Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение и характеристика моноклональных антител к К-тигену сальмонелл

На правах рукописи / -т-ч : II

\

! Ковальчук Наталья Вячеславна

Получение и характеристика моноклональных антител к К-антигену сальмонелл.

14.00.36. - иммунология и аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена на кафедре клеточной физиологии и имму нологии Биологического факультета Московского Государственног Университета им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, ст. науч. сотр. М.В.Раевская

Научный консультант:

доктор биологических наук,

профессор М.В.Гусев

Официальные оппоненты:

доктор¿^¿суи/гС&т. наук В.И.Новиков

доктор биологических наук А.В.Пронин

Ведущее учреждение: Московская Медицинская Академия им. И.М.Сеченова

Защита состоится _1995 г. в часс

на заседании Диссертационного Совета К 001.07.01 в Научно-исс довательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. малеи РАМН {123098. Москва, ул. Гамалеи, д. 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ я Н.Ф.Гамалеи РАМН. ' -

Автореферат разослан " ^^ 1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук Е.И.Коптелов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. В настоящее время известно, что патогенные знтеробактерии, вызывающие желудочно-кишечные инфекционные заболевания, имеют разную степень вирулентности, от чего впрямую зависит характер патогенеза. Молекулярной основой развития специфических процессов являются факторы патогенности бактерий, наличие которых коррелирует с вирулентностью и связано с функциями адгезии, инвазии, способности к внутриклеточному размножению, ци-тотоксичности, каталитической активностью.

Наряду с изученными факторами патогенности сальмонелл, такими, как липополисахарид клеточной стенки, в работах Finley et al.1988, Foster et al.1990 , Pulkkinen et'al..1991 указано на существование целого ряда маркеров вирулентности, функции которых неизвестны и требуют изучения.

В 1977 г Степановой Л.К. и соавт. на различных моделях in vivo и in vitro была достоверно выявлена корреляция между присутствием поверхностного K-антигена (Аг) сальмонелл и вирулентностью бактерий. К-Аг присутствует на клеточной поверхности 33-х серогрупп сальмонелл в разной степени и является фосфорилирован-ным белково-липо-полисахаридным нетоксичным комплексом, хорошим иммуногеном, отличающимся по серологическим, физико-химическим свойствам и химической структуре от других антигенов сальмонелл. Предположительно, его функцией является защита от фагоцитоза и, как следствие, способность к эффективному внутриклеточному размножению. В работе Токаренко Л.Г., 1980 сделан вывод о корреляции наличия K-антител в сыворотке больных сальмонеллезом с тяжестью патогенеза и развитием бактерионосительства. В 1984 г Агеевой В. А. разработана брюшнотифозная вакцина, где К-Аг является составляющим компонентом и обеспечивает выраженную поливалентную защиту от сальмонеллезной инфекции.

Таким образом. К-Аг является важным маркером вирулентное сальмонелл, функции которого однозначно не выяснены. Применяем! до настоящего времени методы изучения K-антигена не позволяют pi шить проблему перекрестной специфичности K-антигенов различи! видов сальмонелл и других энтеробактерий, разработать точное те< тирование степени вирулентности выделенных штаммов. В этой свя; актуальным представляется получение моноклональных антител (МЮ к К-Аг.

Получение и характеристика панели МКА к К-АГ позволит на ос нове современных методов иммуноанализа решить проблему индивид! альности препаратов, выявить, свойственны ли К-Аг только отдел! ным серогруппам или большинству сальмонелл, оценить его наличие других энтеробактерий, также обладающих способностью к внутрикле точному размножению и расширить практическую область применени научных разработок по данной теме.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы являете получение и характеристика панели моноклональных антител к К-ан тигену сальмонелл.

Экспериментальные задачи исследования:

1. Охарактеризовать используемые в работе препараты К-антиге нов сальмонелл в биохимическом отношении.

2. Получить панель моноклональных антител к K-Ar S.typhimuri шп, охарактеризовать свойства полученных МКА .

3.Изучить перекрестную реактивность полученных МКА по отно шению к К-Аг других серогрупп сальмонелл и видов энтеробактерий применяя очищенные препараты Аг и целые бактериальные клетки.

4.Охарактеризовать иммунодоминантные и минорные антигенны детерминанты К-АГ.

5. Показать возможность применения полученных МКА в диагнос тической тест-системе на основе иммуноферментного анализа.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В результате проведения настоящей работы впервые получена панель МКА к K-антигенам сальмонелл. С их помощью достоверно показано наличие иммунодоминантных общеродовых детерминант К-Аг разных серогрупп сальмонелл, отсутствие выраженного перекреста с другими видами энтеробактерий. Впервые показано наличие минорных детерминант, характерных для K-антигенов S.typ-himurium и S. typhi и узкоспецифичных по отношению к целым клеткам. Выявлен единственный достоверный случай перекреста между К-и О-антигенами S.typhi.

С помощью эпитопного анализа охарактеризована общеродовая антигенная детерминанта К-Аг. доказано отличие связывающих эпито-пов К-Аг от основных антигенов сальмонелл.

Показана возможность применения полученных МКА при профилактическом тестировании пищевых продуктов с высокой чувствительностью выявления маркера вирулентности сальмонелл методом двойного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Определены параметры разработанной тест-системы. Разработанная система не имеет аналогов, так как применяемые в настоящее время зарубежные и отечественные диагностикумы используют смесь МКА к О-Аг сальмонелл. Наша система основана на выявлении общеродового маркера вирулентности и таким образом, тестирует степень патогенности выявленных бактерий.

Впервые проведено сравнительное изучение белковой части К-Аг S. typhimurium и S.typhi современными методами, показано, что данные препараты являются родственными по своей структуре, но имеются и различия по содержанию белка и аминокислотному составу.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ. Настоящее исследование позволило получить достоверные данные о К-Аг как об общеродовом маркере сальмонелл, не свойственном другим видам энтеробактерий.

Результаты работы вносят вклад в понимание иммунного ответа на бактериальные антигены, могут быть использованы при аналогичных работах по получению и характеристике МКА к бактериальным антигенам.

Полученные и охарактеризованные в результате проведенных исследований МКА целесообразно использовать:

1) в качестве лиганда для аффинной очистки К-Аг и его последующего использования в составе иммунобиологических препаратов;

2) при изучении функций К-Аг в микробной клетке, выявлении возможного рецептора на поверхности клетки организма хозяина;

3) возможно применение МКА к К-Аг в качестве протективного препарата при сальмонеллезной инфекции подобно запатентованным и официально применяющимся при лечении эшерихиозов МКА к Escherichia coli;

4) разработанная тест-система на основе полученных МКА и ИФА параллельно с другими иммунологическими методами используется группой по проблеме сальмонеллеза в МГУ им. Ломоносова для профилактического тестирования пищевых продуктов. Полученные в процессе работы МКА к другим Аг сальмонелл позволят полностью перевести профилактическое тестирование на новую основу;

5) разработанный метод выявления К-антигена в предложенном виде может быть применен для определения степени вирулентности клинически выделенных штаммов сальмонелл, а также выявления антигена в сыворотке больных на ранней стадии. Возможен.прогноз формирования бактерионосительства.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались на заседании кафедры клеточной физиологии и иммунологии Биологического ф-та МГУ.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 2 печатных работы.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (147 ссылок). Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц и 50 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ. Мыши линии Balb/c в возрасте от 6 до 12 недель. Препараты К-Аг S. typhimurium 30 кр, K-антиген S. typhi 139 mut, ЛПС S.paratyphi А н 460 (сг А). ЛПС S.typhimurium 415 (сг В), ЛПС S.choleraesuis (сг Cl). ЛПС S.typhi 901 (сг Д), ЛПС. S.muenchen (сг С2). ЛПС S.anatum (сг Е) в лиофилизированной форме; взвеси целых фиксированных бактерий рода Salmonella (13 штаммов различных серогрупп) и других представителей семейства энтеробактерий (10 штаммов 7 видов), Staphylococcus aureus Cowan; 4 поликлональ-яые кроличьи сыворотки к различным штаммам Salmonella (НИИЭМ им ri.Ф.Гамалеи РАМН).

Клон Е6, ранее полученный к.б.н. М.В.Раевской.

Коммерческий коагглютинационный диагностику на сальмонеллы :ерогрупп В, Cl. С2, Д и Е; на шигеллы Зонне. Флекснера, Ньюкасл, эазработанный в НИИЭиМ им Н.Ф.Гамалеи.

Пробы пищевых продуктов из столовой N 10 и Комбината питания ¿ГУ им Ломоносова.

Среды для культивирования клеток RPMI-1640, DMEM, ÎPMI-1640-HAT (Gibco, FLOW. Serva, Sigma). Пластиковая посуда для сультуральной работы (Nunc), микропланшеты для ИФА Nunc. Dinateck îicroelisa, НйИМедПолимер. Остальные используемые в работе реактивы были получены от фирм Sigma и Serva, неорганические соли фоизводства "Реахим".

МЕТОДЫ. ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВОЙ ЧАСТИ К-АГ. Проводили изучение .

спектра поглощения в УФ-области. Определяли молекулярную масс (Мг) с помощью гель-хроматографии на носителях Sephadex G-200 Superosa-12 в системе FPLC. Калибровочную прямую строили по дал ным молекулярных стандартов - по оси абсцисс lg Мг, по оси орди нат - коэффициент доступности (Кд). Электрофорез в 13% ПААГ в ре дуцирующих условиях проводился по стандартной методике с последу ющим окрашиванием кумасси R-250 и реагентом Шиффа , положительны контроль - препарат F0F! митохондриальной АТФазы сердца быка молекулярные стандарты. Определяли белок по методу Бредфорд {микрометод в полистироловых 96-луночных планшетах в нашей моди фикации), биуретовой реакцией и пробой с флуорескамином. Опреде ление аминокислотного (Ак) состава препаратов и Н-концевых А K-антигенов проводили дансил-хлоридным методом.

ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ. Сыворотку, супернатанты клеточны; культур тестировали на присутствие специфических антител методо] непрямого ИФА, Аг использовали в концентрациях от 1 нг до 2( мкг/мл, для блокирования неспецифического связывания применяли 1* БСА, вторичные Ат - меченые пероксидазой кроличьи антимышиные Ig, в качестве субстрата использовали о-фенилендиамин, в ДОТ-методе -диаминобензидин. Рабочий объем - 50 мкл. Результат учитывали нг Multiscan-Elisa при длине волны 492 нм и визуально.

ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА МКА. Иммунизировали подопытных животных, сыворотка которых давала отрицательный ответ на Ar сальмонелл в ИФА. Иммунизацию проводили подкожно чистым K-Ar S.typhimurium и виутрибрюшинно в неполном адъюванте Фрейнда по 125 мкг 3 раза с интервалом в 6 нед. Бустирующую внутривенную инъекцию проводили чистым К-Аг (50 мкг) за 3 дня до гибридизации.

Гибридизацию антителообразующих клеток и клеток мышиной мие-ломы Ag.X653 осуществляли по стандартной методике с предварительным тестированием титра сыворотки к К-Аг и проверкой на полной

!анели Ar. Для культивирования клеток применяли вышеуказанные реды с 20% инактивированной СПК, 100 мМ L-глутамином при 37° С во :лажной атмосфере с 5% С02. Фиксировали развитие клеточных линий помощью зарисовки наблюдений в микроскоп. Скрининг осуществляли помощью непрямого твердофазного ИФА на полной панели указанных г и поточным методом только на K-Ar S.typhimurium 30 кр. Клони-шали методом лимитирующих разведений; замораживали клеточные инии в СПК с 10% DMS0. Определяли класс МКА в ИФА с помощью ан-и-классовых биотинилированных козьих антител, изучали кинетику вязывания, индексы аддитивности по отношению к МКА Е6. Массовую аработку осуществляли in vitro и in vivo в. виде асцитной опухо-и. Очистку МКА проводили высаливанием сульфатом аммония, затем онообменной и гель-хроматографией с постоянным контролем Ат ак-ивности. Очистку МКА из асцита проводили аффинной хроматографией а BrCN-сефарозе с ковалентно присоединенным K-Ar S. typhimurium.

ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ МКА И ЭПИТ0ПНЫЙ АНАЛИЗ. Специфичность КА оценивали по взаимодействию в ИФА с панелью Аг, Перекрестную еактивность подсчитывали в % по отношению к уровню относительно-о ответа на K-Ar S.typhimurium 30 кр. Эпитопный анализ также роводили с помощью обработки K-Ar S.typhimurium и S.typhi мета-ерйодатом натрия 8мМ-, 4мМ-, 2 мМ- и 1 мМ-растворами с последую-ей стабилизацией боргидридом натрия, повременного трипсинового идролиза с применением неспецифического ингибитора сериновых ротеиназ PMSF, повременной термической обработкой от 0 до 2 час ри 100° С. обработкой 1 н NaOH с последующей нейтрализацией pH. энечным гидролизом нейраминидазой. гиалуронидазой и а-галактози-азой сорбированных К-Аг с последующим выявлением Аг МКА в ИФА.

ОЦЕНКА РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩИХ K-ДЕТЕРМИНАНТ НА ЦЕЛЫХ КЛЕТКАХ СЕРОБАКТЕРИЙ. Фиксированные формалином суспензии бактериальных теток отмывали центрифугированием. В качестве сорбента использо-

вали полистироловые планшеты с нанесенным 0.1% поли-Ь-лизином. Бактериальные клетки наносили в концентрациях 104. 105. 10s. 107. Последующие этапы ИФА проводили подобно вышеописанным.

ТЕСТ-СИСТЕМА НА ОСНОВЕ ПОЛУЧЕННЫХ МКА. Использовали смесь МКА, обладающих специфичностью к К-Аг сальмонелл и эффективными индексами аддитивности в качестве вторых антител. Вводили перок-сидазную метку перйодатным методом. В качестве первых антител использовали поликлональные сыворотки к Ar S.typhimurium и S.urbana (20 мкг/мл). Калибровали тест-систему растворами К-Аг от 0.1 нг/мл до 1 мг/мл. Рабочий объем - 100 мкл.

В качестве сравнения использовали реакцию коагглютинации (РКА), обработку проб пищевых продуктов проводили в соответствии с методическими указаниями к данному диагностикуму.

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ. Для оценки достоверности различий величин использовали критерий Стъюдента (t>2, р< 0.05). Параметры тест-системы оценивали по рекомендациям доктора N.Weiss. Число последовательностей в каждом опыте было не "менее трех.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

По литературным данным, биохимическая природа К-Аг S.typhi S. typhimurium специально не изучалась. В связи с этим представлялось актуальным исследовать свойства использованных для получения МКА препаратов К-антигенов.

Проведенное исследование спектра поглощения показало, что в составе K-антигенов S.typhi и S.typhimurium присутствует пептидная связь (пик 220 нм). отсутствуют нуклеиновые кислоты (пик 260 нм). низкое содержание ароматических аминокислот (Ак), поглощение при 280 нм существенно выше у К-Аг S. typhimurium.

По данным П.Ш.Гашимовой и соавт., 1970. при выделении К-Аг S.stanley из поверхностных антигенов препарат имеет молекулярную массу около 56-60 кДа. Но, подобно многим протективным комплек-

сам, представляющим собой сложные лабильные полимеры (Езепчук Ю. В.1977), К-Аг диссоциируют с образованием низкомолекулярных субъединиц, что подтверждается нашими данными. В гель-хроматографии на носителе Superosa-12 в системе FPLC К-Аг S.typhimurium выявляется в виде 5-ти фракций с молекулярным весом от 56,2 кДа (исходный, очень слабый пик) до 34.. 7 кДа (видимо, промежуточная фракция, также малое количество) и 3 наиболее выраженных пиков с низкими молекулярными весами (ниже 5 кДа). Последние 3 пика были отобраны для биохимического и иммунологического исследований.

К-Аг S.typhi в этой же системе характеризуется как один слабо выявляющийся пик с молекулярной массой 3.6 кДа .

Более свежая партия К-Аг S. typhimurium, применявшегося для иммунизации, в гель-хроматографии на G-200 выявляется как 6 пиков с молекулярной массой от 10 до 21,9 кДа. Как известно, вещества с молекулярной массой ниже 5 кДа неэффективны в иммунизации и вакцинации без дополнительных мер, но могут выявляться МКА, которые распознают .участки от 4 до 8 сахарных остатков или 5-"6 аминокислот (Guang T.L. et al.. 1991; Klein J., 1991).

В электрофорезе в ПААГе наши препараты давали слабые полосы в низкомолекулярной области и не подлежали фотографированию и интерпретации. Использование высоких концентраций антигенов (до 45 мг по Денисовой и соавтр, 1975) было признано нецелесообразным ввиду малого количества препаратов.

Определение белка по микрометоду Бредфорда и биуретовой реакцией дало разные результаты: К-Аг S.typhi содержит 14% белка по Бредфорду и 68,0% по биурету, S.typhimurium - 13,2% и 21,3%, соответственно. В пробе с флуорескамином по стандартной методике K-антигены визуально не выявлялись.

С помощью дансил хлоридного метода аминокислоты выявлены в K-S.typhi (Pro. Val. Lys. Туг, Gly, Arg, Ala. Leu) и во 2-ой из 3

отобранных фракций S. typhimurium (Gly, Ala, Phe. Leu). В качестве N-концевых Ак выявлены Gly, Ala, Leu. что говорит о родственности обоих препаратов.

На основании проведенного биохимического исследования можно сказать, что данные K-антигены в биохимическом аспекте являются родственными, но не идентичными веществами. Данные по высокой лабильности. низкому содержанию свободных аминогрупп в К-антигенах необходимо учитывать при иммунологических экспериментах.

Получение МКА.

Предварительный отбор животных, не имеющих естественных контактов с Аг сальмонелл и иммунизация чистым К-Аг, а не целыми бактериальными клетками позволили эффективно провести гибридизацию и облегчить скрининг гибридом на специфическую антительную активность. Всего было получено и неоднократно оттестировано на панели антигенов сальмонелл 257 гибридных линий. По данным тестирования отобраны, переведены в массовую культуру, и заморожены на ранней стадии 21 линия гибридных клеток. Из них 17"клонировано методом лимитирующих разведений, 11 продуцировали МКА к К-антиге-нам с различной специфичностью. Характеристика панели МКА к К-ан-тигенам сальмонелл представлена в таблице 1.

Исходя из специфичности к К- и О-Аг сальмонелл, мы можем объединить все полученные клоны в следующие группы:

1. МКА 1СЗ, 1D8, ЗЕЗ. ЗЕ7. 3F10, 4Е6, 5G4, а также МКА ранее полученного М.В.Раевской клона Е6 проявляют, активность к обоим К-Аг, что говорит о наличии общеродовой Аг детерминанты в составе активного эпитопа

2. Строгую специфичность к K-Ar S.typhimurium проявляют Ат только одного клона - 1Е4.

3. К K-Ar S.typhi серогруппы Д наиболее высокоспецифичны Ат клонов 2С6, а также 1С4 и 4С6 (существенный перекрест с ЛПС той

1аолица i ларактеристика панели полученных МКА к К-Аг сальмонелл.

МКА К-Ar S.typhi-raurium 30 кр К-Аг S.typhi 159. raut лпс S.Paratyphi А ЛПС S.typhi-raurium 415 ЛПС S.choler raesuis ЛПС . S. typhi1 Кинетика связывания половинное/ полное время нас Класс МКА Индекс аддитивности с МКА Е6, %.

1СЗ 300, ОЦ, 9 127, Э±3, 0 1КА К ОБЩЕ 33, 6±12,2 : родовым i 0, 3±2, 3 1ЕТЕРМИНА1 0, 312,5 НАМ IC-AHTI 33,914,6 1ГЕН0В 10/50 мин IgG2a 3114,1

1D8 100, 012,3 125, 812, 4 22. 7±0. 4 23,2Ю,3 3,0И, 4 20.2И.4 _г IgGl 3712.7

ЗЕЗ 100,0±3,1 113, 9±2, 6 2, 012, 4 9,612,3 ОН, 1 012,2 - - 2417.3

ЗЕ7 100,0±2,0 135,912,0 11.8±1.1 5,8И,7 0И,6 7,9И,7 - IgG2b 32Ю, 5

3F10 100,0±7,1 124,313,6 ■ 0±1.2 0110,3 016, 5 18,316,6 - IgG2a 3213, 8

4Е6 100,0±2, 7 115,4±0,5 4,0±4,3 8.Н9.0 012,7 17,714,0 - IgGl 29И,5

5G4 100, 0±4, 3 125, 9±2, 8 10, 0±5, 3 019,1 0+4,8 017,2 - Ig2a 3015,6

|1Е4 МКА К K-Ar S.TYPHIMURIUM 100,0±7,71 0, 1±0, 1| 013,0 | 2,4±4,6| 0±1,0 | 0И2,3| 10/50 мин IgG2a| 8719,2

2С6 7, 9±2, 4 100,0±1,6 2, 2±4, 6 МКА К 0,113,8 С-Аг S.TYI 13,9И,6 Ш 3,2И,4 5/45 мин Igßl 81 ±3.5

1С4 20.2±1.9 100, 0±4, 7 012,5 18,8И,0 16, 5И,0 16,5И,0 5/45 мин IgGl 83И2.3

4С6 11,4±0 100,0±2,5 4,0Ю,8 012,0 1,211,2 57,ЗИ,5 10/50 мин IgG2a 92±1,7

1 - в % от уровня ответа на K-Ar S.typhimurium; аналогично в отношении МКА к K-Ar S.typhi

2 - не изучалось.

же серогруппы - 61,0%). в случае с 4С6 наблюдается единственный перекрест между К- и 0- антигенами серогруппы Д (S.typhi), что говорит о наличии общих Аг детерминант, обычно не выявляемых моноспецифической истощенной- К-сывороткой. возможно предположить как общие Аг детерминанты, так и загрязненность антигенов. Данный К-Аг получен из КПА мутанта Vi-0±K+, и примесь ЛПС вполне вероятна.

4. Остальные полученные гибридные линии продуцировали Ат разной специфичности к Аг сальмонелл и не применялись в этой работе.

Полученные нами МКА к общеродовой детерминанте по данным конкуренции с Е6 за связывание с K-антигенами имеют практически одинаковый низкий индекс аддитивности - от 24 до 37%, т.е. связываются с чрезвычайно близко расположенными друг от друга детерминантами или с одной и той же детерминантой и не являются дополнительными.

Ат 1Е4 являются аддитивными по отношению к Е6 (87%), данная пара может использоваться вместе в диагностической тест-системе.

2С6, 1С4 , тестированные на K-Ar S.typhi, имеют почти равные индексы аддитивности к Е6 (81%. 83%. соответственно). 4С6 имеет наибольший индекс аддитивности, выявляемый в наших опытах - 92%.

Проведенный анализ общеродовой детерминанты с помощью МКА Е6 (Таблица 2) показал, что данная детерминанта по своей природе является углеводной, а не белковой (трипсиновая и термическая обработка не снижают связывания с МКА). причем в ее состав входят моносахариды, не содержащие альфа-гликолевой группировки (перйодат-ная обработка не влияет на связывание, в отличие от аналогичного исследования 0-Аг S.typhimurium серогруппы В, Раевская М.В. и со-авт, 1994). В активном эпитопе малопредставлены сахара нейрамино-вой группы, т.к. обработка нейраминидазой не вносит существенных

Таблица 2. Эпитопный анализ общей детерминанты K-Ar S.typhimuriura и S.typhi, (модификация K-антигенов с последующим выявлением МКА Е6 в непрямом твердофазном ИФА).

мета пер- йодат трипси- новый гидролиз термо обработка NaOH нейрами-нидаза гиалу- рони- даза галакто- зидаза

К-Аг S.t. muriu 97,5% 96.7% 85,4% 97,4% 56, г% 84,8% 19,5%

K-Ar S. typhi - 124.0% 86,4% 99,2% 92,0%- 89,1% 31,3%

- не проводилось;

данные приведены в процентах от исходного уровня ответа (без обработки)

изменений в детерминанту. Отсутствуют уроновые кислоты, характерные для кислых полисахаридов (Taylor D.H., 1983) - обработка гиа-луронидазой практически не снижает связывания. Галактозида вызывает резкое снижение связывания в обоих случаях, но, так как этот фермент отличается достаточно широкой специфичностью, мы не может сказать точно, какие связи и моносахариды затрагиваются ее воздействием. Модификация липидной части К-Аг сальмонелл с помощью щелочной обработки никоим образом не влияет на уровень связывания. Однако, по резкому возрастанию стандартной ошибки опыта в процессе обработки можно предположить важную роль липидов в неко-валентной сорбции К-Аг на полистироловую поверхность.

Изучение трипсинового гидролиза показало 2 стадии распада. На 1-й стадии мягкого разрушения (до 30 мин обработки) происходило дополнительное выявление Аг детерминант. Эффект наблюдался только в отношении фракций препаратов, содержащих белок. Мы считаем. что это связано с особенностями строения и распадом белковой части. Вероятней всего, белок в К-Аг является структурной основой. об этом говорит и тот факт, что содержание белка резко не

совпадает с содержанием .свободных аминогрупп, возможно, они участвуют в связывании с сахаридными остатками. При повременной термической обработке получены аналогичные результаты. Необходимо отметить и тот факт, что в случае с K-Ar S.typhi (содержащем большее количество белка) эффект выражен сильнее. По литературным данным, сходные явления часто наблюдаются у антигенов различной природы, например, при мягком трипсиновом гидролизе Н-антигена S.paratyphi В возрастает его серологическая активность (Сазонец Г.И.. 1970).

Таким образом, по данным перекрестной активности и изучению природы общей K-детерминанты можно сделать вывод, что она отличается от основных антигенов сальмонелл.

Данные по перекрестной активности и эпитопному анализу других K-детерминант (1Е4, 2С6, 1С4. 4С6) говорят о том, что это минорные компоненты, не вносящие большого вклада в иммунологическую карту,К-антигенов.

При исследовании распределения K-детерминант на целых клетках сальмонелл и других энтеробактерий было показано, что общеродовая детерминанта Е6 выявляется на всех использованных в работе 13 штаммах сальмонелл с различным уровнем ответа и практически не присутствует на других использованных в работе видах энтеробактерий (Рис 1) (р<0,05). В высокой концентрации общеродовая К-детер-минанта выявляется на S.typhimurium 415 (В), S.choleraesuis (С1), S.london 1343 (Е). Менее выражен ответ у представителей серогруп-пы Д. Не достигнуто полной достоверности отличий по выявлению K-детерминант в отношении Sh.sonnei и Y. pseudotuberculosis 59 (р>0,05) в связи с высокой стандартной ошибкой - следствием использования фиксированных формалином бактериальных взвесей.

МКА 1Е4 более узкоспецифичны и реагируют без серогрупповой специфичности с S.stanley (В), S.typhimuirum (В), S.choleraesuis

А

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 192021 2223

Рис 1 Исследование распределения общеродовых детерминант.

выявляемых на штаммах энтеробактерий с помощью MRA Е6.

- S.abortus bovi. 2 - S.stanley, 3 - S.typhimurium 415,

- S.choleraesuis 26, 5 - S.mission 1326, 6 - S. newport 2361

- S.Cottbus, 8 - S.infantis. 9 - S.dublin 373, 0- S.gallinarum-pullorum 229, 11 - S.moscow 3743,

2 - S.london 1343, 13 - S. anatum 707,

4 - Proteus vulgaris. 15 - Citrobacter frandines 39/57

6 - Enterobacter cloacae, 17 - Hafnia alvei,

8 - Shigella sonnei, 19 - Escherichia coli,

0 - Morganella morganii, 21 - Y. pseudotuberculosis 59,

2 - Y. pseudotuberculosis 20. 23 - Y. pseudotuberculosis 188,

А

0.4

0.3

0.2

IIBL-silLL-

В"

0 j I I I I I I I I I

-j—I_I—i—i—i_

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111213141516171819 20 2122 23

Л

0.8

0.6

0.4

0.2

hQ_

0м_0п_1по_1

-0.2 Lj-1-1-1-1-L_j-1-1-L_J-1-1-I-1_1—l_l__I_I_1__1__1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1/15 19 20 212221

0.1

Рис 2 Исследование распределения детерминант, выявляемых на штаммах энтеробактерий

МКА 1Е4 Ы и 4.С6 (б).

1 - S. abortus bovi, 2 - S.stanley, 3 - S. typhimurium 415, 4 - S. choleraesuis 26, 5 - S.mission 1326, 6 - S. newport 2361, 7 - S.Cottbus, 8 - S. infantis,

9 - S.dublin 373, 10- S. gal 1inarum-puHorum 229, 11 - S.moscow 3743, 12 - S.london 1343, 13 - S. anatum 707, 14 - Proteus vulgaris, 15 - Citrobacter frandines 39/57 16 - Enterobacter cloacae, 17 - Hafnia alvei, 18 - Shigella sonnei, 19 - Escherichia coli, 20 - Morganella morganii, 21 - Y. pseudotuberculosis 59, 22 - Y. pseudotuberculosis 20, 23 - Y. pseudotuberculosis 188,

(С1). (Рис 2a)

MKA 4C6 реагируют с представителя>.ш серогруппы Д S.dublin, S. gallinarum-pullorum и S.moscow, а также в меньшей степени с S. typhimurium.(Рис 26).

Разработка тест-системы для выявления сальмонелл.

По литературным данным, массовые отравления вызываются высоковирулентными штаммами сальмонелл (Станвел-Смит P.E., 1986; Кар-perud G., 1990). в том числе и вспышка сальмонеллеза Д в МГУ в октябре 1989 г, когда было госпитализировано 258 человек. Вследствие этого с 1990 по 1995 г в МГУ действовал централизованный контроль качества пищевых продуктов. Исследования проб проводились в коммерческой тест-системе на основе стафилокковой коагглю-тинации (РКА). Метод выгодно отличается от бактериологического зкспрессностью и чувствительностью. РКА использовалась как метод сравнения в нашей работе при исследовании проб в системе иммуно-ферментного анализа.

В.,качестве вторичного меченого реагента мы иЬпользовали смесь 3-х полученных нами MKA 1Е4, 4С6, 1С4 и МКА ранее полученного клона Е6, исходя из того, что данные МКА всесторонне охарактеризованы и являются дополнительными по отношению друг к другу по индексам аддитивности, исследованию на панели очищенных антигенов и целых клетках бактерий.

В качестве первых антител использовалась кроличья коммерческая сыворотка к серогруппе В. сыворотки к КПА и Аг Грассе S. urbana (редкая серогруппа с высоким содержанием К-Аг) и S.typhimurium (серогруппа В) (Рис 3). Наиболее оптимальные результаты показала сьворотка 1032 к КПА S.urbana, которая в дальнейшем применялась в системе.

В качестве точки отсчета использовали K-Ar S. typhimurium, так как он применялся в качестве иммуногена и основного положи-

\ —1032 1; 107 7-79', 3 К1/2; Ч-3- anti В

Рис 3 . Отработка оптимальных схем выявления К-Аг методом двойного ИФА.

1 - Ат к КЛА S.urbana; 2 - Ат к Ar Грассе, S.urbana; 3 - Ат к КПА S. typhimurium; 4 - коммерческая антисыворотка к серогруппе В сальмонелл. 2-е Ат - смесь МКА с меткой.

тельного контроля при скрининге гибридных линий. Разведения К-Аг и бактериальные взвеси готовили на селенитовой среде, применяющейся для подращивания проб пищевых продуктов. Калибровочную прямую строили по 9 точкам в логарифмическом масштабе.

Система достоверно выявляет K-антиген в концентрации 10-15 мкг/мл, прямая зависимость наблюдается от 10 нг до 500 мкг на плато насыщения система выходит при достижении концентрации около 1 мг/мл. Тест достаточно специфичен, достоверно не обладает перекрестной специфичностью к другим видами энтеробактерий и термически инактивированному (30 мин при 100 С) стафилококку, который часто присутствует в молочных продуктах.

Предварительная стандартизация коммерческой тест-системы на основе коагглютинации в отношении пищевых продуктов показала, что при постановке реакции на стеклах достоверная чувствительность составляет 100 нг/мл. Насыщение системы наступает при концентрации более 500 мкг/мл.

В таблице 3 представлены данные по параллельному 4 тестированию двумя методами пятнадцати проб пищевых продуктов из столовой N 10, Главного склада и мясного цеха МГУ. В РКА выявлялись как положительные по Аг сальмонелл 3 пробы - 3, 4, 10, одна проба (13) давала в РКА слабо положительный ответ. В ИФА та же проба была достоверно положительной, что может объясняться как большей чувствительностью, так и направленностью МКА к K-антигенам. Среди видов сальмонелл, циркулирующих во внешней среде, часто встречаются штаммы с нарушенным синтезом О-Аг, но у таких штаммов на клеточной стенке часто сохраняется К-Аг (Прозоровский С.В.и со-авт.. 1985). что дает более широкие возможности по выявлению данных бактерий.

Таким образом, в процессе апробации метода ИФА при тестировании пищевых продуктов и сравнении с методом РКА мы можем еде-

Таблица .3 . Сравнительное исследование пищевых проб с помощью коммерческого диагностикума на основе коагглютинации и двойного ИФА.

пищевые коагглютинация ИФА

продукты сальмонеллы шигеллы абсолютн. знач-я

1 сосиски _ _ 0.081+0.005

2 сметана - - 0.105+0.017

3 творог + В. д - 0.321+0.010

4 фарш индейки +/- + Зонне 0.223+0.009

5 мясо отварное - - 0.061+0.007

6 фрикадельки - - 0.068+0.009

7 рыба отварная - - 0.075+0.025

8 фарш сырой - — 0.093+0.005

9 сметана - - 0.098+0.006

10 сметана + Д - 0.424+0.029

11 сосиски баварские - 0.085+0. 007

12 ветчина - - 0.079+0.005

13 мясо говяжье -/+ — 0.260+0.014

14 сосиски - - 0.082+0. 006

15 шейка _ 1 — 0.078+0.009

А 0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

1 2 3 4 5

7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Рис 4. Исследование пищевых продуктов с помощью двойного ИФА.

Гл склад. 26.09.95 1 - сосиски. 2 - сметана. 3 - творог.

4 - фарш индейки: 10 столовая, 21.09.95 5 - мясо отварное. 6 - фрикадельки отвар-^ ные. 7 - рыба отварная, 8 - фарш мясной,

9 - сметана;

10 - сметана;

11 - сосиски баварские. 12 - ветчина, 13 - мясо говядина сырое, 14 - сосиски,

15 - шейка.

16 - термически обработанная взвесь Staphylococcus aureus Cowan

Гл склад, 21.09.95 06.10.95

лать следующие выводы:

1. Двойной ИФА на основе МКА и поликлональной сыворотки к К-Аг сальмонелл может применяться для тестирования пищевых продуктов.

2.Данные ИФА хорошо коррелируют с РКА - отрицательные данные полностью совпадают. Совпадают данные достоверно положительных проб.

3. ИФА на порядок чувствительней, чем коагглютинация.

4. Каждый метод имеет как свои достоинства, так и недостатки: РКА - проводится быстрее, чем ИФА:

- не требует специального оборудования и реактивов, кроме готовых растворов диагностикума;

- выявляет сальмонеллы с серогрупповой специфичностью.

ИФА - может применяться как для малого так и для большого количества проб, возможна полная автоматизация с помощью ELI-SA-процессора;

- выявляет сальмонеллы по общеродовому, достаточно специфичному маркеру вирулентности - К-Аг. менее подверженному изменениям в процессе генетических трансформаций, чем О-Аг;

- результаты могут быть выявлены как визуально, так и с помощью ELISA-ридера. т.е. быть задокументированы объективно в цифровых значениях, в отличие от РКА.

В целом, предложенный метод может быть представлен как диагностическая система для исследования контаминированных пищевых тродуктов с учетом вирулентности сальмонелл. Необходимо отметить. *то тестирование болезнетворных бактерий по факторам патогенности геляется перспективным направлением исследований и уже применяет-:я в отношении а-гемолизина клинически выделенных штаммов Staphylococcus (Семина Н.Н. и соавтр, 1995). Шига-токсина энтеробакте-)ий (Downes F.P. et а!.. 1989), Vi-Ar брюшнотифозных бактерий

(Taylor D.N., 1983). Разработанная нами система впервые использует в своей основе смесь МКА и может применяться в отношении пищевых продуктов.

Исходя их того, что K-антигены присутствуют на клеточной поверхности сальмонелл в разной степени, требуются дополнительные исследования на большем количестве штаммов энтеробактерий

Выводы:

1. Получена панель мышиных моноклональных антител к К-анти-генам сальмонелл - 11 клонов. МКА относятся к иммуноглобулинам классов G 1. 2а. 26. 3 и имеют хорошую кинетику связывания, проявляют активность в методе иммуноферментного анализа. .

2. С помощью полученных МКА на основании эпитопного анализа выявлена активная общеродовая детерминанта К-Аг. представленная в разной степени на 13 штаммах бактерий рода сальмонелл и несвойственная 10 другим видам семейства энтеробактерий. Выявлены малоактивные детерминанты использованных в работе K-антигенов, характерные для отдельных видов сальмонелл.

3. В биохимическом исследовании показано, что K-антигены являются высоколабильными родственными соединениями, но имеются и различия по общему содержанию белка и аминокислотному составу.

4. Общеродовая К- детерминанта по данным эпитопного анализа с использованием модифицированных препаратов отличается от других основных антигенов сальмонелл.

5. Полученные МКА могут применяться в тест-системе для профилактического анализа пищевых продуктов. Достоверная чувствительность предложенной системы на основе иммуноферментного анализа 10 нг/мл. Система специфична и поливалентна по отношению к исследованным штаммам сальмонелл, не дает достоверного перекреста с другими энтеробактериями, основана на выявлении общеродового маркера вирулентности сальмонелл К-антигена.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Раевская М.В., Белая Ю.А., Ковальчук Н.В. Получение монокло-нальных антител к О-антигену Salmonella typhimurium серогруппа В (0-4;5)//Бюлл.эксп.биол.и мед.- 1994. - н 6. - с 630-632.

2.Раевская М.В., Белая Ю.А., Ковальчук Н.В., Петрухин В.Г., Черноусова Л.Н. Получение и характеристика мышиных моноклональных антител к K-антигену Salmonella typhimurium//Etojm. эксп.биол.и мед.- 1994. - н 6. - с 633-635.

3. Ковальчук Н.В.. Раевская Н.В. Оптимизация методов получения моноклональных антител к антигенам сальмонелл//Клиническая диагностика. ,1995.(в печати)

4. Ковальчук Н.В., Павлов П.Ф., Раевская М.В., Петрухин В.Г., Белая Ю.А. Сравнительное биохимическое исследование К-антигенов S.typhimuirum и S.typhi // Бюлл. эксп.биол. и мед., 1995 (в печати) .