Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Вакцина против инфекционной бурсальной болезни из штамма "Винтерфилд 2512"

Актуальность проблемы. Эпизоотическое и финансовое благополучие птицеводческих хозяйств во многом обусловлено своевременным предупреждением вспышек наиболее опасных заболеваний вирусной этиологии, к числу которых относится инфекционная бурсальная болезнь (ИББ, болезнь Гамборо).

Причинами возникновения и быстрого распространения данной болезни являются высокая контагиозность вируса ИББ, его способность изменять антигенную структуру и увеличивать степень патогенности [141, 142, 166, 287, 308]. Эпизоотическая ситуация осложняется чрезмерной плотностью популяции домашних птиц, бесконтрольным ввозом и перемещением по территории страны птицеводческой продукции, нарушениями зоотехнических правил содержания и норм кормления, что, в свою очередь, предъявляет повышенные требования к качеству применяемых средств специфической профилактики.

Болезнь Гамборо (ИББ) с середины 80-х годов после появления высоковирулентных штаммов вируса стала настоящим бедствием для птицеводческой отрасли многих стран мира. Случаи заболевания, вызванные высоковирулентными штаммами, были зарегистрированы в 1986 г. в Голландии и Бельгии, в 1988 г. - в Англии, в 1989 г. - на Ближнем Востоке, в Северной и Южной Африке, в 1990 г. - в Японии и Китае, в 1991 г. - в Польше, в 1993 г. - в Индии, о чем имеется ряд сообщений [152, 178, 198, 202, 233, 234, 255]. Смертность бройлеров достигала 25%, у яйценоских пород птиц - более 70%. Экспериментально зараженные СПФ цыплята погибали в 100% случаев [104, 307].

В РФ до начала 90-х годов заболевание носило спорадический характер, вызывая гибель 5-6% цыплят и не представляло серьезной опасности [1, 6, 10, 14]. Вместе с тем, в схемы иммунопрофилактики инфекционных болезней во многих птицеводческих хозяйствах была включена вакцинация против ИББ. В связи с отсутствием отечественных средств специфической профилактики ИББ применяли только импортные препараты, что было экономически неоправданно и послужило основанием для разработки собственной вакцины. Первой была предложена вакцина из штамма «ВНИВИП» (Алиев А.С., 1992) [8, 11], которая была внедрена в биофабричное производство и предохраняла цыплят от инфицирования в условиях сложившейся к тому времени эпизоотической обстановки.

Однако, в последующие годы, в результате бесконтрольных закупок племенного яйца и птицы в зонах, энзоотичных в отношении ИББ, в страну были занесены высоковирулентные штаммы возбудителя, которые быстро распространились во многих регионах и вызывали острые вспышки заболевания с гибелью до 60% поголовья. Пик заболевания зарегистрирован в 1996 году, когда ИББ была установлена в 46 пунктах 27 административных территорий РФ [35, 52].

В такой ситуации вакцина «ВНИВИП» оказалась недостаточно эффективной, поскольку штамм, составляющий ее основу, являлся высокоаттенуи-рованным и был неспособен защищать цыплят от особо вирулентных вирусов. Положение усугублялось неполной антигенной комплементарностью вакцинного штамма «ВНИВИП» циркулирующим полевым возбудителям, о чем позже появились научные сообщения в специальной литературе [60, 61].

Поэтому разработка новой вакцины против ИББ, максимально соответствующей сложившейся эпизоотической обстановке представлялась весьма актуальной и послужила темой настоящей диссертационной работы.

Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось создание вакцины против инфекционной бурсальной болезни, способной обеспечить надежную профилактику ИББ в птицехозяйствах в условиях обострившейся эпизоотической ситуации по данной инфекции.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

• Изучить иммунобиологические характеристики вакцинных штаммов вируса ИББ, имеющихся в коллекции ФГУ «ВГНКИ», выбрать наиболее перспективный для создания новой вакцины и оценить степень его антигенного соответствия циркулирующим в РФ вирулентным возбудителям ИББ;

• Отработать технологические параметры изготовления и методы контроля вакцины на основе выбранного штамма; подготовить комплект нормативной документации;

• Испытать эффективность полученного препарата в лабораторных и производственных условиях, внедрить его в биофабричное производство и ветеринарную практику.

Научная новизна. Научная новизна работы заключается в следующем:

• Определены иммунобиологические и генетические характеристики вакцинного штамма «Winterfield 2512», экспериментально доказаны его преимущества и целесообразность использования в качестве основы живой вакцины. Штамм паспортизирован и депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве в качестве производственного (21.06.1996г под номером 84-ДЕП).

• Установлены параметры репродукции штамма «Winterfield 2512» в культуре фибробластов эмбрионов кур, позволяющие стабильно получать высокоактивный вируссодержащий материал.

• Предложены оптимальные технологические режимы изготовления и методы контроля лиофилизированной и нативной форм вакцины против ИББ из штамма «Winterfield 2512», доказана её эффективность в лабораторных и полевых условиях.

Новизна полученных результатов признана изобретением «Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц» (патент РФ № 2127604 от 20.03.1999 г.).

Практическая значимость. Предложена новая вакцина для иммунопрофилактики ИББ, серийное производство которой организовано в ГУ

ВНИИЗЖ, ООО «НПП «Вировак», НПО «НАРВАК», ГУ Щелковский биокомбинат. Препараты зарегистрированы в РФ.

Разработан и утвержден в установленном порядке комплект нормативной документации на «Вирусвакцину против инфекционной бурсальной болезни из штамма «Винтерфилд 2512» живую» (ТУ 9384-008-00008064-97, утвержденные 12.02.1997г., Наставление по применению № 13-3-04/0265 от 14.12.01г, Инструкция по изготовлению от 11.1995 г).

Положения, выносимые на защиту.

• Результаты изучения иммунобиологических свойств и генетическая характеристика вакцинных штаммов вируса ИББ;

• Технологические параметры получения вируссодержащего материала, его стабилизации и методы контроля вакцины против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512»;

• Результаты лабораторных и производственных испытаний вакцины против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции-семинаре специалистов по птицеводству стран СНГ (Ломоносов, 1994), на Всероссийской научно-практической конференции по вирусным болезням сельскохозяйственных животных (Владимир, 1995), на научно-производственной конференции, посвященной 100-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России (Курск, 1996), на XI Интернациональном конгрессе всемирной птицеводческой ассоциации (Венгрия, Будапешт, 1997), на международной научно-практической конференции по диагностике, профилактике и мерам борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных, посвященной 40-летию ВНИИВВиМ (Покров, 1998), на конференции, посвященной 70-летию ВГНКИ (Москва, 2000), на заседаниях специальной комиссии по проблемам вирусных болезней методического и Ученого Советов ВГНКИ (199599), а также на межлабораторном совещании ФГУ «ВГНКИ».

Разработки по материалам диссертации удостоены медали «Лауреат ВВЦ» (постановление № 32 п.8 от 23.11.95г).

Публикация научных исследований. Основные положения диссертации изложены в заключительном отчете ВГНКИ за 1994-1996гг (№ Гос. Регистрации 01960006555); комплекте НД на вакцину против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512», а также в 9 научных работах, включая Патент РФ на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста и содержит традиционные разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 8 рисунками. Список литературы включает 330 источников, в том числе 269 зарубежных.

4. ВЫВОДЫ

1. Вакцинный штамм «Winterfield 2512» вируса ИББ морфологически соответствует представителям семейства Birnaviridae, генетически однороден, сохраняет свои иммунобиологические свойства при многократном пассировании, не реверсибелен, безвреден для цыплят и не вызывает иммуносупрессии. Нуклеотидная последовательность вариабельной области гена Vp2 штамма «Winterfield 2512» характерна для группы вакцинных штаммов вируса ИББ и комплементарна большинству циркулирующих в РФ полевых изолятов.

2. Наиболее подходящей биологической системой для промышленного культивирования штамма «Winterfield 2512», обеспечивающей его накопление в титре 6,8 - 7,16 lg ТЦД50/см , является 2448-часовая предварительно отмытая от сыворотки раствором Хенкса монослойная культура фиброб ластов эмбрионов кур. Оптимальная о посадочная концентрация клеток 600 - 700 тыс./см , заражающая доза вируса 0,1 - 0,01 ТЦД/клетку, срок инкубирования - 72-96 часов при температуре 37 -38 (+ 0,5)°С в бессывороточной поддерживающей среде, внесенной в соотношении 1:1 к объему ростовой среды.

3. Штамм «Winterfield 2512» обладает высокой иммуногенной и антигенной активностью, при двукратном введении цыплятам в дозе 4,0 lg ТЦД50 вызывает образование вируснейтрализующих антител в титрах 11,2 — 12,0 log2 и не менее 1:1650 - 1:1800 в ИФА, и предохраняет от экспериментального заражения не менее 90% привитых цыплят.

4. Оптимальной защитной средой для лиофилизации штамма «Winterfield 2512» и вакцины на его основе является состав по прописи ВНИИЗЖ (50% раствор сахарозы, 10% раствор желатозы, 20% раствор ГЛА), внесенный в вирусный полуфабрикат в пропорциях 10-15% среды к 85-90% вируса. Нативная вируссодержащая культуральная жидкость без добавления стабилизаторов предложена одной из форм готовой вакцины со сроком годности 6 месяцев.

134

5. Для определения оптимальных сроков начала иммунизации цыплят против. ИББ вакциной из штамма «Winterfield 2512» предложена расчетная формула, учитывающая индивидуальную для каждого хозяйства динамику снижения уровня материнских антител.

6. В неблагополучных по ИББ птицехозяйствах различных зон Российской Федерации и Республики Украина вакцина из штамма «Winterfield 2512» обеспечивала сохранность не менее 90% привитых цыплят и являлась основным средством иммунопрофилактики ИББ.

135

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложена новая вакцина для иммунопрофилактики ИББ, серийное производство которой организовано в ГУ ВНИИЗЖ, ООО «НИН «Вировак», НПО «НАРВАК», ГУ Щелковский биокомбинат.

2. Разработан и утвержден комплект нормативной документации на «Вирусвакцину против инфекционной бурсальной болезни из штамма «Винтерфилд 2512» живую» (ТУ 9384-008-00008064-97, утвержденные 12.02.1997г., Наставление по применению № 13-3-04/0265 от 14.12.01г., Инструкция по изготовлению, утв. директором ВГНКИ 11.95г.) 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

11

12

13

14

1.8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ Проведенный анализ литературных данных показал, что ИББ является актуальной проблемой для птицеводства во многих странах мира. Заболевание широко распространено, отличается образованием стационарных очагов инфекции в связи с устойчивостью возбудителя и наносит большой прямой и косвенный экономический ущерб.

Наибольшую эпизоотическую опасность представляет вирус ИББ первого серотипа, внутри которого установлены три основные антигенные группы штаммов: классические, вариантные и высоковирулентные.

Основным способом борьбы с ИББ является специфическая профилактика с использованием живых и инактивированных вакцин, эффективность которых во многом обусловлена антигенной комплементарностью вакцинного штамма циркулирующим полевым агентам. Защиту молодняка в первые дни жизни обеспечивают пассивные желточные антитела, передаваемые родителями. Дальнейшая невосприимчивость достигается активной иммунизацией птиц. Для создания высокого однородного уровня материнских антител применяют инактивированные вакцины, изготавливаемые из различных штаммов с использованием широкого спектра адъювантов. Для активной иммунизации цыплят создан ряд живых вакцин.

Одним из важнейших вопросов является определение оптимального срока введения живого вакцинного вируса, позволяющее избежать нейтрализации его материнскими антителами. С этой целью применяют различные серологические реакции. Особенно удобным в этом отношении является ИФА, с помощью которого можно быстро и статистически достоверно обследовать большие партии птиц. Для обработки полученных данных имеется ряд компьютерных программ.

При выборе живой вакцины необходимо учитывать эпизоотическую ситуацию конкретного хозяйства и степень аттенуации производственного штамма. Многими исследователями и практическими врачами установлено деструктивное воздействие «горячих» штаммов на фабрициеву сумку, которая является иммунокомпетентным органом и играет важную роль в иммунной резистентности организма цыплят. Поэтому в хозяйствах с субклиническим течением ИББ используют препараты из «мягких» и «промежуточных»

53 штаммов, «жесткими» же вакцинами купируют очаги острых вспышек инфекции, применяя их на 2-3 промышленных турах птицы и рекомендуя затем переход на более ослабленные вакцины.

В Российской Федерации в 1992-1995гг сложилась тяжелая эпизоотическая ситуация по ИББ, обусловленная широким распространением высоковирулентных штаммов вируса и появлением большого количества неблагополучных пунктов. Имеющиеся в арсенале средства специфической профилактики не обеспечивали ликвидации инфекции и оздоровления птицехозяйств.

Учитывая вышеизложенное, целью наших исследований явилось изыскание штамма-продуцента для новой вакцины против инфекционной бурсальной болезни, способной надежно профилактировать появление вспышек заболевания, разработка технологии её биофабричного изготовления и контроля, а также испытание эффективности в лабораторных и полевых условиях.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

2.1.1. Работа выполнена в 1994-1999 гг в лаборатории препаратов, применяемых в птицеводстве Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) в соответствии с заданием 01.06.М., утвержденным Главным Управлением ветеринарии и разрешением ГУВ на проведение широких производственных испытаний № 19-4/433 от 16.06.1993г совместно с сотрудниками лаборатории Смоленским В.И., Голодом Я.Р., Кис Т.Б.

Часть исследований проводили на базе ВНИИЗЖ совместно со специалистами различных подразделений института: Борисовым А.В., Кузнецовым В.Н., Дрыгиным В.В., Щербаковой JI.O., Мудрак Н.С., Пономаревым А.П.

Полевые испытания проводили в птицеводческих хозяйствах нескольких регионов Российской Федерации и Украины на птицепоголовье общей численностью более 10 млн. цыплят.

2.1.2. Характеристика использованных материалов:

• Вирусные штаммы и препараты: вакцинные штаммы "Winterfield 2512"; "Cu-1M"; "LIBDV"; "ST"; "DUF"; "UBD" вируса инфекционной бурсальной болезни с неизвестными характеристиками, имевшиеся в коллекции культур микроорганизмов ВГНКИ; вирулентный штамм "52/70-М" вируса инфекционной бурсальной о болезни с титром на СПФ-эмбрионах кур не менее 5,0 lg ЭИД5о/см и на о цыплятах - не менее 4,0 lg ИД50/0,2см ; вирулентный штамм «Т-53» вируса ньюкаслской болезни с титром на куриных эмбрионах 8,0-9,0 lg ЭЛД50/см3; на цыплятах - не ниже 7,5 lg ЛД50/см3; вакцина против ньюкаслской болезни из штамма «Ла-Сота»;

• Цыплята и эмбрионы птиц:

- коммерческие и СПФ-цыплята 1-14-суточного возраста - более 1000 голов;

- коммерческие и СПФ-эмбрионы кур 10- 11-суточного возраста - более 1000 штук;

- эмбрионы уток 11-12-суточного возраста - более 400 штук;

- эмбрионы японских перепелов 8-9-суточного возраста - более 300 штук;

• Культуры клеток: первично-трипсинизированные культуры фибробластов эмбрионов кур, уток и перепелов (ФЭК, ФЭУ, ФЭП), культура почки эмбрионов кур (ПКЭ); перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки (Vero), полученная из лаборатории культур клеток, питательных сред и растворов ВГНКИ;

• Питатательные среды и растворы:

- культуральные питательные среды и растворы: ГЛА, Игла, 199, растворы Хенкса, Эрла, 0,25% раствор трипсина, 0,02% раствор версена;

- сыворотки крови: крупного рогатого скота, телят, плодов крупного рогатого скота (фетальная), плодов овец, северных оленей, лошадей;

- бактериальные питательные среды: мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ), агар Сабуро, мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) под вазелиновым маслом (среда Китт-Тароцци);

- стабилизирующие среды для лиофилизации: 5-кратный концентрат обезжиренного молока, фосфатно-солевая буферная среда, содержащая бычий сывороточный альбумин и глутамат натрия, сыворотка крови КРС, сыворотка крови лошадей, гидролизат яичных белков "Овогид" (ООО «Биотех»), липосомы, содержащие а-токоферол, сухая пептонно-лактозная смесь в различных процентных соотношениях, 5% среда СПЛФ (сахароза-пептон-лактоза-фосфат), среда ВНИИЗЖ (50% раствор сахарозы, 10% раствор желатозы, 20% раствор ГЛА) в нескольких модификациях;

• Растворы: 0,9% хлорида натрия или ФБР с рН 7,2-7,4 по ГФ X, стр442; TN-буфер (50 мМ трис, рН 7,6, 10 мМ NaCl); 10% трифтортрихлорэтан фреон 113); 10% раствор сахарозы на TN-буфере; раствор CsCl с 20% сахарозы, рН 7,6 (d= 1,45 г/см );

• Химические реагенты: для приготовления буферных растворов и растворов для ферментативных реакций использовали химические реактивы фирм "Serva", "Sigma", "Fluka", "Merck", "Pharmacia", "Promega", а также

ТУ отечественные реактивы марки о.с.ч. Радионуклиды [у- Р]-аденозин-5'-трифосфат, [а- Р]-дезоксиаденозин-5'-трифосфат производства фирмы «Изотоп» (г.Обнинск). Две пары праймеров для nested-ПЦР были синтезированы Н-фосфанатным методом к.х.н. Ломакиным А.И. (ВНИИЗЖ); ферменты: РНК-зависимая ДНК-полимераза (ревертаза) вируса миелобластоза птиц (Омутнинский химзавод, г.Омутнинск); Taq ДНК-полимераза (Promega); ДНК-лигаза Т4 (Биотех); рестриктазы (Биотех); полинуклеотидкиназа (Promega); протеиназа К (Serva);

• Иммуноферментые тест-системы производства ВНИИЗЖ, фирм KPL (США), IDEXX (США);

• Оборудование: электронный микроскоп JEM-100CXII; световые микроскопы «ЛОМО», микроцентрифуга "Eppendorf" (Германия) модель 5414; центрифуга "Bekman" модель J2-21; высокоскоростная центрифуга "Sorvall" (США) модель OTD65B; центрифуга MLW К 70-D (Германия); источники питания LKB (Швеция) модели 3371Е и 2297, Pharmacia (Швеция) модели EPS 3500XL и GPS 200/400; термостаты Millipore (США), Eppendorf модель 5320, Bruva-8, Bruva-10 (Германия) с температурой инкубирования 37+ 0,5°С; амплификаторы MiniCycler и РТС-100™ фирмы MJ Research (США); шейкер Eppendorf модель 5432; холодильники Памир, ЗИЛ (+4 °С) (Россия), Sanyo (-30 °С, -70°С) (Япония), Westfrost (-20 °С) (Дания), проточный спектрофотометр Uvikord LKB (Швеция), спектрофотометр Shimadzu (Япония), спектрофотометр с вертикальным лучом света READER SLT SPECTRA с блоком светофильтров X 405; 450; 492; 650 нм; автоматические пипетки с переменным объемом: 8-канальные (50-300 мкл) Biohit, Tecan, Titertek; 1-канальные (0,5-10 мкл, 1-40 мкл) Ленпипет, Biohit,

Eppendorf; автоматическое программируемое промывочное устройство SLT COLUMBUS WASHER с шейкером; ручное промывочное устройство IDEXX WASH SYSTEM SKATRON; компьютерное обеспечение: универсальная программа «V-test», разработанная ВНИИЗЖ, включающая в себя данные по ИФА-тест-системам ВНИИЗЖ, СИНКО, IDEXX, KPL, BioChek; магнитные мешалки различных моделей (Россия, Польша); инкубатор "Бройлер" (Швеция); гомогенизатор UTU модели MPW-309 (Польша).

2.1.3. Характеристика применяемых методов:

• Приготовление культур клеток. Получение первичной монослойной культуры фибробластов эмбрионов различных видов птиц и культуры почек эмбрионов кур проводили общепринятым методом; перевиваемую линию клеток «Уего» поддерживали согласно «Методическим указаниям по применению перевиваемых клеточных культур для диагностики вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных», утвержденным ГУВ Госагропрома СССР 12.10.1987г;

• Культивирование вируса. Культивирование на эмбрионах различных видов птиц проводили путем аппликации вируса на обнаженную от подскорлупной оболочки хориоаллантоисную оболочку в области естественной или искусственной пуги. Отверстие в скорлупе заклеивали лейкопластырем. Зараженные эмбрионы инкубировали при температуре + 37+0,5°С и относительной влажности 60-70% в течение 196 часов, овоскопируя два раза в сутки. Жидкости и ткани павших после 48 часов эмбрионов, после предварительного охлаждения при температуре +4°С, использовали для приготовления вируссодержащего материала. Для этого готовили гомогенат тканей и жидкостей эмбрионов (20%-ную взвесь на ФБР, включающую тушки эмбрионов, ХАО и аллантоисную жидкость, со средним размером частиц 0,1- 0,3 мм). Суспензию замораживали при минус 70°С, оттаивали и центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин. для осаждения крупнодисперсных компонентов. Полученный материал использовали для последующих пассажей. Накопление в культурах клеток проводили путем внесения вируса на предварительно отмытый от содержащей сыворотку крови ростовой среды монослой при стационарном методе культивирования и последующего инкубирования в течение 120 часов при температуре 37+0,5°С, с ежедневной оценкой под световым микроскопом. После детекции специфического ЦПД флаконы с культурой клеток охлаждали при ч. температуре +4°С, энергично встряхивали и полученную вируссодержащую жидкость использовали для дальнейших пассажей.

• Определение инфекционной активности. Инфекционную активность расплодок штаммов, а также образцов вакцины определяли титрованием на 10-11-суточных СПФ эмбрионах кур и культурах клеток по общепринятым методикам, титр вируса рассчитывали по методу Кербера Г. в модификации АшмаринаП.И. [12] по формуле: lg ТЦЦ/ЭИД50 = lg An-S(SLi - 0,5) где: lg - логарифм числа;

ТЦД/ЭИД50 -титр вируса в объме 1,0 см3, т.е. наименьшее ее количество, способное вызывать инфицирование 50% зараженных эмбрионов или пробирок с культурой клеток; Дм - максимальная из испытанных доз вакцины;

S (сигма) - логарифм кратности разведении; I - сумма значений для всех испытанных доз;

Li - отношение числа эмбрионов, давших положительную реакцию от введения данной дозы, к общему числу эмбрионов, которым эта доза введена; 0,5 - постоянная величина;

• Определение иммуногенности и антигенной активности. Иммуногенность штаммов и образцов вакцины оценивали по результатам контрольного заражения двукратно привитых цыплят с расчетом бурсальных индексов и индекса атрофии бурсы по формулам, предложенным Lucio В., Hitchner S.B. (1979) [209, 210] и Sharma J.M. (1986) [278]. Для этого определяли массу фабрициевых сумок (Бо,, Бк;) и тушек (Toj, Tkj) у цыплят всех групп. Затем рассчитывали массовый бурсальный индекс 1о опытных и

1к контрольной групп цыплят и индекс атрофии бурсы ИАБ по формулам:

Бо: Бк{

Е-------- Е----------------1о

Tos TKj ИАБ =--------

Io= --------- 1к= ------------------1к ц ц

Где: Ц - количество цыплят в группах;

1о - средний массовый бурсальный индекс по опытным группам;

Ik - массовый бурсальный индекс по контрольной группе. Постановка биопробы. В опытах использовали вирулентный штамм «52/70

М» вируса ИББ, который вводили интраназальным методом в дозе 100

-2

ИД50/0;2см • Срок наблюдения составлял 10 суток. После этого всех выживших цыплят убивали, проводили патологоанатомическое вскрытие и определяли групповые бурсальные индексы.

Эффективность иммунизации определяли по общепринятой формуле:

К-О

Э = К хЮО, где

Э - эффективность вакцинации в %;

К - процент заболевшей птицы с признаками ИББ в контрольной группе; О - процент заболевшей птицы с признаками ИББ в опытной группе. • Серологические методы. Наличие специфических антител в сыворотках крови определяли в реакции нейтрализации (РН), реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и постановкой иммуноферментного анализа (ИФА). Для получения сывороток кровь брали из подкрыльцовой вены. Образовавшийся сгусток механически отделяли от стенок пробирки, выдерживали при комнатной температуре (18-22°С) в течение 12-18 часов, а затем 8-10 часов при 4°С. Отделившуюся сыворотку собирали в стерильные пробирки и использовали для исследований.

Постановку РН на культуре клеток осуществляли по общепринятой методике с постоянной дозой вируса (100 ТЦД5о) и двукратными разведениями сыворотки. Учет результатов РН проводили через 120 часов. Активность сывороток оценивали по уровню вируснейтрализующих антител (bg2).

РТГА ставили микрометодом по общепринятой методике с рабочей дозой 4 ГАЕ антигена вируса НБ и 1% взвесью эритроцитов петуха. За титр сыворотки принимали наибольшее ее разведение, вызывающее полное торможение гемагглютинирующей активности рабочей дозы антигена (log2).

ИФА проводили в соответствии с наставлениями по применению имеющихся коммерческих наборов. Сыворотки тестировали в рекомендованных рабочих разведениях 1:100, 1:400, 1:500. Учет реакции осуществляли автоматически с использованием ридера с вертикальным лучом света. Обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы V-test (ВНИИЗЖ).

• Оценку безвредности вакцинных штаммов проводили путем постановки биопробы на цыплятах различного возраста. Безвредность определяли по отсутствию характерных для ИББ клинических признаков и патологоанатомических изменений, а также по оценке бурсальных индексов (БИ) и индексов атрофии бурсы (ИАБ) через 10 суток после введения вируса и вакцин в дозах 5,0 и 6,0 lg ТЦД50.

• Отсутствие реверсибельностн устанавливали путем 10-кратного последовательного пассирования штаммов в организме 14-суточных цыплят при пероральном введении в дозе 100000 ТЦД50. В качестве вируссодержащего материала для второго и последующих пассажей использовали гомогенат фабрициевых сумок цыплят предыдущих пассажей в разведении 1:10. Вакцинированных разными штаммами и контрольных цыплят каждого пассажа содержали строго изолированно в течение 10 суток. Материал для последующего пассажа отбирали через 3 суток после прививки не менее, чем у трех цыплят из каждой опытной группы. Оценку результатов опытов проводили по отсутствию специфических для ИББ патологоанатомических изменений в тушках убитых цыплят и путем вычисления значений бурсальных индексов (БИ) и индексов атрофии бурсы (ИАБ)

• Отсутствие иммуносупрессивных свойств оценивали серологически по уровню поствакцинальных антител к вирусу НБ согласно «Руководства МЭБ по стандартам для диагностических тестов и вакцин» [224]. Принцип метода основан на неспособности штаммов вызывать атрофию фабрициевой сумки с проявлением признаков иммунодефицита, выражающегося в ослаблении индукции антител к другим антигенам, в частности, к вирусу НБ.

• Лиофилизацию штаммов и опытных серий вакцины проводили на базе лаборатории инструментальных методов контроля ВГНКИ, а также во ВНИИЗЖ по следующим методикам:

Замораживание расфасованного вируса проводили при температуре минус (50-55)°С в течение 24 часов, затем, не допуская оттаивания, перегружали кассету с ампулами в камеру сублиматора, подготовленную по следующим параметрам: температура полок не выше минус 10°С, температура конденсатора не выше минус 60°С. После загрузки и подключения датчиков камеру герметизировали и вакуумировали до остаточного давления не выше 60 мкм рт. ст.

Регламент сушки ВГНКИ.

В течение 12 часов проводили сублимацию при температуре не выше минус (40-50)°С до видимого высушивания препарата. Затем устанавливали подогрев полок до 45°С. В дальнейшем температуру постепенно повышали на 1-2°С. При достижении температуры в продукте минус 1°С постепенно, на 1-2°С в час, снижали подогрев полок до 25°С. Зону 0°С проводили плавно. Досушивание проводили с момента установления плюсовой температуры в течение 14-17 ч при давлении в камере не выше 100 мкм. рт. ст. Конечная температура в продукте 25°С, продолжительность сушки 59-68 часов.

Регламент сушки ВНИИЗЖ.

На 3 час Подогрев до минус 35 °С

На 5 час Подогрев до минус 30°С

На 7 час Подогрев до минус 25°С

На 9 час Подогрев до минус 20°С

На 14 час Подогрев до минус 15°С

На 23 час Подогрев до минус 10°С

На 28 час Подогрев до минус 5°С

На 39 час Подогрев до 0°С

На 46 час Подогрев до плюс 5°С

На 56 час Подогрев до плюс 10°С

На 57 час Подогрев до плюс 15°С

На 58 час Подогрев до плюс 20°С

На 59 час Подогрев до плюс 25 °С

На 60 час Подогрев до плюс 30°С

С 65 часа Поддерживать температуру в пределах плюс по 71час 25°С-26°С.

Не выше 27°С!

После 75 часа Выгрузка

• Методы очистки и концентрации вируса. Очистку полученных расплодок проводили методом градиентного центрифугирования, включающим следующие стадии: замораживание-оттаивание, гомогенизация 10-20% вирусной суспензии в TN-буфере (50мМ Трис, рН 7,6, 10 мМ NaCl ) в присутствии 10% трифтортрихлорэтана (фреон 113), низкоскоростное центрифугирование (5 мин. при 10000об./мин на центрифуге "Bekman"), осаждение осветленной вирусной суспензии центрифугированием через 30% раствор сахарозы, приготовленный на TN-буфере (3 часа при 25000 об./мин на центрифуге "Sorvall" с последующей очисткой вируса центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия (1,45 г/см) (6 часов при 23000 об./мин). После диализа очищенный вирус концентрировали ультрацентрифугированием при 48000 об/мин в течение 1 часа;

• Морфологические особенности штаммов и отсутствие контаминации чужеродными агентами определяли в электронном микроскопе на базе ВНИИЗЖ. Использовали стандартный способ отпечатков" жидкого препарата на препаративной пленке-подложке с последующим контрастированием 2%-ным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, рН 6,8;

• Проверка стабилизирующих свойств сред высушивания.

Определяли методом "ускоренного старения" путем прогревания лиофилизированного вируса при температуре 37°С в течение 7 суток. Результаты оценивали по сохранности инфекционной активности.

• Определение нуклеотидной и аминокислотной последовательности генома. Нуклеотидную последовательность вариабельной области гена Vp2 исследуемых штаммов определяли в ОТ-ПЦР с последующим секвенированием продуктов амплификации.

Выделение РНК вируса ИББ. К очищенной и концентрированной вирусной суспензии добавляли протеиназу К до конечной концентрации 0,1 М. Сразу после добавления протеиназы вносили 10% ДСН до конечной концентрации 0,5% и перемешивали, затем инкубировали в термостате при +37°С 30 мин. Добавляли равный объём фенола, энергично перемешивали, центрифугировали 5 минут при 10000g. Водную фазу отбирали, повторяли экстракцию, но перед центрифугированием помещали пробирку с вирусной суспензией в холодильник на -70°С на 3 минуты для осаждения ДСН. К водной фазе добавляли равный объём хлороформа, перемешивали, центрифугировали 5 минут при 10000 g. К водной фазе добавляли 1/10 объёма ЗМ Na ацетата, рН 5,5, и 3 объёма этанола, выдерживали 30 минут при - 70°С. Центрифугировали 5 минут при 10000g. Осадок РНК растворяли в воде. К раствору вирусной РНК добавляли 3 объема 96% этанола и хранили препараты при -20°С. Проверку целостности РНК вируса ИББ проводили электрофорезом в 2% агарозном геле. Электрофорез проводили при напряжении 100 В (5 В на 1 см геля). Гель окрашивали в 0,05% растворе бромистого этидия.

Выделение суммарной РНК. Суммарную РНК выделяли, используя набор реактивов RNAgents Total RNA Isolation System (Promega, США), no модифицированному методу Chomczynski. Перед выделением РНК из фабрициевых сумок инфицированных кур готовили 50% суспензию в буфере (50 мМ трис-HCl, рН 7,0, 10 мМ NaCI), лиофилизированные препараты разводили в 1 мл Н20. К 200 мкл вируссодержащей суспензии добавляли 0,5 мл раствора "Д" (4 М гуанидин-тиоцианат, 25 мМ Na-цитрат, 0,5% саркозил, ОДМ |3-меркаптоэтанол) и гомогенизировали до образования однородной суспензии. Затем вносили 0,5 мл смеси фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (1:1:0,02), перемешивали и помещали на 15 минут на -20°С. После центрифугирования в течение 5 мин при 13000g верхнюю фазу переносили в новую пробирку, добавляли 1/10 объема 2М ацетата натрия, рН 4,0, 2 объема этанола и инкубировали 10 мин при -70°С. После этого центрифугировали 5 мин при 13000g, осадок ресуспендировали в 300 мкл раствора "Д", добаляли 2 объема этанола и повторяли процедуру охлаждения и центрифугирования. Осадок суммарной РНК промывали 75% этанолом, подсушивали и растворяли в 20-50 мкл Н20.

Синтез первой цепи кДНК вариабельной области гена Ур2 ВИББ. Реакцию обратной транскрипции осуществляли с использованием РНК-зависимой ДНК-полимеразы вируса миелобластоза птиц. 10 мкл раствора суммарной РНК прогревали при 96°С в течение 4 мин., затем быстро охлаждали на льду и добавляли реакционную смесь, содержащую 2 мкл 10 мМ dNTP, 3 мкл 10х ревертазного буфера (0,5 М трис-HCl, рН 8,3; 1,4 М КС1; 100 мМ MgCl2, 200 мМ (З-меркаптоэтанол), 10 ед. РНК-зависимой ДНК-полимеразы и по 100 пМ внешних праймеров (PR1 и PR4), добавляли воду до конечного объема 30 мкл, перемешивали и инкубировали 25 мин. при 42°С. После инкубации смесь прогревали при 96°С 4 мин., чтобы инактивировать фермент и разрушить комплекс РНК-кДНК.

Амплификатя фрагментов кДНК методом ПЦР. ПНР проводили в программируемом амплификаторе MiniCycler (MJ ReserchJnc, США). В 0,5 мл пробирку вносили 5 мкл раствора 1 цепи кДНК, по 100 пМ праймеров, 5 мкл lOxPCR буфера (570 мМ трис-HCl, рН 8,3; 160 мМ (NH4)2S04, 25 мМ Mg С12,

0,1% Твин-20), 1,5 мкл 10 мМ dNTP, 2 ед. Taq-полимеразы и воду до конечного объема 50 мкл, сверху наслаивали 50 мкл минерального масла для предотвращения испарения. Реакцию проводили в два этапа. Первый этап -амплификация с внешней парой праймеров (PR1, PR4), 30 циклов при следующем режиме: 94°С- 0,5 мин.; 56°С- 0,3 мин.; 72°С- 0,7 мин. В результате амплнфицируется фрагмент кДНК размером 656 п.н. Анализ продуктов амплификации проводили электрофорезом в 2% агарозном геле с 0,001% бромистым этидием. В случае, если не выявлялась вирусспецифическая полоса, проводили второй этап - реамплификацию. Для этого переносили 2 мкл смеси в пробирку с реакционной смесью, содержащей внутренние праймеры (PR2 и PR3) и проводили 20-30 циклов при тех же режимах. В результате синтезировался продукт размером 484 п.н. Для контроля возможной контаминации компонентов реакций фрагментами вирусной РНК или кДНК, начиная с этапа выделения РНК, ставили отрицательный контроль, используя суспензию фабрициевых сумок здоровых кур или Н20. В качестве положительного контроля брали РНК, выделенную из очищенного и концентрированного вируса ИББ.

КлонированиеамплифицированныхфрагментовкДНК.

Амплифицированные фрагменты кДНК переосаждали 96% этанолом, растворяли в 20 мкл Н20 и клонировали в плазмидный вектор. Для клонирования кДНК использовали плазмиду pUC19, обработанную рестриктазой HincII. Реакцию лигирования проводили при 15°С в течение 1216 часов в смеси объемом 20 мкл, содержащей 50 мМ трис-HCl рН 7,6, 10 мМ Mg С12, 10 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ, 5-10 ед. лигазы, 0,5 мкг фрагмента кДНК и 0,05 мкг вектора. Для трансформации использовали штамм E.coli JM109. Компетентные клетки готовили по модифицированному методу Cohen и соавт. Трансформацию проводили, как описано у Ханаана. Для отбора рекомбинантных плазмид трансформанты высевали на агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина, 4 мкг/мл X-gal и 100 мкМ/мл ИТОГ. Рекомбинанты отбирали предварительно по цветному признаку, и с помощью молекулярной гибридизации с мечеными зондами согласно методике, описанной Маниатис и соавт. Наличие вставки кДНК определяли рестрикционным анализом.

Секвенирование клонированных фрагментов кДНК. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli проводили методом щелочного лизиса. Первичную структуру встроенной в плазмиду кДНК ВИББ определяли методом Sanger в модификации Korneluk, предусматривающей предварительную щелочную диссоциацию цепей плазмидной ДНК. При секвенировании кДНК использовали праймеры для M13/pUC.

Прямое секвенирование амлифицированных фрагментов кДНК. Амплифицированные в ПЦР фрагменты кДНК очищали с помощью набора "Wizard PCR Preps" (Promega). Циклическое секвенирование фрагментов кДНК проводили с использованием набора "fmol DNA Sequencing System Sample" (Promega), как описано в руководстве к набору. При этом использовали внутренние праймеры (PR2 и PR3). Синтезированные в секвенирующих реакциях фрагменты к ДНК фракционировали в тонких клиновидных (0,2-1,2 мм) полиакриламидных гелях с концентрацией акриламида 6 - 7%, содержащих 7М мочевину. По окончании электрофореза гель отмывали от мочевины, высушивали при 100 - 200°С и проводили радиоавтографию на пленку РМ-В (Тасма).

Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых кислот. При выборе оптимальных для праймеров участков генома использовали программы "ALIGN" (Scientific & Educational Software), OLIGO (версия 3.3.) Для выявления вариабельных участков генома ВИББ использовали программу "SQMAX", разработанную специалистом ВНИИЗЖ Зинковским Ю.В. Для анализа установленных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей штаммов ВИББ использовали пакет прикладных программ SeqProgs (Data handling for molecular epidemiology), версия 1.0, (N.J.Knowles, IF АН, Великобритания). • Статистическая обработка результатов. Использовали стандартные методы статистической обработки, общепринятые в биологии [12, 23, 58].

67

Достоверность различия между средними показателями определяли по критерию Стьюдента уровнем значимости р. При р > 0,05 результаты считались недостоверными, при р < 0,05 и р <0,01 - достоверными.