Автореферат и диссертация по медицине (14.00.31) на тему:Индукция образования антибиотиков неактивными культурами актиномицетов

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков

На правах рукописи

МАЛКИНА Наталья Дмитриевна

ИНДУКЦИЯ ОБРАЗОВАНИЯ АНТИБИОТИКОВ НЕАКТИВНЫМИ КУЛЬТУРАМИ АКТИНОМИЦЕТОВ

С14.00.31 - химиотерапия и антибиотики}

Диссертация на соискание Научный руководитель

ученой'степени кандидата член-корреспондент РАМН

биологических наук профессор Ю. В. Дудник

Москва - 1998

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ .................................................4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Биохимические и генетические основы 7

биосинтеза антибиотиков

ГЛАВА 1. Биохимическая регуляция образования вторичных

метаболитов у актиномицетов .................... 7

1.1. Катаболитная репрессия в присутствии глюкозы .... 8 1. 2. Катаболитная репрессия в присутствии источников

азота ........................................................11

1. 3- Регуляция фосфатом ......................................12

1.4. Ауторегуляторы................................... 17.

1. 4« 1 •> А~ ф з. я т о р» ......................................................18»

ГЛАВА 2. Генетические аспекты вторичного метаболизма у

актиномицетов ................. ..............................20

2. 1. Геном актиномицетов ............................. 20.

2. 1.1. Хромосомы и кластеры генов биосинтеза антибиотиков

актиномицетов ................................... 21

2. 1. 2. Плазмиды ........................................22.

2. 2. Функционирование генома актиномицетов............ 23

2. 2. 1. Экспрессия кластера биосинтетических генов.......23.

2. 2. 2. Гены резистентности к антибиотикам. .............. 35.

ГЛАВА 3. Генетическая нестабильность .....................39

3. 1. Спонтанная генетическая нестабильность .......... 39

3. 2. Индуцированная генетическая нестабильность . . . 44.

3.2. 1. Влияние мутагенов на генетическую

нестабильность актиномицетов .................... 44

3.2.2. Влияние протопластирования на генетическую

нестабильность актиномицетов .................... 49

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. Материалы и методы исследования ............... 55

1. 1. Штаммы микроорганизмов.........................55

1. 2. Условия культивирования. Питательные среды.....55

1. 3. Мутагенная обработка штаммов актиномицетов ..... 57

1. 3. 1. Мутагенные факторы....................................57

1. 3. 2. Мутагенная обработка ........................... 58

1. 4. Определение антибиотической активности

методом диффузии в агар......................... 59

1. 4. 1. Выявление в рассеве колоний актиномицетов, проявляющих антибиотическую активность . ............. 59

1. 4. 2. Определение антимикробного спектра актиноми -цетов-продуцентов путем совместного высева

штрихами с тест- культурами -.....................60

1. 4. 3. Определение МПК антибиотиков, синтезируемых му-

тантными штаммами при глубинном культивировании 60

1.5. Изучение морфологических, хемотаксономических, культуральных свойств актиномицетов ............ 60

1. 5. 1. Морфологические характеристики................. 61

1. 5. 2. Хемотаксономические характеристики. . ............61

1. 5. 3. Анализ дифференцирующих Сахаров. ................ 62

1. 5. 4. Культуральные свойства .........................62

1.6. Изучение физиологических свойств культур актиномицетов ................................................63

1. 6. 1. Потребление источников углерода ........................63

1. 6. 2. Потребление источников азота...................63

1. 6. 3. Разжижение желатины...................................64

1. 6. 4. Гидролиз крахмала..............................64

1. 6. 5. Гидролиз казеина........ ..........................................64

1. 6. 6. Уреазная активность. ...................................64

1. 6. 7. Восстановление нитратов в нитриты..............65

ГЛАВА 2. Результаты и обсуждение ...................... . 66

2. 1. Отбор штаммов антиномицетов, не проявляющих

антибиотическую активность ..............................66

2. 2. Отбор активных штаммов после обработки

неактивных культур антиномицетов мутагенами. ... 66

2. 2. 1. Обработка этидий бромидом. .....................66

2. 2. 2. Обработка даунорубицином...................... . 72

2. 2. 3. Обработка N" метил- N' - нитро- N" нитрозогуанидином 75 . 2. 3. Изучение культур антиномицетов, у которых был индуцирован биосинтез антибиотиков под

действием мутагенов........................... 85

2.3.1. Мутантный штамм 167ЭБ5 ....................... 85

2. 3. 2. Мутантный штамм 1281 ЭБ10 ......................92

2. 3. 3. Мутантный штамм 5738МННГ50 ................... . 98

2. 3. 4. Мутантный штамм 2608ЭБ5- 1 ................104

2.3.5. Мутантный штамм 438МННГ25-54 -----........ 111

2.3.6. Мутантный штамм 2798МННГ100..................117

2. 3. 7. Мутантный штамм 977 3Б20 ......................120

2. 3. 8. Мутантный штамм 6038ЭБ40 ..................... 123

2. 3. 9. Мутантный штамм 1977ДР50 .................... 127

ВЫВОДЫ....................................................133

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. ......................................... 135

- 4 -ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Получение новых эффективных антибиотинов является важной задачей в связи широким распространением патогенных микроорганизмов, устойчивых к имеющимся препаратам. Большинство известных в настоящее время антибиотиков - актиномицетного происхождения. При поиске продуцентов новых антибиотиков среди культур актиномицетов традиционными методами значительнвя часть тестируемых штаммов оказывается биологичесни неактивной и отбраковывается. Ранее в НИИ по изысканию новых антибиотиков РАМН было показано, что регенерация протопластов антибиотически неактивных штаммов актиномицетов индуцировала образование активных вариантов, синтезирующих антибиотики [Маланичева, 1993], что можно объяснить активацией молчащих генов биосинтеза вторичных метаболитов. Другим способом воздействия на геном актиномицетов является мутагенез. Однако, полученные этим методом активные варианты, оказывались нестабильными и быстро утрачивали способность к образованию антибиотиков. Другим способом воздействия на геном антиномицетов является использование химических мутагенов. Известно, что обработка интеркалирующими агентами усиливает генетическую нестабильность актиномицетов [Родионова, 1988] и, вероятно, может привести к экспрессии молчащих генов вторичного метаболизма.

Цель и задачи исследования. Представляемая работа является продолжением исследований, связанных с поиском новых антибиотиков, проводящихся в Институте по изысканию новых антибиотиков РАМН. Цель настоящей работы заключалась в изучении

возможности получения продуцентов антибиотиков при обработке мутагенами неактивных культур актиномицетов, и выявление синтезируемых ими антибиотиков.

В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие задачи:

- отобрать неактивные в отношении тест- микроорганизмов штаммы актиномицетов;

- подобрать условия для обработки их мутагенами;

- выявить активные варианты и изучить условия биосинтеза антибиотиков на агаризованных и жидких питательных средах;

- изучить естественную изменчивость продуцентов антибиотиков для отбора наиболее продуктивных вариантов;

-наработать антибиотики в количествах, достаточных для изучения их физико-химических свойств;

- сопоставить таксономические признаки исходных и мутантнь штаммов.

Научная новизна. Показана возможность индукции образования антибиотиков неактивными штаммами после обработки их мутагенами. У 44% неактивных культур актиномицетов после обработки этидий бромидом в популяции с высокой частотой обнаруживались активные варианты.

Показано более широкое распространение актиномицетов-антагонистов в природе, чем это можно обнаружить традиционными методами, и доказано, что при определенных условиях большинство актиномицетов может синтезировать антибиотини.

В результате мутагенной обработки неактивных культур антиномицетов получены:

новый антибиотик из группы цервиномицинов; антибиотик 1281 неизвестной ранее природы;

новые продуценты брунеомицина, монензина, актиномицина, относящиеся к видам актиномицетов, для которых ранее не было описано образование этих антибиотиков.

Прагтичесгая значимость. Показано, что в результате обработки мутагенами неактивных культур актиномицетов можно получить стабильные продуценты антибиотиков. Получены продуценты двух новых антибиотиков и новые продуценты брунеомицина, монензина и актиномицина.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Биохимические и генетические основы биосинтеза антибиотиков

Многоклеточная мицелиальная структура с образованием в репродуктивной части спор и способность к синтезу большого разнообразия вторичных метаболитов значительно увеличивает адаптивные возможности актиномицетов.

Такие вторичные метаболиты, как антибиотики, являются формой биохимической дифференциации у антиномицетов. Гены, кодирующие вторичные метаболиты, дифференциально эьспрессируются на стадии замедления скорости клеточного роста. Селективная экспрессия этих генов происходит через узнавание РНК- полимеразой промоторов. Взаимодействие отдельных РНК- полимераз с

промоторами вторичного метаболизма и, следовательно, экспрессия генов, возможно, контролируется А- фактором и родственными плейотропными эффекторами, фосфатом, легко усвояемыми источниками углерода и азота [Martin, 1989].

ГЛАВА 1. Биохимическая регуляция образования вторичных метаболитов

Необходимость получения антибиотиков, образуемых

актиномицетами, требует разработки определенных методов культивирования этих микроорганизмов в условиях погруженной культуры, резко отличающихся от условий естественной среды их обитания. Способность роста актиномицетов в жидкой питательной среде явилась отражением широкого диапазона нормы реакции признаков актиномицетов, обеспеченной функционированием их генома. Оказалось, что антибиотики, как и большинство вторичных

метаболитов, при культивировании в жидкой среде образуются после стадии активного роста вегетативного мицелия (тропофазы) в идиофазе, при низкой концентрации питательных веществ. Такое разделение тропофазы и идиофазы наблюдается при культивировании микроорганизмов на обогащенной питатальной среде, что характерно для образования большинства антибиотиков в оптимальных лабораторных условиях. При определенной концентрации компонентов питательной среды, поддерживающей слабый рост, возможна экспрессия генов биосинтеза антибиотиков в период роста культуры [Vining, 1995]. Очевидно, в этих условиях проявляется морфобиохимическая гетерогенность мицелия актиномицета, одна часть которого может находиться в состоянии ассимилиции и роста (тропофазе), а другая часть - в состоянии вторичного метаболизма и генеративной дифференциации (идиофазе). Частичное совпадение идиофазы и тропофазы наблюдалось при культивировании продуцентов хлорамфеникола, этамицина, рифамицина [Demain, 1992; Lancini 1993] и, вероятно, характерно для жизнедеятельности актиномицетов в природных условиях .

Начало биосинтеза антибиотиков актиномицетами регулируется специфическими механизмами, включающими натаболитную репрессию, регуляцию метаболизма азота и фосфата. В присутствии легко усваиваемых источников углерода, азота и фосфата может происходить как репрессия синтеза, так и подавление активности ферментов, вовлеченных в образование антибиотиков.

1. 1. Катаболитная репрессия в присутствии глюкозы

Синтез многих индуцибельных ферментов биосинтеза

антибиотинов актиномицетами, растущими в присутствии какого-либо источника углерода, может быть репрессирован вносимой в питательную среду глюкозой. Катаболитная репрессия глюкозой представляет собой общую координирующую систему, которая создает преимущество глюкозе благодаря подавлению экспрессии оперонов, кодирующих ферменты альтернативных метаболических путей.

Глюкоза является легко усваиваемым источником углерода, стимулирующим синтез первичных метаболитов, но может препятствовать образованию аминогликозидов, полипептидов, ß-лактамов, тетрациклинов, пуромицина, актиномицина и других антибиотиков [Jones, 1985; Cortes, 1986; Piret, 1988; Lancini, 1993]. В процессе синтеза этих антибиотиков наблюдалась репрессия глюкозой активности одного или нескольких ферментов. Это показано экспериментально при замещении медленно потребляемых источников углерода {полисахаридов, олигосахаридов, растительных масел) в ферментационной среде глюкозой, действующей как репрессор синтеза и как ингибитор активности ферментов вторичного метаболизма [Demaine, 198 9; Vining, 1995].

У продуцента актиномицина S. antibioticus

феноксазинон-синтаза и ферменты, участвующие в синтезе пептидной части молекулы, а также практически все изученные ферменты биосинтеза этого антибиотика являются объектом катаболитной репрессии глюкозой . Позднее эти данные были подтверждены методами молекулярной генетики. Методом блоттинга показано, что появление фермента завершающего этапа биосинтеза актиномицина перед началом образования актиномицина (AM) обусловлено биосинтезом новой мРНК, кодирующей этот фермент (ФС). При росте S. antibioticus на глюкозо-галантозной среде доля мРНМ для ФС в

общем количестве синтезируемой мРНК незначительна, но по мере потребления глюкозы ее доля увеличивается и достигает максимума при полном истощении глюкозы; начинается потребление галактозы и полная дерепрессия биосинтеза мРНК ФС. Регуляция биосинтеза ФС глюкозой происходит на уровне транскрипции [Jones, 1984].

Для некоторых продуцентов антибиотиков катаболитная репрессия может быть временным явлением, возможно, устраняемым за счет усиления инициации транскрипции генов, ответственных за усвоение медленно потребляемых источников углерода, в присутствии циклического аденозинмонофосфата (сАНР). Роль этого эффектора в инициации биосинтеза антибиотиков до конца не выяснена. Известно, что увеличение внутриклеточной концентрации сАМР стимулирует образование тилозина у S.fradiae; стимулирует синтез N-ацил-канамицин-амидогидролазы у S. kanamyceticus- С другой стороны сАМР не участвует в дерепрессии ферментов биосинтеза антибиотиков у s. venezuelae, S. antibioticus и S. coelicolor [Seno, 1983].

Существует мнение [Ikeda, 1984], что сАМФ облегчает репрессию глюкозой, благодаря фосфорилированию молекулы глюкозы в присутствии фермента глюкониназы ^окислительное

фосфорилирование}. Мутации, инактивирующие ген glk глюкокиназы у S. coelicolor A3 (2), предотвращают не только потребление глюкозы, но также репрессию глюнозой генов, обеспечивающих транспорт и усвоение глицерина, арабинозы и других Сахаров. Мутации устраняют также репрессию глюкозой ферментов, необходимых для расщепления агара и других полисахаридов. Введение клонированного гена glk в мутантный штамм S. coelicolor восстанавливает как синтез глюкозо-6-фосфата, так и репрессию

глюнозой.

1. 2. Катаболитная репрессия в присутствии источников

азота

Регуляция источниками азота характерна для вторичного метаболизма актиномицетов. Образование антибиотиков находится под контролем ионов аммония Жц* или определенных аминонислот. Биосинтез антибиотиков начинается только тогда, когда значительная часть ионов аммония в среде истощается или замещается на медленно потребляемые источники азота. Доказательством этого может служить трехкратное увеличение выхода стрептомицина, обнаруженное при замещении в ферментационной среде ионов аммония медленно потребляемым пролином [Lancini, 1993].

Традиционное использование соевой муки при культивировании продуцентов антибиотков связано с ее медленным потреблением. В результате устраняются высокие концентрации ионов аммония и аминокислот. Среда с медленно потребляемым источниками азота является оптимальной для синтеза вторичных метаболитов. Высокие концентрации ионов аммония негативно влияют на синтез стрептомицина, цефамицина, рифомицина, клавулановой кислоты, эритромицина, хлорамфенинола, линкомицина, тилозина, спирамицина [Piret, 1988].

Идентифицированы некоторые ферменты биосинтеза

антибиотиков, ингибируемые ионами аммония. Среди них - циклаза и экспандаза, участвующие в синтезе цефамицина [Castro, 1985]; валин- дегидрогеназа, синтезирующая тилозин, спирамицин [Omura, 1984]; ангидротетрациклин- оксигеназа, ответственная за синтез

тетрациклина [Behal, 1983].

Добавление в ферментационную среду фосфата магния, мочевины или природных цеолитов (служащих ловушкой для приводит к

увеличению выхода макролидов и стрептомицина [Masuma, 1983].

Другой тип регуляции источниками азота осуществляется тогда, когда антибиотик или аминокислота синтезируются по одному и тому же биосинтетическому пути, и образование специфической аминокислоты конкурирует с образованием антибиотика. Репрессия аминокислотой по принципу обратной связи препятствует образованию антибиотика на ранней стадии общего пути. Примером может служить синтез кандицидина и ароматических кислот S. griseus. Один путь - синтез триптофана, тирозина, фенилаланина осуществляется через хоризмовую кислоту, другой путь - синтез кандицидина - через пара-аминобензойную кислоту (ПАБК). Все три аминокислоты подавляют образование кандицидина: они репрессируют как первый фермент общего пути, так и первый фермент биосинтеза кандицидина - ПАБК-синтетазу [Martin, 1983].

В культурах актиномицетов, у которых образование вторичных метаболитов начинается после истощения источников азота или после замены быстро потребляемого источника азота на более медленно потребляемую форму, активация генов вторичных м