходящих в рамках международного конгресса «Биотехнология -перспективы развития» (в 2010 и 2012 гг.), а также заняла призовое место на Конкурсе молодых ученых международной Пущинской школы-конференции в 2010 году.

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, среди них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на

листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,

описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка литературы, включающего источников. Диссертация иллюстрирована ¿3 рисунками и таблицами.

Материалы и методы

Объектами исследования служили 17 штаммов актиномицетов, выделенных из почвенных образцов в секторе Коллекции культур ГНЦА (Россия, Москва) под лабораторными номерами Streptomyces sp.: 12,27,59, 108, 133,221,229,269,270,279,325,351,379,470,484,525,544.

Штаммы были отобраны ранее, как продуценты гиполипидемических соединений в опытах на культуре клеток гепатоцитов Hep G2, а также в опытах по ингибированию синтеза эргостерола грибной культуры Tolypocladium inflatum 106, с последующей оценкой в опытах in vivo на кроликах с экспериментальной гиперхолестеринемией (Чмель, 2004).

Погруженное культивирование культур актиномицетов проводили в колбах Эрленмейера (750 мл) со средой Ml (Бибикова и др., 1985) на круговой качалке (частота вращения 3,3 с"1 - 4,3 с"1) при температуре 28 °С, в течение 4-6 суток.

Выделение комплексов биологически активных веществ осуществляли из нативного раствора (экстракция этилацетатом) и биомассы мицелия (экстракция ацетоном). Полученные экстракты концентрировали на вакуум-выпарной установке (ИР - 1).

Отдельные биологически активные фракции выделяли из полученных комплексов хроматографическими методами (тонкослойной, колоночной и высокоэффективной жидкостной хроматографии).

Определение антибиотического спектра исследуемых соединений осуществляли методом диффузии в агар (Нетрусов, 2005) в отношении тест-культур: Aspergillus niger 137А (Бибикова и др., 1991), Candida albicans 8836 CBS, Penicillium glabrum №29, Penicillium variable №11, Aspergillus nidulans №20, Aspergillus versicolor №22 (Дарханова, 2010), Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, а также методом оценки жизнеспособности культур окрашиванием диацетат флуоресцеином (ФДА) в отношении Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Изучение влияния на систему QS и факторы вирулентности бактерий. Механизм QS регулирует образование фиолетового пигмента виолацеина у грамотрицательной бактерии Chromobacterium violaceum. При постановке эксперимента использовали природный изолят С. violacium 7 (Почвенный факультет МГУ им. Ломоносова). Влияние на систему QS анализировали по

характеру пигментации тест-культуры вокруг лунок с экстрактами исследуемых штаммов.

Далее проводили исследования по обнаружению у отобранных штаммов способности ингибировать факторы вирулентности клинического штамма Pseudomonas aeruginosa 7 ]. В опытах использовали ацетоновые экстракты из мицелия.

Изучение ингабирования образования пигмента пиоциаиина Pseudomonas aeruginosa 71. Тест-культуру инкубировали в присутствии исследуемых экстрактов в жидкой среде КингА при 37°С в течение 24 ч. В качестве контроля использовали тест-культуру без добавления экстрактов. После инкубации P. aeruginosa 71 пигмент, содержащийся в супернатанте, экстрагировали в хлороформ, затем в соляную кислоту. Степень окраски растворителя (оптическую плотность) измеряли при длине волны 492 и 540 им с помощью системы Bioscreen («Labsystems», Финляндия). Уровень образования пиоцианина в экстрактах оценивали по изменению оптической плотности в отношении контроля, принятого за 100 % (Kessler et al., 1997; Schaber et al., 2004). Работа проведена совместно с к.б.н. Грамматиковой Н.Э. («Олфарм»),

Изучение ингибированпя протеазы на молочном агаре. Опыт проводили методом диффузии в агар на чашках Петри с молочным агаром. В эксперименте использовали Протеазу С (Россия) в концентрации 1 мг/мл, качестве контрольного ингибитора - препарат Контрикал (апротинин -полипептид, способный ингибировать протеолитические ферменты). Результаты оценивали по отсутствию/наличию и величине зон просветления молочного агара вокруг лунок.

Изучение ингибирования протеазной активности LasA (стафилолнтическая активность). Супернатант клинического изолята P. aeruginosa 71 смешивали с суспензией из клеточных стенок S. aureus АТСС 29213, затем добавляли испытуемые экстракты, контролем служила смесь без экстрактов. Измеряли оптическую плотность с помощью системы Bioscreen при длине волны 580 нм. Уровень стафилолитической активности протеазы LasA оценивали по снижению оптической плотности в контрольной смеси, ингибирование - по стабильности оптической плотности относительно контроля.

Изучение ингибирования образования биопленок у Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853. Тест-культуру выращивали в жидкой среде Мголлер-Хинтона в течение 24 часов при температуре 37°С, затем вносили исследуемые экстракты и инкубировали тест-культуру в присутствии экстрактов последующие 24 ч. Образовавшиеся биопленки промывали фосфатным буфером (рН=7), окрашивали кристаллвиолетом (0,1% раствор). Извлечение

красителя из биопленок осуществляли смесью этанола и ацетона (4:1). Интенсивность окраски экстрагента (оптическую плотность) определяли при длине волны 540 нм с помощью спектрофотометра Graphicord UV-240 («Shimadzu», Япония). Плотность биопленок, полученных в присутствии изучаемых веществ, оценивали по отношению к контролю (интактной биопленке), принятому за 100% (Ни et al., 2006).

Оценка жизнеспособности бактерий. Уровень жизнеспособности бактерий оценивали по оптической плотности раствора после флуоресцентного окрашивания (Joux F. et al., 2000). В качестве флуоресцентного красителя использовали ФДА, окрашивающий живые клетки в золотисто-зеленый цвет. Для проведения опыта использовали 0,1% ацетоновый раствор ФДА, непосредственно перед работой разведенный в воде (1:10). В пробирки со средой, зараженной P. aeruginosa АТСС 27853, вносили исследуемые соединения в сочетании с гентамицином, а также без него, и инкубировали в течение суток при 37°С. Затем в каждую пробирку вносили по 100 мкл красителя, перемешивали и термостатировали 60-90 минут до зеленого окрашивания раствора в контрольных пробирках. Биомассу отделяли на центрифуге и оценивали интенсивность окраски нативного раствора спектрофотометрически при длине волны 490 нм.

Оценка действия экстрактов на образование теломеразы в лизатах опухолевых клеток. Эксперимент проводился совместно с Д.Д.Ждановым (лаборатория молекулярной биологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова).

Определение прямого действия ингибитора на теломеразную активность (ТА) проводили с помощью модифицированного метода Telomeric Repeat Amplification Protocol (TRAP). Данный метод основан на полимеразной цепной реакции-амплификации (ПЦР) продуктов теломеразной реакции, полученных при удлинении ферментом специфического праймера (Kim et al., 1994). Опыт проводили на опухолевых клетках линии Jurkat (Т-клеточная лейкемия человека). Результаты оценивали с использованием УФ-трансиллюминатора (А. 254 нм). Кинетические параметры ингибирующей активности проводили определением ТА в присутствии различных концентраций субстратов (TS-праймера, дезоксиаденозинтрифосфат, дезокситимидинтрифосфат и дезоксигуанинтрифосфат) и ингибитора.

Тонкослойная хроматография. Экстракты в петролейном эфире и хлороформе наносили на хроматографическую пластинку Silufol (UV 240) в количестве 10 мкл и хроматографировали в системе растворителей петролейный эфир-ацетон (2:1). Хроматограммы проявляли в парах йода и растворе перманганата калия, затем оценивали в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Фракционирование антибиотических комплексов. Первичную очистку экстрактов для получения целевых фракций осуществляли методом колоночной хроматографии. Полученный при выпаривании остаток (сырец) растворяли в минимальном количестве хлороформа и вводили пипеткой в колонку с Kiselgel. В качестве подвижной фазы использовали систему петролейиый эфир:ацетон (1:1,5). Из каждой фракции отбирали аликвоту (приблизительно 5 мл), оценивали методом ТСХ, после чего одинаковые фракции объединяли и упаривали досуха.

Высокоэффективная жидкостная хроматография. Тонкую очистку действующего вещества, а также качественный и количественный анализ комплекса проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), совместно с с.н.с. А.Н. Даниленко (Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН). ВЭЖХ проводили на хроматографе в изократическом режиме и градиенте растворителей.

Масс-спектрометрию проводили для определения молекулярной массы вещества совместно с Д.Д. Ждановым (Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН).

В качестве внутреннего калибранта использовали смесь соединений с известной молекулярной массой. В качестве образца сравнения использовали смесь Н20 : CH3CN с 0,1% СНООН (муравьиная кислота) без добавления исследуемого вещества.

Изучение естественной изменчивости штаммов-продуцентов проводили с целью отбора более продуктивных морфологических вариантов.

Исследовали морфологические признаки моноклонов, выделенных из естественных популяций штаммов №12 и №59 при рассевах на различных агаризованных средах (глицерино-нитратная, крахмально-аммиачная, синтетическая №1(СР1), Гаузе 1, Ваксмана, Чапека, мясо-пептонный агар, овсяный агар, солодовый агар, кукурузный и гороховый агар) после инкубирования в течение 5-7 суток при температуре 28°С. Было проведено описание характера роста типичных и морфологически измененных колоний, подсчитано число колоний разных типов в популяции. Процент морфологически измененных колоний определяли от общего числа выросших клонов в процентах, с учетом окраски воздушного и субстратного мицелия, размера, формы и складчатости колоний.

Изучение индуцированной изменчивости проводили, обрабатывая культуру УФ излучением с помощью ламп Lamber (Я. 254 нм), при экспозиции 1, 3, 6 и 9 минут. Воздействию подвергали споровые суспензии культур №12 и 59.

В качестве селективных агентов использовали различные соли металлов (C11SO4, ZnS04) и антибиотики (рубомицин, грамицидин, доксорубицин,

эритромицин, гентамицин). Результаты оценивали по выживаемости колоний на чашках, в зависимости от экспозиции и дозы мутагена, по активности полученных клонов и сохранению этой активности в течение нескольких пассажей.

В качестве химического мутагена использовали N-HHTpo30-N-метилмочевину (НММ). В споровую суспензию штамма №12 добавляли 0,5 мкг/мл мутагена, выдерживали в течение 15, 30 минут, 1, 2, 6 и 24 часов, после чего производили рассев на среде с агаром.

Оценивали выживаемость (число колоний выросших после обработки культур, по отношению к контролю), способность клонов к биосинтезу целевого продукта и ее сохранности при пассажах. Отдельные клоны рассевали для оценки биосинтетической способности их популяции.

Подбор питательных сред проводили для штамма Streptomyces sp. №12. Для этого использовали методы математического планирования эксперимента (Бирюков, 1967).

На первом этапе была составлена матрица случайного баланса, после обработки результатов вычисляли эффекты, полученные от каждого фактора. Таким образом были определены наиболее значимые компоненты и составлены следующие матрицы: двухуровневая матрица на 8 факторов, далее трехуровневая матрица на 8 факторов. Для получения достоверных результатов варианты сред, приготовленных в соответствие с матрицей, засевали с повторностями.

Результаты и обсуждение

Спектр антибиотической активности исследуемых актиномицетов.

Были проведены опыты по изучению антибиотического спектра нативных растворов и ацетоновых экстрактов исследуемых культур актиномицетов рода Streptomyces, что является важной характеристикой каждого биологически активного соединения.

Антибиотические свойства оценивали в отношении грамположительных тест-культур Bacillus subtilis АТСС 6633, Staphylococcus aureus АТСС 29213, грамотрицательных Escherichia coli АТСС 25922, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, микромицетов Asperguillus niger 137A и дрожжей Candida albicans 8836 CBS.

Экспериментально показано, что культура Bacillus subtilis АТСС 6633 была более чувствительной к действию исследуемых соединений, чем Staphylococcus aureus АТСС 29213 (табл.1).

Чувствительность грамотрицательных микроорганизмов существенно ниже, чем грамположительных. Как и следовало ожидать, ингибиторы синтеза

стеролов подавляют рост грибных культур. Мицелиальная тест-культура Asperguillus niger 137А более чувствительна к изучаемым ингибиторам синтеза стеролов, чем дрожжевая тест-культура Candida albicans 8836 CBS.

Таблица 1

Антибиотический спектр нативных растворов и ацетоновых экстрактов _культур (диаметр зоны подавления роста, мм*) _

№ S.aureus B.subtilis P.aeruginosa E.coll A.niger С. albicans

шт ATCC 29213 ATCC 6633 ATCC 27853 ATCC 137A 8836 CBS

25922

э/м** н/р*** э/м н/р э/м н/р э/м н/р э/м н/р э/м н/р

27 +- - 18 - - - - - +- - - -

12 15 - 19 +- 13 - 15 - - - - -

59 12 - 24 +- +- +- +- - 25 12 - 18

108 +- - 17 12 - - - - +- 14 - 15

133 - - - - - - - • - - - -

221 - - - +- - +- - - 21 - 18 -

229 - - - - - - - - - - - -

269 16 - 21 12 +- - 12 - 14 +- +- -

270 +- - - - 15 - - - - - - -

279 - - - - +- +- - - 12 - 17 15

325 - - - - - - - - - - - -

351 - - 16 - - - - - 18 - - -

379 +- - 17 14 - 15 - - 19 - - +-

470 - - - - - - - - 17 - - -

484 - - - 15 - - - - +- - - +-

525 - - +- - - - - - +- 12 - 12

544 - - - - - - - - - - - -

♦диаметр лунки 8мм; ** экстракт мицелия; *** нативный раствор

Таким образом, антифунгальная активность в данном случае может быть связана с гиполипидемическим действием. Так, ловастатин является низкоактивным антигрибным антибиотиком, который почти не влияет на рост дрожжевых культур. Более того, ранее было показано, что исследуемые гиполипидемические препараты ингибировапи синтез эргостерола в культуре мицелиалыюго гриба Tolypocladium inflatum 106 (Бибикова, 2004).

Обращает на себя внимание высокая антагонистическая активность штамма №59 в отношении используемых тест-культур. При сильно выраженной антифунгальной активности этот препарат имеет низкую токсичность и проявляет значительный гиполипидемический эффект в дозе 0,04 мг/кг при испытании на кроликах (Чмель, 2004). В медицинской практике крайне востребованы антигрибные антибиотики, поэтому, препарат №59 был нами отобран для дальнейшей работы, так как обладает специфическим механизмом действия - ингибирования синтеза стеролов.

Было проведено более широкое изучение антигрибного спектра наиболее активного комплексного препарата №59 в отношении ряда почвенных микромицетов: Pénicillium aculeatum №23, Pénicillium glabrum №29, Pénicillium

variable №11, Aspergillus nidulans №20, Aspergillus versicolor №22, выделенных из почвы Бурятии (Дарханова, 2010). Использовали метод нанесения суспензии спор грибов на агар с добавкой активного комплекса, выделенного из штамма 59. Ингибирование роста всех грибных культур наблюдалось при 100 мкг/мл, более чувствительными оказались Penicillium aculeatum и Aspergillus nidulans, их рост ингибировался при 1-10 мкг/мл. Таким образом, нами установлено, что мицелиальный экстракт штамма №59 обладает высокой антифунгальной активностью.

Результаты свидетельствуют о том, что наибольшую антибиотическую активность проявили экстракты мицелия изучаемых культур; способность к ингибированию тест-культур у нативных растворов гораздо ниже или отсутствует вовсе, что указывает на гидрофобные свойства выделенных активных соединений.

Ингибирование системы QS и факторов вирулентности бактерий. QS -это природный механизм микроорганизмов, позволяющий регулировать экспрессию тех или иных генов в зависимости от плотности популяции. Передача информации между клетками микроорганизмов осуществляется сигнальными веществами различной природы. У грамотрицательных бактерий это аутоиндукторы ацил-гомосеринлактоны (AHL). Система QS также регулирует экспрессию факторов вирулентности у патогенных бактерий (Hentzer et al., 2003) и формирование биопленок (Davies et al., 1998).

Ингибирование образования пигмента внолацеина у природного штамма Chromobacterium violaceum 7. Chromobacterium violaceum — факультативный анаэроб, грамотрицательная, неспорообразующая тропическая почвенная бактерия.

У штамма С. violaceum 7 продукция пигмента (виолацеина) находится под контролем QS. Синтез пигмента обусловлен наличием в среде ацил-гомосеринлактонов C6-AHL и других AHL с длиной боковых ацильных цепочек от С4 до С8, имеющих различный уровень чувствительности к ингибиторам. В тест-микроорганизме активен ген синтеза AHL, отвечающий за продукцию C6-AHL, уровень образования которого связан с синтезом пигмента виолацеина. В присутствии ингибитора QS рост культуры не подавляется, но отсутствует пигментация. Подавление передачи сигнала возможно в случае разрушения сигнальной молекулы AHL ингибитором, инактивирования ингибитором непосредственно гена синтазы AHL, а также из-за конкурентного связывания ингибитора с белком регулятором LasR (Rasmussen, 2006).

Нами исследовалась способность изучаемых комплексных соединений с гиполипидемической активностью ингибировать образование фиолетового пигмента виолацеина штаммом С. violaceum 7, через 24-48ч роста. Из 17 исследованных штаммов, способность к образованию ингибиторов

бактериальных аутоиндукторов проявили 10 штаммов (58,8%), при этом у 6 штаммов активность установлена только в экстракте из мицелия, а у 3 штаммов - в нативном растворе и в мицелии. Ацетоновые экстракты из мицелия штаммов №№59, 12, 108, 470 и 525 ингибировали синтез виолацеина, не влияя на рост бактерии (табл.2).

Таблица 2

Влияние изучаемых соединений на пигментацию СкготоЪасХегтт хШасеит 7

Отсутствие пигментации (диаметр зоны отсутствия пигментации, мм*)

№ ШТ. э/м** н/р*** № шт. э/м н/р № шт. э/м н/р

27 14 - 269 16 12 484 - -

12 15 - 270 - - 525 17 -

59 16 12 279 17 - 544 - -

108 14 +- 325 16 - * диаметр лунки 8мм; ** экстракт мицелия; *** иативпый раствор

133 - - 351 - -

221 - - 379 18 13

229 - - 470 15 -

Активность в отношении механизма С^Б на данной модели была обнаружена, в основном, в экстрактах из мицелия изучаемых культур; нативные растворы проявили слабую активность.

Анализ ингибировання протеазы на молочном агаре. Способность исследуемых препаратов ингибировать внеклеточную протеазу является существенной характеристикой комплексных соединений (т.к. протеаза является одним из факторов вирулентности, в том числе у Р.ае^тояа).

Нами была исследована способность изучаемых культур ингибировать протеазную активность на чашках Петри с молочным агаром (табл.3).

Таблица 3

Ингибирование протеазной активности (20 мкл в лунку*)

№ шт. э/м** н/р*** № шт. э/м н/р № шт. э/м н/р

27 + + 269 + + 484 - +

12 - - 270 - + 525 + -

59 + + 279 + - 544 - -

108 + - 325 + - * диаметр лунки 8мм; ** экстракт мицелия; *** нативный раствор

133 - - 351 + +

221 - - 379 + -

229 + - 470 + -

Для опыта использовали Протеазу С (Россия) в концентрации 1 мг/мл. В данной модели эксперимента мы определяли качественную реакцию на ингибирование протеазы исследуемыми соединениями. Способность ингибировать протеазу установлена у экстрактов из мицелия 11 штаммов. У штаммов №270, №484 ингибирование наблюдалось только в нативном растворе.

Анализ ингибирования протеазной активности LasA. Исследовали способность экстрактов, отобранных в предыдущем опыте, ингибировать протеазную (стафилолнтическую) активность, вызываемую супернатантом, полученным при росте в жидкой среде клинического штамма Pseudomonas aeruginosa 71. Контролем служила жидкая смесь лизата Staphylococcus aureus и супернатанта Pseudomonas aeruginosa 71. Степень стафилолитической активности оценивали по изменению оптической плотности в контроле, ингибирование - по стабильности оптической плотности относительно контроля.

В опыте активность показали два экстракта №269 и №108, ингкбирующие стафилолнтическую активность в жидкой среде. Через 30 минут в контроле количество разрушенных протеазой клеточных стенок составило 28 % от исходной величины и со временем достигло 38 % (табл.4).

Таблица 4

Время измерения Контроль Содержание клеточных стенок, %

№108 №269

330 мкл/мл 165 мкл/мл 82.5 мкл/мл 330 мкл/мл 165 мкл/мл 82.5 мкл/мл

15 мин 100 100 100 100 100 100 100

30 мин 72 100 98 95 100 100 100

45 мин 66 100 95 88 100 98 94

1ч 62 100 89 79 100 95 89

1 ч 15 мин 62 100 84 76 100 90 83

Полученные данные показывают, что исследуемые штаммы №№269, 108

способны ингибировать стафилолитическую активность клинического изолята Pseudomonas aeruginosa 71.

Ингибирование пиоцианазной активности клинического штамма Pseudomonas aeruginosa 71. Пигмент пиоцианин является фактором вирулентности P. aeruginosa, вызывает воспаление тканей макроорганизма (Gallagher et al., 2002), обладает антибиотической активностью. Установлено, что экстракты мицелия штаммов №№525, 108 и 59 (100 - 200 мкл/мл)

ингибировали образование пиоцианина на 35-55%, при снижении концентрации

исследуемых соединений (до 50 мкл/мл) подавление синтеза пиоцианина не отмечалось.

Из всех исследованных нами препаратов, способность ингибировать образование пиоцианина клиническим

штаммом Р. aeruginosa 71

Таблица 5 Образование пиоцианина в присутствии

экстрактов культур актиномицетов

Концентрация экстракта, мкл/мл Уровень образования пиоцианина по отношению к контролю, %

№59 №108 №525

12.5 100 100 100

25 100 98 95

50 100 94 92

100 73 79 64

200 65 67 45

Контроль 100 100 100

показали 3 экстракта мицелия: Ms 59, 525 и 108(табл.5).

Можно предположить, что для подавления синтеза пиоцианина необходимы более высокие концентрации вещества, чем для подавления образования виолацеина.

Оценка способности отобранных экстрактов подавлять образование биопленок у штамма Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853. Культуры №№ 59, 108, 269 и 525, ингибирующие механизм QS, протеазы и образование гшоцианина, исследовались на способность ингибировать образование биопленок штаммом Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853.

Формирование биопленки является одним из факторов вирулентности у Р.aeruginosa и находится под контролем реакций QS. Высокая резистентность синегнойной палочки объясняется именно ее способностью образовывать внеклеточный матрикс, состоящий из ДНК, полисахаридов, липидов и рамнолипидов. Клетки, находясь в этой структуре, становятся в 500 раз более устойчивыми к воздействию стандартных методов антибиотикотерапии

(Watnick, 2000, Costerton, 1999). Исследуемые экстракты из мицелия культур подавляли образование биопленок в количестве 200, 100 и 50 мкл относительно контроля. Внесение экстракта №59 приводило к максимальному снижению

плотности биопленок на 38%. В присутствии экстракта №108 формирование биопленок

снижалось на 42%. Результаты оценивали по оптической плотности по сравнению с

Гентамицин в концентрации 2 мкг/мл (МПК для планктонной культуры Р.aeruginosa АТСС 27853) не ингибирует формирование биопленок. Некоторое снижение (27-30%) образования биопленок можно наблюдать при добавлении гентамицина в концентрации 64 мкг/мл (в 32 раза выше МПК для планктонной культуры) к 24 часовой тест-культуре. Из этого можно сделать вывод, что клинические препараты активны только в отношении планктонной культуры и почти не влияют на бактериальные биопленки. Природные комплексные соединения, полученные нами в данной работе, проявляли более высокий ингибирующий потенциал в меньшей концентрации.

\т

ш

12,5 мкл 25 мкл 50 мкл 100 мкл 200 мкл Рисунок 1. Оптическая плотность биопленок P.aeruginosa АТСС 27853 под действием экстрактов 59,108,269,525. (%)

контролем (рис.1).

Оценка жизнеспособности планктонной культуры P.aeruginosa АТСС 27853 при совместном применении гентамицина и изучаемых экстрактов.

Гентамицин действует только на планктонную культуру P.aeruginosa, а отобранные нами препараты ингибируют образование биопленок, поэтому представляло интерес изучение совместного действия гентамицина и исследуемых соединений.

Установлено, что в отношении планктонной культуры P. aeruginosa АТСС 27853 существует высокий синергизм отобранных экстрактов из мицелия и гентамицина. Совместное применение экстрактов в дозах 10 мкг/мл и гентамицина (1 мкг/мл — субингибирующая концентрация) приводило к значительному снижению числа жизнеспособных микробных клеток в планктонной культуре.

Таким образом, можно сделать вывод, что благодаря высокому синергизму с гентамицином, отобранные препараты ингибируют образование биопленок P. aeruginosa, что определяет их повышенную чувствительность при воздействии гентамицина.

Влияние экстрактов изучаемых культур на образование теломеразы. Совместно с лабораторией молекулярной биологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Коваленко Н.А., Жданов Д.Д.) были проведены опыты по выявлению среди экстрактов изучаемых культур соединений, способных влиять на образование фермента теломеразы человека. Исследования проводили методом ПЦР на клеточной линии Jurkat, с последующей оценкой отсроченной (на 3-5 сутки) гибели клеток по типу апоптоза. Были исследованы комплексные препараты из мицелия и нативного раствора 17 актиномицетов, из которых был отобран штамм №12, экстракт мицелия которого ингибировал образование теломеразы в лизатах опухолевых клеток линии Jurkat, рака молочной и предстательной железы.

Главной задачей было выделение фракции, ответственной за ингибирование ТА. Комплексный препарат №12 исследовали методом ТСХ, было выделено три группы веществ, отличающихся степенью гидрофобности. Вещество получали при помощи накопительной хроматограммы с последующей оценкой их способности ингибировать ТА и подавлять рост

Таблица 6

Влияние совместного применения гентамицина и экстрактов мицелия №108 и 59 на выживаемость Р.

Проба Оптическая плотность раствора после окрашивания ФДА

Контроль 1,360

Гентамицин (1 мкг/мл) 1,335

№108 1,351

№59 1,330

Гентамицин (1мкг/мл)+ №108(10мкг/мл) 0,425

Гентамицин (1мкг/мл)1-№59(10 мкг/мл) 0,298

опухолевых клеток in vitro. Была выявлена фракция 3. активно ингибиругощая активность теломеразы. При этом компоненты зоны 1 подавляли рост тест-культуры Bacillus subtilis АТСС 6633, компоненты 2ой группы ингибировапи синтез пигмента виолацеина у Chromobacterium violaceum 7 и не имели антибиотической активности.

I I.S 2 2,5 3

Концентрация п.шсствз и

.1 (ВГ/МЛ)

Компоненты 3 группы веществ, входящих в состав комплексного соединения,

продуцируемого штаммом 12, ингибировали ТА и при этом не обладали антибиотическими свойствами и не влияли на механизм С)8.

Культура была отобрана для дальнейшего изучения

воздействия на ТА, накопления вещества, подбора питательной среды и оптимизации процесса биосинтеза.

Выделение активных фракций. Первичное накопление и очистку экстрактов для получения целевых фракций осуществляли методом колоночной хроматографии с Ктве^е!.

Рисунок 2. Ингибирование ТА веществами зон 1, 2 и 3.

Рисунок 3. Хромагографическая подвижность биологически активных компонентов третьей группы фракций штамма №12 в системе растворителей петролейный эфир : ацетон.

Нами было установлено, что только фракция №3 подавляет ТА в опытах с использованием принципа ПЦР на клеточной линии .1игка1:.

Высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектрометрия. Для изучения физико-химических и биологических особенностей активной фракции №3 проводили очистку препарата методом

ВЭЖХ. Исследование спектра позволило определить

максимумы поглощения данного вещества. Один из максимумов спектра поглощения наблюдается при длине волны 240 нм, поэтому детектирование выхода веществ на ВЭЖХ проводили по оптическому поглощению при

Рисунок 4. Спектр поглощения вещества №12.

данной длине волны.

Для очистки изучаемого вещества ВЭЖХ применяли в изократическом режиме. Данные ВЭЖХ в градиенте растворителей позволили установить отсутствие примесных соединений в целевой фракции. Чистота препарата после ВЭЖХ составила более 95%. Полученное вещество (aITEL1296) данной чистоты использовали для дальнейших исследований.

Были определены некоторые физико-химические свойства изучаемого вещества. Оно обладает слабой растворимостью в воде и растворимо в спирте.

Спиртовой раствор можно разбавлять водой до необходимых концентраций исследуемого вещества. Вещество окрашено в красный цвет.

Исследование выделенного вещества методом масс-спектрометрии, проведенное совместно с Институтом биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН (Жданов Д.Д.), позволило установить его молекулярную массу — около 338 Да.

Сопоставление литературных и полученных в эксперименте данных позволяет предположить, что изучаемое вещество является новым ингибитором ТА, так как в публикациях нет описания препарата с характеристиками, подобными aITEL1296. В данный момент ведутся работы по установлению структуры этого вещества.

Согласно последним исследованиям (Жданов, 2011) выделенный нами ингибитор ТА (aITEL1296) ингибировал рост опухолевых клеток рака молочной и предстательной железы in vitro-, вещество также вызывало торможение развития трансплантированной опухоли у мышей in vivo.

Оптимизация биосинтеза. С целью отбора наиболее продуктивных морфологических вариантов были проведены работы по изучению естественной изменчивости отобранных штаммов №№12 и 59 при оптимальной температуре роста продуцентов на различных средах.

Штамм № 59. Для выращивания штамма №59 использовали среды: Гаузе 1, крахмально-аммиачная среда, МПА, овсяный агар. В зависимости от состава используемой среды моноклоны имели морфологические отличия (размеры колоний, цвет субстратного и воздушного мицелия, складчатость) и проявляли различные биосинтетические особенности. На всех перечисленных средах штамм №59 образует колонии 2-3 мм, исключением является овсяный агар, на котором продуцент растет слабо и размер колоний не превышает 2 мм.

Установлено, что наибольшую антибиотическую активность №59 проявляет на среде Гаузе 1. Остальные среды, особенно крахмально — аммиачная и овсяная, не обеспечивали максимального уровня антибиотикообразования.

Изучение естественной изменчивости штамма №59 на среде Гаузе 1. В рассевах штамма на агаризованной среде Гаузе 1 было выделено 4 вида

колоний. Наибольший уровень биосинтетической активности выявлен у колоний 1 типа, которые составляли 90% от популяции. Колонии круглые, радиально - складчатые 5 мм в диаметре. Субстратный мицелий светло-бежевый, воздушный - зеленовато-серый с белым центром. Остальные колонии были менее активны. Колонии 1 типа (59-1) были отобраны для селекционной работы.

Применение УФ-облучення для получения высокоактивного продуцента. УФ-индуцированной селекции подвергали линию штамма 59-1 для получения клонов с повышенным уровнем антибиотикообразования. После обработки УФ лучами отмечена существенная вариабельность не только морфологических признаков моноклонов, но и их биосинтетического потенциала. Наибольшая морфологическая изменчивость (52,6%) отмечена при экспозиции 3 минуты, при этом выживаемость составила 0,3%. На этом этапе было выделено 188 вариантов, из них 48,4% (91 вариант) являлись малоактивными (образовывали менее 80% активных веществ от уровня контроля), 18,1% (34 варианта) превышали исходный по синтезу активных веществ, остальные клоны по уровню антибиотикообразования были близки к контролю. Следует отметить, что при последующих пересевах повышенная продуктивность сохранялась у одного штамма. Содержание активных компонентов (уровень антибиотикообразования) оценивали

спектрофотометрически и методом ТСХ.

В результате облучения был получен клон 59-2УФ, отличающийся от исходного штамма по морфологическим признакам и уровню антибиотикообразования (табл.7).

Таблица 7

Наименование тест - культур Диаметр зон подавления роста (мм)

1 мкл 10 мкл 100 мкл

Aspergillus nigerl37A - 17/15* 30/25*

Bacillus subtilis А ТСС 6633 - 15/14* 27/24*

♦зона подавления роста экстрактом мицелия исходного штамма №59

Таким образом, антибиотическая активность варианта 59-2УФ выше таковой у исходного штамма в среднем на 15 %.

Штамм № 12. Изучение естественной изменчивости штамма №12 на различных средах. Опыты проводили, используя среды: глицерино-нитратную, крахмально-аммиачную и синтетическую №1(СР1), Гаузе 1, Ваксмана, Чапека, мясо-пептонный агар, овсяный агар, солодовый агар, кукурузный и гороховый агар.

На всех средах наблюдали относительную морфологическую однородность продуцента. Так, на мясо-пептонном агаре основной вариант составлял 98% популяции. На других средах популяция штамма №12

представлена в 2-3 вариантах, отличающихся по цвету и размеру колоний, окраске мицелия.

Изучение естественной изменчивости этого штамма показало, что среда Гаузе 1 выявляет максимальное количество морфологических вариантов (колонии 3 типов). Наибольшую биосинтетическую активность культура штамма №12 проявляет именно на этой среде. Для селекционных работ отобраны колонии 1 типа (97% от популяции, колонии круглые, 2 мм в диаметре; субстратный мицелий бледно-фиолетовый, воздушный - серовато-сиреневый). Остальные колонии были менее активны.

Подбор питательных сред. Оптимизацию состава жидкой питательной среды проводили для отобранного штамма №12, продуцента комплексного

препарата с антибиотической

Рисунок 5. Сравнение ТСХ

активностью, а также

экстракта из мицелия

исходной культуры (А) и способностью ингибировать два одного из полученных клонов процесса: и образование

(Б) теломеразы. Целью

оптимизации было увеличить выход минорного компонента, способного ингибировать ТА и не проявляющего антибиотической активности.

Для этого использовали методы математического планирования эксперимента (Бирюков, 1967).

В связи с тем, что целевой продукт является минорным компонентом без выраженной антибиотической активности, количественный анализ не представлялся возможным, уровень биосинтеза оценивался визуально по степени пигментированное™ среды, а так же методом ТСХ и определением оптической плотности на спектрофотометре.

Индуцированная изменчивость штамма №12. УФ-индуцированной селекции подвергали штамм №12 для получения клонов с повышенным уровнем выхода минорного компонента (ингибитора ТА). Обработку споровой суспензии культуры штамма №12 производили аналогично таковой для штамма №59. Морфологическая изменчивость популяции, по сравнению с контролем, значительно возросла. Наибольшая изменчивость отмечена при экспозиции 3 минуты, при этом выживаемость была равна 0,8%, а изменчивость составила 55,4%. Было выделено 245 вариантов, большинство из них продуцировало искомый компонент на уровне контроля или меньше.

При последующих пересевах повышенная продуктивность сохранялась у одного штамма. Содержание компонентов фракции 3 оценивали спектрофотометрически и методом ТСХ.

В результате облучения был получен клон 12-19, отличающийся от исходного штамма морфологическими признаками (цвет воздушного и

субстратного мицелия, складчатость) и количеству продуцируемого компонента фракции 3, ингибитора ТА.

На следующем этапе использовали мутаген НММ. Наибольшая изменчивость отмечена при воздействии мутагеном на споровую суспензию в течении 24 часов. При этом выживаемость составила 1,5%, а изменчивость 67%.

В результате воздействия НММ было получено 3 клона, с повышенным синтезом минорного компонента, который в нашей работе является целевым. При этом количество примесей значительно уменьшилось, что облегчило анализ препарата методами ТСХ и ВЭЖХ.

Заключение

В данной работе мы изучали биологическую активность комплексных природных соединений с гиполипидемическими свойствами.

Был определен антибиотический спектр изучаемых препаратов, у 9 штаммов из 17 (53%) выявлены антибактериальные свойства; при этом штаммы №№ 12, 269, 379 обладали антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных тест-культур. Антифунгальные свойства были выявлены у 8 штаммов (47%). Пять штаммов сочетали в себе как антигрибные, так и антибактериальные свойства. Наибольшую активность проявляли экстракты из мицелия исследуемых культур, что указывает на гидрофобную природу биологически активных веществ, образуемых продуцентами, а также о взаимосвязи антибиотических и гиполипидемических свойств.

В результате проведенных опытов были отобраны штаммы, обладающие высокой антибиотической активностью; особенно стоит отметить штамм № 59, экстракт из мицелия которого угнетает рост как бактерий, так и микромицетов, а также ингибирует С^Б в ряде проведенных нами опытов, при этом не токсичен, что делает его перспективным объектом для дальнейших изучений.

В данной работе впервые поиск ингибиторов бактериальных аутоиндукторов осуществляли среди актиномицетов, продуцирующих гиполипидемические соединения. Нами была проведена оценка влияния изучаемых комплексных соединений с липидоснижающими свойствами на экспрессию факторов вирулентности ряда бактерий.

В модели опытов с использованием С. \iolaceum 7 в качестве тест-культуры было установлено, что 5 штаммов ингибировали синтез пигмента виолацеина и при этом не влияли на рост самой тест-культуры. Всего способность к продукции ингибиторов бактериальных аутоиндукторов проявили 10 штаммов из 17, что является высоким показателем при направленном скрининге.

Исследовано влияние веществ, ингибирующих QS, на экспрессию факторов вирулентности бактерий, образование которых тесно связано с синтезом бактериальных аутоиндукторов.

В опытах по оценке влияния исследуемых соединений на ингибирование протеазной активности (один из факторов вирулентности Р. aeruginosa), были отмечены те же препараты, что и в предыдущем эксперименте. Всего активными оказались 13 штаммов из 17.

Способность Р. aeruginosa проникать в ткани связана со способностью продуцировать активную протеазу, поэтому очень важны препараты, способные ингибировать образование протеаз вирулентными штаммами. Модельная система (ингибирование протеазы LasA) основана на способности лизатов Р. aeruginosa гидролизовать стенки S.aureus. Стафилолитическую активность проявили только 2 штамма №№108 и 269.

В результате опытов по оценке действия исследуемых соединений на образование пиоцианина, который также является фактором вирулентности, клиническим штаммом Р. aeruginosa 71, было отобрано 3 продуцента (№№59, 108,525), экстракты которых ингибировали образование пиоцианина.

Предполагается, что около 80% инфекционных заболеваний связано с образованием биопленок (Spoering A.L., 2001). В настоящее время биопленки рассматриваются как один из факторов вирулентности, так как их образование контролируется QS и образованием аутоиндукторов. Учитывая, что воздействие на формирование биопленок в настоящее время рассматривается как одно из ключевых направлений в борьбе с инфекционными заболеваниями, в которых традиционная антимикробная терапия неэффективна, необходим поиск новых соединений, способных воздействовать на образование биопленок и таким образом потенцировать действие уже известных антибактериальных препаратов.

В результате наших исследований были отобраны соединения, ингибирующие образование биопленок штаммом Р. aeruginosa АТСС 27853. Опыты показали, что экстракт мицелия штамма № 59 в максимальной концентрации ингибировал образование биопленки на 38%, № 108 на 42%. Был установлен высокий синергизм отобранных соединений с гентамицином при воздействии на планктонную культуру Р. aeruginosa АТСС 27853.

Интересен тот факт, что сильное ингибирующее QS действие изученные нами экстракты оказывали, являясь неочищенными экстрактами из мицелия, поэтому можно предположить, что потенциал этих соединений довольно велик. Таким образом, исходя из полученных данных, отобранные штаммы можно рассматривать как перспективные для выделения и изучения активного начала. Препараты №№59, 108, 269, 525 рекомендованы для более тщательного исследования.

В настоящее время ведутся исследования по изучению совместного применения гиполипидемических и противоопухолевых препаратов. Существуют данные о том, что прием ловастатина дает положительные результаты при лечении некоторых видов раковых опухолей (Чочиева, 2006).

Все большее распространение в направлении поиска средств для терапии злокачественных опухолей получает так называемая таргетная терапия; она заключается в воздействии на специфические молекулы-мишени, характерные для раковых клеток. Известно, что теломераза является одной из таких молекул, поскольку активна в большинстве опухолей человека. Таким образом, воздействие на теломеразу специфическими ингибиторами вызывает в процессе пролиферации клеток уменьшение длины теломер, нарушение их структуры и потерю функций. Эти процессы приводят к активации процессов апоптоза и вызывают гибель опухолевых клеток.

В результате опытов, был отобран экстракт из мицелия штамма №12, оказывающий ингибирующее воздействие на синтез теломеразы на клеточных линиях 1игка1, рака молочной и предстательной железы.

Нами была выделена фракция, отвечающая за ингибирование ТА в клеточных лизатах. Было установлено, что данное вещество проникает через клеточные мембраны и вызывает устойчивое ингибирование ТА внутри опухолевых клеток. Таким образом, ингибирование ТА вызывает гибель раковых клеток по типу апоптоза. При этом в дозах, критичных для опухолевых клеток, вещество не оказывает действия на пролиферацию нормальных фибробластов человека, что указывает на избирательность его действия (Жданов и др., 2011).

Найденное вещество не соответствует ни одному из описанных в литературе ингибиторов ТА; об этом свидетельствуют полученные данные ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Эти данные позволяют предположить, что нами получен новый ингибитор ТА.

На основе этих данных, при условии дальнейшего исследования, возможно создание нового высокоспецифичного противоопухолевого терапевтического препарата. Выделенное нами вещество также может быть использовано в исследованиях в области биологии теломер и теломеразы.

В результате проведенных опытов нами было отобрано два наиболее перспективных продуцента №59 и №12, для которых проводилась первичная селекция и оптимизация процесса биосинтеза.

Путем УФ индуцированной селекции был получен клон 59-2УФ, превосходящий оригинальный штамм по уровню антибиотикообразования и способности ингибировать механизм С^Б у С. \iolaceum 7, а также клон 12-19, уровень синтеза минорного компонента (ингибитора ТА) которого превышал исходный.

После воздействия мутагеном НММ было получено три клона, продуцирующих ингибитор ТА в количестве, превышающем исходный на 1520%.

Была подобрана оптимальная среда для штамма №12, позволяющая при глубинном культивировании повысить синтез вещества, ответственного за ингибирование ТА.

Таким образом, полученные в ходе наших исследований данные могут быть использованы для дальнейших изысканий. Выделенные нами вещества могут стать основой для создания как традиционных лекарственных препаратов для терапии инфекционных заболеваний, так и для получения новейших средств, воздействующих на систему QS, а также могут быть использованы для создания гиполипидемических и противоопухолевых препаратов нового поколения.

Выводы:

1. В работе показано, что природные комплексные соединения с гиполипидемической активностью, продуцируемые актиномицетами, проявляют широкий спектр биологической активности.

2. Изучен антибиотический спектр комплексных природных гиполипидемических соединений. Показано, что из 17 исследованных штаммов 14 проявляют активность в отношении различных тест-культур (грамположительные, грамотрицательные, микромицеты, дрожжи). Отобран штамм №59 с высоким уровнем антигрибной и антибактериальной активности.

3. Изучено воздействие комплексных природных гиполипидемических соединений на образование бактериальных аутоиндукторов (LasA, AHL); из 17 исследованных продуцентов активность установлена у 10.

4. Определено влияние изучаемых соединений на экспрессию факторов вирулентности ряда бактерий. Показано, что 13 препаратов из нативного раствора и экстрактов мицелия 17 исследованных штаммов ингибировали протеазу С. Установлена способность 3-х экстрактов ингибировать образование пиоцианина; 2 препарата подавляли стафилолитическую активность клинического штамма Pseudomonas aeruginosa 71.

5. Отобраны комплексные соединения, ингибирующие образование биопленок штаммом Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853. Установлен высокий синергизм этих соединений с гентамицином при воздействии на планктонные клетки тест-культуры.

6. Проведена оценка действия соединений на фермент теломеразу и возможности ингибирования опухолевых процессов. Из штамма №12 отобрано новое природное соединение, эффективно ингибирующее ТА в опухолевых клетках ряда клеточных линий, вызывая в них активацию процессов апоптоза. При дальнейшем исследовании данное вещество, вероятно, может служить

основой для разработки высокоспецифичного препарата для терапии злокачественных опухолей.

7. Разработаны методы выделения и очистки ингибитора теломеразы. Получены данные о некоторых физико-химических характеристиках ингибитора (растворимость, данные ВЭЖХ, масс-спектрометрия), позволяющие оценить соединение как новый, ранее не описанный, ингибитор ТА.

8. Проведена первоначальная селекция отобранных штаммов-продуцентов, в результате которой был получен клон 59-2УФ, превосходящий исходный штамм по уровню антибиотикообразоваиия на 15%.

9. В результате индуцированной селекции штамма №12 при помощи НММ было получено 3 клона, уровень образования ингибитора ТА в которых превышает исходный, при этом количество примесей значительно снизилось.

10. Произведен подбор питательных сред для отобранных штаммов №12 и 59-2УФ.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Готовцева В.Ю., Грамматикова Н.Э., Бибикова М.В. Влияние природных комплексных соединений с гиполипидемической активностью на экспрессию факторов вирулентности бактерий/ Антибиотики и химиотерапия, 5-6,2011.

2. Коваленко H.A., Жданов Д.Д., Бибикова М.В., Готовцева В.Ю. Влияние соединения aITEL1296 на теломеразную активность и рост опухолевых клеток/ Биомедицинская химия, 2011 том 57 вып. 5 (переведена на английский язык Biomedical Chemistry, 2012, Vol. 6, No. 1, pp. 48-54).

3. Жданов Д. Д., Коваленко Н. А., Готовцева В. Ю., Бибикова М. В., Орлова Е. В. Механизм ингибирования теломеразпой активности новым природным соединением aITEL1296/ Молекулярная медицина №1,2012.

Другие научные издания

4. Готовцева В. Ю., Бибикова М. В. Влияние природных комплексных соединений с гиполипидемической активностью на образование бактериальных аутоиндукторов /Московская международная научно-практическая конференция "Биотехнология: экология крупных городов" / Сборник тезисов / Москва, 2010, стр. 452.

5. Kovalenko N.A., Zhdanov D.D., Abakumova O.Y., Bibikova M. V. Gotovtseva V. Y. Telomerase inhibitor suppresses growth of cancer cells in vitro / 5-ая международная конференция «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnology for Medicine» / Сборник тезисов / St.Petersburg, 2010, p.70.

6. Готовцева В. IO., Бибикова M. В. Изучение влияния природных гиполипидемических соединений на систему кворум сенсинга бактерий / 14-ая

международная Путинская школа-конференция молодых ученых/ Сборник тезисов / Пущино, 2010, стр. 120.

7. Готовцева В. Ю., Бибикова М.В., Борисова НА. Биологическая активность природных гиполипидемических соединений / 15-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых/ Сборник тезисов / Пущино, 2011, стр. 201.

8. Коваленко Н. А., Жданов Д. Д., Абакумова О. Ю., Бибикова М.В., Готовцева В. Ю., Соколов Н. Н. Исследование взаимодействия ингибитора теломеразной активности с субъединицами теломеразы / 1-ая международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» / Сборник тезисов / М.: 2010, стр. 102.

9. Kovalenko N., Zhdanov D., Gotovtseva V., Bibikova M., Spiridonova I., Sokolov N. Influence of compounds ITEL1296 and AITEL1296 on telomerase activity and the growth of cancer cells / 22nd International Congress on Anti-Cancer Treatment / Сборник тезисов / Paris 2011, p. 352.

10. Готовцева В. Ю., Бибикова М. В. Влияние комплексных природных гиполипидемических соединений на ингибирование образования бактериальных биопленок / VI Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития"/ Сборник тезисов / Москва, 2011, стр. 57.

11. Gotovtseva V. Increasing productivity of the strain Streptomyces sp. № 59 by induced selection / 5th European Young Investigator Conference / Сборник тезисов / Frankfurt-Oder, 2011, p. 32.

12. Готовцева В. Ю., Бибикова М. В., Жданов Д.Д., Коваленко H.A. Скрининг ингибиторов теломеразной активности. Международная научно-практическая конференция «Фармацевтические и медицинские биотехнологии»/Сборник тезисов / Москва, 2012.

Благодарности

Я выражаю искреннюю благодарность научным руководителям Маргарите Васильевне Бибиковой и Надежде Алексеевне Кустовой за неоценимую помощь и всестороннюю поддержку при выполнении работы. Большое спасибо Инне Анатольевне Спиридоновой, Ольге Геннадиевне Кураниной, Наталии Эдуардовне Грамматиковой и Наталии Аркадьевне Коваленко за полезные советы и помощь при постановке некоторых экспериментов. Я искренне признательна всему коллективу кафедры экологии и промышленной биотехнологии МГУИЭ и коллективу ООО «Виорин» (бывш. сектор коллекции культур ГНЦА по антибиотикам).

Подписано в печать:

11.02.2013

Заказ № 8137 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru