Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Морфология лимфоидных клеток при спонтанном и экспериментальном гемобластозах крупного рогатого скота

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на отчетных научных конференциях Московской ветеринарной академии им. К.И.Скрябина (1976-1996 гг.), на координационныхвещаниях программы по решению НТП 0.69.05 "Лейкозы человека и животных" Государственного комитета по науке и технике (1976-1990), на VIII, IX Всесоюзных научно-методических конференциях по патологической анатомии-х. животных (Витебск, 1981; Казань, 1984), на Международноммпозиуме поавнительному изучению лейкемии и родственных заболеваний (Пицунда, 1979); Всесоюзной конференции "Иммунология и иммунотерапия животных" (Самарканд, 1984); Всесоюзноммпозиуме "Первично-локализованные опухоли кроветворной ткани приматов и

9 t' " i > с л человека, пути генерализации" (Сухуми, 1986); II Всесоюзномезде гематологов и трансфузиологов (Львов, 1985); Всемирном ветеринарном конгрессе (Рио-де-Жанейро, Бразилия, 1991); Всероссийской научно-методической конференции по патологической анатомии-х. животных (Воронеж, 1993), Международная научно-практическая конференция, посвященная 40-летию ВНИИВВиМ (Покров, 1998)

Результаты работы экспонировались на ВДНХ СССР 1983 г., в 1987г. Главным комитетом ВДНХ награждены бронзовой медалью (Постановление от 23.07.87).

П. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования служили 237 гол. крупного рогатого скота [ерно-пестрой (210 гол.), костромской (14 гол.) и бушуевской (13 гол.) пород. Животные были разделены на следующие группы: 74 коровы клинически здоровые, серологически отрицательных в реакции имму-нодиффузии (РИД) к антигенам ВЛКРС; 77 гол. серологически положительных, 86 коров больных различными формами гемобластозов, серологически положительных к антигенам ВЛКРС.

Диагноз поставлен на основании клинико-гематологических (Петровский Г.С.), вирусологических (Крикун В.А.) и патолого-морфологических (Сноз Г.В.) исследований, проведенных в динамике развития лейкозного процесса, при убое животных или их гибели с характерными признаками лейкоза. Животные обследовались гематологически: в крови у здоровых коров 4,5-9,0 тыс/мкл лейкоцитов (50-60% лимфоцитов), больных животных 16,5-365,0 тыс/мкл лейкоцитов (8090% лимфоцитов), в лимфе 4,5-16,0 тыс/мкл лейкоцитов (95% лимфоцитов).

В качестве контроля были взяты нативные и культивированные лимфоциты крупного рогатого скота с индуцированной аденовирусной инфекцией (5 телят в возрасте 1 мес.)* и болезнями незаразной этиологии: маститы, эндометриты, травматический ретикулит, бронхопневмония. В крови данных животных было 12,5-36,0 тыс/мкл лейкоцитов с 5075% лимфоцитов (15 гол).

Экспериментальными моделями служили крупный рогатый скот: 3 гол. бурой латвийской породы, 9 гол. черно-пестрой и 3 гол. бушуевской пород; гетерологичные виды: овцы - 16 гол. романовской и 22 гол. каракульской пород и 5 гол. породы меринос; козы - 5 гол.; кролики - 10 гол.

Все животные подбирались по принципу аналогов со сходной зоотехнической характеристикой: порода, пол, возраст. В качестве материала для заражения крупного рогатого скота (телята в

Материал любезно предоставлен профессором Белоусовой Р.В, возрасте 1 год) использовали культуральную жидкость 48-часовой культуры лейкоцитов крови лейкозной коровы, содержавшую ВЛКРС, вводили внутрибрюшинно в дозе 100,0 мл . Кроме того использовали очищенный онкорнавирус и цельную кровь коровы, больной лейкозом. Ягнят в возрасте 3-х месяцев, свободных от онкорнавирусной инфекции заражали дважды с интервалом 3 месяца нативными лимфоцитами крови коровы, больной XJIJI, дозами 625x10б клеток в объеме 1 мл внутрибрюшинно, внутривенно, внутрикожно (Салимов Х.С., Крикун В.А.).

Козлят в возрасте 14-36 дней заражали 45 мл крови больной овцематки (L - 560 тыс/мкл, 99% лимфоцитов) и кровью лейкозной коровы (L 190,0 тыс/мкл) 20 мл подкожно (Андриян Е.А.). В процессе исследований были использованы клетки линии тимуса эмбриона крупного рогатого скота - МВА-76 "продуцента" онкорнавируса типа С (ТЭК МВА-76) (Крикун В.А. и соавт., 1978).

Материалом для трансмиссионной и растровой электронной мик роскопии служили нативные лимфоциты крови и лимфы и культивированные in vitro. Пробы крови брали из яремной вены, лимфу от коров получали сразу после выведения грудного протока или на 2-ой день после операции (Иткин Б.З., Петраков К.А.), в количестве 100-150 мл. Культуры лимфоцитов готовили по общепринятой методике. Лимфоциты лимфы выделяли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Выделение лимфоцитов и их подготовку к электронной микроскопии проводили по методу Anderson (1969) в нашей модификации. Из лимфоцитов периферической крови и центральной лимфы крупного рогатого скота, овец, коз и кроликов подготовлено и изучено 5820 блоков. Исследовано 325 краткосрочных культур лейкоцитов и одна перевиваемая вируспродуцирующая культура ТЭК МВА-76 на разных пассажах. Ультратонкие срезы контрастировали уранилаце-татом и цитратом свинца. Препараты изучали в электронном микроскопе JEM 100 С при 80 кв.

Для растровой электронной микроскопии препараты готовили по стандартной методике, изучали и фотографировали на пленку при увеличении 5 х 10000 раз в электронном микроскопе JEM 100С со сканирующей приставкой. В каждом препарате просматривали не менее 250 клеток. Всего проанализировано более 15000 снимков.

Результаты экспериментов обработаны статистически, достовер ность различий оценивали по Стьюденту.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Электронно-микроскопическое исследование лимфоидных клеток крови и лимфы клинически здорового крупного рогатого скота.

2.1.1. Ультраструктура лимфоцитов крови здорового крупного рогатого скота из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств.

Комплексное изучение свойств лейкозных клеток при спонтанном и экспериментальном лейкозах человека, крупного рогатого скота и лабораторных животных позволило выявить достоверные качественные и количественные ультраструктурные отличия их от нормальных клеток той же степени дифференцировки.

Ультраструктура нормальных, интактных лимфоцитов изучалась ла 54 гол. крупного рогатого скота трех пород: черно-пестрой, костромской, бушуевской. Все животные имели нормальные гемограммы и были клинически здоровы.

Изучение клеток лимфоидного ряда в электронном микроскопе показало, что по размерам и морфологии они неоднородны. Наиболее приемлема для крупного рогатого скота, на наш взгляд, классификация, разработанная для лимфоцитов крови человека Э.И.Терентьевой и Г.И.Козинцом (1972). Взяв за основу данную классификацию мы выделили и описали лимфоидные клетки у здорового крупного рогатого скота.

Малые светлые лимфоциты у здоровых, неинфицированных ВЛКРС животных представляли самую большую, в процентном соотношении, группу клеток. Они имели ровную или с небольшим количеством ворсинок и выступов клеточную поверхность, высокое ядерно-цитоплазматическое отношение. Большую часть клетки занимало округлое, иногда с глубокими выпячиваниями, ядро, окруженное узким или широким ободком цитоплазмы. Гетерохроматин ядер плотный, распределен в виде конденсированных глыбок у ядерной мембраны. Основную часть ядра занимал мелкозернистый или аморфный эухроматин. В некоторых клетках обнаруживали :омпактное ядрышко. Цитоплазма электронно-светлая, бедна »рганеллами, содержала 1-3 митохондрии конденсированного типа. Эндоплазматическая сеть слабо развита, в виде небольших канальцев и вакуолей. Аппарат Гольджи выявляли редко, он состоял, как правило, из мелких пузырьков и единичных цистерн.

Малые темные лимфоциты имели структуру аналогичную малым светлым лимфоцитам, но в цитоплазме находили визуально значительно больше свободных рибосом, которые придавали клетке темный вид, и крупные митохондрии (5-6) с хорошо выраженным рисунком крист.

Большие лимфоциты встречались редко, имели ровную или извилистую клеточную поверхность, низкое ядерно-цитоплазматическое отношение.

Ядро округлое или овальное располагалось эксцентрично, аморфно зернистый

Таблица №

Характеристика животных

Группа животных Серология (РИД) Количество лейкоцитов, тыс/мкл % встречаемости ЯК (250 кл на 1 гол.)

Животные из благополучных по лейкозу хозяйств

1. Клинически здоровые (п=51) 4,7-8,

Животные из неблагополучных по лейкозу хозяйств

2. Клинически здоровые (п=26) 3,2 - 6,2 0,57 ±0,

3. а) инфицированные ВЛКРС до 2% ЯК, (п=27) б) инфицированные ВЛКРС до 4% ЯК, (п=30) в) инфицированные ВЛКРС ЯК выше 4%, (п=24) + + + 5,3-7,5 5,3 - 9,2 5,8-11,6 1,13 ±0,24 2,95 ± 0,95 6,67 ± 1,

4. Начальная стадия ХЛЛ, (п=15) + 16,6 - 32,5 7,13 ± 1, хроматин располагался неравномерно с участками уплотнения в центре и у ядерной мембраны.

Лимфоплазмациты встречались крайне редко и характеризовала хорошо развитой сетью гранулярного эндоплазматического ретикулу-ма. Общим для всех четырех видов клеток было отсутствие патологических изменений в ядре: ядерных карманов и ядерных инвагинатов. Нами проведены исследования клинически здоровых, серонегативных коров (26 гол.) из неблагополучного по лейкозу хозяйства. Лимфоциты крови были представлены в основном малыми светлыми и единичными большими лимфоцитами по ультраструктуре однотипными с подобными клетками здоровых животных из благополучных по лейкозу хозяйств. Однако некоторые животные имели в ядрах лимфоидных клеток ядерные карманы. Данные аномалии находили в среднем у 0,57 ± 0,14% клеток с колебаниями от 0,4 до 0,8% (табл. 1).

Таким образом лимфоциты коров серологически отрицательных в РИД из благополучных по лейкозу хозяйств не имеют изменений в структуре клеточных органелл. Они появляются у аналогичных животных из неблагополучных по лейкозу хозяйств, в среднем 1%.

2.1.2. Ультраструктура лимфоцитов лимфы клинически здорового крупного рогатого скота.

Наименее изученным звеном в системе лимфопоэза остается ультраструктура лимфоцитов лимфы крупного рогатого скота. Анализ литературных данных показал, что до настоящего момента не было специальных исследований по сравнительному изучению лимфоидных леток периферической крови и центральной лимфы крупного рогатого кота. Вопрос изучения клеточного субстрата лимфы здоровых животных остается важным, так как является отправным моментом изучения патогенеза лейкозов.

При электронно-микроскопическом изучении морфологии клеточного состава лимфы крупного рогатого скота из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств установлено, что клеточная популяция лимфы здоровых животных содержит несколько вариантов, различающихся по ультраструктуре, клеток лимфоидного ряда с небольшой примесью эритроцитов, полиморфно-ядерных лейкоцитов и гранулоцитов.

Первым, доминирующим типом клеток были лимфоциты диаметром 4-6 мкм, с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, которое было в пределах 0,83-0,92. Такие клетки имели крупное, округлое или овальное ядро, располагающееся в центре клетки, часто с узкими глубокими впячиваниями.

Цитоплазма отличалась повышенной электронной плотностью и была бедна органеллами, среди которых были лишь рибосомы, единичные пиноцитозные пузырьки и 1-2 мелкие митохондрии с электронно-светлым матриксом и четко очерченными кристами.

Второй тип клеток • лимфоциты такого же или несколько боль-иего размера (до 7 мкм), но с более широким ободком цитоплазмы. Ядерно-цитоплазматическое отношение 0,65-0,73. По сравнению с узко-цитоплазматическими лимфоцитами клетки с широким ободком цитоплазмы имели больше митохондрий (3-6), округлой или овальной формы. Аппарат Гольджи представлен расширенными мембранами диктиосом и вакуолями.

Третий тип клеток - большие лимфоциты с низким ядерно-цитоплазматическим отношением - 0,4-0,5, широким ободком цитоплазмы, где находили многочисленные митохондрии (8-10), развитый аппарат Гольджи, элементы гранулярного ретикулума, полирибосомы.

Четвертый тип - недифференцированные клетки размером 9-12 мкм, контуры которых обычно гладкие. Ядерно-цитоплазматическое отношение 0,4-0,5. Цитоплазма умеренной электронной плотности содержала свободные рибосомы, эндоплазматический ретикулум, различные вакуоли: Часто встречались фагосомы, цитосегресомы, мультивезикулярные тельца, единичные микротрубочки.

Клеточная популяция лимфы коров серологически отрицательных в РИД к антигенам ВЛКРС из неблагополучного по лейкозу хозяйства представлена всеми перечисленными выше клетками. Кроме того, довольно часто обнаруживали крупные клетки диаметром 9-11 мкм с ядерно-цитоплазматическим отношением 0,6 - 0,7, которые имели большое количество полисом и развитую (по сравнению с лимфоцитами) сеть эндоплазматического ретикулума. Ядро таких клеток крупное, расположено эксцентрично. Как правило, их называют "плазматизиро-ванные" лимфоциты.

В лимфоцитах лимфы животных из неблагополучного хозяйства наблюдали единичные ядерные карманы несложной архитектоники, которые представляли собой пузырьковидные образования, состоящие из фрагментов цитоплазмы, ограниченные ядерной мембраной.

В нашем случае обнаружение у некоторых животных (2 из 5) лим-фоплазмацитов и единичных клеток с ядерными карманами может свидетельствовать о скрытом, на данный момент, носительстве вируса лейкоза крупного рогатого скота.

2.2. Ультраструктурные особенности лимфоидных клеток крови и лимфы крупного рогатого скота в динамике лейкозного процесса.

Важным моментом взаимодействия онкогенных вирусов и клеток хозяина является причастность их к механизмам клеточной пролиферации. В настоящее время считают, что экспрессия ВЛКРС в организме крупного рогатого скота является антигенным стимулом, запускающим пролиферацию В-лимфоцитов.

На молекулярно-генетическом уровне установлена разница между инфицированными и опухолевыми клетками по локализации копий провируса в хромосомах лимфоидных клеток. Имеются сведения о различиях в экспрессии провируса ВЛКРС, лейкозоассоциированных анти генов, клеточного гена С-тус в процессе лейкозогенеза и в опухолях, индуцированных ВЛКРС (Gupta P. et al., 1986; Ruzmak J. et al, 1993, Tambasco A. et al, 1996, Levkut M. et al, 1996, Куделева Г.В., 1991; Чев-кина E.M., 1997). Остается неясным вопрос взаимосвязи молекулярно-генетических и иммунологических перестроек с изменениями морфологии основных клеточных органоидов клеток-мишеней в процессе лейкозогенеза.

2.2.1. Электронно-микроскопические особенности лимфоидных клеток крови при онкорнавируспой инфекции.

В связи с выяснением вопроса о том, являются ли серологически позитивные к антигенам ВЛКРС животные потенциальными претендентами в группу больных животных, нами исследованы коровы черно-пестрой породы, серологически положительных в РИД из неблагополучных по лейкозу хозяйств (табл. 1).

Популяция лимфоидных клеток, как и у животных серологически отрицательных в РИД, состояла из малых светлых лимфоцитов и единичных больших лимфоцитов с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением. Лимфоциты инфицированных животных имеют изменения в ядре, мембранном аппарате клеток, митохондриях. Выявлены расслоения и миелинизация мембран ядра, образование фибриллярных труктур, сформированных в кольцевидные или пакетообразующие комплексы. В цитоплазме часто выявляли аппарат Гольджи, более развитую эндоплазматическую сеть. Самым значимым для онкорнавирус-ной инфекции является наличие лимфоидных клеток с патологическими изменениями в ядрах ядерными карманами, ядерными инвагинатами и ядерными вакуолями. Ядерные карманы были однообразной формы, в виде небольших пузырьков. Иногда встречались несложные комплексы из двух ядерных карманов.

Представляло интерес проследить за развитием спонтанной он-корнави-русной инфекцией на крупном рогатом скоте из хозяйства с высокой общей инфицированностью стада: 62,5% - инфицированных ВЛКРС; из них 10,2% - больных лейкозом и 12,8% - подозрительных на заболевание. С инфекцией вируса лейкоза у крупного рогатого скота ассоциировано три состояния: бессимптомная инфекция, гематологическая и опухолевая формы болезни. Мы провели пятилетние наблюдения за четырьмя группами животных:

1. Животные положительные в РИД к антигенам ВЛКРС с нормальной гематологией - 27 гол.

2. Животные положительные в РИД с нормальным лейкоцитозом и относительным лимфоцитозом - 30 гол.

3. Животные положительные в РИД со слабо выраженным лейко-щтозом и лимфоцитозом (подозрительные на лейкоз) - 20 гол.

4. Животные положительные в РИД с выраженным лейкоцитозом и лимфоцитозом (больные лейкозом) - 15 гол.

Гематологические и электронно-микроскопические исследования представлены в табл. 1 (группа 3, 4).

Продолжительный период наблюдения позволил констатировать, что длительность онкорнавирусной инфекции коррелировала с нарастанием ультраструктурных изменений в клетках-мишенях для ВЛКРС-лимфоцитах крови. Если первоначально животные первой подгруппы (За) не имели ядерных карманов в лимфоцитах или имели их лишь у небольшого (до 1,13±0,24%) количества клеток, то через 2-3 года количество клеток с ядерными аномалиями возросло в 2-4 раза у 8 коров, у 19 гол. показатели оставались стабильно одинаковыми (1,2-1,4%), четыре животных с повышенным лейкоцитозом и лимфоцитозом до уровня подозрительных или положительных на лейкоз показателей (14,2-16,7 тыс./мкл) были переведены в третью подгруппу (Зв). Количество лимфоцитов с ядерными карманами с 1,4-1,7% возросло до 5,7-8,2%.

У животных второй подгруппы (36) количество лимфоидных клеток с ядерными карманами увеличилось, но осталось в пределах значимости для клинически здоровых, инфицированных животных (2,95±0,95%). Из этой группы выбыло два животных с положительной на лейкоз гематологией (18,1 - 21,5тыс./мкл).

Анализируя результаты исследований лимфоцитов животных третьей (Зв) и четвертой группы (ЯК 6,67 ± 1,2), следует сказать, что 50% животных выбраковано как положительные по гематологии на лейко: У оставшихся животных, несмотря на повышение лейкоцитоза и относительного лимфоцитоза, количество клеток с маркерными аномалиями лейкозных лимфоцитов или оставались практически на одном уровне, или повышалось перед гибелью животного. Возможно альтернативное объяснение данного факта:

1. Несмотря на возрастающий лейкоцитоз и лимфоцитоз нарастание лимфоцитов с патологическими изменениями, ядерными аномалиями, имеет индивидуальные пределы, зависящие от иммунобиологического статуса отдельной особи или ряда других экзогенных и эндогенных факторов.

2. Увеличивающийся лейкоцитоз может быть связан с доброкачественной В-клеточной пролиферацией лимфоцитов.

Не без оснований можно предположить, что клинически здоровые инфицированные животные с высоким процентом лимфоцитов (3-6%) с ядерными карманами представляют собой группу "повышенного риска" к заболеванию лейкозом и возможно такое состояние назвать "предлей-козом".

2.2.2. Субмикроскопическая морфология лимфоцитов крови и лимфы крупного рогатого скота при гемобластозах.

Анализ данных литературы показал, что до настоящего момента не было специальных исследований по сравнительному изучению лимфоидных клеток периферической крови и центральной лимфы крупного рогатого скота при гемоблатозах. В связи с вышеизложенным крайне важным являлось не только обнаружение патологических изменений в лейкозных клетках, но и доказательство их специфичности, стабильности присутствия в клетках, возможности определения количественных критериев малигнизации лимфоидных клеток в течении развития и становления лейкозного процесса. Указанные моменты прослежены на больных гемобластозами животных.

Хронический лимфоидный лейкоз (ХЛЛ).

Это наиболее часто встречающаяся форма лейкоза у крупного рогатого скота в возрасте 4-8 лет. Хронический лимфолейкоз наблюдали у 45 коров, из которых 20 имели начальную стадию, 15 - развернутую и 10 - терминальную стадии болезни. Количество лейкоцитов в 1 мкл крови колебалось от 12 тыс./мкл до 365 тыс./мкл и более при наличии в лейко-формуле 7-14% пролимфоцитов, а в терминальной стадии - до 50% лим-фобласгов, недифференцированных и атипичных клеток.

Начальная стадия лимфолейкоза характеризуется наличием в пе-рифери-ческой крови в основном малых и средних лимфоцитов иногда обнаруживали единичные пролимфоциты и лимфобласты. Ультраструктура преобладающего числа клеток не имела существенных отли-ий от таковых у здоровых животных. Поверхность лимфоцитов преимущественно гладкая или с небольшим числом выступов. Клетки с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением. Ядро расположено эксцентрично. В цитоплазме концентрируются органеллы с измененной ультраструктурой. Митохондрии (3-10 на клетку) часто имеют набухшие, деградированные или полностью редуцированные кристы. Часто встречается комплекс Гольджи и центриоли. У единичных клеток находили длинные профили эндоплазматического ретикулума. Цитоплазма богата рибосомами и полисомами. Ядрышко преимущественно большое, рыхлое. Постоянно наблюдали лимфоидные клетки с полиморфизмом ядер, наличием ядерных карманов (в среднем у 8,1 ± 1,6 % клеток) простой пузырьковидной формы. В отдельных лимфоцитах наблюдали 1-3 ядерных кармана.(Табл. 4)

Развернутая и терминальная стадии ХЛЛ. В отличие от начальной в развернутой и терминальной стадиях ХЛЛ наряду с увеличением общего числа лейкоцитов и лимфоцитов (30,0 тыс/мкл - 365,6 тыс./мкл), значительно увеличивается количество незрелых лимфоидных клеток (до 50%), лимфобластов и недифференцированных (до 5%), ридеровских форм клеток. Среди всех обнаруженных типов клеток увеличилось число лимфоидных клеток с выраженными изменениями субмикроскопического строения важнейших клеточных органелл. Для лейкозных лейкоцитов были характерны прогрессирующие изменения в цитоплаз-матических органеллах. Как в малых, так и незрелых, недифференцированных клетках и бластах находили центриоли, пиноцитозные пузырьки и аппарат Гольджи, который нередко был гипертрофирован, состоял из больших везикул и канальцев. В одной клетке находили 2-4 пластинчатых комплекса. Характерные аномалии обнаруживали в митохондриях. Наряду с типичными митохондриями в одной и той же клетке наблюдали гигантские формы с обычной структурой или выраженной диском-плексацией и деструкцией крисг. В митохондриях часто встречались миелиноподобные структуры, образованные из мембран крист или

Рис. №1 Ультраструктурные изменения в лимфоцитах при онкорнавирусной инфекции и хроническом лимфолейкозе: а,б - ядерные карманы; в -миелиноподобные структуры) г - полиморфизм МИТОХОНД-рий.х

Рис №2, 3 Развернутая стадия хронического лимфолейкоза. Увеличение перинуклеарного пространства, разнообразные комплексы ядерных карманов. X 40 ООО, 18 ООО внешней мембраны. У небольшого числа клеток мембраны шероховатого ретикулума были большой протяженности и располагались параллельно ядерной мембране. Такие клетки напоминали "плазматизированные" лимфоциты.

Наиболее значительные изменения обнаружены в ультраструктуре ядра, его мембране. Ядра клеток преимущественно имели неправильную форму с выпячиваниями и углублениями разнообразной конфигурации. Ядерные мембраны дуплицировались и участвовали в образовании аномалий 3 видов: ядерные карманы, ядерные инвагинаты и фибриллярные комплексы. Аномалии сочетались с локальным расширением перинуклеарного пространства.

Самым существенным отличительным признаком лейкозных лимфоцитов, как и при начальной стадии, было наличие в них многочисленных ядерных карманов. Количество их возрастало - в развернутой стадии 19,52 ± 5,05 % клеток, в терминальной - 28,01 ± 9,08%. Стенк; ядерного кармана формировалась внешней и внутренней ядерными мембранами и слоем гетерохроматина толщиной 25-50 нм, который располагался между двумя мембранами. Эта слоистая структура инва-гинировала в цитоплазму или ядро клетки и окольцовывала их фрагменты с различными органеллами: рибосомами, вакуолями, цистернами шероховатого эндоплазматического ретикулума, хроматином. Ядерные карманы разных размеров имели вид пузырьков, петель, рукавов, фила-ментов или кеглевидную форму.

При развернутой и терминальной стадиях болезни в лимфоцитах выявляли комплексы подобных патологических структур, состоящие из 2-5 ядерных карманов, или отдельные аномалии от 2 до 6 на клетку.

Второй вид часто встречающихся аномалий - это так называемые ядерные инвагинаты, которые образовывались за счет выпячивания внутренней мембраны ядра в кариоплазму и формирования петлевид-ных или пузырьковидных структур. В ядрах лимфоцитов больных животных значительно увеличивалось количество ядрышек, которые выглядели гомогенными, мелкоточечными или кольцевидными.

Недифференцированные клетки имели крупное, чаще бобовидной формы, ядро с нежно-зернистым эухроматином и электронно-плотным тонким слоем гетерохроматина. На периферии ядра находили одно или несколько рыхлых гомогенных ядрышек. Незначительная по ширин< цитоплазма содержала много рибосом, крупных митохондрий с четким рисунком крист. Аппарат Гольджи представлен скоплением пузырьков.

Лимфобласты - крупные клетки с ядром овальной или округлой формы. Мелкозернистый хроматин распределен равномерно, с незначительным уплотнением околоядерной мембраны. Часто выявляли четко контурированные ядрышки. В цитоплазме: 8-10 митохондрий. Ядерные карманы обнаруживали как в малых лимфоцитах, так и недифференцированных клетках - пролимфоцитах, лимфобластах. Наши исследования показали, что имеется корреляция наличия лимфоидных клеток с ядерными карманами с тяжестью течения лейкозного процесса, но нет прямой корреляции между лейкоцитозом и числом клеток с ядерными карманами.

Лимфосаркома

Исследования проведены на 13 коровах с лимфосаркомой. Общее количество лейкоцитов составляло 5,2 тыс/мкл крови при содержании в лейкоформуле 54-84% лимфоцитов, 5-12% лимфобластов, незрелых и атипичных лимфоидных клеток.

При лимфоцитарной лимфосаркоме основную массу лимфоидных клеток периферической крови составляли малые и средние лимфоциты, редко большие лимфоциты и двухъядерные клетки Ридера. Клеточная поверхность лимфоцитов преимущественно гладкая, реже с ворсинками. В лимфоидных клетках при лимфосаркоме находили те же изменения, что и при ХЛЛ. В цитоплазме регулярно выявляли фибриллярные комплексы у ядерной мембраны, мембран клетки и митохондрий, развитый аппарат Гольджи. Выявляли изменения митохондрий, кольцеобразную деформацию крист, вакуоли и профили эндоплазматического ретикулу-ма. В цитоплазме - большое количество рибосом. Значительные изменения обнаруживали в ядрышках. Характерным признаком было обнаружение ядерных телец, которые не выявляли при ХЛЛ. Они были различной формы: кольцевидные, полулунные, трехслойные, ламелляр-ные, и различных типов: фибриллярные, гранулярные, тубулярные.

Пролимфоцитарная и лимфобластная лимфосаркома. При этих заболеваниях в крови циркулирует большое число пролимфоцитов, полиморфных недифференцированных клеток, бластов, "лимфосаркомных" опухолевых клеток больших размеров. Они имели своеобразную морфологию ядра - большого, округлого, с инвагинатами, но чаще с изрезанным или причудливо очерченным профилем. Встречаются крупные клетки с "конволютными" ядрами. Хроматин в них имел своеобразное распределение - узкий, тонкий ободок гетерохроматина и широкий аморфный эухроматин. Почти постоянно выявляли 1-4 рыхлых ядрышка, ядерные тельца. Ядерные карманы - у 9,7 ± 4,6 % клеток. В цитоплазме мало рибосом, митохондрий 4-6, увеличенное количество вакуолей, развитый аппарат Гольджи. Обнаруживали также мультиве-зикулярные тельца и тубулоретикулярные структуры.

Острый лимфобластный лейкоз (ОЛБЛ)

Встречается у крупного рогатого скота реже, чем ХЛЛ и в более молодом возрасте (до 5 лет). Лимфобластный вариант лимфоидного лейкоза характери-зовался острым течением, высоким лейкоцитозом (150-450 тыс./мкл) и наличием в лейкоформуле до 50% лимфобластов. В начальной стадии ОЛБЛ лейкоцитоз был незначительным - до 30-70 тыс./мкл, но лимфобластов было 30-35 %. Лимфобластный лимфолейкоз характеризовался наличием среди лимфоидных клеток крови большого числа клеток с размерами и субмикроскопической морфологией лимфобла-стов и единичными гигантскими лимфоидными клетками с низким ядерно-цитоплазматическим отношением.

Они имели обильную электронно-светлую цитоплазму, значительное число свободных рибосом и отдельные полисомы, множество канальцев гранулярной эндоплазматической сети, 8-12 митохондрий с просветленным матриксом и разнообразной архитектоникой крист: четко конту-рированые, деструктурированные, с нарушенной комплектацией, нередко миелиноподобной упаковкой. На экваториальные срезах клеток выявляли хорошо развитый комплекс Гольджи, в его зоне 1-2 цен-триоли, электронно-плотные гранулы, рассеянные по всей цитоплазме, пиноцитозные пузырьки. Часто в лейкозных клетках при ОЛБЛ находили рибосомо-пластинчатые комплексы.

Большое округлое или овальное ядро было в центре клетки или эксцентрично. Оно содержало аморфный эухроматин и узкую примем-бранную зону гетерохроматина. Встречаются клетки (единичные или до 15%) с необычно причудливо изогнутым "конволютным" ядром; 1-2 крупными ядрышками с хорошо выраженной нуклеоплазмой. Постоянно присутствовали многочисленные ядерные карманы, инвагинаты. При лейкоцитозе 40-70,5 тыс/мюх (5 животных) ядерные карманы выявляли у 23,2 ± 1,56% клеток, при высоком лейкоцитозе (80 тыс/мкл и более - 8 гол.) - у 35 ± 4,5% клеток.

Пролимфоцитарный лейкоз (ПЛЛ)

Больные с подобной формой лейкоза встречались редко. Нами исследованы лимфоидные клетки от пяти животных с общим лейкоцитозом 30-90 тыс/мкл с наличием более 15% пролимфоцитов.

Лимфоидные клетки имели ультраструктурные параметры и размеры средние между лимфоцитом и лимфобластом. Цитоплазма содержит довольно полный набор органелл, немногочисленные полирибосомы, короткие профили эндоплазматического ретикулума, комплекс Гольджи с развитыми мембранной и везикулярной частями, 12 центриоли. Ядро правильной округлой формы с хорошо выраженными гомогенными или сетчатыми 1 -2 ядрышками. В перенуклеарной зоне встречаются ламиллярные комплексы и лизосомоподобные, электронно-плотные гранулы. В единичных клетках ядра с изогнутой конфигурацией типа "конволютных". У 11,5 ± 3,1% клеток находили ядерные карманы с ядерным или цитоплазматическим содержимым (табл. 4).

2.2.3. Ультраструктура лимфоидных клеток лимфы при хроническом лимфолейкозе и лимфосаркоме.

Электронно-микроскопическое изучение клеток лимфопоэза и в первую очередь лимфы началось в конце семидесятых годов. Была дана ультраструктурная характеристика лимфоцитов лимфы здоровых мелких и лабораторных животных (кошек, крыс, мышей) и при некоторых незаразных заболеваниях. Более пристальное внимание исследователей было направлено на изучение лимфоцитов лимфы человека. Сведений об ультраструктуре лимфоцитов лимфы при гемобластозах в доступной литературе нами не обнаружено.

В этой связи первоначально нами изучена ультраструктура натив-ных, некультивированных лимфоцитов лимфы при спонтанных хроническом лимфолейкозе и лимфосаркоме. Изучали клетки лимфы 12 коров черно-пестрой породы, больных в начальной, развернутой и терминальной стадиях лимфолейкоза. Четыре коровы в начальной стадии лейкоза с лейкоцитозом в крови до 35 тыс/мкл, в лимфе имели незначительные изменения, общее количество клеток немного превышало норму (3-5 тыс/мкл), в лимфограмме увеличивался процент пролимфоцитов (до 10%) и клеток Ридера.

При электронно-микроскопическом изучении клеточной популяции лимфы крупного рогатого скота больного начальной стадией КИЛ установлено, что лимфа содержит четыре варианта клеток лимфоидного ряда, которые обнаруживали и у здоровых животных: малые узко или широкоцитоплазменные лимфоциты с ядерно-цитоплазматическим отношением в пределах 0,85 - 0,97; крупные клетки с низким ядерно-цитоплазматическим отношением (0,4 - 0,61); недифференцированные бластные клетки размером 10-12 мкм и более, ядерно-цитоплазматическое отношение 0,4 - 0,45. Следует отметить, что наряду с "нормальными" лимфоцитами, преобладали клетки с более многочисленными внутрицитоплазматическими структурами с видимыми качественными и количественными отличиями в компановке и архитектонике отдельных органоидов. Так клеточные поверхности всех четырех типов чаще неровные, с довольно многочисленными филоподиями. В цитоплазме часто находили органеялы с измененной структурой. Митохондрии лимфоцитов нередко имели просветленный матрикс с деструкцией крист. В матриксе крупных митохондрий обнаруживали миелиноподоб-ные структуры, которые не выявляли в нормальных клетках. В некоторых лимфоцитах (до 3%) находили ядерные.карманы на разных стадиях формирования.

В развернутой и терминальной стадиях исследовали 8 коров с уровнем лейкоцитоза в крови свыше 100 тыс/мкл, в лимфе содержание форменных элементов увеличивалось по сравнению с нормой в 3-4 раза (10-15 тыс/мкл), бластов было более 10%. В отличие от начальной стадии чаще встречали клетки с дефектами ядерных мембран, ядерными карманами. Десгруктированные ядерные мембраны формировали мие-линоподобные структуры, фибриллярные комплексы. Ядерные карманы находили у 3-4% лимфоидных клеток, ядерные инвагинаты и вакуоли. Мелкие пузырьковидные или сложные комплексы ядерных карманов находили от 1 до 5 на ядро лимфоцита. Они имели ядерное и цитоплаз-матическое содержимое, внешнюю (цитоплазматическую) и внутреннюю (ядерную) локализацию.

В наших опытах были животные больные лимфосаркомой (10 гол). Гема-тологическими исследованиями установлено, что в начале болезни отмечается умеренный и перемежающийся лейкоцитоз (10-15 тыс/мкл) с относительным или абсолютным лимфоцитозом, эозинофи-лия, моноцитоз. При обострении процесса наступает лейкемизация (в 10-12%) случаев). Общий лейкоцитоз достигает 15-63 тыс/мкл. Наиболее демонстративные изменения при лимфосаркоме наблюдали в лимфе, так кале типичные лимфосаркомные клетки обнаруживали в ней чаще, чем в крови; при обострении их число достигало 50-86%. Общее содержание клеток в лимфе также резко возрастает и обычно превышает число лейкоцитов в крови. В зависимости от формы лимфосаркомы в лимфе преобладали лейкозные лимфоциты (ЛЛС) или бласты (ЛБЛС). В обоих случаях наблюдали большое количество крупных или очень больших (свыше 18 мкм) опухолевых клеток. Находили клетки с 2-5 лопастными ядрами. В узком ободке цитоплазмы выявляли полирибосомы, 2-8 митохондрий конденсированного типа, гипертрофированные аппарат Гольджи.

Следующий вариант лимфоцитов представлял собой клетки с небольшим округлым ядром и широким ободком цитоплазмы, которая содержала множество полирибосом, элементы гранулярного ретикулу-ма, формировавшего рибосомо-пластинчатые комплексы и единичные микрофибриллы. В небольших митохондриях находили дезориентацию крист и уменьшение гранулярного компонента матрикса. В таких клетках обнаруживали структуры, которые никогда не находили в нормальных лимфоцитах. В частности, к ним относятся кристаллоидные тельца.

Типичными представителями редко встречающихся клеток являлись лимфоциты, ядро которых имело извилистые контуры, в центре -гипертрофированные ядрышки неправильной формы, часто выявляли ядерные тельца - глобулярные, фибриллярные и сочетанного типа.

Часто встречались клетки с ядром неправильной формы, с неровными контурами клеточных мембран и многочисленными отростками, типа псевдоподий. Последние считают типичным признаком лимфосаркомы. В таких клетках находили ядерные карманы. Митохондрии нередко принимали необычную форму с продольной ориентацией крист.

Таким образом, по сравнению с нормой лимфоциты лимфы коров, больных различными формами лейкоза, имеют определенные отличия, заключающиеся в изменении количества отдельных структур: полирибосом, мембран ретикулума, клеточных отростков и появление органелл, которые не выявлялись в нормальных лимфоцитах: миелиновые структуры, ядерные карманы, ядерные тельца, кристаллоидные тельца, канальцевые структуры. Важнейшим признаком злокачественности клеток является полиморфизм, который наиболее ярко выражен при гема-тосаркомах.

При ХЛЛ трансформированные и опухолевые клетки накапливаются в сосудистом пуле периферической крови, а при лимфосаркомах в центральной лимфе. О накоплении лейкозных лимфоцитов в периферической крови говорит присутствие в ней большого количества клеток с ядерными карманами. В лимфе эти показатели значительно меньше, но лимфа не является интактной. А при лимфосаркоме изменения в лимфоцитах лимфы превалируют над таковыми лимфоцитов крови.

Рассматривая возможности цитологического диагноза лейкоза с помощью электронного микроскопа можно выделить две группы признаков злокачественности: 1) беспорядочность созревания различных органелл; 2) патология клеточных органелл. Мы считаем, что феномен "ядерные карманы", постоянно обнаруживаемый в лимфоцитах больных лейкозом животных, является стабильным признаком и может быть маркером лейкознотрансформированных клеток.

Проведенные нами исследования позволяют заключить, что электронная микроскопия дает возможность проследить на субмикроскопическом уровне процесс лейкозогенеза и является полезной при дифференциальной диагностике лейкозов.

2.2.4. Электронно-микроскопические сведения о лимфоцитах крови при болезнях нелейкозной этиологии.

Для определения патогномоничности установленных при спонтанном лейкозе ультраструктурных аномалий лимфоцитов крови крупного рогатого скота мы провели изучение ультраструктуры лимфоцитов крови при экспериментально индуцированной аденовирусной инфекции и болезнях незаразной этиологии - маститах, эндометритах, травматических ретакулитах, сопровождающихся лейкемоидными реакциями.

Проведенные исследования показали, что при клинически выраженной экспериментальной аденовирусной инфекции лимфоциты периферической крови телят имели вид "нормальных", интактных лимфоидных клеток. В их популяции преобладали малые лимфоциты с гладкой поверхностью, большим, занимающим основную площадь клетки, ядром, овальной или округлой формы. Узкий ободок цитоплазмы включал три-четыре мелкие, овальные митохондрии, единичные пи-ноцитозные пузырьки, рибосомы и полирибосомы. Крупные недифференцированные клетки встречались в единичных случаях. В лимфоидных клетках отсутствовали ядерные аномалии или подобные им структуры.

При болезнях с лейкемоидной картиной крови лимфоциты, также как и у клинически здоровых серологически отрицательных в РИД животных из благополучных по лейкозу хозяйств, были интактны. Ни в одном случае мы не обнаруживали ядерных аномалий, карманов, мембранных комплексов в цитоплазме, деструктивных изменений в митохондриях и аппарате Гольджи.

Таким образом, анализируя данные по сравнительному изучению ультраструктуры лимфоидных клеток при лейкозе и других болезнях вирусной и незаразной этиологии можно сделать вывод о специфичности ядерных аномалий лимфоцитов для лейкозной трансформации клеток при гемобластозах крупного рогатого скота. Однако, выявленные патологические изменения ядер лимфоцитов не являются строго специфичными для данной патологии, а обнаруживаются при лейкозах человека и лабораторных животных. То есть они патогномоничны в целом для лейкозного процесса различной этиологической природы.

2.3. Исследование лимфоцитов крови и лимфы при экспериментально индуцированном лейкозе крупного рогатого скота

Несомненным подтверждением этиологической роли вируса лейкоза крупного рогатого скота в развитии гемобластозов служат опыты по экспериментальному воспроизведению онкорнавирусной инфекции и лейкозов путем инфицирования крупного рогатого скота, овец и коз (Klintevall К., 1995, Rulka I., 1996, Бусол В.А. и соавт., 1995, Гулюкин М.И, и соавт., 1995, Симонян Г.А., 1996, Кунаков A.A. 1996).

В наших исследованиях предметом изучения служили лимфоциты крови и лимфы 15 голов крупного рогатого скота бурой латвийской, черно-пестрой, бушуевской пород.

Ультраструктура лимфоидных клеток изучалась in vivo и in vitro.

Эксперимент на крупном рогатом скоте бурой латвийской породы был поставлен в институте микробиологии АН Лат. ССР им. Кирхин-штейна. На момент исследования животные находились в опыте 4 года, имели удовлетворительное клиническое состояние. В крови экспериментальных животных было 13,5-21,5 тыс/мкл, в лимфе - 7,1-15 тыс/мкл лейкоцитов и 82-84% лимфоцитов, недифференцированных клеток 2-19%.

При электронно-микроскопическом изучении установлено, что лимфоидные клетки крови экспериментальных животных бурой латвийской породы представлены в основном лимфоцитами небольших и средних размеров, реже встречались крупные недифференцированные клетки. Преобладающий тип клеток - малые лимфоциты - были электронно-светлыми и электронно-темными с узким и широким ободком цитоплазмы. Второй тип - большие лимфоциты с широким ободком цитоплазмы. Ядро обычно расположено эксцентрично, имеет изрезанный профиль, неравномерно окружено цитоплазмой. В цитоплазме находили до 10 митохондрий конденсированного типа, единичные мембраны

Таблица

ДАННЫЕ КОМПЛЕКСНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ИНФИЦИРОВАННОГО ВИРУСОМ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ВЛКРС

Инв. № Кол-во лейкоцитов, тыс/мкл РИД %Я1 К на 250 клеток в культ. леик.

I. Экспериментально инфици рованные животные

1308 17.6 14.8 18.2 19.1 + 3.5 4.5 4.8 6.0 +

350 9.0 10.6 10.5 11.6 9.4 + 5.0 5.0 7.3 7.2 8.7 +

377 21.8 34.2 40.0 53.1 - + 6.3 8.0 9.1 9.5 - +

1314 11.7 30.2 75.5 100.0 - + 5.7 5.7 16.4 12.4 - +

II. иммунизированные перед заражением

1311 5.2 6.0 6.3 7.0 - - 0 0 0.7 0.8 -

1319 4.7 5.4 10.4 6.8 7.0 + 0 1.2 2.0 5.9 6.0 +

1304 9.8 8.4 18.2 17.2 9.0 + 2.0 2.0 6.3 10.5 10.0 +

349 15.9 17.6 17.2 19.8 15.2 + 3.4 5.6 11.7 10.2 10.4 +

I группаМ±ш 8.78±1.6 р<0.

II группа М±ш 6.98 + 2.0 р<0.01 №349-ХЛЛ; №377-ХЛЛ; №1314-ЛС. Ми =0. ретикулума, лизосомальные структуры.Как в малых, так и в больших лимфоцитах часто выявляли центриоли, пиноцитозные пузырьки и пластинчатый аппарат. Характерные аномалии обнаруживала в цитоплаз-матических органеллах, отвечающих за энергетический обмен клеток - в митохондриях. Часто находили гигантские митохондрии с обычной структурой или дискомплексацией и деструкцией крист, миелиноподоб-ными структурами. Наиболее существенные изменения, как и при спонтанном лейкозе, находили в ультраструктуре ядра лимфоцитов крови экспериментальных животных. Значительно увеличено количество ядрышек, по сравнению с нормой; они гомогенные, точечные и кольцевидные. По литературным данным, разнообразная структура ядрышек соответствует их функциональному состоянию. Ядерные мембраны часто дуплицировались и образовывали 3 вида аномалий: 1) ядерные вакуоли, 2) фибриллярные комплексы и 3) ядерные карманы. Типичные ядерные карманы находили в большом количестве в малых и больших лимфоцитах. Число клеток с этими аномалиями равнялось в среднем 18,1%. У трех-четырех процентов клеток обнаружили не только изрезанный профиль ядра, но и углубления, которые формировали 2-4 лопастные ядра, аналогичные по структуре клеткам Ридера.

Клетки лимфы экспериментальных животных были более разнообразными по размерам и структуре лимфоцитами с большим числом крупных недифференцированных клеток. Ядерные карманы в лимфоцитах лимфы встречались значительно реже, чем в лимфоцитах крови -лишь у 4,1% клеток. В лимфе находили огромные опухолевые клетки с причудливым очертанием ядра, в котором выявляли 1-5 ядерных карманов. При культивировании лейкоцитов крови и лимфы обнаруживали вирус лейкоза крупного рогатого скота. Для воспроизведения лейкоза у черно-пестрого крупного рогатого скота опыт поставлен на 9 животных, разделенных на 2 группы. Наблюдение продолжалось 5,5 лет. 1 группа - четыре животных, были заражены материалом, содержащим BJ1KPC. 2 группа - 4е животных первоначально иммунизирована лейко-зоспецифическим иммуногеном, а через год также заражена культу-" ральной жидкостью. Одно животное заразилось спонтанно.

При качественных и количественных субмикроскопических исследования установлено, что у всех вошедших в опыт животных перед заражением BJIKPC и иммунизацией лимфоциты имели ультраструктуру нормальных клеток. В них отсутствовали маркерные аномалии в ядрах -ядерные карманы, а при культивировании лейкоцитов in vitro не нахо-, дили ВЛКРС. Через три месяца была выявлена онкорнавирусная инфекция. К 7-9 месяцу у восьми животных было отмечено повышение содержания лимфоидных клеток до подозрительных, а далее по опыту до положительных на лейкоз значений. Три животных (№ 377, № 1314, № 349) погибли от XJIJI и лимфобластной лимфосаркомы.

Через год после заражения в лимфоидных клетках инфицированных животных появились ультраструктурные изменения, характерные для аналогичных клеток животных серологически положительных к антигенам ВЛКРС, т.е. единичные ядерные карманы (до 1%), а в культивированных лимфоцитах единичные зрелые и незрелые частицы ВЛКРС. У этих животных наблюдали увеличение ультраструктурных изменений в важнейших клеточных органеллах, а у двух из первой и одного животного из второй группы они соответствовали таковым при начальной и развернутой стадиях ХЛЛ. Самые показательные изменения, как и при спонтанном лейкозе, находили в ядре лимфоцитов исследованных животных. Причем у всех животных первой группы установлены имеющие тенденцию к увеличению стабильно высокие показатели коэффициента встречаемости лимфоидных клеток с ядерными карманами. У двух животных (№№ 377, 1314) из первой группы наблюдали характерные для развернутой стадии изменения не только лимфоцитов крови, но и лимфоцитов лимфы, особенно у животного № 1314с 1 посмертно подтвержденным диагнозом лимфосаркомой. Количество клеток с ядерными карманами прогрессивно увеличивалось на протяжении трех лет. К моменту гибели или убоя составляло 8,7-12,4%. В течение четырех лет у животных первой группы (№№ 350, 377, 1314) выявляли вирусные частицы.

У иммунизированных животных (вторая группа) в лимфоцитах трех из четырех животных обнаруживали маркерные аномалии - ядерные карманы, количество которых было также крайне высоким 6,010,4% и имело четкую тенденцию к увеличению, а одно животное (МЬ 349) пало с характерной клиникой лейкоза. Гистологический диагноз -хронический лимфолейкоз. Анализ статистических данных показывает, что пропорционально увеличению или стабильности гематологических показателей, характерных для лейкоза, имеет место сохранение определенного уровня или увеличение количества клеток с ядерными карманами. Это позволяет говорить не только об аномальности морфогенеза ядерных оболочек и структурной организации хроматина, но и функциональных изменениях в ядрах, в процессе развития онкорнавирусной инфекции и становлении лейкозного процесса.

У животных бушуевской породы после заражения ВЛКРС, наблюдали лишь онкорнавирусную инфекцию. Лимфоциты крови имели ультраструктуру аналогичных клеток сероположительных животных.

Обобщая полученные данные можно заключить, что развитие экспериментального лейкоза сопровождается увеличением содержания лимфоидных клеток, имеющих ядерные аномалии и ультраструктурные изменения других важных органелл клеток-мишеней для опухолевой трансформации. Развитие лейкоза происходит на фоне накопления лей-козотрансформированных клеток в периферической крови и изменениях в лимфоцитах центральной лимфы.

Таким образом, впервые дана сравнительная ультраструктурная характеристика лимфоцитов крови и лимфы крупного рогатого скота бурой латвийской, черно-пестрой и бушуевской пород при индуцированном лейкозе. Ультраструктурные изменения в лимфоцитах крови и лимфы экспериментально инфицированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота были аналогичны таковым при развернутой и терминальной стадиях спонтанного хронического лимфолейкоза и лимфосар-комы.

2.4. Электронно-микроскопическая характеристика лимфоцитов крови и лимфы больного гемобластозами и здорового крупного рогатого скота in vitro.

2.4.1. Количественная и качественная характеристики краткосрочных лейкоцитарных культур крови коров, больных гемобластозами.

Многочисленные зарубежные и отечественные ученые получили убеди-тельные доказательства тому что, BJIKPC не обнаруживается в! свежевыделенных лейкоцитах периферической крови больных животных. Методом электронной микроскопии удалось выявить вирусные частицы лишь в культивированных in vitro лейкоцитах крови крупного рогатого скота, больного лейкозом (Miller J. et al., 1969; Olson С., 1972; Кукайн P.A. с соавт, 1972; Валихов А.Ф., 1974, Шишков В.П., 1989; Меньшикова З.Н. 1991-98, Касьян E.H. 1997). Доказано, что клетками-мишенями вируса лейкоза являются B-лимфоциты. Позднее появились работы, свидетельствующие о том, что вирус обнаруживали как в В-лимфоцитах, так в Т-лимфоцитах и моноцитах (Prem Р. et al., 1977; Vogt К., 1984; Ytcney J. et al., 1992; Ishiguro M. et al., 1994; Wu D. et al. ,1996; Schwartz I. et al., 1996). Вместе с тем Buehrung G. et al., (1994) делают заключение, что ВЛКРС имеет более широкий тропизм и заражает также эпителиальные клетки вымени. Однако не существовало единого мнения о сроках наибольшего выхода вируса из клеток. Кроме того, в литературе отсутствовали данные о зависимости стадий развития и форм болезни с вируспродукцией лейкоцитов крови. Учитывая изложенное, мы поставили задачу - изучить количественные и качественные изменения клеток краткосрочных лейкоцитарных культур коров больных различными формами гемобластоза, и на разных стадиях болезни.

Проведенными исследованиями установлено, что изученные культуры лейкоцитов крови при 24, 48, 72 ч. культивирования представлены1 в основном клетками лимфоидного ряда, встречались двухядерные клетки, гранулоцитарные и недифференцированные клетки. В зависимости от размера клеток, ядерно-цитоплазматического отношения и степени развития цитоплазматических органелл, клетки лимфоидного ряда разделены на 5 групп: 1 - малые светлые, 2 - малые темные лимфоциты, 3 - большие лимфоциты, 4 - лимфобластные клетки или недифференцированные, 5 - лимфоплазмоциты, имевшие ультраструктуру некультивированных лимфоцитов той же степени дифференцировки. При 24 ч. культивирования лимфоидных клеток было 60%, при 48 - 68%. При увеличении срока инкубации наблюдали дегенерацию клеток, в результате чего через 72 ч. лимфоидных клеток оставалось лишь 29%. При изучении вируспродукции клеток лейкоцитарных культур крови при начальной и терминальной стадиях лимфолейкоза и лимфосаркомы установлено, что самое большое число клеток, продуцирующих вирусные частицы, получено при 48-часовом культивировании для каждой группы животных. Количество вируспродуцирующих клеток при ХЛЛ и лимфосаркоме практически одинаковое - 27,9%; 28,4%. Не обнаружено разницы между вируспродукцией клеток при разных стадиях болезни: при начальной стадии этот показатель составлял 30,3%, при терминальной - 25,7%. Разница между этими показателями недостоверна.

Во всех вируспродуцирующих лейкоцитарных культурах крови больных животных лимфоциты в большом количестве имели патологические изменения в ядрах (ядерные карманы) и цитоплазматических ор-ганеллах. По механизму образования и ультраструктуре ядерные карманы были аналогичны обнаруженным в нативных некультивированных лимфоцитах.

Таблица №

Сравнительное изучение количественных изменений в культурах лейкоцитов крови и лимфы от коров, больных ХЛЛ в разные сроки культивирования

Показатели 24 ч. 48 ч. 72 ч. кровь лимфа кровь лимфа кровь лимфа

Соотношение 1,9:1 2,4:1 2,2:1 3,1:1 1:2,8 1: лимфоидных и других кле клеток, 8,3 4,0 28 13,1 3,7 0, продуцирующих

ВЛКРС лимит) 0,8-14,4 0,83-8,2 11-34,8 4,56-20,49 0-16,6 0 клеток с 11,6 3,6 9,6 2,8 1,4 2, ядерными карманами лимит) 4,1-19,5 0-5,5 3,3-14,2 4,1-6,1 0-5 0-7,

Количество вирусных 50,2 20,8 264 128, частиц (на ячеек сеток подложек)

Они были: 1) типичные и атипичные; 2) внешние и внутренние. Наибольший процент клеток с ядерными карманами был обнаружен при 24 часовом культивировании. При 72 ч. Культивировании этот показатель был минимальным (1,3-1,6%). При всех сроках культивирования обнаруживали клетки с клазматозом. Наибольший процент их выявляли в 48 часовых культурах. В цитоплазме находили рибосомо-пластинчатые комплексы, миелиноподобные образования, нарушение архитектоники митохондрий и аппарата Гольджи.

Следует отметить, что культуры лейкоцитов крови коров с лим-фолейкозом по морфологии, ультраструктуре и клеточному составу не отличались от культур лейкоцитов крови коров с лимфосаркомой. Основными продуцентами ВЛКРС являются малые светлые лимфоциты, содержавшие большое количество ядерных карманов. Реже - малые темные лимфоциты и бластные клетки.

Таким образом, установлено закономерное увеличение лимфоид-' ных клеток к 48 ч. культивирования. В этот период отмечается максимальная продукция бычьего лейкозного вируса. Следовательно, для накопления вируса лейкоза наиболее оптимальными являются 48 часовые лейкоцитарные культуры крови коров, больных гемобластозами.

2.4.2. Комплексная электронно-микроскопическая оценка стимулированных митогенами лейкоцитарных культур крови коров, больных гемобластозами.

Имеются многочисленные данные, свидетельствующие о том, что митоге-ны: митомицин С, 5-бромдезоксиурин, кортикостероидные гормоны, а также фитогемагглютин - митоген Т-лимфоцитов и конканава-лин А - митоген В-лимфоцитов значительно активизируют латентный вирус лейкоза крупного рогатого скота и ускоряют его репродукцию.

В параллельных опытах нами проведены сравнительные исследования краткосрочных культур лейкоцитов крови, культивированых в течение 3, 6, 12, 18, 24, 48, и 72 ч. с добавлением фитогемагглютинина (ФГА) и конканавалина-А (кон-А) и нестимулированных интактных культур.

Краткосрочные лейкоцитарные культуры, стимулированные ФГА и кон-А и контрольные культуры отличались по количеству клеток, продуцирующих вирусные частицы, имеющих ядерные аномалии -ядерные карманы. Максимальное количество вируспродуцирующих клеток находили в культурах, стимулированных ФГА, через 24 ч. культивирования (24,4%>); в культурах, стимулированных кон-А и контрольных - через 48 ч. инкубирования (35,8%; 23,5%). Количество клеток с ядерными карманами взаимосвязано с количеством клеток, продуцирующих вирусные частицы. С увеличением срока инкубирования количество ядерных аномалий увеличивалось и достигало максимума для культур, стимулированных ФГА, к 18 ч. (13,6%), для культур, стимулированных кон-А - к 24 ч. (24%). Плазматизированные клетки появляются в сроки, оптимальные для вируспродукции (24, 48 ч).

Стимулированные культуры состояли из клеток лимифоидного ряда, гранулоцитов, эритроцитов и тромбоцитов. Ультраструктура этих клеток не отличалась от интактных.

Таким образом, статистически достоверный материал по изучению влияния митогенов ФГА и кон-А на краткосрочные лейкоцитарные культуры крови больных лейкозом коров позволяет сказать, что ФГА не увеличивает вируспродукцюо клеток лейкоцитарных культур, а только ускоряет начало репродукции и выделения ВЛКРС. Кон-А значительно увеличивает вируспродукцию и сокращает латентный период репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота.

2.4.3. Количественная и качественная характеристики стимулированных и нестимулированных митогенами культур лимфоцитов лимфы коров, больных лейкозом.

В доступной литературе мы не нашли сведений, касающихся репродукции ВЛКРС в культурах лимфоцитов лимфы коров, больных лейкозом. Некоторые авторы использовали лимфоциты центральной лимфы грудного протока крупного рогатого скота для изучения бласто-генеза лимфоцитов под действием ФГА и антигена (Rohert J., Fitts С., 1984) или изучения некоторых биохимических свойств лимфоцитов лимфы (Семенова Л.П., 1976; Николаева Н.В. и соавт., 1978).

Исходя из вышесказанного, мы изучали потенцию лимфоцитов лимфы грудного протока к репродукции ВЛКРС при краткосрочном культивировании. Клетки лимфы больных лейкозом коров, стимулированные ФГА и без него, исследовали через 24, 48, 72 ч. культивирования.

Лимфоциты лимфы в процессе культивирования претерпевали качественные и количественные изменения. Количественные характеристики нестимулированных культур лимфоцитов лимфы приведены в таблице №3. Клеточный состав культур лимфы представлен в основном лимфоидными клетками, среди которых преобладают малые светлые лимфоциты. Они являлись основными продуцентами вирусных частиц. Малые темные лимфоциты встречались значительно чаще, чем в лейкоцитарных культурах крови. В отличие от культур лейкоцитов крови в культивированных клетках лимфы плазматизированные лимфоциты почти не встречаются. При 24 ч. культивировании число лимфоидных клеток составляло 70,5%. При 48 ч. культивировании процент лимфоидных клеток достигал 76,5%. При 72 ч. культивировании количество данных клеток за счет их старения и дегенерации значительно уменьшилось (до 50%). Ультраструктура культивированных лимфоцитов лимфы была аналогична таковой лейкозных лимфоцитов in vivo.

Изучение вируспродукции культур лимфоцитов лимфы позволило установить, что после 48 ч. культивирования количество клеток,

Т аблица №

Комплексное исследование здорового и больного гемобластозами крупного рогатого скота

Животные Кол-во лейкоцитов, % лимфоцитов с ядерными % вируспро-дуцирую-щих Ульстрастр. измен, в лимфоцитах тыс/мкл карманами клеток митохондрии цитопл. органеллы

1. Клинически здоровые, РИД "-" к антигенам ВЛКРС, (л=34) 4,7-8,

2. Инфицированные 2,98 ± 0,97 3,8 ±0,

ВЛКРС, (п=64) 5,3-11,8 6,67 ± 1,02 10,4 ± 1,

3. Больные ХЛЛ, п=45): начальная стадия, 16,6-32,5 7,13 ±1,61 20,6 ± 2, п=20) развернутая 32,0-100,0 19,52 ±5,05 27,9 ± 2, стадия, (п=15) терминальная 100,0- 28,01 ± 9,08 28,4 ± 3, стадия, (п=10) 365,

4. Острый лимфобластный лейкоз п=5 (I) 40,0-70,0 23,2 ±1, п=8 (II) 70,0-450,0 35,2 ±4,5 34,4 ±1,

5.Пролимфоцитарны й (п=5) 30,0-90,0 11,5 ± 3,1 26,9 ± 3,

6. Лимфосаркома п=13) 5,6-63,0 9,7 ±4,6 28,4 ± 3,

О - нет изменений; 1 - единичные изменения; 2 - значительные изменения; 3 - глубокие деструктивные изменения продуцирующих частицы, достигало максимума по сравнению с другими сроками и составляло 13,1%. В начальной и терминальной стадиях болезни среднее количество клеток, продуцирующих вирусные частицы, составляло 13,6% и 12,4% соответственно. Среди этих клеток закономерно находили ядерные аномалии. При 24 ч. культивировании количество клеток с ядерными карманами было максимальным. Средний показатель клеток с ядерными карманами состаблял 3,6%. Исследования стимулированных ФГА культур лимфоцитов лимфы позволяет считать, что они не имеют никаких отличий от нестимулированных культур.

Таким образом, лимфоциты лимфы при гемобластозах не являются интактными, а претерпевают существенные изменения в ультраструктуре, а культивированные лимфоциты лимфы больных лейкозом животных продуцируют типичный вирус лейкоза крупного рогатого скота.

Изучение стимулированных ФГА и нестимулированных культур лейкоцитов крови и лимфы коров клинически здоровых с болезнями не-лейкозной вирусной этиологии (аденовирусная инфекция) и неинфекционной патологией (мастит, эндометрит и др.) показало, что при различных сроках культивирования вирусных частиц, клеток с ядерными карманами и клазматозом не обнаружено. Морфологически основной состав культур клеток лимфоидного ряда был представлен малыми темными и светлыми лимфоцитами. Большие лимфоциты и бластные клетки практически не встречались.

2.4.4. Субмикроскопические данные о морфологии и морфогенезе вируса лейкоза крупного рогатого скота в краткосрочных культурах лейкоцитов крови и лимфы при гемобластозах

Одной из констант идентификации и детекции вируса лейкоза крупного рогатого скота считается процесс почкования от клеточной мембраны вируспродуцирующих клеток. Однако, многочисленные авторы отмечали факт неадекватности количества почкующихся и экстра-целлюлярно расположенных вирусных частиц в коротко и длительно живущих линиях различных культур клеток.

Учитывая вышеизложенное, нами изучены пути морфогенеза ВЛКРС в краткосрочных культурах лейкоцитов крови и лимфы. По нашему мнению возможны три варианта созревания и экструзии вирусных частиц из клетки.

Первый вариант - почкование. Почкование как начальный этап формирования вирусных частиц может происходить от внешней цито-плазматической клеточной мембраны или от внутренних мембран цито-плазматических вакуолей и эндоплазматического ретикулума. Путем почкования формируются незрелые и зрелые вирусные частицы, которые достигая соответствующих размеров, отделяются во внеклеточное пространство.

Рис №4, 5 фрагменты лимфоидных клеток из 48 час. культур лимфоцитов лимфы. Зрелые вирионы ВЛКРС на поверхности клетки. X

Второй вариант - электронно-плотный материал конденсируется в цитоплазматических вакуолях и цитоплазме лимфоцитов, формируясь в зрелые и незрелые вирусные частицы. Вакуоли со зрелыми частицами транспортируются к стенке клетки, мембрана клетки и вакуолей разрушается и вирусные частицы оказываются во внеклеточном пространстве. В результате чего на поверхности клетки часто встречали группы вирусных частиц (от 5 до 90), окруженных элек-тронно-плотным материалом.

Третий возможный путь выхода вируса из клетки - клазматоз. Вирусные частицы, свободно расположенные в цитоплазме или цитоплазматических вакуолях выходят из клетки вместе с клазматизирующимися участками цитоплазмы. Клазматоз встречается у 5 % клеток. Наибольшее количество клазматизирующих клеток находили в культурах при сроках оптимальных для максимального накопления вируса. Некоторые авторы считают, что дегенерация вируспродуцирующих клеток является одним из вариантов выхода внутриклеточного вируса. В 72 часовых культурах мы находили большое количество разрушенных клеток и среди клеточного детрита частицы BJIKPC.

Ультраструктура и морфогенез вирусных частиц в краткосрочных культурах лимфы не отличалась от таковых в культурах лейкоцитов крови. При этом вирусные частицы из культур лимфы на поверхности имели меньше электронно-плотного гомогенного вещества и поэтому, на наш взгляд, является более подходящим и для изучения биофизических свойств вируса.

Анализ результатов электронно-микроскопического исследования краткосрочных культур крови и лимфы здорового и больного лейкозом крупного рогатого скота позволил заключить:

• вирус лейкоза постоянно выявляется только при культивировании лейкоцитов крови и лимфы животных, больных различными формами гемобластоза и при длительной онкорнавирусной инфекции;

• для накопления in vitro ВЛКРС наиболее оптимальными являются 48 часовые лейкоцитарные культуры. Основными продуцентами вируса являются клетки лимфоидного ряда;

• впервые получена новая система для накопления ВЛКРС-культура лимфоцитов лимфы и доказана способность вируса к репродукции в ней;

• представлена детальная характеристика морфогенеза ВЛКРС (почкование, формирование и выход с содержимым цитоплазматических вакуолей, клазматоз) в двух взаимодополняющих культуральных системах.

2.4.5. Морфометрическая характеристика лимфоцитов кровикрупного рогатого скота

Морфометрические исследования в гематологии, в частности в лейкозологии, направлены на получение усредненных параметров клеток лимфопоэза в норме и при опухолевой трансформации. Это дает возможность исключить субъективный фактор и более точно идентифицировать лейкозные лимфоциты.

Учитывая вышеизложенное, основываясь на работах по методам морфометрии и стереологии (Ягубов А., Кац Б., 1978; Васильев Г., Гус-ки X., 1977), для вычисления морфометрических показателей лимфоцитов крови мы брали электронограммы клеток с окончательным увеличением х 20 ООО. Лимфоциты для обсчета брались с диаметром 5-7 мкм по 50 клеток на каждое животное.

Полученные данные приведены в таблице №5.

Таблица №

Сравнительные морфометрические показатели лимфоцитов крови больных гемобластозами

N N гр. Категории животных Площадь клетки мкм2 Площадь ядра мкм2 Объемная фракция ядра, % Объемная фракция митохонд. Кол-во рибосом в мкм2ци-топл.

I Серонега-тивные к ВЛКРС, п=5 71,8 ± 1,3 52,9 ± 1,1 54,9 ± 0,2 5,5 ±0,1 52 ± 10,

И Серопо-зи-тивные к ВЛКРС. 72,5 ± 1,4 53,8 ± 1,5 56,4 ±0,4 5,35 + 0,2 53 ± 12,

ХЛЛ стадии

III начальная 74,9 ± 1,6 63,6 ± 1,3 59,7 ±0,1 8,48 ± 0,2 65 ± 15,

IV развернутая, п=10 79,4 ± 1,2 65,4 ±1,2 66,8 ± 0,5 9,81 ±0,1 69 ± 14,

V лимфо- сар-кома, п=5 78,8 ± 1,4 63,8 ± 1,1 65,8 ±0,1 9,10 ±0,2 69 ±13,

Достоверность показателей Ш-У групп к 1-Н группам Р<0,

При анализе результатов исследования выявлено следующее: 1)При сравнении морфометрических параметров лимфоцитов серонега-тивных животных с серопозитивными к антигенам ВЛКРС, достоверные различия имеются только между объемными фракциями ядер (у сероне-гативных они выше, Р<0,05). Остальные параметры достоверных различий не имеют.

2) При сравнении клеток серонегативных животных с начальной стадией XJUI достоверные различия имеются в объемных фракциях ядер, митохондрий, количестве рибосом в мкм2 цитоплазмы, Р<0,05).

3) Сравнивая показатели лимфоцитов животных серопозитивных с ХЛЛ и J1C установлены достоверные различия по всем изученным параметрам (Р<0,001).

4) Между начальной стадией ХЛЛ и экспериментальным лейкозом разница недостоверна по всем параметрам (Р>0,5).

5) Различия между показателями при развернутой стадии ХЛЛ и лимфосаркомой недостоверны.

Таким образом можно сделать вывод, что при углублении патологического процесса в клетках увеличивается объем ядер, митохондрий, количество рибосом, канальцев эндоплазматической сети, везикул аппарата Гольджи, что свидетельствует о морфофункциональных нарушениях в белоксинтезирующей, энергетической и выделительной системах лимфоидных клеток.

2.5. Экспериментальное воспроизведение лейкозов и инфекции ВЛКРС у гетерологических видов животных.

Ранние экспериментальные работы по воспроизведению лейкоза крупного рогатого скота показали, что ВЛКРС обладает высокой онко-генной активностью для овец и кроликов. В настоящее время овцы и кролики широко используются в качестве биопробы для выявления рет-ровируса в различных биологических материалах от крупного рогатого скота больного лейкозом и для изучения некоторых молекулярно-биологических аспектов ВЛКРС. Убедительно доказано, что овцы и козы восприимчивы к инфекции ВЛКРС, но у овец после длительного периода она переходит в опухолевую форму гемобластоза, а у коз подобного явления не наблюдали (Schwartz A. et al., 1994; Mukakami R. et al., 1994; Бузераиб Абделькрим, 1986; Шульга П.И. и соавт., 1994; Доронин Н.Н. и соавт., 1994; Гулюкин М.Ю. и соавт., 1995,1998; Кунаков А. А.1995).

Мы поставили своей задачей дать комплексную характеристику онкорнавирусной инфекции и лейкоза у ягнят и козлят.

Исследования на 16 гол. романовских и 22 гол. каракульских овец показали, что сыворотки крови животных всех групп до заражения были отрицательными к gp 51 антигену ВЛКРС, а после заражения антитела появлялись на 20 сутки у романовской и на 15 - у каракульской породы овец. Через 35-60 дней после заражения у некоторых животных выявляли антитела к полипептидному антигену (Р-24) в реакции имму-нодиффузии. Положительная реакция в РИД к антителам ВЛКРС сохранялась на все время опытов (18-36 мес. для романовский овец и 7 лет - для каракульских)

При ежемесячном гематологическом исследовании ягнят романовской породы не выявлено стабильных изменений в морфологическом составе белой крови, характерных для лейкоза. Общее количество лейкоцитов колебалось в пределах 3,6-13,0 тыс./мкл при наличии в лейкоцитарной формуле 20-68% лимфоцитов.

При электронно-микроскопических исследованиях установлено, что первые положительные находки вирусных частиц в краткосрочных культурах лейкоцитов крови ягнят отмечены через 5 месяцев после инокуляции вируссодержащего материала. К концу первого года наблюдения вирусоносительство и клетки с ядерными аномалиями обнаружены у всех животных серологически положительных в РИД на антигены ВЛКРС.

У 22 гол. каракульской породы в течение 9-17мес. эксперимента у подопытных овец новых изменений со стороны ядерных клеток крови не обнаружено, хотя у отдельных животных наблюдали относительный лимфоцитоз (76-90%) и нестабильный лейкоцитоз (2-15,2 тыс./мкл). Начиная с 18 мес. у 12 баранов зарегистрирован почти стабильный лейкоцитоз (12,2-24,8 тыс./мкл) с 54-83% лимфоцитов. У 10 из 18 павших животных каракульской породы установлен лимфоидный лейкоз. Заболевание протекало лейкемически (35,0 - 474,4 тыс./мкл) и алейкемически (без увеличения количества лейкоцитов).

Электронно-микроскопический анализ ультратонких срезов краткосрочных культур клеток крови подопытных овец, зараженных натив-ными лейкоцитами больной лейкозом коровы, вируссодержащей жидкостью и фильтрованным вирусом позволили через 17, 24, 33, 46, 58 мес. после заражения обнаружить ВЛКРС, расположенный в цитоплаз-матических вакуолях и вне клеток. Через 46, 58 мес. после заражения выявляли небольшое количество клеток с ядерными карманами, характерными для лейкозного процесса

2.5.1. Субмикроскопическая характеристика нашивных и культивированных in vitro лимфоцитов крови здоровых, инфицированных ВЛКРС и больных гемобластозами овец и коз.

Ультраструктуру нативных и культивированных лимфоцитов крови здоровых овец изучали у 10 гол, романовской и каракульской породf Все животные имели нормальные лейкограммы и были отрицательны в РИД и gp 52 и р 24 антигенам ВЛКРС.

Нативные лимфоидные клетки по размерам и морфологии однородны, преобладают малые светлые лимфоциты. Общим для всех лимфоцитов здоровых неинфицированных животных было отсутствие патологических изменений, характерных для лейкоза - ядерных карманов и ядерных инвагинатов. При культивировании таких клеток репродукции ВЛКРС не наблюдали. У инфицированных ВЛКРС животных через 5 месяцев после заражения лимфоциты крови по ультраструктуре однотипны с подобными клетками неинфицированных животных.

В более поздние сроки в нативных лимфоцитах ягнят романовской и каракульской пород, находившихся в опыте 1-7 лет (серологически положительные в РИД к антигенам ВЛКРС, с нормальными гемограммами или высоким лейкоцитозом) обнаружили, наряду с нормальными клетками, лимфоциты, имеющие деструкцию мембран крисст митохондрий, увеличенное количество профилей гранулярного ретикулума, большое количество пиноцитозных пузырьков и лизосомоподобных структур.

Самым существенным отличием лимфоцитов крови овец с онкор-навирусной инфекцией или больных лимфолейкозом было наличие в ядрах лимфоидных клеток патологических изменений, характерных для лейкоза (крупные гомогенные ядрышки, ядерные карманы, тельца). В отличие от крупного рогатого скота ядерные карманы встречались лишь у 0,4-3,6% лимфоидных клеток. У четырех животных с большим лейкоцитозом (выше 56 тыс./мкл при наличии 82-96% лимфоцитов), павших от хронического лимфолейкоза, ядерные карманы находили также у небольшого числа лимфоцитов (2,8-4,2%). У культивированных в течение 48-72 часов лейкоцитов крови большинства экспериментально зараженных, серологически положительных в РИД овец через 5-10 месяцев выявляли вирусные частицы типа С, имеющие морфологию и размеры ВЛКРС. Однако процент вируспро-дуцирующих клеток у инфициро-ванных и больных лимфолейкозом овец был небольшим: до 2,16 ± 0,32% (Р < 0,001) с колебаниями от 0,9 до 3,4%.

Увеличивалось число лимфоидных клеток с лейкозной трансформацией в ультраструктуре основных органелл, которая выражалась в: 1) изрезанности контуров ядра; 2) увеличении числа ядрышек; 3) увеличении числа рибосом; 4) расширении канальцев эргастоплазмы; 5) набухании, вакуолизации митохондрий; 6) наличии ядерных включений и ядерных карманов.

2.5.2. Морфология, морфогенез ВЛКРС в краткосрочных культурах лейкоцитов крови экспериметально зараженных овец.

Ультраструктура вирусных частиц в краткосрочных культурах лимфоцитов крови экспериментально зараженных ВЛКРС овец не отличалась от таковой вирионов, обнаруженных в краткосрочных культурах крови больных лейкозом коров.

Зрелые частицы с общим диаметром 90-120 нм имели округлую или овальную форму, состояли из электронно-плотного нуклеоида, диаметром 75-95 нм, окруженного двухслойной оболочкой. Нуклеоид состоял из осмиофильных нитей, толщиной 6-8 нм, и мелких гранул. Он отделен от внешней оболочки электронно-прозрачной зоной диаметром 7-12 нм. Морфогенез вирусных частиц в культивированных лимфоцитах крови овец проходил двумя путями:

1) внутривакуольное формирование вирионов вируса лейкоза с последующим выходом из клетки путем экзоцитоза - основной путь;

2) почкование от клеточной мембраны - единичные случаи.

Нами проведены попытай стимулировать вируспродукцию лейкоцитов крови овец при онкорнавирусной инфекции и лейкозе. Испытано влияние раз-личных условий выделения и культивирования клеток, а также влияние митоге-нов Т и В лимфоидных клеток: ФГА и липополи-сахарида Е. coli. Методом электронной микроскопии установлено, что применение сред различного состава (бессывороточных сред, внесение в среды митогенных веществ), культивирование клеток стационарно и во вращающихся сосудах не привело к повышению вируспродуцирующей способности лимфоцитов инфицированных и больных ягнят и овец. При добавлении в питательную среду ФГА процент вируспродуцирую-щих клеток составил 2,8 ± 0,56% (Р<0,05), при внесении липополисаха-рида - 2,9 ± 0,58% (Р<0,05), в нестимулированных культурах - 2,16 ± 0,32% (Р<0,001).

При исследовании нативных лимфоцитов 4-х коз через три года после инфицирования ВЛКРС установлено, что ультраструктура лимфоцитов инфицированных, серологически положительных в РИД животных, с повышенным лейкоцитозом (до 32 тыс/мкл) и с нормальной гемограммой аналогична описанной при онкорнавирусной инфекции и лейкозе овец. Ядерные карманы также обнаруживались у небольшого количества клеток (3,8%) и лишь у одного животного (коза № 12) с лей-кемической картиной крови (L - 32 тыс/мкл) и было 12,5 %.

Таким образом, инкорпорация вируса в геном клеток-мишеней* лимфоцитов овец и коз сопровождается появлением ультраструктурных изменений в основных органелдах ядра и цитоплазмы лимфоцитов через 10-12 мес. после инокуляции ВЛКРС. Изменения в ультраструктуре лимфоцитов появлялись при онкорнавирусной инфекции и увеличивались при развитии лейкозного процесса или длительной персистенции вируса в организме эксперимегальных моделей. В культивированных лимфоцитах серологически положительных в РИД овец происходит полная репликация ВЛКРС. Морфология и морфогенез ВЛКРС аналогичны установленным в культивированных лимфоцитах крупного рогатого скота. Существенным отличием индуцированной онкорнавирусной инфекции и лейкоза овец от ВЛКРС инфекции и лейкоза крупного рогатого скота является значительно (в 10 и более раз) меньшее число ви-руспродуцирующих клеток и клеток с маркерными ядерными аномалиями - ядерными карманами в интактных и культивированных лимфоцитах. Одним из объяснений этому являются сведения о том, что ВЛКРС вызывает у крупного рогатого скота B-клеточный, а у овец в основном Т-клеточный лейкоз. Можно предположить, что BJIKPC в организме овец обладает тропизмом к Т-лимфоцитам, которые, вероятно, в меньшей мере продуцируют вирусные частицы.

2.5.3. Электронно-микроскопическая индикация вируса лейкоза крупного рогатого скота в лейкоцитах крови кроликов

Использование кроликов в качестве экспериментальной модели для изучения лейкозогенеза оправдано скоростью воспроизведения он-корнавирусной инфекции, сопровождающейся повышенным количеством лейкоцитов в периферической крови.

В нашем опыте для установления онкорнавирусной инфекции у кроликов наряду с серологическими и гематологическими исследованиями были применены прямые методы: тест синцитиеобразования (ТСО), позволяющий обнаружить инфекционный вирус, и электронная микроскопия, позволяющая выявить вирусные частицы в исследуемых образцах. Исследования проводились на кроликах, инфицированных BJIKPC. Объектом исследования являлись лимфоциты периферической крови, культивированные в течение 24, 48 и 72 часов при температуре 37 С.

В TCO у кроликов через четыре-пять месяцев после инокуляции клеток FLK и нативных лейкоцитов от больной лейкозом коровы был выявлен активный инфекционный вирус, обнаружены специфические изменения - синцитии. У кроликов контрольной группы, которые были серологически негативными, подобных изменений не выявляли. Количество лейкоцитов в крови инфицированных кроликов повышалось в пределах 30-60 %, достигая у некоторых особей 16-18 тыс./мкл. Одновременно наблюдался относительный лимфоцитоз. Электронно-микроскопические исследования проводили через 5 мес. после заражения.

Краткосрочные культуры лейкоцитов инфицированных животных представлены в основном клетками гранулоцитарного и лимфоцитар-ного ряда. Преобладающими элементами являлись малые и средние лимфоциты, реже - большие лимфоциты. В отличии от интактных лимфоцитов, у серологически положительных животных обнаруживали клетки с явно выраженными аномалиями. Они заключались в следующем: появлении фибриллярно-миелиновых структур, увеличении количества рибосом, вариабельностью количества и строения митохондрий, наличии многочисленных цитоплазматических включений.

Наиболее существенные отличия находили в ультраструктуре ядра лимфоидных клеток, которые характерны для лейкозов крупного рогатого скота и человека. Ядерные мембраны часто дуплицировались и образовывали ядерные инвагинаты и ядерные карманы. В отличии от крупного рогатого скота у кроликов клетки с ядерными карманами встречались редко (0,2-1,6%).

В культурах лейкоцитов кроликов после 48-часового культивирования обнаружены вирусные частицы, имеющие размеры и морфологию типичную для ВЛКРС. Зрелые частицы диаметром 90-120 им имели округлую или овальную, реже вйтянутую и неправильную форму. Они располагались в основном вне клеток и на их поверхности в виде скоплений вирионов.

Морфогенез вирусных частиц в краткосрочных культурах лимфоцитов крови кроликов проходил традиционным путем.

При электронно-микроскопическом изучении нативных лимфоцитов кроликов, зараженных ВЛКРС, вирусных частиц не было выявлено.

Таким образом, овцы, козы и кролики могут служить адекватными экспериментальными моделями для изучения вирусного канцерогенеза.

2.6. Изучение поверхностной архитектоники лимфоцитов периферической крови в норме и при гемобластозах крупного рогатого скота.

Сканирующая или растровая электронная микроскопия (РЭМ) предоставляет возможность изучить поверхность лимфоцитов при лей-козной трансформации клеток. Известно, что при различных патологических процессах изменение клеток зависит от особенностей их поверхности.

В наших опытах была исследована архитектоника клеточной поверхности лимфоцитов здоровых (5 гол.) и больных гемобластозами коров (10 гол.). В ЮМ лимфоциты периферической крови здоровых коров представляют собой неоднородную по морфологии клеточной поверхности группу. По типам клеточной поверхности лимфоциты разделились на гладкие и ворсинчатые.

Гладкие лимфоциты. Абсолютно гладкую поверхность имели единичные клетки, у остальных поверхность была с небольшой волнистостью, иногда с короткими ворсинками

Ворсинчатые лимфоциты имеют на поверхности густо расположенные разновеликие ворсинки, покрывающие всю видимую сторону клеток. Соотношение гладких и ворсинчатых типов лимфоцитов у нормальных животных 2:1.

При исследовании в ЮМ лимфоцитов больного хроническим лимфолейкозом крупного рогатого скота выявляли резкое изменение соотношения гладких и ворсинчатых клеток с преобладанием последних. Наблюдали некоторое увеличение размеров лимфоцитов, более выраженную складчатость. Появлялись филоподии - нитевидные образования длинной 10-15 мкм (до 18 шт.), которые слепо заканчивались или сливались с филоподиями соседних клеток. Довольно редко находили пластинчатые выросты высотой 6-8 мкм, длиной 8-10, толщиной около 0,1-0,15 мкм. Пузыри - выпячивания цитоплазмы сферической формы и ламелоподии были у единичных клеток. Микроворсинки встречались часто, но небольшого размера и редко расположенные на поверхности клетки. Лимфоциты больных лимфоцитарной лимфосар-комой животных представляли собой популяцию клеток средних размеров, правильной округлой формы. Поверхность клеток была сплошь покрыта мелкими пузырьками и короткими микроворсинками, что создавало эффект "кипящей" поверхности и характерно для лимфосарком-ных клеток. Встречались клетки больших размеров со складчатой ламелоплазмой.

Таким образом, при спонтанном хроническом лимфолейкозе и лимфосаркоме клетки с выраженным рельефом поверхности встречаются значительно чаще, чем у здоровых животных. При этом в РЭМ, на наш взгляд, не представляется возможным определить принадлежность клеток к Т- и В-субпопуляции, так как к настоящему времени имеются сведения о том, что Т-лимфоциты тоже могут иметь на поверхности ворсинки, а некоторые В-лимфоциты имеют гладкую поверхность. Это не исключает возможности использования растровой электронной микроскопии как экспресс-метода в прижизненной диагностике лейкозов.

2.7. Электронно-микроскопическая характеристика долгоживущей культуры ТЭК-МВА-76, продуцирующей вирус лейкоза.

Широкое использование перевиваемых культур, хронически инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, в практической и теоретической лейкозологии определено необходимостью конструирования новых клеточных линий, изучения их морфологических, культуральных свойств, а также наличие морфологической характеристика продуцируемого ими вируса и доказательств его идентичности вирусу лейкоза.

Мы провели электронно-микроскопическое исследование полученной в лаборатории гемобластозов и иммуномодуляторов Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина линии клеток ТЭК-МВА-76. Линия клеток ТЭК-МВА-76 на разных уровнях пассажа обладала островковым характером роста, имела одинаковую морфологию и состояла из эпителиоидных клеток округлой формы с ядерно-цитоплазматическим индексом 1:1,5 - 1:2,0. Крупное ядро клеток располагалось в основном эксцентрично, имело округлую, реже овальную форму, неровные границы, образующие многочисленные инвагинации. В ядре хорошо различимы эу- и гетерохро-матин, плотные крупноячеистые ядрышки (3-7 на клетку). Очень редко (0,05%) встречались гигантские клетки с одним или несколькими ядрами и множеством рыхлых ядрышек. В узком ободке цитоплазмы отличали хорошо развитый шероховатый эндоплазматический ретикулум. Митохондрии многочисленны, отличались небольшими размерами с электронно-плотным матриксом и плотной . упаковкой крист. Такие митохондрии обозначают как митохондрии конденсированного типа.

Рис №6 Растровая электронная микроскопия. Лимфоциты здоровых и больных лимфолейкозом и лимфосаркомой коров: гладкие, ворсинчатые лимфоциты, лимфосаркомные клетки с «кипящей» поверхностью. X 10 ООО, 7 500, 20 ООО, 11 500.

Вируспродуцирующие клетки обладали сходными ультраструктурными признаками, однако в цитоплазме обнаруживали многочисленные вакуоли, несущие вирионы типа С различной степени зрелости или нуклеоидоподобные электронно-плотные скопления. На клеточной мембране в ряде случаев находили почкующиеся формы вируса, а рядом во внеклеточном пространстве - скопления зрелых вирионов типа С. Вируспродуцирующие клетки отличались кроме того большим количеством гипертрофированных митохондрий, увеличением профилей рети-кулума и появлением разнообразных рибосомо-пластинчатых комплексов. Среди популяции клеток ТЭК-МВА-76 выявляли в среднем 60-65% вируспродуцирующих клеток.

На поздних сроках культивирования (6-7 суток) появлялись полуразрушенные клетки, в которых- наблюдали нуклеоидоподобные частицы и цельные вирионы типа С, что говорит о том, что некрозу подвергались вируспродуцирующие клетки.

2.7.1. Морфология и морфогенез вируса лейкоза крупного рогатого скота в культуре ТЭК-МВА-76.

В цитоплазматических вакуолях исследованных клеток культуры ТЭК-МВА-76, во внеклеточном пространстве и рядом с клеточной мембраной располагались многочисленные вирионы однообразной морфологии. Они имели электронно-плотный нуклеоид, диаметром 50-90 нм, отделенный от внутренней мембраны электронно-прозрачной зоны варьируюшего размера. Между внутренней мембраной и наружной двухслойной оболочкой вируса располагалась четко выраженная также электронно-прозрачная зона. Ее размер в среднем 6-16 нм, полный диаметр вирионов варьировал от 80 до 120 нм. Вирионы обладали выраженной гетерогенностью в размерах и форме. Встречались сферические, элипсоидные, вытянутые и гантелевидные формы.

Во внутриклеточных вакуолях, кроме вирусных частиц, располагались мембранные структуры, аморфные электронно-плотные скопления. Находили вакуоли с большим числом нуклеоидоподобных частиц и вирионов различной степени зрелости. Вируснесущие вакуоли располагались по всей цитоплазме. В местах соприкосновения с плазмо-леммой наблюдали разрывы последней, через которые вирионы выходили из клетки. Внеклеточно располагались только зрелые вирионы, которые имели все характерные признаки ретровирусных частиц типа С, форма их была более стабильна. Процесс почкования в исследованных культурах обнаруживался крайне редко и шел традиционным путем. Образование почки начиталось с конденсации электронно-плотного материала, сферическим выпячиванием над плазмолеммой. Цитоплазматическая мембрана превращалась в оболочку вириона. Образовавшаяся "почка" отшнуровывалась от клетки. Таким образом, методом электронной микроскопии впервые дана суб-микроскопическая

Рис №7, 8 Общий вид клеток культуры ТЭК МВА 76 - эпителио-подобные клетки с ячеистыми ядрышками; фрагмент клетки - зрелые вирусные частицы в межклеточном пространстве. X 6 ООО, 58 ООО. характеристика новой перевиваемой культуры ТЭК-МВА-76. Доказаны ее отличия от американской культуры Van der Maaten FLK. Культура ТЭК-МВА-76 активно продуцирует вирус лейкоза крупного рогатого скота. Формирование вирионов происходило в основном путем внутри-вакуольного созревания с последующим выходом из клетки с помощью экзоцитоза и клазматоза. Процесс почкования вируса от клеточной мембраны является крайне редким явлением. Приоритет на культуру защищен авторским свидетельством ТЭК-МВА-76 № 702073 от 20.06.1978.

1. A.c. № 702073 "Клеточная линия тимуса эмбриона крупного рогатого скота МВА-76 и продуцент онковируса типа С ТЭК МВА-76 II Крикун В.А., Лебедева Т.В., Меньшикова З.Н., Петровский Г.С.,Шишков В.П., Иткин Б.З. Приоритет от 20.06.1978.

2. Продукция бычьего лейкозного вируса (БЛВ) и вирусных антигенов в хронически инфицированной перевиваемой культуре клеток тимуса эмбриона коровы МВА-76 / Шишков В.П., Иткин Б.З., Крикун56

3. В.А., Меньшикова З.Н., Лебедева Т.В. // Сб. науч. тр. / Ин-т вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР: М., 1979.- С. 150-152.

4. Методические рекомендации по ультраструктурному анализу имфоцитов и хромосом лимфоцитов лимфы в норме и при лимфолейкозе / Шишков В.П., Меньшикова З.Н., Мутузкин Л.И., Крикун В.А., Тареева И.Г., Фельдман Л.В., Иткин Б.З. М., 1984,- С. 1-16.

5. Экспериментальное воспроизведение лимфолейкоза у овец вирусом лейкоза крупного рогатого скота/ В.П. Шишков, Х.С. Салимов, Б.З. Иткин, В.А. Крикун, З.Н. Меньшикова, Г.В. Сноз II Вестник с.-х. науки,- 1985,- № 12.- С. 97-102.

6. Шишков В.П., Меньшикова З.Н., Фельдман Л.В. Цитопатоло-гия лимфоидных клеток крови и лимфы крупного рогатого скота при онкорнавирусной инфекции и хроническом лимфолейкозе // Тез. докл. II Зсес. съезда гематологов итрансфузиологов. М., 1985,- С. 329.

7. Экспериментальная онкорнавирусная инфекция у овец / Бузераиб А., Меньшикова З.Н., Крикун В.А., Петровский Г.С. // Лейкозы крупного рогатого скота* Сб. науч. тр. / Моск. вет. акад. им. К.И.Скрябина. М., 1985,- С. 25-31.

8. Меньшикова З.Н. Ультраструктура лимфоцитов крови рогатого скота в динамике лейкозного процесса // Проблемы лейкоза и ин-фекц. заболеваний с.-х. животных: Межвуз. сб. науч. тр./ Моск. вет. акад. им.К.И.Скрябина, 1988. С. 59-71.

9. Меньшикова З.Н., Фельдман Л.В. Ультрасгруктурная и поверхностная архитектоника лимфоцитов крови при онкорнавирусной инфек-ции у крупного и мелкого рогатого скота // Актуальные вопросы диагностики заболеваний крови: Сухуми, 1988. С. 136.

10. Шишков В.П., Меньшикова З.Н. Ультраструктурная характеристика вируспродуцирующих лимфоцитов при лейкозе крупного рогатого скота II Архив патологии. 1989.- № 4, Т. 51. - С. 45-52.

11. A.c. 1645297 "Способ получения метафазных хромосом клеток крови животных". Приоритет от 03.01.1991 г.

12. Меньшикова З.Н., Фельдман JI.B. Ультраструктура лимфоцитов крови крупного и мелкого рогатого скота II Мат. Всерос. научн. конф. по патологической анатомии с.-х. животных. Воронеж, 1993,- С. 66-67.

13. Гулюкин М.И., Замараева Н.В., Касьян Е.Н., Крикун В.А., Меньшикова З.Н. Экспериментальная онкорнавирусная инфекция у кроликов/ Ретровирусы и прионные инфекции// Труды ВИЭВ, М.:1999. Т.П.- С.242-247.

14. Меньшикова З.Н. Индикация вируса лейкоза крупного рогато» го скота в лейкоцитах крови кроликов/ Ретровирусы и прионные инфекции// Труды ВИЭВ, М.Л999. Т.72.- С.250-254.

15. ГПП «Печатник» Заказ 182. Тираж 100.

16. МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

17. МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И

18. БИОТЕХНОЛОГИИ им. К.И.СКРЯБИНА