Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение моноклональных антител к патогенным псевдомонадам P. mallei и Р. pseudomallei и конструирование на их основе диагностических препаратов

Р Г 5 ОД

* Ч* и)

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВА Ирина Владимировна

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ПАТОГЕННЫМ ПСЕВДОМОНАДАМ Р.та11е1 И Р. р$еи<1ота11е1 И КОНСТРУИРОВАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Научные руководители: - кандидат медицинских наук

В.В.Свиридов

- доктор медицинских наук

Н.П.Храпова

Официальные оппоненты: - доктор медицинских наук,

профессор Н.Б.Егорова

- доктор биологических наук,

профессор В.С.Хлебников

Ведущая организация - Московская медицинская

академия им. И.М.Сеченова

Защита состоится 21 марта 1996 г. в 14^ часов на заседании диссертационного совета Д 001. 38.01 при НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Российской Академии медицинских наук по адресу: 103064, г.Москва, Малый Казенный пер., 5а.

Автореферат разослан 21 февраля 1996 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Н.Г.Кудрявцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Pseudomonas ;.iallei и Pseudomonas pcou(io:.iallei являются возбудителями особо опасных для человека и животных гнойно-септических заболеваний - сапа и мелиои-доза, заканчивающихся в 85-100% случаев острого течения летальным ИСХОДОМ (Alexander A.D. et al., 1970; Dorff G.L. c-t al., 1971; Flick !.'-.;<., Glui'i L.i., 1976; Howe C. et al., 1;71; Kanii K., I33ii; jjoelarassnee A., 1936). Заболевания носят очаговый характер и наиболее часто регистрируются в сранах Юго-Восточной Азии, Африки, Центральной Америки, Северной Австралии, однако интенсивно развивающиеся торговые связи, возросшая миграция лиц из эндемичных по этим заболеваниям районов не исключает возможности завоза данных инфекций в другие регионы (коропеп 1.1.А. et ai.,1991). Необходимость раннего выявления P.pseudo:.iaiioi диктуется также подтверждением факта переноса мелиоидоза от человека к человеку ( KcCormid: J.:.. et ai, 1975 ).

i-c mallei и P.pseudomaliei занимают уникальное положение в группе i'seuüomonades вследствие их чрезвычайно высокой гомологии в строении ДНК и антигенном составе (Alexander A.B. et ali, 1970: Ashdown x,.:*., 1979, 1938, 1939; Cravitz h., iiiier ^ .:(., 1950; Handel L., 1966; Hedfearn U.S. et al., 1966; Ro-ui et al., 1970), поэтому применяемые обычно методы серологической диагностики, основанные, в частности, на использовании поликлональных антисывороток (иммунофлюоресцентный анализ, РИГА, латекс-агглютинация) практически не позволяют дифференцировать эти близкородственные виды возбудителей. Куль-туральные и биохимические тесты, включающие выделение культуры и дальнейшую ее идентификацию стандартными методами, поз-

ВОЛЯЮТ надежно дифференцировать P. mallei И P.pseudomalj.ei I однако в сроки, значительно превышающие допустимые, особенно в случае молниеносных форм заболеваний.

Поскольку имчунохимические методы, основанные на использовании моноклональных антител (МкАт), обладают исключительно высокой разрешающей способностью, представлялось перспективным получить МкАт, позволяющие с высокой степенью надежности идентифицировать и дифференцировать возбудителей сапа и мели-оидоза. Несмотря на то, что за последние годы во многих лабораториях мира получены моноклональные антитела ко многим антигенам, в том числе и бактериальным ( Yon^- L.s.,1935 ), в доступной литературе к началу проведения наших экспериментов обнаружить каких-либо данных о получении МкАт к р. mallei и P.pseudomaliei не удалось. Решению птой проблемы и посвящена наша работа.

Цель исследования. Получение МкАт к патогенным для человека и животных псевдомонадам ?.:aaiiei и P.pseudo:.ialLei и разработка методов использования препаратов на их основе в качестве диагностических реагентов для выявления и дифференциа-" ции возбудителей данных видов.

Задачи исследования:

1. Разработать эффективную схему иммунизации мышей сапным и мелиоидозным антигенами для получения спленоцитов пригодных для создания гибридом, продуцирующих специфические МкАт.

2. Разработать систему иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления МкАт к антигенам сапа и мелиоидоза.

3. Получить гибридные клоны-продуценты антител к антигенам сапа и мелиоидоза.

4. Изучить специфичность полученных МкАт, их основные

свойства.

5. Отобрать технологичные клоны гибридом для массового культивирования их в организме животных и получить МкАт в препаративных количествах.

6. Оценить возможность приготовления диагностических препаратов для выявления патогенных псевдомонад и их антигенов .

Научная новизна.

Впервые получены клоны гибридом и продуцируемые ими МкАт специфичные к видовым антигенам возбудителей сапа и мелиоидо-за; разработаны методы получения диагностических реагентов для выявления данных видов микроорганизмов и их антигенов в различных иммунохимических реакциях ("сэндвич"-вариант ИФА с использованием одного типа МкАт, прямой и непрямой варианты иммунофлюоресцентного анализа, РИГА, двойная иммунодиффузия в геле).

Практическая значимость.

Штаммы гибридных культивируемых клеток Mus muscuius ъ. -продуценты МкАт к г.mallei и P.pceudomallei - депонированы В "Банке клеточных культур" института цитологии РАН (ВСКК) с присвоением авторских наименований соответственно ММ-Р.м.1 , ММ-Р.рм.1 и ММ-Р.рм.2 под номерами ВСКК II 275 Д.ВСКК II 276Д и ВСКК II 388 Д. По заявкам на изобретение получены авторские свидетельства ( № I79I45I и № I79I450 ).

Разработаны инструкции по изготовлению, контролю и применению препаратов МкАт для выявления и дифференциации P.mallei и P.pseudomaiiei , утвержденные директором НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова Семеновым Б.Ф.

Штаммы переданы в Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт, ведущий институт по исследованию па-

тогенных псевдомонад, для наработки антител и приготовления на их основе серийных диагностических препаратов для идентификации возбудителей сала и мелиоидоза и их антигенов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полученные МкАт ММ-Р.м.1, ММ-Р.рм.1, ММ-Р.рм.2 и ММ-Р.рм.З обладают выраженной видовой специфичностью в отношении типичных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, а также атипичного пуринзависимого штамма Р.раеийотаа1е1 УРА.

2. Диагностические реагенты, приготовленные на основе полученных МкАт, позволяют с высокой специфичностью идентифицировать и дифференцировать возбудителей сапа и мелиоидоза и их антигены в иммунофлюоресцентном анализе, "сэндвич"-вари-анте ИФА с использованием одного типа МкАт, агглютинационном и иммунопреципитационном тестах.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на ИЗ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 97 источников. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 16 рисунками.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на конференции молодух ученых НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова ( Москва , 1990 ); конференции молодых ученых Пермского НИИ вакцин и сывороток ( 1990 ); II Всесоюзной конференции " Современные направления создания медицинских диагностикумов" ( Москва , 1990 ).

Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ Работа по получению МкАт к типичным штаммам возбудителей сапа и мелиоидоза и атипичному пуринзависимому штамму P.pseudo-multaiVPA выполнена на базе лаборатории клеточных гибридов НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова совместно с Волгоградским НИПЧИ и Любучанским институтом иммунологии, располагающими коллекцией музейных штаммов возбудителей и препаратами антигенов.

В работе использовали традиционные метода гибридомной технологии, иммунохимические и хроматографические методы.

Эксперименты проводили на мышах линии ваъз/с и гибридах PI CbalB/cx A/Sn ) массой 14-20 г.

В качестве антигенов использовали убитые 0,5% раствором формалина микробные клетки типичных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза и их ВСЭ, а также ВСЭ атипичного пуринзависи-мого штамма p.pseudonaiiei vpa . .Для определения изотипа МкАт использовали кроличьи антисыворотки против мышиных иммуноглобулинов А, И, G, G1, G2a, G2b, G3-

Схему иммунизации мышей пригодную для получения сплено-цитов способных при слиянии с миеломными клетками образовывать гибридные клетки, продуцирующие специфические МкАт, разрабатывали с учетом проведенных ранее экспериментов по получению МкАт к бактериальным антигенам (Кожевникова Е.В., 1989; КотоваЛ.Ю., 1991; Bach :.;.-А. and Hoffenbach А.А., 1983; De Boer 5.H. and Vieczorek A., 1934; Bundesen P.G. et al., 1985; Lan J.3. et al., 1937; ink J.I.I.c. et al., 1990).

-В качестве злокачественного партнера для гибридизации использовали миеломную клеточную линию РЗ Х63 Ag8.653 (np), дефектную по активности фермента ГГФРТ" и, вследствие этого,

не растущую на среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин, ти-мидин (ГАТ). Для культивирования миелошшх и гибридных клеток использовали среды НйЛ-1640 ("Serva", ФРГ) и Искова и Хэма с 10% СПК и другими ингредиентами; селективную среду ГАТ и переходную к обычной среду ГГ. Для отмывания клеток использовали бессывороточные среда RPHl -1640, Игла, раствор Хэнкса.

Для удаления возможных ГГФРГ+ ревертантов миеломных клеток в культуры добавляли 8 азагуанин до концентрации 20мкг/мл и культивировали в такой среде 10-14 дней.

Жизнеспособность миеломных и гибридных клеток оценивали с помощью суправитального окрашивания 0,2%-ным трипановым синим. Подсчет клеток прйводили в камере Горяева.

В качестве фидерных клеток использовали спленоциты в концентрации 5*10® клеток на планшет или клетки перитонеального смыва той же концентрации.

В качестве сливающего агента использовали стерильный раствор 50% (вес/объем) полиэтиленгликоля ("Serva", ФРГ) молекулярной массой 1550.

Гибридизацию клеток, последующее культивирование, первичный скрининг, клонирование, массовое культивирование гиб-ридом-продуцентов "ин витро" и "ин виво", замораживание и размораживание миеломных и гибридных клеток, а также очисткуМкАт с помощью насыщенного раствора сульфата аммония проводили принятыми в лаборатории методами, описанными в "Методических рекомендациях по получению гибридом-продуцентов моноклональных антител к бактериальным антигенам" (Москва, 1986).

Изотип МкАт определяли методом встречной радиальной им-мунодиффузии в геле по Ухтерлони (1948).

Препараты биотинилированных МкАт готовили на основе гамма глобулиновых фракций асцитных жидкостей, содержащих МкАт в

концентрации 10-12 мг/мл и диализо ванных против 0,1 М'КББ рН 8,0 - 8,5. Для этого 10 мг биотин-N -гидроксисукцинимидного эфира ("fierce", США) растворяли в 250 мкл диметилформамида ("Serva", ФРГ) и 50 мял полученного реагента при перемешивании добавляли к I мл препарата МкАт. Смесь инкубировали в. течение 2 часов при 20°С и диализовали против ФСБ. Диализованные препараты биотинилированных МкАт стабилизировали глицерином с добавлением 0,155 азида натрия.

Препараты моноклональных ФИТЦ-коныогатов готовили, смешивая 0,7 ríí белка препарата очищенных МкАт с 3 частями флгаорох-рома. От несвязавшегося с белком ФИТЦ избавлялись хроматогра-фированием реагента на колонке с сефарозой Q 50. Меченые антитела концентрировали при помощи ПЭГ 20 ООО ("Serva", ФРГ).

Эритроцитарные МкАт-диагностикумы готовили по методу Ка-ральника Б.В. (1976).

Для приготовления ультразвуковых дезинтегратов (УЗД) использовали типичные штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза, а также штаммы синегнойной палочки FI, F6, 868 и 1700/5, разведенные физиологическим раствором до концентрации 10^ м.к./мл. Суспензии подвергали действию ультразвука трижды по 3 минуты на дезинтеграторе " Virsonic" модель 16-850. Полученные УЗД центрифугировали при 8000 об./мин в течение часа, надосадки отбирали и использовали в качестве антигенов при постановке ИФА.

ИФА проводили в соответствии с общепринятыми принципами. При постановке "сэндвич"-варианта использовали один тип МкАт как в качестве подложки при сенсибилизации планшета, так в качестве маркера в виде биотинилированных антител с последующим использованием конъюгата авидин-пероксидаза в рабочих разведениях, выявляемыми субстанциями при этом являлись как микробные

клетки возбудителей, так и их растворимые антигены.

Иммунофлюоресцентный анализ (непрямой и прямой варианты) проводили на стеклах с предварительно фиксированными микробными клетками возбудителей с использованием либо препарахв гамма- глобулиновых фракций асцитных жидкостей, содержащих МкАт, с последующим проявлением реакции кроличьим антимыпшным глобулином меченым ФИТЦ (непрямой вариант), либо моноклональных ФИТЦ-ко нъга гатов (прямой ИФлА). Учет реакции проводили под масляной иммерсией в люминесцентном микроскопе.

Реакцию непрямой гемагглютинации проводили общепринятым способом.

При постановке имцуноэлектрофореза(ИЭФ) использовали 1,2% агарозу ("Bio Had"), приготовленную на барбиталовом буфере. Электрофорез проводили в течение 1,5 часов при 260 в.

Электрофоретическое разделение препаратов ВСЭ возбудителей сапа и мелиоидоза в тонком слое 10% полиакриламидного геля (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) в буферной системе Лэммли (1970) проводили при 200 В при прохождении, проб в концентрирующем геле и 250 В - в разделяющем. После электропереноса препаратов на нитроцеллюлознуго мембрану прово- ' дили иммуноблоттинг с МкАт ММ-Р.м.1.

Очистку igG проводили на колонке с сорбентом DEAE-Affi-sel blue IgG purification gel фирмы "Bio-Üad." (США) по методу Згиск с. et ai. (1979) в модификации; очистку I^ü проводили на колонках с конканавалин -А сефарозой (" Pharmacia' .Швеция).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа по получению моноклональных антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза и разработке методов использования препаратов на их основе в качестве диагностических реагентов для выявления и дифференциации возбудителей данных видов состояла из ряда этапов: выбора схемы иммунизации мышей наиболее пригодной для создания гибридом-продуцентов специфичных МкАт; разработки системы ИФА для выявления МкАт к антигенам P.mallei и P.pseudomallei ; получения и селекции клонов-продуцентов МкАт, исследования их специфичности и основных свойств; отбора наиболее технологичных клонов гибридом для получения МкАт в препаративных количествах и изучения возможности использования полученных МкАт в качестве диагностических реагентов для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза.

Разработку схемы иммунизации проводили с использованием в качестве модельного иммуногена микробных клеток P.pseudomallei шт. 56830 из коллекции Волгоградского НИПЧИ. При этом были использованы два подхода: в первом случае вторичную стимуляцию спленоцитов осуществляли путем иммунизации "ин виво", во втором - "ин витро". Основным критерием оценки иммунного ответа считали нарастание титра антител в сыворотке крови мышей или культуральной среде при индукции вторичного ответа "ин витро", определяемое с помощью ИФА.

Исследования по индукции вторичного ответа "ин виво" показали, что по титру антител в ИФА оптимальными для иммуниза-

9 Р

ции животных такого рода антигеном являются дозы 10 - 10 м.к. на мышь, что согласуется с литературными данными и данными, полученными в нашей лаборатории в ходе экспериментов. Увели-

чение или уменьшение дозы антигена приводило к ослаблению им-цунного ответа: меньшие дозы являлись недостаточными для индукции полного иммунного ответа, большие, напротив, угнетали иммуногенез. Анализ схем иммунизации показал, что для получения гибридом-продуцентов МкАт при вторичной стимуляции "ин виво" достаточным является двукратное введение антигена с интервалом 14 дней. Данный подход был использован нами в опытах по получению гибридом-продуцентов МкАт к возбудителю сапа.

Исследования по индукции вторичного иммунного ответа "ин витро" показали, что по титру антител оптимальными для иммунизации животных и последующей стимуляции спленоцитов антигеном

7 8

в системе "ин витро" также являются дозы 10 - 10 м.к. на мышь и мл среды культивирования. При этом максимальный иммунный ответ наблюдался при стимуляции спленоцитов на 31 день после первичной иммунизации "ин виво". Такая схема иммунизации позволила получить 100% выход антителопродуцирующих гибридных клонов.

В результате слияния предварительно подготовленных селезеночных и миеломных клеток в опытах по индукции вторичного ' ответа "ин виво" и "ин витро" были получены 863 гибридные культуры, из которых 55 секретировали антитела к антигенам сапного микроба, 316 - к антигенам возбудителя мелиоидоза и 27 - к антигенам атипичного пуринзависимого штамма P.pseudomallei VPA. Для скрининга первичных культур и дальнейшей оценки клонов на способность к антителопродукции применяли ИФА как один из наиболее чувствительных, быстрых и производительных способов детекции антител. В качестве антигенов для ИФА использовали сорбированные на твердой фазе ВСЭ типичных штаммов P.mallei и P.pseudomallei , а также атипичного штамма P.pseudomallei VPA.

Из полученных гибридных культур для наработки препаратов

МкАт различной специфичности, дальнейшего исследования иммуно-химических свойств и диагностических возможностей (для гибридом, секретирующих антитела к антигенам типичных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза) были отобраны 4, из которых 3 культуры (ММ-Р.мЛ, ММ-Р.рм.1, ММ-Р.рм.З) получены в опытах с использованием спленоцитов мышей, стимулированных "ин виво", и одна - ММ-Р.рм.2 - в опытах с использованием спленоцитов, стимулированных в системе "ин витро". Гибридомы отличались высоким уровнем антителопродукции, сохраняя его на протяжении 25 и более пассажей при культивировании "ин витро" и 5 и более пассажей при культивировании "ин виво" без дополнительного рекло-нирования. Исследование класса продуцируемых гибридомами МкАт показало, что МкАт ММ-Р.мЛ имеют изотип IgG2b , МкАт ММ-Р.рм! и ММ-Р.рм.2 - igM изотип, МкАт ММ-Р.рм.З - igG изотип. Специфичность антител изучали в реакциях ИФА, РИГА и НИФлА с использованием препаратов асцитных жидкостей мышей, содержащих МкАт.

Исследование взаимодействия МкАт ММ-Р.мЛ с препаратами

антигенов возбудителей сапа и мелиоидоза в ИФА показало, что

5 7

данный тип антител в разведениях 10 - 10" взаимодействует только с ВСЭ типичных штаммов возбудителя сапа. Изучение агглютинирующей активности МкАт ММ-Р.мЛ показало высокую активность антител (2,5-Ю"5) при взаимодействии с сапным эритроци-тарным диагностикумом и отсутствие таковой при взаимодействии с мелиоидозным эритроцитарным диагностикумом. Результаты исследования позволили сделать вывод о направленности МкАт ММ-Р.мЛ к поверхностной детерминанте возбудителя сапа и их видо-специфичности, что нашло подтверждение в дальнейшей работе по исследованию специфичности МкАт в реакции непрямого ИФлА с различными штаммами микроорганизмов: антитела давали выраженную положительную реакцию с 13 типичными штаммами P.mallei; 3 ати-

пичных штамма возбудителя сапа в этом тесте МкАт ММ-Р.м.1 не выявлялись. Единичные светящиеся клетки отмечались в мазках лишь 3 из 46 штаммов возбудителя мелиоидоза. Гетерологичные микроорганизмы данным препаратом МкАт не окрашивались.

Исследование природы антигена, выявляемого МкАт ММ-Р.м.1 в иммуноблоттинге, показало, что данный тип антител с абсолют-, ной специфичностью взаимодействует с поверхностным антигеном P.mallei , имеющим полисахаридную структуру. Проведение более детального анализа не представлялось возможным вследствие недостаточной изученности сапных антигенов.

Исследование взаимодействия МкАт ММ-Р.рмЛ и ММ-Р.рм.2 с препаратами антигенов возбудителей сапа и мелиоидоза в ИФА показало, что данные антитела взаимодействуют как с ВСЭ P.pseudo-mallei , так и с препаратами ЛЛС и ВМФ P.pseudomailei шт.100 в разведениях 10"^ - Полученные результаты свидетельст-

вовали о направленности МкАт ММ-Р.рмЛ и ММ-Р.рм.2 преимущественно к ЛПС-компоненту возбудителя мелиоидоза. Кроме того, МкАт ММ-Р.рмЛ активно взаимодействовали и с ВСЭ P.mallei что указывало на наличие общей для возбудителей сапа и мелиоидоза антигенной детерминанты, выявляемой с помощью данного типа МкАт. МкАт ММ-Р.рм.2 в данной реакции взаимодействовали с антигенами P.pseudomailei и не взаимодействовали с ВСЗ возбудителя сапа, проявляя видоспецифичность.

С помощью конкурентного ИФА, примененного для установления специфичности МкАт ММ-Р.рмЛ и ММ-Р.рм.2 к одному или различным эпитопам молекулы антигена, показано, что антитела не конкурируют между собой за места связывания, более того, увеличение сигнала оптической плотности в лунках, где были представлены оба варианта антител по сравнению с пробами, представленными каким-либо одним антителом, свидетельствовало об

одновременном взаимодействии данных препаратов МкАт с различными антигенными детерминантами.

Изучение агглютинирующей активности МкАт ММ-Р.рм.1 и ММ-Р.рм.2 в РИГА показало, что данные МкАт в одинаковой степени агглютинируют как эритроциты, сенсибилизированные ВСЭ возбудителя мелиоидоза, так и эритроциты, несущие сапный' антиген. Для МкАт ММ-Р.рм.1, имеющих перекрестную активность, это взаимодействие являлось еще одним доказательством, свидетельствующим о направленности данных антител к общей для P.mallei и P.pseudomallei поверхностной детерминанте. Взаимодействие антител ММ-Р.рм.2 с сапным эритроцитарным диагностикумом в РИГА при выраженной видоспецифичности в ИФА остается непонятным. Агглютинирующая активность этих МкАт не связана с принадлежностью к IgM или какой-либо неспецификой: антитела не агглютинируют "чистые" эритроциты барана и не дают реакции с дифтерийным эритроцитарным диагностикумом. Мы предполагаем, что во время сенсибилизации полистирола и эритроцитов по-разному происходит пространственное ориентирование молекул антигенов, в результате чего те или иные эпитопы становятся доступными антителам, экранируются или конформационно меняются.

Исследование взаимодействия МкАт ММ-Р.рм.1 и ММ-Р.рм.2 с различными видами микроорганизмов в непрямом ИФлА показало, что МкАт ММ-Р.рм.1 дают выраженную положительную реакцию как с типичными штаммами p.pseudomallei , так и с типичными штаммами p.mallei . МкАт ММ-Р.рм.2 в данном тесте проявляют себя как видоспецифичные, взаимодействуя только с типичными штаммами возбудителя мелиоидоза; гетерологичные микроорганизмы препаратами данных типов МкАт не окрашиваются.

При установлении специфичности МкАт ММ-Р.рм.1 и ММ-Р.рм.2 к какому-ли(5о из известных антигенов P.pseudomallei методом им-

муноэлектрофореза выявлена направленность МкАт ММ-Р.рм.1 к антигену 8, а МкАт ММ-Р.рм.2 - к антигену 6 возбудителя ыелиои-доза. Ранее антиген 8 рассматривался как видоспецифичный для Р.pseudomaiiei . Высокая активность МкАт ММ-Р.рм.1 в отношении типичных штаммов возбудителя мелиоидоза и наиболее вирулентных штаммов возбудителя сапа в реакциях ИФА, РИГА и НИФлА указывает на наличие антигена 8 и у сапного микроба. Изучение химического состава и има^унобиологических свойств очищенных с помощью МкАт ММ-Р.рм.1 и ММ-Р.рм.2 антигенов 8 и б показало , что антиген 6 является видоспецифичным гликолипопротеином, а антиген 8 - гликопротеином с выраженным патогенным эффектом , обусловленным его антифагоцитарной активностью. В связи с этим антиген 8 теперь рассматривается как один из факторов патоген-ности этих двух видов псевдомонад.

Исследование в ИФА специфичности МкАт ММ-Р.рм.З с использованием различных антигенов, включая антигены типичных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, показало, что данный тип МкАт проявляет активность только в отношении атипичного пурин-зависимого штамма P.pseudomaiiei VPA и не взаимодействует ни с какими другими исследованными антигенами. После определения специфичности МкАт ММ-Р.рм.З были переданы для дальнейшего анализа в Любучанский институт иммунологии, клон криоконсервиро-ван.

Таким образом, изучение иммунохимических свойств 4 типов МкАт показало специфическую направленность антител к поверхностным антигенным детерминантам типичных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, при этом МкАт ММ-Р.м.1 проявляют выраженную специфичность по отношению к P.mallei и его полисахаридному антигену; МкАт ММ-Р.рм.2 являются видоспецифичными по отношению к P.pseudomaiieiи взаимодействуют с антигеном 6 возбудите-

ля; МкАт ММ-Р.рмЛ проявляют перекрестную активность, взаимодействуя с 8-м антигеном вирулентных штаммов псевдомонад. МкАт ММ-Р.рм.З проявляют специфичность в отношении атипичного пу-ринзависимого штамма Р.рзеи<1сш1а11е1 ура и не взаимодействуют ни с какими другими антигенами типичных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза.

Исследование возможности получения методом колоночной хроматографии чистых и1£М фракций МкАт с целью использования последних в качестве диагностических реагентов показало, что может быть получена фракция антисапных МкАт ММ-Р.м.1, однако стабильностью такой препарат не отличается: при хранении в жидком виде он теряет активность значительно быстрее, чем препарат глобулиновой фракции асцитной жидкости. При получении фракций МкАт ММ-Р.рмЛ и ММ-Р.рм.2 резкое снижение активности препаратов МкАт в 100 и более раз происходило уже на этапе элюции. Учитывая подученные данные, в дальнейшей работе по изучению возможности применения полученных МкАт в качестве иммунохимических реагентов для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза мы использовали препараты глобулиновых фракций асцитных жидкостей как наиболее стабильные, отличающиеся высокой удельной активностью (титр/мг белка) и специфичностью.

Возможность использования полученных МкАт в качестве диагностических реагентов была установлена на этапе определения их специфичности в реакции НИФлА на чистых культурах возбудителей и подтверждена при исследовании мазков-отпечатков органов зараженных экспериментальных животных. МкАт ММ-Р.м.1 и ММ-Р.рм.2 с высокой специфичностью выявляли типичные штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза соответственно; МкАт ММ-Р.рмЛ выявляли типичные штаммы обоих видов возбудителей. Свечения микробной .стенки гетерологичных по отношению к данным возбудите-

лям микроорганизмов не наблюдалось (таблица I).

Таблица I.

Специфичность МкАт в реакции НИФлА

Препарат МкАт 1 л.aailei 1 P.pseuaomallei ¡Гетероло-¡гичные шт ! м/о

¡типичные ! шт. !ятипичные!типичные ! шт. ! шт. ¡дтипичныи ! шт.

ММ-Р.м.1 13/13 0/3 3/46 0/1 0/19

ММ-Р.рм.1 13/13 0/3 46/46 0/1 0/19

ММ-Р.рм.2 I/I3 0/3 46/46 0/1 0/19

Примечания: В числителе дроби - число положительных проб, в знаменателе - общее число проб.

В качестве гетерологичных видов микроорганизмов использованы штаммы: Р.aeruginosa н-1, н-5, н-12; r.putida БК1.Ш-1301; P.stutzeri 4136; P.cepacia 3181, 8236, 8237; p.fluorescein C-2234, 4125; P. pseudoalcaligenes BKHB-1300; Aeromonas B-47.B-48; a.typhi 14600; S.paratyphi A-27, B-493; Sh.Sonne 20; ii.coli 0-2, 0-11.

Высокие титры МкАт ММ-Р.м.1 в среде культивирования гиб-ридомы в ИФА (640-1280) позволили использовать данный препарат в непрямом варианте ИФлА в "сыром" виде без дополнительной процедуры очистки. При этом микробные клетки возбудителя сапа показывали типичное свечение на 3+ - 4+ при разведении культура-льной среда 1:10 - 1:20, что делало использование этих МкАт весьма выгодным и экономически.

При приготовлении моноклональных ФИТЦ-конъюгатов для прямой иммунофлгаоресценции установлено, что конъюгация МкАт ММ-Р.м.1 с ФИТЦ приводит к снижению активности антител на 1-2 порядка; это не является серьезным препятствием для использования препарата в качестве высокоспецифичного реагента для выявления возбудителя сапа, так как и в таком виде рабочее разведение сохраняется Hai высоком уровне (1:512).

При метке МкАт ММ-Р.рм.2 ФИТЦ активность антител не уменьшается, видоспецифичность в отношении типичных штаммов возбудителя мелиоидоза также не изменяется. Использование препара-

тов МкАт в прямом и непрямом вариантах имцунофлюоресценции позволяет быстро и надежно идентифицировать возбудителей сапа и мелиоидоза, поскольку метод не требует выделения чистой культуры возбудителя.

Конструирование моноклональных диагностикумов, в частности, "спндвич"-вариантов ИФА, предназначенных для выявления антигена, основывается на использовании двух типов антител, специфичных к различным гэпитопам молекулы антигена: одного типа МкАт - для сенсибилизации твердой фазы, второго - для приготовления конъюгата.'Поскольку отобранные нами МкАт взаимодействуют с эпитопами антигенов, имеющих полис ах аридную природу, мы использовали один тип МкАт как в качестве подложки при сенсибилизации планшета, так и в качестве маркера в виде биотинили-рованных антител с последующим использованием конъюгата авидин-пероксидаза. Предварительное исследование полученных препарата биотинилированных МкАт показало повышение регистрируемой в ИФА активности меченых антител по сравнению с немечеными (рис.1,2). Дальнейшие исследования подтвердили возможность использования одного типа МкАт для выявления микробных клеток возбудителей

сапа и мелиоидоза и их растворимых антигенов (таблица 2).

Таблица 2.

Выявление микробных клеток и растворимых антигенов возбудителей сапа и мелиоидоза в ИФА с использованием одного

типа МкАт

Тип Т Се энсибили: з.! Рабочее ! Количество выявляемого АГ

МкАт ,!дс зза(мкг/» "{жтаи (м-к-/мл)!

ММ-Р.м.I 10 1:4000 Юб 1/600

ММ-Р.рм.1 10 1:2000 Юб 1/3200

х - в качестве растворимых антигенов использовали ВСЗ возбудителей; указаны максимальные разведения препаратов.

Выявление растворимых антигенов в таком варианте постановки ИФА свидетельствует о достаточной протяженности данных

on 450 нм ■ 0,6 г

0,5

I

0,4

0,3

0,2

0,1

3

О

0,018 0,05 0,16 0,5 1,5 4,4 13 40

Рис. I. Активность препаратов МкАт ММ-Р.м.1 в ИФА (на твердой фазе - ВСЭ P.mallei 10230 ).

По оси абсцисс - концентрация МкАт (мкг/мл).

1 - МкАт ММ-Р.м.1 до биотинилирования + конъгогат антивидовой;

2 - МкАт ММ-Р.м.1 после биотинилирования + конъюгат авидин-пероксидаза;

3 - МкАт ММ-Р.м.1 до биотинилирования + конъюгат ави-дин-пероксидаза (контроль).

ОП 450 нм 0,5 г

2 I

0,1

0,2

0,4

0,3

О

3

0,018 0,05 0,16 0,5 1,5 4,4 13 40

Рис. 2. Активность препаратов МкАт ММ-Р.рм.1 в ИФА (на твердой фазе - ВСЭ p.pseudomallei 56330).

По оси абсцисс - концентрация МкАт (мкг/мл).

1 - МкАт ММ-Р.рм.1 до биотинилирования + конъюгат антивидовой;

2 - МкАт ММ-Р.рм.1 после биотинилирования + конъюгат авидин-пероксидаза;

3 - МкАт ММ-Р.рм.1 до биотинилирования + конъюгат ави-дин-пероксидаза (контроль).

антигенов и наличии нескольких (по крайней мере двух) участков связывания с соответствующим типом МкАт.

Известно, что стандартные зритроцитарные диагностикумы, приготовленные на основе поликлональных антисывороток, являются малоспецифичными. С этих позиций мы подошли к решению вопроса о возможности использования высокоспецифичных антисапных МкАт ММ-Р.м.1, как имеющих изотип, в качестве реагента для приготовления эритроцитарного диагностикума и выявления на его основе возбудителя сапа в РНГА. В ходе сравнительного анализа эритроцитарных МкАт - и ПкАт-диагностику-мов показано, что стандартный поликлональный диагностикум агглютинирует микробные клетки как возбудителя сапа, так и возбудителя мелиоидоза; эритроцитарный диагностикум, приготовленный на основе МкАт ММ-Р.м.1, с абсолютной специфичностью агглютинирует микробные клетки типичных штаммов возбудителя сапа (таблица 3). Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования данного типа МкАт как высокоспецифичного реагента для выявления типичных штаммов ?.та!1е1в РНГА.

Таблица 3.

Чувствительность и специфичность эритроцитарного МкАт-диагностикума

Музейные штаммы I Концентрация выявляемых м/о (м.к./мл) _! I с.ут. культивир. ! 2 сут. к.ультивир.

Р. таПех (13 шт.) 2'10б - 1,5'Ю7 8-Ю6 - 6Ю7 Атип. шт. Р • таЮеЦ 2 шт.)

Г.рзеис1о;па11е1 (42 шт.) - -

Гетеролог. м/о (19 шт.)

Направленность МкАт ММ-Р.рм.1 к антигену 8 вирулентных штаммов псевдомонад определяет особую диагностическую значимость данного вида антител. Показано, что помимо способности выявлять антиген в реакциях ИФА и НИ5лА эти антитела, как от-

носящиеся к l¿ti , обладают способностью преципитировать гомологичный антиген в иммунодиффузионных тестах. Поскольку идентификация г.mallei иp.pseudomaiiei основана на выделении чистой культуры микробных клеток с последующим исследованием ее в различных иммунохимических тестах (исключение составляет ИФлА , где возможно выявление возбудителя в мазках-отпечатках пораженных органов), была исследована возможность использования МкАт ММ-Р.рм.1 в реакции двойной иммунодиффузии в геле для диф- . ференциации вирулентных-невирулентных штаммов псевдомонад на стадии выделения колоний. Установлено, что при внесении МкАт ММ-Р.рм.1 в лунки рядом с растущими на агаре колониями зона преципитации появляется только у колоний, синтезирующих антиген 8. Преципитации антител с антигенами гетерологичных видов микроорганизмов отмечено не было.

Таким образом, в ходе проделанной работы было показано, что полученные нами МкАт ММ-Р.м.1, ММ-Р.рм.1, ММ-Р.рм.2 и ММ-Р.рм.З могут быть использованы в качестве иммунохимических реагентов для выявления и дифференциации типичных штаммов P.mallei и p.pseudomaiiei , а также атипичного пуринзависимого штамма p.pseudomaiiei Vpa в реакциях ИФА, иммунофлюоресцент-ного анализа (прямом и непрямом вариантах), РИГА и двойной иммунодиффузии в геле.

Штаммы переданы в Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт для наработки антител и приготовления на их основе серийных диагностических препаратов для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза и их антигенов.

вывода

1. На осковг использования спленоцитов животных, стицули-рованных ко вторичному иммунному ответу как "ин виво", так и "ин витро", созданы гибридомы-продуценты антител к антигенам возбудителей сапа и мелиоидоза.

2. Синтезируемые гибридомами моноклональные антитела обладают видовой специфичностью по отношению к типичным штаммам возбудителей сапа и мелиоидоза, атипичному пуринзависимому штамму Р.рэеиЛотане! ура , а также антигену 8 возбудителя мелиоидоза.

3. Применение полученных препаратов МкАт в качестве диагностических реагентов позволяет с высокой специфичностью выявлять и дифференцировать возбудителей сапа и мелиоидоза в реакциях ИФА, прямой и непрямой иммунофлюоресценции, РИГА и двойной иммунодиффузии в геле.

4. Выявление микробных клеток возбудителей сапа и мелиоидоза и их растворимых антигенов возможно с использованием лишь одного типа МкАт в "сэндвич"-варианте ИФА.

5. С помощью МкАт ММ-Р.рм.1 выявлено, что антиген 8 (фактор вирулентности р.рэеиаогааНе! ) присутствует не только у типичных штаммов возбудителя мелиоидоза, но и у высоковирулентных штаммов возбудителя сапа, что позволяет рассматривать данный антиген как общий фактор патогенности этих двух видоь псевдомонад.

6. Использование МкАт ММ-Р.рм.1 и ММ-Р.рм.2 позволило определить локализацию антигенов б и 8 на микробной клетке

р.рзеийошаНе! , выделить эти антигены в очищенном виде и уточнить их природу.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Использование ыоноклональных антител для выявления патогенных псевдомонад. Синюкова И.В.// Тезисы докладов конференции молодых ученых. - Пермь. - 1990. - С. 27.

2. Использование моноклональных антител для выявления патогенных псевдомонад при мониторинге окружающей среды. Свиридов В.В., Храпова Н.П., Синюкова И.В., Липницкий A.B., Барков A.M., Кулаков М.Я.// Тезисы докладов II Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов". - Москва. - 1990. - С. 39.

3. Авторское свидетельство № I79I450 на изобретение: "Штамм гибридных культивируемых клеток ¡.'из musculus и. -продуцент моноклональных антител к антигену 8 возбудителя мелиоидоза Pseudomonas pseudomelia!". Синюкова И.В., Свиридов В.В., Луговая А.Э., Липницкий A.B., Храпова Н.П., Барков A.M., Фарбер С.М. I октября 1992 г.

4. Авторское свидетельство № I79I45I на изобретение: "Штамм гибридных культивируемых клеток Mus тизcuius и. -продуцент моноклональных антител к поверхностному антигену ТИПИЧНЫХ штаммов возбудителя сапа Pseudoi.ior.as mallei ". Синюкова И.В., Свиридов В.В., Липницкий A.B., Храпова Н.П., Барков A.M., Новицкая И.В. I октября 1992 г.

5. Моноклональные антитела в дифференциации Pseudomonas mallei и Pseudomonas pseudomallei. Яковлева И.В., Свиридов В.В., Титова Н.Г., Храпова Н.П., Липницкий A.B., Фарбер С.М., Барков A.M.// ЖМЭИ. - 1995, №6. - С. 14-15.

6. Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител к возбудителю мелиоидоза с использованием лимфоцитов, стимулированных антигеном в системе in vitro. Титова H.Г., Рази-

на И.В., Свиридов В.В., Яковлева И.В., Храпова Н.П., Кулаков М.Я.// ЖМЭИ. - 1995, № 6. - С. 82-83.

Подп. в печ. 30/1 1996 г. Формат 60x84 1/16 Тираж 100

Объем 1,5 п.л. 1,15 уч.-изд.л. Заказ 94

ВНИЭРХ. 101925, Москва, Б.Спасоглинищевский пер., 4/2