Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Выявление антигенов и антител против энтеробактерий иммунодиффузионными методами

РГО

. _ п МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Мосхохокая ветеринарная академия им. К.И^Скрябина

На прар?х. рукописи

ТЕСФАЙЕ ВОРЮГ ХАЙДЕМИЧАЕЛ

ВЫШЕНИ1 АНТИГЕНОВ И АНТИТЕЛ ПРОТИВ ¡ЙТЕРОБАКТЕРИЙ : ■ ИММУНОда$УЗИОННЫМИ МЕТОДАМИ . • • •

16.00,03 - ветеринарная иикробиологмя, вируоологая, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

.1

*

> - '

диосрртации. не соискание ученой степени кандидата зэторинарку* наук

МОСКВА - 1993

. ' . ' • *

" Работа выполнена в Московской ветеринарной академии км. К.И. Скрябина.' . .

Научный руководитель - доктор ветеринарии: наук, профессор Бурлаков В.Л.-

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных к*ук профессор ' Малахов Ю.А., кандидат ветеринарных наук доцент Скородумов Д. И.

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Коваленко Я.Р.

Защита состоится ^f^ * ßtkcSli Х993 г. в часов на заседаний снепиахиэироаанного совета К 120*36.05 по принуждение ученой степени кандидата наук в Московской ветеринарной шеадвшш >ш. К.И.Скрябина ( 109472, Москва, уа* Академика С;грлФжа, 23, тел.» 377-93-83);

С диссертацией иожно ознакомиться в библиотеке еяэдешш. Автореферат разослан " $ '

"'Г ' '.Л-: •-'-■•■"

Ученый секретарь епепиализированного совета : Садосзаса Т.Н.

»

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. В последние годы многие исследователи (Воронин S.C., Шишков В .П., Старцева Л.Я. и др., 1989," Куриленко А.Н., Крупа-хьншс В.Л.; 1992, Соколова Н.Л., 1993,' Sediat J.} Riche H-, 1968) юобщаэт об изменении кяксробного пейзана вопбудителей диарейных ки-зечных инфекций. На смену сальмонеллам, энтеропатогенным эшрихияы триаши »такие представители условно-патогенной микрофлоры как протей, слебсиелла, цитробакт.ер, стафилококк и повсеместно стали регистриро-зать наличие заболеваний вирусной этиологии (рота- и коронавируаные шфэкции и гастроэнтериты).

Наиболее ваэдой задачей является всестороннее изучение антигенной :труктуры возбудителей кишечных заболеваний человека и животных, в тврвув очередь <-знтеробактериозов, изучение механизмов иммунитета и 20верззнств0вание' методов выявления антигенов и антител при этих задеваниях, приемлемых для практической работы.

Существует^ бактериологический метод диагностики заболеваний, зызываеаых з нте рс баэт ор;шет у телят, трудоемкий и длительный; на ус-рановяещю диагноза требуется не ыенеэ 6-7 суток (Антонов Б.И.,1986).

При массовых серологических исследованиях наиболее доступной является реакция агглютинации, в то*, не время из-за отсутствия стандартных антигенов к сизороток шэ наборов или вообще при ряде энтероба-хтерий, осуществить пбстановку РА часто не представляетсявозможным, I реакция шее? лишь подсобное диагностическое значение. Другие серологические реакции пока не находят применения в практике лабораторных исследований.

Поэтому разработка ускоренных методов диагностики этих заболеваний по установлению фимбриального или других специфических антигенов является актуальной проблемой {Hanson ¿'H- H al ., 1971/ Ahesiedi s. ei A3-/ 1972,1973, Ah^si&di s. ei л7.,1975, Белая O.C., 1966; Степанова Л.К., I960; Баркус M.U., Бондаренко В.Н., ЭлуерФ.С., 1986).

На основании изложенного попытка изучить перспективы использования РДП и ЕИЭФ для уточнения антигенного родства и выявления антигенов и антител у иивотных в силу повсеместного распространения заг-Золевпний, вызываемых энтеробактерйямп, является актуальной задачей,

■ Цель и задачи исследований. Учитывая недостаточную разработанность юшунохзшических методов для выявления антигенов и антител, a гакз'е неясность перспектив их применения для уточнения меяродовда, межвидовых и ^гутривздовых перекрестных реакций у энтеробактерий, перед нами была поставлена цель: ' ■ •

- отработать простой и надежный иетод выявления антител и анти- .

1-т •.•'•' • "•

-генов на основе диффузионной преципитации в геле^ (включая встречный иыыуноэлектррфарез); • ,г

- уточнить с использованием этого метода антигенные взаимоотношения у основных родов энтеробактерий, являющихся возбудит елк.-и кии чных заболеваний.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие конкретные задачи: -

- выделить 0-, К- и' Н- антигены некоторых видов патогенных и уст ловнопатогенных энтеробактерий;

- приготовить сыворотку на антигены сальмонелл {¿.typhimartum) эшерихий (Е. coll ), клебсиелл tKl» рп«итю'м£), протей ( R\ Vvl^ris и цитробактера (C-^r«</ndü );

- отработать методики РДП и ВИЭФ, обеспечивахщие выявление в ига сиыальных титрах подученных антигенов и антител в сыворотках;

- изучить в сравнительном аспекте антигенные взаимоотношения эн теробактерий в реакциях-агглютинации, диффузионной преципитации (РДП) и"встречного иымуноэлектрофореза (ВИЭФ).

Научная новизна. Изучены условия осаждения антигена жгутиков S. -tij phimuriwn полиэтнленгликолем (6000) и разработана методика получения ПЭГ-Н-анткгеНа. Установлены оптимальные режимы постановки РД и ВИЭФ для выявления специфических антител и антигенов энтеробакте рий. ■."./-■.•..-

Получены дополнительные данные, свидетельствующие об отсутстви антигенного родства протея и цитробактера с S. typh'miurtum Е. coli и Kl. potumD>y\a* и наличии такового между структурными антигенами у последних (РА, РДП, ВИЭФ). './

Показана возможность.выявления в РДП и ВИЭФ антител в сыворотк и молозиве и антигенов в органах экспериментально зараженных лабор торных животных и естественно инфицированных телят. J "

Практическая значимость. Резрабртанный метод получения ЮГ-Н-г тигена s. typhimur-ivm может применяться в исследованиях для полз чения жгутиковых аотигенов подвижных ба!«ерий. Предаоженкые метод» ки постановки РДП и ВИЭФ могут быть использованы в ветеринарных ле бораториях для массовых серологических исследований с целы» выявл« ния пост вакцинальных и постинфекциональных антител, а ТЩ13& с Цел1 прямого выявления антигенов 'в органах животных, теробактериями. Полученные активные антигены и сыворотки могут Sie. основой создания для практики комплексных диагноетичедае: Кторов для РДП и ВЙЭ5 с целью. дифференциации наиболее 'чшв^'^Щрхчфщхз^ з »болеваяий кр^тшого .рогатого скота; (колкбактериоз, ^альмонэллез,:

протеоз» клебсиеллеэ, рота- и коронавирусныз болезни и др.).

Апробация работы и публикации. Ыагериалы диссертации доложены и >добрены на отчетной научной конференции Йосковской ветеринарной академии в 1992 г.

По теме диссертации опубликованы две статьи в сборнике научных ■рудо в (межведомственный) Московской ветеринарной академии им. К.И. ¡крябинф - "Опыт подготовки кадров для сельского хозяйства зарубеж-ых стран", и., 1992.-

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 50 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора ли-зрзтуры, собственных,исследований, обсуждения, выводов и рекомендации по использованию научных выводов. Список использованной литера-¡грт включает,-205 публикаций по тематике исследований, из них 95 рус-íüx и 105 зарубежных. Материалы иллюстрированы 32 таблицами, 3 фото-

зафаяш' и • б рисунками,

■ ' *

. 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.Г. Материалы и методы

Работу проводили по плановой исследовательской тематике на кадре .вирусологии, микробиологии и биотехнологии Московской ветери-рной|цсадемии им. К.И.Скрябина в 1990-1993 гг. В экспериментальной работе по получению антигенов и сыворот&к, а гае для выделения чистой культуры и проверки свойств штаммов испо-ювано более' 550 белых кшей, 55 кроликов породы шиншилла в возра->'7-8 месяцев весом 3-3,5 кл и 40 морских свинок. .Кроме того, были гучеш из хозяйства Носковской, Костромской, Нижегородской и Цели-'радской областей Йо#»е 400 сывороток от привитого и непривитого тив энтеробаятерий . крупного рогатого скота. В исследовательской работе использовали эпизоотический штамм coif 0126: ШЗ, обладающий гемолитической активностью, эталонные имы из лаборатории болезней молодняка 1ÍBA и лаборатории ВсеросСи-. эго государственного научно-исследовательского института станда-зегога, сертификации и контроля ветеринарных препаратов. _ Исследования проводили с использованием бактериологических, се-)гичерких, биохимических я биологических методов, включалцих на-I, разработанные в Горьковском институте эпидемиологии и микроби->ия 'для ускоренной идентификации энтеробактерий СИБ и 1ВДЕ (Сис-i ¡шдшгаторшх бумажек и Пластины биохимические, диффврекцирупциэ робактерин).. .

При диссоциации в процессе культивирования проводили селекг^ш £э - форм каждой культуры. Для этого колонии. 18-часового ростй" на агаре Хоттингера просматривали через бинокулярный мийроскоп в косопрохо-дящем свете по методике Хоменко H.A. (1974).

Для накопления адгезивного антигена К99 позитивных ашерихий применяли специальную .0реду„ "Минка".

Серологические исследования для идентификации сальмонелл., клее- • биелл, эшерихий, протеев и датробактеров проводили, используя коммерческие диагностические агглютинирующие адсорбированные поливалентные и моновалентные 0-, К- и Н-сыворотки в реакции агглютинации на стекле в соответствии с антигенди&гностическиыи схемами, приведенными в наставлениях по применению препаратов и Методических указаниях по бактериологической диагностике 'Справочник по лабораторным исследована в ветеринарии. Бактериальные инфекции, Ы., 1986,с.23-25).

Гипериммунные сыворотки получали путем иммунизации кроликов цель-номикробными и отдельными структурными антигенами энторобактерий, из готовленными по методам Rocshea R. (1950), Кузьмина (1968) н frlQ-uffmaiw Я (1959). Жгутиковые антигены энтеробактерий готовили методом дефлагелляши, примененным Богоявленской (1972) для приготовления неадсорбированных специфических 0- сывороток к сальмонеллам. Патогенные свойства изучали на белых шшах весом 12-14 г. ЛДзд вычесляли по Риду и Менчу. Статистическую обработку результатов исследований проводили согласно штодике Баша D.K. (1989). Определение 0- и K-антигенов в реакции агглютинации. • Как известно, одним из критериев, указывающих на наличие у бакг термальной клетки К-сштигена, является отсутствие агглютинации необработанных нагреванием бактерий E.coll в гомологичной 0-сьша-ротке (Knipscfiitdc H.a., 1945, Kaujjmann 1947,1954, vJUtt'ng Wo 1965). . j ''.;..■

Для типирования культур E.coJ« ' по K-антигену применяли РА о использованием агг лотинирупцих OK-сывороток, полученных путем гипер иммунизации кроликов суспензиями живых балтерий. При взаимодействие бактерий, имеющих K-антиген, с гомологичной OK-сывороткой, наблю- . дается образование крупнохлопчатых агломератов.

> 0 степени развитости K-антигена судили'по разнице в величине_ титров РА живых и гретых бактерий с ОК-сивороткани (Полякова O.A., 1978, Fey И., 1974). - .

ОК-гсыворотки. получали на типовые штагам, используя при этом •• IS-20-часовые. агароска культуры, сотке физиологическим раствор»«!' содержащим 0,3% фориалина. ' ; ' ..'-..'¡У „•-

.Для определения наличия О-актигена Ькьгвы•IS^jae&^ae'apa^BS^

культур подвергали термической обработке. Дня выявления з шташэ Й-аитигена типа А суспензия бактерий автокл визировали при 121°С в течения- 2-2,5 часов. Пробирки с антигенами и сыворотками вычеркивали 16-18 ч при 37°С, после чего учитывали реакцию. Результаты РА определяли в крестах:

-н-н- - полное просветление пндкости над полностью осевшим на дно пробирки аггдютинатоы в виде раскрытого перевернутого белого кружевного зонтика, при встряхивании зонтик разбивается на хлопья и комочки, а квдкость остается прозрачной.

+++ - неполное просветление иидкости, но хоропо выраженный зонтик С7Ь% агглотинадия), при встряхивании агглютинат разбивается на хлопья, ко'гочки, глыбки, яидкость слегка цутноватая.

■н- - заметное просветление пндкости, зонтик умеренно выражен (50% агглотинадия), при встряхивании осадок разбивается на более мелкие глыбки и комочки, жидкость мутная.

+ - едва заметное прс^сзатлениа зидкости, зонтик слабо выраяен, яри встряхивании осадок разбивается на небольшое количество хлопьев ;! коиочков (25% агглкгтгацзя), якдкосуь явно цутн«л.

- бяетус) г просветление падкости и образование зонтика отсутствует, на дао пробирки в-центре видна "пуговка". . Показатели' агглютинации'в пробирках на два, три или четыре крес-га характеризовались как положительные.

2.2. Результаты исследований

На первой отеле были проверена .морфологические, тиняториальные, 1ультуральнаа I на 8 видах тщательных ередЗ^ ферментативные, серо-эариентные п патогепшэ свойства используемых шташов энтеробактерий,

Получэзгнае данный свидетельствовали о типичности свойств штаммов ут того или иного рода (сальмонеллы, эшернхии, клебсиеллы, протей, щтробактеры).

Эталонны! а апизоотачесшй втгшмн зпернхий были проверены со ста-щартныии сивороткаш на одгезивнцэ антигены К-88, К-99 , 907 I А20. ...

В процесса работы были выявлены, основные биохимические тесты, по-1В0ЛЯ2СКЭ с минимальными гатрапроводоть дифференциацию штаммов, :сгользуе:их антерабоктерий:

I» ЕзЛяр'еЫа. - кгграт натрия, галонат натрия, мочевина,' фс5гдлаланин..

2. .- цитрат натрия, иадонат натрия, оряитин,^

г-ж ' '

- ь -

мочевина, фенилаланин, -галактозидаза. .

3. К]еЬ51вЦй - цитрат натрия^ малонат натрий, инозит, -1галакто-

зидаза.

4. СЦгоьаЫе.г- _ цитрат натрия, малонат натрия, мочевина, Фогес-

Проскауэр, - галактозидаза.

5. 5а(топе&а - цитрат натрия, малонат натрия, мочевина, Фогес-

Проскауэр, лизин, аргинин, орнитин, фенилаланин.

2.2.1. Получение различных антигенов энтеробактерий.

После селекции и изучения основных биологических свойств имеющихся штаммов, мы приступили к получению антигенов.

Цельномикробные антигены получали путем концентрирования выращенных суточных культур ПЭГом ( 4 части культуры + I часть стерильного 50га раствора ПЭГ). Одновременно в препараты добавляли формалин до концентрации 0,3$ в целях инактивации возбудителя. Концентрирование бакмассы^с одновременной инактивацией (0,31> формалина) до 1/10 от исходного объема проводили путем спонтанного отстоя при температуре О- + 4°С в теченио 2-3 суток. После образования осадка 9 частей прозрачного надосадка сливали сифоном или отсасывали пипеткой, оставляя нижний слой аморфного осадка с небольшим количеством надосадка (I часть). Концентрация энтеробактерий в подобных контрольных (без формалина) препаратах была от 10 до 70 млрд микробных тел в 1 мл (по стандарту мутности).

Выделение комплекса поверхностных (К) антигенов произведши катодом водно-солевой экстракции по и ¡.ъипду (1952).

Была предпринята попытка приготовления антигена по ыэтоду Грассэ путем замораживания и оттаивглия микробной взвеси (Деркач, 1940).

60-70 -миллиардную взвесь суточной культуры 5- 1урь1тиг\ат в физиологическом раствора замораживали и оттаивали 6-Ю раз (при температуре - 50- +37°С). После цзнтрифугированил нздоседочную еидко-сть консервировали ыертиолатом и использовали как антиген4 В после-" Д5шг,ем получали спиртоацетоногые 0- антигены сальмонелл.

Жгутиковые антигены получали тремя способами: ультрацентрифугиро* ванием, с помощью 1ВГ5 и стандартным форлол-методо». Дистиллированной водой смывали культуру с матрацев, двукратно петркфугировали и де^пагеллпровали в шюттель-аппар&те. По окончании встряхивания микробную массу центрифугировали в течение, 30 мин при 6-8 тыс. об/мш Полученную нядосадочную квдкоеть использовали кяк источник жгутиков. Эту жидкость собирали и подвергали ультр^иемтрифугяровенив при 40■ ткс. об/мин .( 105556) в течение 1^5 ч Лультрапентрафулиий ме- . тод получения'Н-антигена). ' "

Мы. резили изучить возможность использования. ПЭГ для осйзденйя .

жгутиковых антигенов знтеробактерий после дефлягеляции <ПЭГ-Н-анти-ген). С этой целью предварительно были отработаны оптимальные параметры: концентрация ПЗГ - 8%>, температура -0-+4°С, длительность спонтанного осаждения - 24-48 часов или "легким" центрифугированием (6-8 тыс. об, 30 мин).

В последующему полученную надеоадочную жидкость добавляли ПЭГ-6000 из расчета 8г ПЭГ на 100 мл надосадочной жидкости. После полного растворения ПЭГ при многократном перемешивании жгутики (флагеллин) осаждали легким центрифугированием при 6-8 тыс. об/мин в течение 30 мин. или путем спонтанного отстоя при 0-+4°С в течение 24-48 часов. Затем осадок ресуспендировг^ли физраствором, доводя общий объем до первоначального. Далее определяли концентрацию флагеллина (белка) на спектрофотометре (-СФ- 16А) в антигенах, полученных различными методами.

Концентрация жгутиковых антигенов (белков), полученных осаждением ПЭГ, превышала з 4-5 раз крнцентрации Н-антигенов, полученных ультрацентрифугированием. .

Как показали данные последующих исследований, получаемые нами антигены знтеробактерий были активными (от 1:3 ООО до 12 800 в РА) и обеспечили получение специфических сывороток и разработку методик постановки РДП и ВИЙ с целью выявления антигенов и антител, а также антигенных связей интерисупцих нас патогенных знтеробактерий. Антигены сохраняли исходную .активность (1:4 - 1:16 в РДП и 1:8 -1:128 в ВИЭФ) в течение 10 месяцев в условиях заморозки -10—18°С).

2.2.2. Получение гипопиммункых сывороток.

Для получения гиперкммунш« сывороток на различные виды антигенов знтеробактерий ¡а гипериммунизировали кроликов породы шиншилла массой 3-3,5 кг еженедельно.'В процессе гипериммунизяции от кроликов брали крозь из ушой. вен (по 1-5 мл) для контроля активности сыворотки.

• Через месяц и позднее в сыворотках большинства кроликов,-гиперим-гунизироЕгншХ внутривенно семикратно а интервалом 5 дней комплексными цельнс::и:сг.об:Е1мн антигенами, препипитируицие .антитела выявляли п титрах 1:16-1:64. Лнтксыворотки на разлишшэ антигены получали по 1 сходным С"е"-гг гкпериммуннзгщии, отличающимся по"интервалам введения (2-5-днеЛ), способом введения (чередование: внутривенных и'подкалних тлп.л;::«!) и делам антигенов. При тотальном обескровливании обычно от ' ¡фодига полу^-"::*. 5П-60 мл сыворотки, сыворотки консервировали ыерти-олатец 1:10 ООС, расфасовывали в ампулы и хранили без снижения их. ^•тппности а течение года при 0-+4°С или -Ю~18°С. Агглютинирующая ..

■и преципитирупцая активность внтисывороток на основные грутп^ ьнти-генов энтеробактерий представлена в т&блицо I.

Таблица I

Агглютинирующая и преципитирупцая активность' полученных антисывороток на различные цельномикробные и структурные антигены энтеробактерий с гомологичг ныыи антигенами ( п»3)

* I Антигены | Средний титр внтисывороток с

! > РА 1 РДП

I. Ц.Ы. ¿г. ^¡рЫтиг'шт 1:12ЭОО 1:32 .

. 2. Ц.М. Е. соз/ 1:25600 1:32-1:64 "

3. Ц.И. Р 1:3200 1:16

4. Ц.М. к. р1читоп\йл. 1:6400 . 1:32

5. Ц.М. С./г«ап«Ги 1:6400 ' Ч' 1:16

6. ЦоОатический (0-) 1:12800 ■ 1:16-1:32

7. Соматический (0-) 1:3200 Г : 1:16

; Е.со11 ■ • ' / ' ' ; ■., ..". . ■

8. Капсульный Е.соИ 1:25600 • 1:16-1:32

9. Формол-жгутиковый Ш-)5-*ЧрМ-ПЭГ-Н-антиген тигйиЛ. 1:6400 1:16-1:32

10. 1:12800 ? 1:31-1:64

чг ' - ¿•Ь^рЫтчг'Чм ■ Ч. 'ЧГ

И. Формол-Н-антиген р. У(/2^аг«5 1:3200 '' Ч. 1:16 ' V 1 " - ■ .' .

12. ШН-Н-антиген ".'„*.; 1:6400;

р. Уц1уаг

Примечание : Ц.М. т цельноийКробиый Ч^'Ч.-,'" ЧЧ1. -Ч

Ч"' ',"■:'-'.'." •-'■"' ■■''"""'.ЧЬ.."' ^ ."'"гЧ*-- -'.' ' , 1-.:' Ч '-' ', " "-

Как видно из данных таблицы I, полученные нами антисыворотки «а различные вида антигенов энтеробактерий были высоко активны при проверке с соответствующими гомологичными антигенами (Рй РА титры от Г 1:3200 до.1:25600 и 1:16-I:64> РДП), Наименее активными э.РМХМ ; 3200) и в РДП (1:16) • были; сыворотки на соматически«»/антигены "Ё.со ; цельномикробга^ 1Й:;;фо^л-Н^антиг'еш про?ад. АктквиЦт^; «яитнсызоро-, ток ¡на эксп9риментаяьнк® ГО^-Й-антйгены обычно првЕыц^а*.аКТ11ВЙость антисывороток на ..стандартный .формбл-Н-шггкген. . " - I, У:' -

2.2.3. Отработка методов постановки реакции яМк ; ^узионной преципитации. и встречного имму-нозлектрофореза.

.Реакция.диффузионной преципитации'(РДП) применяется при многих Заболеваниях и считается высокоспецифичной, надежной, но недостаток чно чувствительной. Реакцию ставили на предметных стеклах или чашках Петря. АгарДифхо разливали соответственно по 3-4 и 15-20 ил, расстояние между лунками было 4 ш.

Учет реакции проводили через 12,24, 36 и 48 ч.

Для выяснения оптимальных условий постановки диффузионной преципитации (РДП) испытывали следущиерсзкмы: ; .■ -... концентрация агара - от 0,8 до 1,5?; температура - 37-38°С, 20-25°С, 0-4°С; рН - от 6,5 до 8,0.

При каждой нз отрабатываемых рэжшгов было проведено от 50 до 150 опытов. Чувствителыгость пзрвси&чалько определяла визуально по четкости линий преципитация в .'¿аяснуаггько рзнняе сроки о цальнйии или раэведенншет кошонентеагз» а гакка по иг тнтрацногйюй активности.

Реакции считали полояятвяыгоЗ при формировании одной или нескольких линий,, полос преципитации иазду луияил! о антигеном и сывороткой. ■ \ .'; ■ ; .

При использовании 0»в-Г1 агарового <галя полояительную реакцию с гонологгечншгй антигенащ; и сыворотками откачали в 81,3 - 86,6% случаев, а в гэтерояогичных системах - 10-16$. Прп использовании 1,2'и 1,5% агаровых гелей формирование ^впйтя'йругаря: полос регистрировалк в значительно меньших количествах пря вегх сочетаниях антигенов 1 антитая, чвы в гелях с 0,8 н 1%»агарэ. В последующих исследованиях 50 определению оптиыальногб температурного ргзгааа и величины рН йс-тояьэовался агар только в 1% концентрации (в отдельных опытах в чашках 5 .концентрацией агара при избыточном количестве конденсата агар гсслаизается)V.,.-. • '.•; .• ;••.

Положительные ргзуйьтаты РДП были несколько вше прй ее поста-совке в уелойгях термостата (+ -+38°С). РН 7,2-7,5 бале, оптима-[ьной, так кел обеспечивала наибольшую*воспроизводиыость результатов I гомологичных антиган-шятлтельнах системен (81%). при 3-4% реакций I гетерологичннх системах,?'Кроне того, при кксяьгх рН осложнялся учет асчет■ неотчетливое*«;»/зернистости в линиях преципитата.- :*.' .; В "этих -ошз'лзс' быяо показано, что найбблее четкие и воспроизводи-ие-^еэуяь'га.тннаблвдали через" 24-36 ч.; В более поздние сроки появ-ения; Дополнительных линий преципитаций обычно не отмечали.; ..

-■ю -

Титры антигенов, использованные при отработке режимов РДП и специфических к ним антисывороток в РДП, колебались от 1:8 до 1:32, с отдельными антигенами и сыворотками удавалось получить РДП и в гетерЬлогишшх комбинациях в низких разведениях (цельные - 1:2).

• Все■последующие исследования проводились при стандратных, наиболее оптимальных для воспроизводимости реакции режимах:

- концентрация агара - 1%\

- инкубирование реакции со влажной камере Сэксикаторе) при 37-• 38°С;

- рН сяабо щелочная (7,2-7,5).

Реакция встречного иымуноэлектрофорез» (ВИЭ$),

При отработке методики постановки ВИЭФ необходимо было установить оптимальные параметры силы ^ока, температуры, рН и крнцентра-дии аеара в геле. Для отработки 1а использовали наиболее активные в РДП антисыворотки и антигены энтеробактерий.

Цами испытывалась приемлемость применения следущ;ос величин силы тока на одну.стеклядаую пластинку: 4-8 иА, 10-15 ыА и 16-22 мА при установленных в последующем оптимальных значениях рН, темпера, туры "и концентрации геля,

Испытанные высокие показатели силы тока были непригодны для постановки ВЙЭФ, так как имели место разогрев и деформация агара, что осложняло учет результатов реакции. При минимальной силе тока (4-8мА) отчетливые полосы преципитации н&чинйли просматриваться только через 1,5-2 ч, более приемлемым был рехиц при силе тока 10-15 НА, когда результаты рзакции были четкими чараз' 1-1,5 часа.

Результаты исследований показал):, что охлаждение подставки ьодо-проводной водой слишком осложняло технику постановки реакции, а отчетливого повышения чувствительности или ускорения учета результатов йе отмечали. Проведение ВИ&5 при повышенной температуре (30-35°С) способствовало более'быстрому получении ргзультйтов, но возникало опасность деформации геля, нарушения локализации-и форш линий преципитации. Поэтому оптииалышй те:.:леро.турный режим для Яро-."ведения ВИЗФ определялся практнчзекга,и: условшцш без охлаадения стекол при температуре 25-30°С, а оптамум рН агара' п буферных растворов была 7,2-7,5.

При плотном слое агара £1,5-2,0%) диффузия била затруднена к результаты ВДЭЕ в наиболее прнешееше сроки учете (1-1,5 ч) бгкн отрицательными, или тит$ы сывороток иш нкке, чем при концонзр&хрз; агара 0,8-1,0%. Сущзственьой разницы в ризультатях не отметали при использовании агара'в концентрации 0,8 и I% (максимальные титры).

Так как 0,8л arapsEL-rii слой в отдельных'опытах получался рухльШ|. сползал, целесообразно использовать его концентрацию, как оптимальную для данной методики - 1%,

. 2.2.4. Изучение специфичности РДП, ВИЭ$. РА и аотигеннцх взаимоотнодеяий у знтеробактерНЙ.

В ходе проведения этих опытов кроме антигенов и сывороток на энте-робактерии (в том числе и полученных нами), были испытаны следующие биопрепараты:

- единый бруцеллезный антиген для РСК и РА, антиген респираторное' го микошгазмоза птиц для РА, антиген сибиреязвенный стандартный, тг тиген пастерелла мул&тэцпда серотипов А, В и Д, а таете культура стрептококков и стафилококков;

- бруцеллезные для РСК и РА, птершзлунныэ сыворотки против пас-тэрелл серовариектов А, В и Д, специфическая сыворотка к вирусу гриппа, лечебная сыворотка против оггероко.таоэой инфекции и сборная си-воротка крови крупного рогатого скота Московского и Кяззсксго гшсокомбинатов.

Подученные нами кроличьи ^гггсыворогхи па цзльшчинрсбкыв антигена ангоробактериЗ из давали :сг«!х-либо пзсяотфлестгс рзаяцяй в РДП, Б11Э5 н РА с эталошкли гозбудэтоло?! бруцэллзаа, пас-

тэреллеэа, иакоядазмоза, сябярокоЛ язза,- агазактпЯного стрептококкозй я оояоткстш» стефалокоаком. Однгао, иззи скворотки в яэиоторах слу- , »гаях давали псрзкрзсгннэ рзадгаа'с йггпгочаглн этаяонгапс зтеммов эн-тэрсбаотерай. Как в посявдувщза было ует< ^злэно,подобные эйфакты свадеярея&стсоваля о$ aimirei-nicy родства •..-.v.chx злтср-обактерий. Полученные срашпяеяьшз результаты crtmatsav.«авали о специфичности отработанных шши ике^у^одпайуз'лошж «зтодов а .используемой т практика реакции агглагсннаик:!«

Специфичность названных реакций подтвердились и при проззрке эталонных сывороток с пояучеияда» нами антигенами энетробгаггериЯ.

Нвко?ор;а пере^реетикэ реакции в низких титрах медду цельиошгаро-б:"пгл антигенами сальмонелл, эгзрихий и клебсиелл,и сборной и йнтс-рояокковоЯ сыворотками от ярусного рог!того скота, вероятно., свидетельствовали об ннфишфованности доноров дисезли знтеробактерилми.

Полученная наш гитпсыворотка на ПЭГ-Н-антиген сальмонелл но. давала перекрестных реакций со структурными антигена)« эперихий, в то' ■ время как антисыворотна на форыол-Н-антигйн реагировала! во всех реакциях в нипких разведениях с соматическими целькомикробным анти-" генами энергий.. - "

В целом денные свидетельствовали о большой? специфической акти- • внести антксыврроток на ягутиковый антиген сальмонелл, получаемый' • по предлагаемой нами методике., ."vat w .-„льн?**-'

Мы проводили.специальные исследования по изучению антигенных взаимоотношений используемых итамшв эитеробактерий. Первоиачальио ; для выявления меяродоввсо родства опыта проводили с цеяьноыикробиы-ми (компонентами) антигенами. При выявлении т^ковоио в последующем ' в РА, РДП и ЕИЭФ .изучали антигенные взаимоотношения мекду различив-; ми структурными антигенами вшерихий и сальмонелл. .

Перекрестное антигенное родство было установлено во всех реакциях между сальмонеллами, ашерихюши и клебсиеллами. Полояителькне разу-.дьтаты о1 ыежродовоы родстве были получены в РА в разведениях 1:25- j 1:50, в РДП линии прзципитагрш формировались только при использова-: нии неразведанных сывороток (цельные) или в разведениях 1:2,. в 'ВИЗФ, 1:2-1:8, .•■■ v \ ' ' , ;

- Цитробактер и цротай не имели антигенного родстга с еверихшша, сальмонеллами и клосбиедявш. Такна но выявлено родства у веозс ей-серобактерий q еититенами гканей кмшечянкд воспр.'жтчивих лабораторг-•яюс ииво'тных (кролики а 122га); ■ > v ; ;:'*■'.'■ \j

Кроме сугубо вндосп^цнфичейкого жгутикового едавгенат вое осталь-; ные структурные агггигецы:.S,fyphtaturiun>i'- нЧЕ.соИ - имели пере- <

крестное родство,;выявляемое во ?сех трех серологических реакциях Между собственными структурными антигенами S-typhmuriatn были вы-! яейены значительные перекрестные свАзи (1;950 в РА,"1:2 в РДП и 1:8 в ЭДЭ®). Вфтеетведою, титры антисывороток с ацтигеназд, на которые ■! они были получены\ имели несравнимо болызие значения Сот 1:3200 до 1:25600 в PA, I:I6-U6f в РДП и Z:I6-J:I28" щВШУ,

- . •• • 2.2.5. Изучение возможнорти практического .

. - ■ выявления антител и антигенов энте~'

. . - „ ■..•.,'.,_ ■ тэобакташй у больных животных небла- i-..

• гополучных хозяйств и акспзтменталь-'

»но зараженных лабораторных животинх.

В хозяйствах Московской, Целиноградской и-Костромской областей были взяты 564 пробы сывороток и 59 проб молозива о? крупного рогатого скота различного возраста (телята от 2-4 дней до 3 ше,, коро-.вы и быки 1-3 лет).- ;' •■

В хозяйствах Московской и Целиноградской областей проводилась, плановая вакцинация поголовья против сальноиввяеза и кодибак^эрио-за, а яивотные из,-колхоза "За мир" Костромской области за послодние 3 года не были вакцинирован*!.- ,

%% вакцтшров-.шяс* и швакцинировшашх телггг в возрасте От двух дней до 3 мое., ст яоторпх были взяты материалы Для исследования* 61Ш ли клинически больными. 3 основном это тялята слабые с матовым иэр-стшш покровом, некоторый из тле не поднимались, фекалии у большинства ппдкой консистенции, у некоторых отмечался проффузный понос, почти у всех задние конечности и хвост запачканы фзкадняыи, температура тела в пределах нормы-, иногда несколько виза.

Как следует из данных таблицы 29, среди неблагополучного по .ост-Phîî килечным заболеваниям стада тавотных (Костромская область) выявлены антитела на различные знтеробактерии как у телят, так и взрослого поголовья (до 25$). Прячем, у большей частя выявляли по антителам смешанное инфицирование с участием клебсиэл й центробактера. У "животных, привитых ассоциированной вакциной Шосховская и Целиноградская области) и полученных от ш телят 3-40-дневного возраста,■ практически во всех случаях регистрировали наличие ентлтея в сыворотках и молозиве. Вероятно, в данных хозяйствах улхивоткых вкявляли антитела на-вакцинные nraieai (крот цитрсбактерз), п получатдае-результаты но давали возможности обоснованно судить об этиологии ки-пзчиых расстройств у таких телят. -

Наш! данные свидетельствует о toîj, ':то РДП является перспективный методом для еиявлсния штитэл у сагсшшнрозгипшх или инфицированных Ентеробактериягп! яивотных.

До-настоящего времени на практике п-з используются серологичес-кио рзакцип для прямого выявления- нитигелоз эн7еробактернй в тканях больнше или павптас зстзоткых. '•'

Ги резили изучить возмотшорть выявлен!* я антигенов патогенных и условно патогенных эитеробактериЯ в -гкп:*«.••-.•: кгпбримЕнтально заргехенн

кроликов для обоснования последующих исследований с половыми • патериаламп. •

Кроликов заражали .-40-50 ¡ифд. ÎIF энтеробактерлй внутрибротинно. • ГЕивотные погибали (сальмонеллы и клесбиеллы) или были убиты, (эшери-зши, протай и цитробактер) на 4-6 день после заражения. От яивотннх брали кусочки .парзгошматозных органов, готовили 20% суспензии, которые подвергали 5-7-кра?ко«у зашраяивйкй® и оттаиванию. После этого соответствующие суспбпзил'-цснтрифугировали в течение 45 мин при 3000 об/мня и надосадоетМ шщкостй использовали в качестве испытуемых антигенов в РДП. п ВКЭ5. Сыворотки применяли в разведениАх, со- • деряаарк 4-!фажнуэ:-'до^>,". исходя из предельного, титра.' , '.'liait видно.из"таблица.30, вг'20% суспензиях'почек, селезенок и-'-' пзченИ* DrtCnspn'-.fsnrajrbKö зарягеншх- энтс$збактериямгт кроликов., ста- , ; «Jtîâbifiài-;тщёщ(ш соответствующие антигена а РДП и ВИЗФ. Хотя титры .

• -14-

антигеноа в селезенке, были все же ниже, и этот орган, как и сердце, | не следует рекомендовать для подобных исследований. В антигенах из иеч^и и рочек антигены энтеробактерий выявляли в РДП от цельных до 1 1:4, & в ВИЭФ - в пределах от 1:2 до 1:8: в селезенке тктры антигенов были ниже, д в ткани сердца их обычно не выявляли.

Реакция ВИЭФ дня выявления антигенов была предпочтительнее.

. В дальнейшем нем били доставлены из хозяйства патматериаш (се- . лезенка, почка, печень я сердце) от павших теля? с ¿актериологичео- . ки тюдтвержденнымдиагнояом на колибактериоз.

Суспензии тканей от етих телят получаем по вышеуказанной методик» и проверяли на возможность выявления в них этерихиозиого антигена \ сантисывороткаыина цельномикробные антигены в ВИЗ®.

В органах дових от колиб&ктериоза телят в реакции ВИЭФ стабильно выявляли антигены возбудителя заболевания (печень, точка и селезенка), т.е. результаты были сходны с таковшги при засперименталь-мбй инфекции у кроликов и мышей.

В зт|цс исследованиях РДП оказалась менее вффектишой в сравнении с бактериологеской диагностикой. Однако, показаикл,ВИЭ® полностью .совпали'о'результатами бахтеряаяоггмескогометода«

Таким образом, реэу^ьтати проведенных'нами исследований позволяют рассыатриватьРДП и ВИЭВ как специфичные чувствительные лабораторные метода! перспективные для широких испытаний и внедрения в ве-. теринарную практику с целью выявления антител и антигенов при заболеваниях, ^вввлМис'внтеррб^^ияш.;;-^

• • ' вывода . .... '.

I. Разработана методика получения долее активных « специфичных препаратов ШГ-Н-антиген ^црЫтигЫгп (1:12800 в РА и 1:32 в РДП), получены структурные антигены з.ЦрМтагып, , Б.со1|' К.ртиты/а-е и и соответствующие гипарим-

ыунные кроличьи сыворотки для РДП и ВИЙ, Диагностикумы сохраняли активность в течение 10 месяцев (срок наблюдения) при иинуо 107 18°С. . 7-''. . . • . " V _л;;7 д.

2-. Отработаны оптимальные режимы постановки РДП к ВИЭФ для выявления антител и антигенов энтеробактерий.

Параметры постановки РДП: концентрация агара - 1%, температура инкубации во влаяной камере при. 37~38°С, учет результатов через • 24-36' ч, •' 7 д .-'¡"С. ' ' 7■777.-7;>.

Параметры, постановки ВИЭФ: сила тока 10-15 мА на одну стеклянную платинку размером 6x9 см, концентрация агар^г/- 1%, рН - 7'Ж^г температура в камере -::25-30°С, учет результатов через'1-1,%;

■3. Изучены Ептигкшые взаишотнопення меяду структурными антигенами энтеробактерий. Установлено отсутствие шгтигенного родствА протея и цптробактера а .эсерюсиямЯ, сальмонеллами и плебсиеллами. Выявлены перекрестннз антигенные связи в РА, РДП и ЕйЭФ между цельно-микробными антигенами S.iyphirturiuivt , Е. coll и К. pneumoniae Удтоновлейа двусторонняя перекрестная связь между структурными 0- и К-онтигенаыи 5- typhimurium и Е.соЛ (до 1:50 в РА и 1:2-1:4'

в рдйи виза». *. •

4. Иымунодиффузиокныв тесты пригодны для выявления антител на аптигены энтеробактерий в. сыворотках переболевающих или вакцинированных иивоткых.-

5. Установлена оозтяность прйютго выявления в РДП и ВИЭ® антигенов энтеробактерий в 20% дефростированных суспензиях тканей почин, печени и селезенки экспериментально зараяекных лабораторных животных иля естественно инфицированных телят.

6. Отработанные методы РДП и ВИЭЬ просты.в техническом отношении, специфичны пря выявления антител и антигенов энтеробактерий и перспективны для использования в практической исследовательской работе.

4. РЕИОМВДШИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЙ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ ■

- Целесообразно па базе втезрянаряых лабораторий провести широкие производственные испытания отработанных изтодов РДП и ВИЭЗ с йзльв,выявления антител у Бшсцинировпгпых и первболевакрх животных, а такие путем пряного выявления'антигенов в органах и тканях живот-, тих инфицированных знторобактерияця.

-ПрэдлолошшЯ кэтод подучепяя ГВГ-Н-ан?г{генов сальмонелл следует апробировать в исследовательйках учрггэде!п«с; для получения подобных ентигаюй из других подвижных бактерий. •

; ' : ; 5.СШС0К РАБОТ,. 0ПУБШ1К0ВАШШХ Ш ТШЕ ДИССЕРТАЦИИ .

I. Твсфайе Ворку. Изучение аятигённых взаимодтйоианий энтеробактерий. Сборгак научных трудов МВА "Опыт подготовки кадров для сель-саогяС^гШетва зарувеаннх стран", 19|2, стр. 154-158. .

• - 2. ТесфаЯв Ворку, Бурлаков З.А. Получение активных антигенов и енпгсыЕороток па _эптороб&ктерпя. Сб.. научных трудов МВА"0пк? под-готовш! ^кадров;сельского хозяйства' зарубежных стран", Л992",

.Ротапринт . Подгшседо э,печать ^Ъф^^ъцп Формат бумаги 60x90V16 " Объем I печ.'1 я. Тираж . 100 Заказ , 706

Типография Московской ветеринарной академии имени К,И.Скрябина

' 109472, Москва, ул. Академика Скрябина,-23