Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Внутриклеточный рН и морфофункциональные параметры лимфоцитов периферической крови в норме и при лейкозе крупного рогатого скота

ВСЕСОЮЗНЫМ ОРДЕНА ЛЕНИНА НАУЧНО-ИССЛВДОВАТЕЛЬСКШ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРЮЛЕНТМЫЮЛ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р. КОВАЛЕНКО

ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДОШ СЕЛЬСКОХОЗШСТВЕННиХ НАУК имени В.И. ЛЕНИНА

На правах рукописи

АБРАМЯН ЛЕОНИД ЙРАНТОВИЧ

УДК 619:616.155.39?~036.12:636.22/.28

ШУТРШИВТОЧШй рН И лЮРФОФУНКЦИОНАЛЬШЕ ' ПАРАМЕТРЫ ЛШЮЦИТОВ ПЕР®ЕР1ШЕСКОЙ КРОВИ В НОРМЕ И ПРИ ЛЕЙКОЗЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

АВТ0РВ5ЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990'

Работа выполнена в Центральном отделе лейкозов, сравнительно!! и экспериментальной онкологии Всесоюзного ордена Ленина научно-исследовательского института экспериментально" ветеринарии ;;м.

Я.Р. Коваленко

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор Г.А. Симонян

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник З.Б. Туровецкий

Официальные оппоненты:

1. Заслуженный деятель науки PCFCP, доктор биологических наук, профессор Дьяконов Л.П. (ВИЗВ).

2, Кандидат ветеринарных наук, стариий научны": сотрудник Петровский Г.С. (МВА).

Ведущее учреждение - Институт иммунологии Литовской Академии наук.

Защита диссертации состоится ф 1990г.

в /6 —часов на заседании Специализированного совета Д 020.26.02 по зачтите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном ордена Ленина научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВЙЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ Автореферат разослан " ^ " oi^iii^1Я 1990г.

Ученый секретарь

Специализированного совета ;

кандидат биологических наук В.В. Амелина

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность теш. Одной из ваанейших задач современной лей-козологии является разработка новых и совершенствование существующих методов ранней и дифференциальной диагностики гемооласто-зов. За последние десятилетия отечественными исследователями внесен огромный вклад в изучение лейкоза крупного рогатого скота (Б.Б.Ермолаев, 1963; Г.А.Симонян, 1963, 1975; Т.П.Кудрявцева. 196?; Н.В.Румянцев, 1975; В.П.ШишкоВ, 1975; Г.Ф.Коромыслов, 1975; Г.С.Петровский, 1979; Л.Г.Бурба, 1983; В.И.Нахмансон, 1986; В.И.Тамошюнас, 1987 и др.). Методами комплексных клинико-гематоло-гических, цитологических, иммунологических, биохимических и вирусологических исследований били всесторонне изучены особенности патологических изменений при данной болезни. *1з разработанных прижизненных методов диагностики лейкоза сравнительно достоверным остается гематологический, а для уточнения и подтверждения диагноза - цитоморфологичесхие методы. Вместо с тем, диагноз, установленный морфологическим методом исследования не всегда подтверждается патоморфологическям анализом, незначительный лимфоцитоз может тлеть место и при некоторых заболеваниях нелелкозной природы, а зрелые лимфоциты не во всех случаях поддаются идентификации. Исходя из этого перед лейкозологаии встала необходимость изыскания дополнительных тестов, позволяющих дифференцировать незначительные морфологические и структурно-функциональные изменения в крови при лейкозе от таковых, обусловленных причинами нелейкозного характера.

В настоящее время все большее применение получают физико-химические метода изучения структуры и функций клеток, среди которых значительное место принадлежит методу флуоресцентных зондов. Благодаря способности целого ряда флуоресцирувдих соединений (как внутриклеточной природы, так и вводимых в клетку извне) отвечать изменением параметров собственной флуоресценции на изменение физико-химических свойств окружения, создается возможность следить с их помощью за такими параметрами клеток, как внутриклеточный рН, содержание Са2+, состояние мятохондрлального и лшзосомального аппарата, состояние клеточных мембран, синтетическая активность клетки, содержание некоторых внутриклеточных соединений и др. (Ю.А.Владимиров, Г.Е.Добрэцов, 1980; В.П.Зорин, 1984). Все это дает возможность изучать различные системы клеточной регуляции, к числу наиболее важных из которых относят систему рН-регуляцки.

Анализ литературных данных о взаимосвязи между изменениями физико-химических свойств и функциональных характеристик клеток, скорости протекания внутриклеточных процессов, пролиферативной активности и т.п. с одной стороны, и пространственно-временными сдвигами величины внутриклеточного рН с другой, убедительно показывают, что ионы водорода могут и должны играть важную регуляторную роль в процессах клеточной жизнедеятельности (Л.Л.Литинская, А.М.Зекс-лер, В.Е.Туровецкий, 1987 и др.).

В то же время проблемы участия ионов водорода в лейкозной трансформации лимфоидных клеток изучена явно недостаточно (Т.Н.Багла-ев и др., 1982) и требует дальнейших углубленных исследований. При этом, особо перспективным представляется комплексный анализ изменений, происходящих на клеточном уровне, включающий в себя, наряду с изучением модификации внутриклеточного рН, исследование таких важных параметров структурно-функционального состояния как содержание АТФ, синтетическая активность и состояние клеточных.мембран.

Такой подход, в конечном итоге, должен обеспечить расшифровку механизмов лейкозной трансформации и, как следствие, создать дополнительные методы ранней и дифференциальной диагностики данного заболевания. Это, в значительной степени, и определяет важность и актуальность данной диссертационной работы.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явилось изучение в сравнительном аспекте с помощью одного из наиболее перспективных направлений физико-химического анализа г метода флуоресцентных зондов и ряда других методов - отличительных особенностей лимфоцитов периферической, крови здорового и больного лейкозом поголовья коров, возможности использования полученных данных для идентификации нормальных лимфоцитов от. лейкемических в качестве , дополнительного критерия оценки лейкозного процесса и дифференциальной диагностики лейкоза крупного рогатого скота. •

Дня достижения поставленной цели, на-семи отобранных, группах коров (здоровые, инфицированные ВЛКРС и больные лейкозом животные, находящиеся в предлейкозном состоянии,, начальной, развернутой нетерминальной стадиях) ставилась задача, изучить в,сравнительном аспекте следующие параметры .клеток:

. I. Цито.морфологические. изменения лимфоцитов- периферической - . крови.. : - . ; - ■ • , ■■ ■ ■'

2. Внутриклеточный рН (концентрация ионов водорода).в■лимфоцитах периферической крови.

3. Интенсивность флуоресценции лимфоцитов периферической кро-

ви, окрашенных люминесцентным зондом.

4. Синтетическую активность лимфоцитов крови (отношение РНК к ДНК в клетке).

5. Содержание количества общего белка и внутриклеточной АТФ в лимфоцитах периферической 1фови.

6. Содержание липидов и микровязкость клеточных мембран лимфоцитов.

Научная новизна. Впервые методами комплексных гематологических, серологических (РИД), цитоморфологических и физико-химических исследований с применением флуоресцентных зондов проведено изучение морфосуункциональных особенностей лимфоцитов периферической крови у здоровых, инфицированных ВЛКРС и больных на различных стадиях лейкоза коров. Доказано, что в процессе развития заболевания прогрессивное нарастание числа лейкоцитов в крови сопровождается преимущественной пролиферацией средних и больших лимфоцитов, увеличением среднего их размера, значительным повышением внутриклеточного рН и связывания ими фдуоресцеина. Отмечается также одновременное возрастание уровня,АТ0 в клетках, повышение их синтетической активности, изменение микровязкости мембран лимфоцитов. Изменения в характере распределения .клеток в популяции по величине данных параметров имеют диагностическое и патогенетическое значение.

Практическое значение -работы. Развитые в диссертационной работе метода определения внутриклеточного рН и интенсивности флуоресценции, окрашенных флуоресцентным зондом клеток используются для изучения механизмов лейкозной трансформации и дифференциации лим-фоидных клеток. Данные методы вошли в сборник "Методические рекомендации по цитохимическим и физико-химическим методам диагностики гемобластозов крупного рогатого скота", предназначенные для научно-исследовательских учреждений, изучавших гемобластозы сельскохозяйственных животных и в "Программу профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в хозяйствах агропромышленного объединения "Новомосковское на 1987-1992 гг.". Полученные в диссертационной работе результаты, помимо важного теоретического, имеют также большое практическое значение и могут.послужить основанием для разработки соответствующих диагностических тестов.

Апробация работы. Основные положения диссертации долшены на "Координационном совещании по проблемам лейкозов человека и животных", (Кишинев, 1989); на научно-производственных совещаниях сот-

рудников Центрального отдела лейкозов, сравнительной и экспериментальной онкологии ВИЭВ в 1987, 1988, 1989 годах; на заседаниях Ученого Совета ВИЭВ в 1988 и 1989 годах; на научной конференции молодых ученых ВИЭВ в 1990 году;.на Республиканской научно-технической конференции "Ветеринарная медицина:.экономические, социальные и экологические проблемы" (Харьков, ноябрь, 1990).

Публикации. По теме диссертации опубликованы три научные статьи и две методические рекомендации.

0бъем_2абота. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста. Текст иллюстрирован II таблицами.и 18 рисунками. Работа, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов . исследований, результатов исследований, обсуждения полученных-результатов, выводов, практических.предложений. Список литературы содержит 179 наименований работ, в том числе 67..-зарубежных публикации. ■ . .

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ . •. 2.1; .Материалы и метода исследований

Работу проводили в Центральном отделе лёйкозов, сравнительной и экспериментальной онкологии ВИЭВ,1 Калужском отделе лейкозов ВИЭВ, на кафедрах биофизики биологического факультета и химической энзи-мологии химического факультета Московского Государственного университета им.. Ы.В.Ломоносова и в научно-исследовательском институте физико-химической медицины МЗ РСФСР. Экспериментальная часть работы по:подбору и,исследованию групп ливотных проводилась в хозяйствах Тульской (колхоз-племзавод им.В.И.Ленина,•агрофирма "Иван-озеро") и Калужской (госплемзаврд:им.Цветкова,; опытно-производственное хозяйство* "Калужское"), областей, v ■ !

При-массовых-гематологических и серологических (РИД) исследованиях крупного , рогатого.; скота, оздоравливаешх. от лейкоза из 2125 животных были отобраны 168 коров, которые в зависимости от количества лейкоцлтов (лимфоцитоз) в крови были: подразделены на семь групп: здоровые, инфицированные ВЛКРС, в предлейкозном состоянии, в начальной стадии с умеренным и высоким лейкоцитозом.в-крови,- в развернутой и терминальной стадиях лейкоза. Отобранные коровы в зависимости' от поставленной цели .были подвергнуты исследованиям от I до 15 раз с интервалами от нескольких часов до 3-6 месяцев,, а в некоторых случаях и до года, как для исключения ошибок методического

характера и определения воспроизводимости результатов исследований, так и установления факта прогрессировали лейкозного процесса у исследуемого животного.

Гематологические исследования проводили согласно "Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота", одобренным ГУВ МСХ СССР 25 марта 1974 г.

Для выявления инфицированности животных ВЛКРС применяли реакцию иммунодиффузии (РИД) в геле агара согласно "Методическим рекомендациям по серологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота", утвержденным ГУВ Госагропрома СССР от 30 ноября 1988 г.

Выделение лимфоцитов из цельной крови проводили по зоуип .и (1972) и ЛодинонзйЛ.а. (1982) на градиенте плотности фиколл-веро-графина.

Определение внутриклеточного рН и интенсивности флуоресценции лимфоцитов, выделенных из периферической крови проводили с использованием микрофлуориметричёского метода (Литинскэя Л.Л. и др., 1984) на серийно выпускаемом люминесцентном микроскопе марки Люмам-ИЗ, оснащенном фотометрической насадкой <5ЛШ~1А с набором интерференционных светофильтров, (фотоэлектронным умножителем ФЭУ-79 и цифровым вольтметром Щ-4300.

Определение активности синтетических процессов в лимфоцитах периферической крови проводили микро^луориыетрпческш методом с использованием люминесцентного зонда акридинового оранжевого.

Определение содержания внутриклеточной ВТО в лимфоцитах периферической крови проводили с использованием биохемилшинесцентной реакции на люминометре ЛКБ-1250 (Угарова Н.И. и др,, 1987).

Определение количества общего белка в лимфоцитах проводили по методу Лоури с некоторыми модификациями.

Микровязкость клеточных мембран лимфоцитов и содержание мембранных липидов определяли методами ЭПР-спектроскопии и проточного флуориметрического анализа с применением спиновых и люминесцентных зондов.

Обработку полученных данных проводили с помощью методов вариационной статистики.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Гематологические, серологические и цитоморфо-■ логические изменения периферической крови у животных в норме и при различных стадиях развития инфекционного и лейкозного процессов

Методами комплексных исследований коров, проведенных на отобранных группах животных были' установлены характерные особенности показателей крови, отражающие норму, инфёцированность животных ВЛКРС и стадии течения лейкозного процесса. Наряду.с определением относительного и абсолютного количества лимфоидных элементов в I мил крови, большое внимание обращали на идентификацию различных видов лимфоцитов и изменение их процентного соотношения в динамике развития лейкозного процесса.

а. Группа здоровых коров

Как видно из табл.1 количество лейкоцитов в среднем по всей" группе коров составило.7,2 + 2,65 тыс/мкл с пределами колебания от 4,5 до 9,8 тыс/мкл и коэффициентом вариации 36,8$. Лейкоцитарная формула, т.е. процентное соотношение различных видов лейкоцитов, как в среднем по группе, так и у отдельных коров, находилась в пределах физиологической нормы. Относительное и абсолютное содержание лимфоцитов составило 59,1 + 2,11$ и.4,13 + 1,49 тыс/мкл соответственно.. Основную массу клеток составили малые лимфоциты (55,0$),при мишшальном. числе средних (37,0$) и больших (5,0$) клеток. Средний размер зрелых лимфоцитов по всей исследованной группе составил 7,2 + 0,126 мкм, с пределами колебаний 6,63-7,81 мкм.' Таким образом, как гематологические, так и цитоморфологические показатели здоровых коров служили в качестве контроля для сопоставления и правильной интерпретации данныхполученных в последующих группах инфицированных, и больных лейкозом коров. -

б. Группа инфицированных ВЛКРС коров

В группе инйжщюванкых ЗЛКРС коров с нормальными показателями крови, количество лейкоцитов составило в среднем 7,6 + 2,65 тыс/мкл, а относительное и абсолютное число лимфоцитов - 69,6 + 2,13$ и 4,67 + 1,52 тыс/мкл соответственно. Соотношение малых (54,0$), средних (38,0$), больших (5,0$) и широкоцитоплазменных (3,0$) лимфоцитов,, а также средний размер их (7,2 мкм), оставались на уровне показателей здоровой группы животных. Различия их недос-

Таблица I

Гематологические и цитоморфологические показатели лейкоцитов периферической крови у коров в динамике развития инфекционного и лейкозного процессов

№

п/п Группы животных

н. Количество

(гол) лейко~ цитов

(тыс/ мкл)

¡количество лимфоцитов_

отн. (*)

абс.

(тыс/гда)

Субпопуляции лимфоцитов __ {$) '

ма-:сред-1 боль- широ- молы с ние !шие коци- лото- дые плазменные

С {%)

Средний

размер

лиШоци-

тов

(мкл)

1. Корма (контроль)

2. Инфицированных

"ВЛКРС

3. Предлейкоз Начальная стадия

4. с умеренным

5. с высоким лейкоцитозом

6. Развернутая 7„ Терминальная

22 7,2±2,65

21 7,6±2,65

20 12,6±2,08

38 20,1^4,42

32 33,8±4,61

24 58,5*9,99

II 161,6±31,5

59,1±2,И 4,13±1,49 55 37 5

69,6±2,13 4,67^1,521 54 38 5 80,4±2,3 10,4-1,65 46 42 8

36,8

7,2±0,126

86,4-1,98 17,2±2,49

89,4±2,13 29,1±2,15 93,7±1,9 65,6*2,85 95,7±1,7 143,5*3,73

32 46 17

32 47 16

20 . 48 24

9 51 ' 29

3

4

• 4

4

5

34,9 1 7,2±0Д31

16,5 | 7,6*0,163

!

22,0 8,02*0,135

13,64

10,44), 120

17,08111,05*0,347 19,5 112,9*0,573

товерны, что свидетельствует об интактности ВЛКРС на клетки крови на стадии инфицированности коров.

в. Группа коров в предлейкозном состоянии

С началом проявления болезни обнаруживаются ранние, хотя и незначительные, морфологические изменения показателей крови. Так, общее количество лейкоцитов в среднем по группе составило 12,6 + 2,СБ тыс/мкл, а коэффициент вариации - 16,5$. В лейкоцитарной формуле происходит заметное увеличение относительного (80,4 + 2,3$) и абсолютного (10,4 + 1,66 тыс/мкл) содержания лимфоцитов. Соответственно меняется и процентное соотношение малых (46,0$), средних (42,0$) к больших (8,0$) лимфоцитов в сторону некоторого повышения числа последних. Средний размер лимфоидных клеток по данной Группе составляет 7,6 + 0,163 мкм.

г. Группа коров в начальной стадии лейкоза

В начальной стадии лейкоза происходит становление заболевания со стабилизацией гематологических показателей на высоком уровне. Для достоверной интерпретации полученных результатов последующих физико-химических исследований, животных данной группы мы подразделили на две подгруппы: с лейкоцитозом от 14,1 до 25,0 и от 25,1 до 40,0 тыс/мкл. В первой подгруппе количество лейкоцитов в среднем составило 20,1 + 4,42 тыс/мкл, с коэффициентом вариации 22,0$, а относительное и абсолютное число лимфоцитов составило соответственно 86,4 + 1,98$ и 17,2 ± 2,49 тыс/мкл. Достоверность отличий при сопоставлении проб как с нормой, так и предыдущей группой коров составила Р-—0,001. 3 данной подгруппе происходит дальнейшее снижение содержания малых (32,0$) и повышение числа средах (46,0$) и больших (17,0$) лимфоцитов, а также появляются в крови единичные молодые клетки. Средний размер всех лимфоидных клеток заметно увеличивается и составляет 8,09 ± 0,135 мкм. .

В подгруппе коров с относительно высоким, на сублейкемическом уровне, лейкоцитозом в крови количество лейкоцитов в среднем составило 33,8 + 4,61 тыс/мкл, а относительное и абсолютное число лимфоцитов - 89,4 + 2,13$ и 29,1 ¿2,15 тыс/мкл соответственно. Число малых лимфоцитов составляет 32,0$, средних 47,0$, больших.16,0$, ишрокоцитоплазменных 4,0$ и молодых 1,0$. Средний размер лимфоидных клеток увеличивается до 10,4 мкм. Резкое увеличение среднего размера клеток в популяции можно объяснить как повышением числа больших лимфоцитов, так и появлением в крови молодых клеток.

э

д. Группа коров в развернутой стадии лейкоза

Полное и почти повсеместное распространение патологического процесса в организме сопровождается более глубокими-изменениями гемопоэза, которые отражаются на показателях периферической крови. Количество лейкоцитов в среднем по группе повышается до 58,5 + 9,99 тыс/мкл, а лимфоцитов до 93,7 + 1,9% и 65,6 + 2,85 тыс/мкл.

Задержка дифференциации молодых клеток в органах лимфопоэза привела к увеличению их до 4,0%, дальнейшему повышению числа средних (48,055) и больших (24,0%) лимфоцитов и снижению числа малых до 20,0%. Средний размер лимфоидных клеток составляет 11,05 мил с пределами колебания от 9,35 до 12,75 мкм.

е. Группа коров в терминальной стадии лейкоза

Животные с гиперлейкоцитозом в крови, наличием клинических симптомов или патологических изменений были отнесены к конечной или терминальной стадии лейкоза. Количество лейкоцитов в этой группе составило в среднем 161,6 +. 31,5 -тыс/мкл, относительное число лимфоцитов составило 95,7 ± 1,7%, абсолютное их содержание 143,5 + 3,73 тыс/мкл. Значительное увеличение числа больших (29,0$) и средних (51,05?) лимфоцитов при'минимальном числе малых (9,0%) клеток привело к максимальному повышению размера лимфоидных клеток в среднем по всей группе до 12,9 ± 0,573 мкм с пределами колебания 10.0514,1 мкм. Разумеется, что помимо больших лимфоцитов, на увеличение средних размеров лимфоидных клеток оказали малодифференцированные элементы, которые составляют 6,0$.с пределами колебания от 3,0 до 12,0$.

Таким образом, сравнительные гематологические и цитоморфологи-ческие исследования лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота показали прогрессивное нарастание числа лейкоцитов в основном за счет пролиферации в крови средних и больших лимфоцитов, а также молодых и малодифференцированных клеток.

2.2.2. Внутриклеточный рН Л1шфоцитов периферической крови в динамике развития лейкозного процесса

Данный раздел работы был проведен с целью установления взаимосвязи между степенью возрастания внутриклеточного рН и уровнем лиыфоцитоза в крови, отражающего стадийность течения лейкозного процесса, а также выявления возможности идентификации.нормального лимфоцитоза от лейкемического. На отобранных нами группах коров с

использованием люминесцентного микроскопа и флуоресцентных зондов определяли внутриклеточный рН живых лимфоцитов нативной крови.

Группа здоровых коров служила контролем, т.е. исходным материалом для сравнения и правильной интерпретации результатов, полученных в последующих группах животных. Как видно из табл.2, средняя величина внутриклеточного рН лимфоцитов у коров в норме составила 7,03 + 0,014 ед, при среднеквадратическом отклонении - =0,067. Исследование животных в динамике показало относительную стабильность величины, внутриклеточного рН.

Группа инйицированных ВЛКРС животных. Среднее значение внутриклеточного рН лимфоцитов по всей группе инфицированных ВЛКРС животных повысилось до 7,08 + 0,01 ед. Достоверность отличий по сравнению с показателями предыдущей, т.е. здоровой группы, составила Р < 0,01. Повышение внутриклеточного рН по сравнению с показателями здоровых животных в среднем на 0,05 ед свидетельствует о возможности воздействия ВЛКРС на сдвиг кислотно-щелочного равновесия, который нарастает по мере проявления и дальнейшего развития лейкоз-ного процесса. -

Группа коров в предлейкозном состоянии. В этот период раннего проявления лейкоза наступает нарушение функциональной деятельности лимфопоэза, который выражается в усиленной пролиферации лимфоцитов, а возможно, и в появлении первых видоизмененных клеток. Среднее значение внутриклеточного рН составило 7,11 + 0,007 ед, что выше на 0,03 -ед по сравнению с предыдущей группой и на 0,08 ед по сравнению с нормой. В данной и во всех последующих группах коров достоверность отличий по сравнению с нормой составила Р<0,001.

Группа коров в начальной стадии лейкоза. В первой подгруппе коров с умеренным лимфоцитозом в крови показатели внутриклеточного рН идентичны таковым предыдущей группы животных и составляют 7,Н± 0,13 ед. Во второй подгруппе с высоким лимфоцитозом в крови.внутриклеточный рН составил в среднем 7,15 + 0.010 ед. Этот показатель отражает заметное повышение числа лимфоцитов с высоким значением внутриклеточного рН. Отсюда следует, что и в начальной стадии лейкоза с относительно спокойным течением болезни, при компенсированном состоянии патологического процесса со стабилизацией гематологических показателей'на сублейкемическом уровне, появляются в крови клетки, характеризующиеся более высоким значением внутриклеточного рН.

Таблица 2

Изменение мор^о^ункционылышх параметров яшйоцитов периферической крови крупного рогатого скота на разных стадиях развития лейкозного

процесса

Группа животных

IV

(гол)

РН1 ед.

Зло . (отн.ед)

Белок ! Ш (ед) (ют/106 кл) '

1СГ кл)

1. Норма (контроль) 22

2. Инфицированных

ВЛКРС 21

3. Предлейкоз 20

Начальная стадия

4. С умеренным ЗС

5. С высоким лейкоцитозом 32

6. Развернутая 24

7. Терминальная II .

7,03*0,014 1В0,2*5,2 0,157*0,016 0,23*0,012 0,458

7,08*0,010 7,11*0,007

200,2*5,8 220,6*8,1

0,106*0,004 0,138*0,01

0,26*0,012 0,29*0', 013

7,11-0,013 -221,2*5,4 0,150*0,01 0,35*0,013

7,15*0,010 7,23*0,018 7,5*0,066

332,8*8,5 362,8*8,0 444,0*13,0

0,167*0,01

0,183*0,015

0,366*0,017

0,43*0,027 0,43*0,032

0,600

0,718

0,937 0,918

Группа коров в развернутой стадии лейкоза характеризуется усугублением лейкозного процесса с наличием первых не специфических клинических симптомов болезни. Видаю поэтому параметры лимфоцитов по величине внутриклеточного рН изменены более значительно и резко отличаются от таковых предыдущих групп животных. Внутриклеточный рН в среднем по группе коров составил 7,23 + 0,018 ед при средне-квадра.тическом отклонении С = 0,089.

Группа коров в конечной, терминальной стадии лейкоза характе-ряризовалась не только гиперлейкоцитозом в крови, но и наличием повышенного количества молодых и малодифференцированннх клеток. Ви димо, в основном за счет последних и произошло дальнейшее нарастание величины внутриклеточного рН и составило в среднем по группе 7,5 + 0,66 ед. Разница по сравнению с показателями здоровых животных значительна и составила 0,47 ед, а по сравнению с предыдущей группой - 0,27 ед.

Увеличение в крови больных лейкозом животных больших лимфоид-ных клеток с -высоким значение внутриклеточного рН и прогрессивное их нарастание по мере развития лейкозного процесса, свидетельствует о специфичности их для лейкоза. Такие лимфоциты, как утверждают многие исследователи, можно отнести к лейкемическим клеткам.

2.2.2.1. Диагностическое и патогенетическое значение внутриклеточного рН лимфоцитов периферической крови при лейкозе

Прогрессивнее нарастание величины внутриклеточного рН лимфоцитов крови по мере развития лейкозного процесса свидетельствует о возможности использования данного теста дая уточнения и подтверждения прижизненного гематологического диагноза на лейкоз. Однако, необходимо было уточнить за счет каких видов клеток происходит увеличение значения внутриклеточного рН в среднем по группам коров: увеличивается число больших лимфоцитов с повышением значения внутриклеточного рН, или появляется новая популяция клеток с высокой концентрацией ионов водорода, которая не обнаруживается у здоровых животных?

Популяционный анализ гистограмм распределения лимфоцитов периферической крови на трех группах коров, отражающих норму, начальную и терминальную стадии лейкоза, показал существенную разницу между ними. Из гистограммы распределения клеток по величине внутри-

клеточного рН, характеризующей норму (рис.1а) видно равномерное гауссовое распределение клеток всей популяции, среднее значение которого составляет 7,03 ± 0,014 ед. Пределы колебания в данной популяции составляют от 6,6 до 7,6 ед.

В начальной стадии лейкоза с высоким лейкоцитозом в крови гистограмма распределения клеток (рис.16) имеет тенденцию к смещению в сторону защелачивания величины внутриклеточного рН по сравнению с нормой. Среднее значение внутриклеточного рН составляет 7,15 + 0,01 ед. В популяционном анализе, в частности, наблюдается ушире-ние гистограммы за счет появления в популяции лимфоцитов с более высоким значением внутриклеточного рН. Как видно из гистограммы, минимальное значение в распределении лимфоцитов в начальной стадии лейкоза идентично с таковым в норле. Однако, верхний предел распределения увеличен за счет появления в популяции незначительного количества клеток с высоким значением внутриклеточного рН (3,4$), что ведет к увеличение пределов колебаний в данной группе, верхний предел которого равен 8,0 ед.

Распределение популяции лимфоцитов в терминальной стадии (рис. 1в) лейкоза принимает совершенно отличительный, чем при норме и в начальной стадии,вид. Среднее значение внутриклеточного рН достигает своего максимума и составляет 7,5 ± 0,066 ед. Если в норме и в начальной стадии среднее значение по величине внутриклеточного рН соответствует примерно максимальному пику гистограмм, а характер распределения имеет симметричную конфигурацию, то в терминальной стадии наблюдается перераспределение клеток по значению внутриклеточного рН в интервале от 7,0 до 8,3 ед. Из этого видно, что в популяции отсутствуют клетки со значением внутриклеточного рН ниже 7,0 ед, ранее присутствовавшие в достаточном количестве как у здоровых (39,8$), так и больных в начальной стадии лейкоза (22,5$) животных. На гистограмме появляется новая популяция клеток, ранее не наблюдаемая в норме и обнаруживаемая в начальной стадии с высоким лейкоцитозом, как указывалось, в количестве 3,4$ от всей популяции, варьирующая в ■ пределах от 7,6 до 8,3 ед рН. Доля этих клеток составляет 36$ от всех клеток данной популяции. Появление второго пика в распределении гистограммы клеток в терминальной стадии, возможно обусловлено пролиферацией молодых и малодифференцирован-ных клеток, обладающих более высокой величиной внутриклеточного рН.

•7 /ы

а)

G.4 6,7 7,0 7,3 .7,6 7,í

K/V

tí)

I ■ ■ 1 _I_I_I_I_1_I-!_1-1-1-1-

6,4 6,7 7,0 7,3 7,6 7,9

в)

>н;

6,9

7,2

7,5

7,3

М

8,4

Рис Л. Гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота по величине внутриклеточного рН в группе контрольных животных (а), начальной стадии лейкоза с высоким лейкоцитозом (б) и в терминальной, стадии (в).

2.2.3. Интенсивность флуоресценции лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота на разных стадиях развития лейкозного процесса

Величина интенсивности флуоресценции лимфоцитов периферической крови в группе здоровых коров составила в среднем 180,2 + 5,2 относительно единиц (табл.2). В груше коров, инфицированных ВЖРС величина интенсивности флуоресценции увеличивается по сравнению с нормой и соответствует 200,2 ±5,8 ед. На всех последующих стадиях лейкоза наблюдается высокая достоверность отличий параметров по величине интенсивности флуоресценции по сравнению с нормой (Р<0,С01). Величина интенсивности флуоресценции составляет в период предаейко-за.220,6 + 8,1 ед, а в начальной стадии с умеренным лимфоцитозом -221,2 + 5,4 ед. Начиная с группы.-коров', находящейся в начальной стадии лейкоза с высоким содержанием лимфоцитов, наблюдаются темпы усиленного нарастания величины параметра интенсивности флуоресценции по сравнению с таковыми предыдущих груш животных. Интенсив-

ность флуоресценции с 332,8 + 8,5 ед возрастает до 362,8 ± 8,0 в развернутой, достигая своего максимума 444,0 + 13,0 ед в терминальной стадии болезни. Таким образом, параметр интенсивности флуоресценции в динамике развития инфекционного и лелкозного процессов увеличивается в 2,46 раза в конечной стадии по сравнению с нормой. Нормальные лимфоциты содержали в 2 - 2,5 раза меньше флуоресцеина, чем лейкемические клетки при лейкозе. Чем больше ФДА поглотилось клеткой, тем больше степень ее гидролиза, ферментативная активность и интенсивность флуоресценции.

Для удобства в интерпретации характеристик клеток, вся популяция флуоресцирующих клеток была подразделена на три группы: со слабой 'флуоресценцией до 300 ед, имеющие среднюю флуоресценцию в 300 - 600 ед,и сильно'флуоресцирующие лимфоциты с интенсивностью свыше 600 ед. В группе здоровых коров 85$ клеток обладал!! слабой флуоресценцией. По мере развития болезни снижается число лимфоцитов со слабой интенсивностью флуоресценции и увеличивается доля клеток со средней и сильной интенсивностью флуоресценции. В терминальной стадии лейкоза количество их составляет 12, 70 и 18$ соответственно. Кроме того, в этой стадии, помимо количественного уши-рения гистограммы вправо, наблюдаются качественные изменения в распределении клеток. Выявляются два пика распределения лимфоцитов с интенсивностью 520-650 ед и 700-800 ед. Появление второго и третьего пиков может быть обусловлено появлением в крови повышенного числа молодых клеток.

Данные флуоресцентно-микроскопических исследований позволяют предположить, что при лейкозе происходит изменение проницаемости мембранного аппарата лимфоцитов, которое, в свою очередь, влияет на процессы накопления и утечки флуоресцеина в клетках и, как следствие этого, на интенсивность их флуоресценции.

2.2.4. Структурно-функциональная характеристика лимфоцитов периферической крови

Структурно-функциональную характеристику лимфоцитов периферической крови с использованием различных тестов изучали на том же контингенте здоровых, инфищфованных ВЖРС и больных лейкозом коров на различных стадиях развития лейкемического процесса. Изучение этих параметров диктовалось необходимостью более полного представления о механизмах изменения метаболизма лимфоцитов крови при повышении внутриклеточного рН и интенсивности флуоресценции.

Синтетическая активность лимфоцитов. Синтетическую активность, т.е. соотношение РНК к ДНК в лимфоцитах периферической крови определяли с использованием флуоресцентного красителя акридинового оранжевого (АО) под люминесцентным микроскопом.

Результаты исследований показали, что с повышением количества лейкоцитов в крови происходит активация синтетических процессов в клетках. Так, в группе здоровых коров средняя величина синтетической активности лимфоцитов составила 0,167 + 0,016 ед (табл.2).

У инфицированных ВЛКРС коров происходит снижение синтетической активности лимфоцитов до 0,106 + 0,004 ед. По сравнению с показателями здоровых коров величина синтетической активности снижается более чем в 1,5 раза. По-видимому, ВЖРС, являясь внутриклеточным агентом, при внедрении в клетку оказывает влияние на ее метаболизм, подавляя, в частности, активность синтетических процессов. Начиная с предлейкозного состояния величина синтетической активности возрастает от 0,138 + 0,01 до 0,150 ± 0,01 и 0,167 +' 0,01 ед в начальной и до 0,183 ± 0,015 ед в развернутой стадиях лейкоза. Более чем в два раза по сравнению с нормой повышается уровень синтетической активности у животных в терминальной стадии болезни - 0,366 0,017 ед. Возможно, что значительное повышение.синтетической активности клеток в конечной стадии заболевания происходит как вследствие повышения числа зрелых видоизмененных лелкемических лимфоцитов, так и появления в крови большого числа молодых и малодифферещироваш-шх клеток. - ■ .

Содержание общего бежа в лимфоцитах. Содержанке абсолютного количества белка в суммарных гомогензтах здоровых коров составило в среднем 0,23 + 0,012 ыкг/.Ю6 клеток (табл.2). Начиная'со стадии инфицирования коров ВЖРС происходит незначительное повышение количества общего белка до 0,26 ± 0,012 глкг/106 клеток. С проявлением заболевания и до его финального конца, содержание общего белка прог-рёссивно нарастает и составляет: в предлейкозном состоянии - 0,20 j. 0,013, в начальной стадии - 0,35 £ 0,013 и 0,43 ± 0,27 мкг/106 клеток соответственно по подгруппам. В группе коров, отражающих начальную стадию с высоким лейкоцитозом в крови содержание общего белка по сравнению со здоровой группой увеличивается в 1,87 раза. Б развернутой стадии лейкоза дальнейшее повышение содержания' общего белка не происходит и составляет 0,43 + 0,032 мкг/10 клеток. Таким образом, развитие инфекционного и лейкозного процессов сопровождается увеличением абсолютного содержания общего белка в лимфоцитах

крови и достигает своего максимума в начальной и развернутой стадиях лейкоза.

Количество внутриклеточной ATO в лштооштах. Все процессы в организме животного могут происходить только при строго определенных концентрациях водородных ионов. Лаже незначительное смещение реакции внутриклеточной среды в кислую или щелочную сторону вызывает изменение активности ферментов и в связи с этим, нарушение закономерности течения биохимических процессов.

В наших исследованиях установлены изменения концентрации внутриклеточной ATO по мере развития лейкозного процесса. Так, в контрольной группе коров среднее количество внутриклеточной АТФ составило 0,458 шоль/10^ клеток (табл.2). В динамике развития лейкозного. процесса, синтез АТФ увеличивается соответственно до 0,600 в предлойкозном состоянии, до 0,718 в начальной стадии с умеренным и 0,937 пмоль/107 с высоким лейкоцитозом, что в два раза превышает показатели здоровых коров. В развернутой стадии происходит незначительное снижение содержания внутриклеточного АТФ до 0,918 пмоль/ 10' клеток. Эти данные отражают достаточное большое^аккумулирование энергии в клетках за счет синтеза АТФ.

Микровязкость клеточных мембран лимфоцитов. При лейкозе количество свободных радикалов в клетках коррелирует с их метаболической активностью и концентрация свободных радикалов изменяется при возникновении патологических процессов. Так гак многие белки и нуклеиновые кислоты, и один из важнейших компонентов, характеризующий микровязкость мембран - липида - не обладают собственными сигналами электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), мы воздействовали на суспензию лимфоцитов спиновым зондом 5-доксилпальмитан и следили за параметром, характеризующим подвижность зонда Ajj (А-парал-лельиая).

Наши исследования установили уменьшение показателя A-q с 6,35 у здоровых до 6,11 мТл у больных лейкозом коров, что говорит о возрастании скорости движения зонда в гидрофобной фазе мембран лимфоцитов, обусловленное уменьшением микровязкости мембран. Вязкость уменьшается вследствие появления ненасыщенных кислот, нарушения лишщно-белкового обмана клетки, уменьшения проницаемости мембран и, как следствие этого, нарушения функциональных процессов, происходящих в клетке.

Методом проточного цитометрического анализа с помощью люминесцентного зонда диметилхалкона (ДОО установили увеличение липидного

1Э

компонента в мембрана;: лимфоцитов больных лейкозом коров по сравнению с таковым здороьых животных. Увеличение количества липидов было связано с уменьшением микровязкости мембран. Снижение утечки красителя из клеток на позних стадиях лейкоза может быть обусловлено частичным снижением пассивной проницаемости флуоресцекна через клеточную мембрану в условиях снижения ее вязкости в эти сроки.

В Ы ВОД Ь!

1. Комплексными гематологическими, серологическими (ГИД), ци-томорфологическими и физико-химическими методами исследований установлено, что лиглфоидние клетки периферической кровн крупного рогатого скота неоднородны по своей морфологии и структуре.

2. Развитие лейкозного процесса сопровождается преимущественной пролиферацией средних и больших лимфоцитов, появлением в крови молодых форм лшлфоидных клеток.

3. В процессе развития лейкоза крупного рогатого скота проис-' ходит постепенное повышение среднего значения внутриклеточного рН, достигающее максимальной величины в развернутой и терминальной стадиях лейкоза. Развитие патологического процесса сопровождается уширением гистограммы распределения клеток и смещением среднего значения внутриклеточного рН по сравнению с нормой.

4. Величина интенсивности флуоресценции лимфоцитов крови, окрашенных флуоресцентным зондом, увеличивается при развитии инфекционного и лейкозного процессов, достигая своего максимума в конечной стадии лейкоза. В процессе развития заболевания наблюдается изменение характера распределения клеток по данному параметру.

5. У больных лейкозом коров в периферической крови обнаруживается клон лимфоиднкх клеток, прогрессивно нарастающий по мере развития лейкозного процесса и отличаюшийся повышенными значения.™ внутриклеточного рН, интенсивности (флуоресценции, содержания АТФ, активности синтеза нуклеиновых кислот, увеличением количества общего белка и снижением микровязкости мембран'лимфоцитов.

6. Определение внутриклеточного рП и других структурно-функциональных параметров в комплексе с существующими гематологическими и цитоморфологическими методами исследований может быть использовано для идентификации функционально"видоизмененных лимфоцитов при изучении патогенеза и дифференциальной диагностике лейкоза крупного рогатого скота.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЯОШШ •

; .:орфо лог ич е с кпо и физико-химические особенности лимфоидных кле^ ток периферической крови, характерные для определенных стадии тече^ ния лейкозного процесса, свидетельствуют о возможности использования их в качестве дополнительных тестов для прижизненной дифференциальной диагностики и изучения патогенеза болезни. Полученные результаты, в комплексе с другими данными могут послужить основой дая дальнейшего изучения различных физико-химических механизмов функционирования лимфоцитов крови, а также в целях их идентификации для раннего распознавания лейкозов.

Указанные методы вопли в сборник "Методические рекомендации по цитохимическим и физико-химическим методам диагностики гемобласто-зов 1фупногс рогатого скота", предназначенные для научно-исследовательских учреждений, изучающих гемобластозы сельскохозяйственных япвотны:-: п в "Программу профилактики и борьбы с лейкозы крупного рогатого скота в хозяйствах агропромышленного объединения "Новомосковское" на 1987-1992 гг.".

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Абрамян Л.Г. Внутриклеточный pH лимфоцитов периферической крояк у здоровых к больных лейкозом коров //Ветеринария, 1990, -а 3, С.32-34.

2. Парювиди Г.З., Туровецкий В.Б., Пархоменко U.U., Абрамян Л.Г., Скокова Т.В. Влияние малых доз радиации на функциональную активность нейтрофилов аашей //Калужский ЩГО'.-Информ.листок,

Л 88-39- -1988.

3. 'Айрзиян л.Г., Симонян Г.А., ТуровецкиЛ B.C. Активность синтеза нуклеиновых кислот лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота в пор;® и при лейкозе //Тезисы докладов Республиканской науно-тзхпической конференции "Ветеринарная медицина: экономические, социальные и экологические проблемы", ларьков, 1990.

Гюдцисэно к печати 12.10.20 woptai бук. ¿0x84/16. Объем 1,0 п.д. Ьак. БЗУ5. 1'ир. 120 экз.

Типографу PüCiiii'i'H