Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биологические свойства вакционного штамма "СТ", технология его получения и использования против инфекционной бурсальной болезни кур

НА ПРАВАХ РУКОПИСИ ГОДИЗОВ ПЕТР ХЛРИТОНОВИЧ

Биологические свойства вакцинного штамма „СТ", технология его получения и использования против инфекционной бурсальной

болезни кур

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

СТАВРОПОЛЬ —2006

Работа выполнена во Вс-.'россш'к'к^м ! i <ч у ч и о -1 ! с с л с л о к а т ел ьс к о м ветеринарном институте птицеводства н ФГОУ ВПО «Горский государственный аграрный университета

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор

Алиев Алаутдин Серажутдинович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Дорофеев Виталий Иванович;

доктор нетерннарных наук, профессор Л\алышева Людмила Александровна;

доктор биологических наук Жарникова Ирина Викторовна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет».

Защита диссертации состоится ¿Л2006 г. в Стасов

на заседании диссертационного совета Д 220.062.02 при ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» (355017, г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 12),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО <Ставро-польскнй государственный аграрный университет».

Автореферат разослан ¿ЗгЛ^-^с^*-? 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Квочко А. Н.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Птицеводство, как скороспелая отрасль сельского хозяйства, позволяет быстро, относительно с небольшими затратами, получить значительное количество высококачественных продуктов питания.

Однако для птицеводческих предприятий особую опасность представляют вирусные заболевания из-за их недостаточной изученности, высокой контагиозности, большого разнообразия путей и факторов передачи инфекционного агента. Проблема вирусных болезней приобретает все возрастающую актуальность еще и по той причине, что ряд инфекций стали протекать атипично, значительно возросла роль ассоциации различных агентов вирусной и бактериальной природы (Кудрявцев Ф. С., Алиев А.

C., 1982).

В связи с этим дальнейшему развитию отрасли и повышению ее эффективности препятствуют различные заболевания, среди которых инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) причиняет значительные потери, связанные с гибелью молодняка птиц (от 5 до 40%), снижением продуктивности и увеличением процента выбраковки птиц и тушек, особенно в хозяйствах бройлерного направления (Dickson Т., Ногте А., 1989; Hirai К., Kato N.. 1979).

ИББ - высококонтагозное вирусное заболевание молодняка птиц 3-6-недельного возраста, характеризующееся поражением фабрициевой сумки, почек внутримышечными геморрагиями, диарей (Bech H., 1980; Dorn P., 1984).

Вирус ИББ снижает эффективность специфической профилактики против многих инфекционных заболеваний в условиях птицеводческих хозяйств. Вследствие разрушения вирусом B-лимфоцитов резко снижается иммунная реакция организма птиц в ответ на любое антигенное воздействие. Инфекция представляет серьезную опасность для хозяйств как бройлерного, так и яичного направления.

В основе профилактики и ликвидации ИББ лежит применение специфических средств и проведение общих ветеринарно-санитарных мероприятий.

В большинстве стран в промышленном птицеводстве разработаны методы диагностики и предложены различные типы вакцин для специфической профилактики ИББ. Накопленный опыт борьбы с ИББ показывает, что строгое соблюдение ветеринарно-санитарных мероприятий и систематическая вакцинопрофилактика позволяют значительно снизить экономические потери от ИББ. Однако проблема искоренения заболевания в последние годы осложнилась в связи с увеличением случаев субклинического течения, при котором иммунодепрессивное действие вируса и экономические последствия проявляются не менее значительно, чем при остром течении заболевания (Ezeokoli С., 1986; Giambrone J.J., Donahoe J.P. Dawe

D.L., Eidson C.S., 1977; Lukert P.D., Davis R.B., 1984; Perelman В., Heller

E.D., 1983).

Специфическая профилактика ИББ проводится с помощью живых и инактивированных вакцин (Wyeth P.J., Gough R.E., Cullen G.A., 1981). При этом наряду с предупреждением прямых экономических потерь, обусловленных самой болезнью, вакцинация одновременно обеспечивает сохранность структуры и функции фабрициевой сумки, что гарантирует стабильность поствакцинального иммунитета против других инфекционных болезней птиц. Для изготовления живых вакцин используют природно-ослабленные или аттенуированные штаммы (Алиев A.C. и др., 1999; Ф. Фсннер., Б. Мак - Ослеп., С. Мимо., Дж. Сембрук., Д. Уайт., 1977).

Трудности в создании эффективного препарата против ИББ связаны со сложностью ослабления иммунодепрессивного действия полевого штамма, не снижая его иммуногенной активности, при этом основным свойством вакцинного штамма является его генетическая стабильность, исключающая возможность как реверсии вируса в патогенный, так и его дальнейшей спонтанной аттенуащш. В этой связи всестороннее изучение генетических маркеров, связанных с вирулентностью и иммуногенностью, а также условия культивирования и хранения вакцинного штамма вируса ИББ, предлагаемого для производства варусвакцины, имеет важное практическое значение (Голод Я.Р., 1975).

Интересы отечественного промышленного птицеводства настоятельно требуют разработки новых эффективных средств и методов специфической профилактики ИББ (Годизов П.Х., 2003).

Цель и задачи исследования. Целью исследования явилась разработка и внедрение в практику птицеводства эффективных средств и методов профилактики инфекционной бурсалыюй болезни. В соответствии с этим в задачи исследования входило:

1. Изучить распространение ИББ в ряде птицеводческих хозяйств.

2. Исследовать биологические свойства эпизоотических и эталонных штаммов вируса ИББ.

3. Разработать технологию изготовления вирусвакцины против ИББ.

4. Определить эффективность вирусвакцины против ИББ в лабораторных и производственных условиях.

5. Изучить действие лучистой энергии и ирлитов на формирование по-ствакциналыюго иммунитета против ИББ.

6. Разработать систему мероприятий по профилактике и борьбе с ИББ.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые проведено сравнительное изучение иммуногенных и реактогенных свойств некоторых вакцинных штаммов, предложен биологически активный, высо-коиммуногенный и ареактогенный штамм «CT» для производства вирусвакцины против ИББ.

Изучена динамика накопления вирусов в различных видах клеток. Определены оптимальные условия культивирования вируса ИББ в культуре ФЭК, ПЭК и перевиваемой культуре типа VERO и ВГМ - 70.

Изучено влияние различных защитных сред на инфекционную и иммуногенную активность штамма «СТ» при лиофилизации и хранении вируса.

Найдена высокопродуктивная система для культивирования вакцинного штамма и определены оптимальные условия его накопления.

Дана оценка чувствительности различных методов титрования вакцинного штамма «СТ». Показана стабильность основных иммунобиологических свойств - штамма «СТ» при длительном пассировании в культуре ФЭК, безвредность его для цыплят различного возраста.

Разработан способ изготовления вирусвакцины против ИББ и метод ее применения. Изучено влияние лучистой энергии и ирлитов на поствакцинальный иммунитет. Штамм паспортизирован и депонирован под №124-ДЕП во всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ).

Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц из штамма «СТ» признанна изобретением ФИПС от 15 февраля 2006.

Теоретическая и практическая значимость работы

Разработана технология изготовления вакцины против ИББ, метод ее контроля и условия применения. Изготовлены опытные серии сухой вирусвакцины против ИББ, которые использовались для профилактики болезни в неблагополучных хозяйствах.

Результаты диссертационной работы использованы в нормативно-технической документации на вирусвакцину против инфекционного бурсита кур», утвержденной директором ВНИВИП для опытно-промышленного производства указанного препарата.

Разработано временное наставление по применению сухой вирусвакцины против ИББ из штамма «СТ», утвержденного департаментом ветеринарии МСХ РСО - Алания.

Результаты научных исследований используются в учебном процессе при чтении лекции и проведении лабораторно-практических занятий со студентами по эпизоотологии в Ставропольском государственном аграрном университете, Горском государственном аграрном университете, Кабардино - Балкарской государственной сельскохозяйственной академии и в Санкт - Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.

Результаты исследований используются при разработке мероприятий против ИББ в угрожаемых и неблагополучных птицехозяйствах.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на XXXII Всесоюзной конференции молодых ученых и аспирантов по птицеводству (г. Загорск, 1989), Всесоюзной научно-практической конференции «Комплексная система ветеринарных мероприятий в птицеводстве - резерв повышения эффективности производства» (г. Ленинград, 1989), научно-производственной конференции Горского госагроуниверситета по итогам НИР (г. Владикавказ, 1995); Всероссий-

ской научно-практической конференции «Актуальные проблемы производства птицы и птицепродуктов и свинины в Российской Федерации (пос. Персиановский, 2004); Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы производства и применения биологических препаратов» (Алма-Аты, 2004); первом международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (Москва, 2005).

Результаты основных этапов исследований прошли комиссионную проверку и доложены на методических советах отдела вирусологии ВНИВИП (1988, 1989, 1990); заседаниях ученого совета ВНИВИП (1990); ученого совета факультета ветеринарной медицины Горского ГАУ (2002, 2003, 2004 - 2005); департамента ветеринарии МСХ PGO - Алания (2005). На кафедре инфекционных и инвазионных болезней Горского ГАУ (2006) и кафедре эпизоотологии Ставропольского ГАУ (2006).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 43 научные работы, из них 5 в центральных научных журналах и 4 монографии

Вопросы, выносимые на защиту.

1. Характеристика биологических свойств вакцинного штамма вируса ИББ.

2. Технологические параметры получения культуралыюго вирусного сырья для изготовления вакцины.

3. Результаты оценки безвредности и иммуногенной активности вирус-вакцины в лабораторных условиях.

4. Эффективность влияния лучистой энергии и ирлитов на поствакцинальный иммунитет против ИББ.

5. Специфическая профилактика ИББ птиц вирусвакциной из штамма «СТ»

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 280 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложений. Работа иллюстрирована 45 таблицами, 13 рисунками. Список использованной литературы включает 519 наименований, из которых 428 иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 1987 - 2005 гг. по отраслевой научно-технической программе НИР в отделе вирусологии Всесоюзного научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства, НИИ особо чистых биологических препаратов Министерства биологической промышленности РФ, Горском государственном аграрном университете, на Рязанской бройлерной птицефабрике и птицехозяйствах Северного Кавказа.

В работе использованы различные штаммы вируса ИББ: вакцинный штамм «СТ» вируса ИББ, реизолированный из коммерческой вакцины производства Голландия и модифицированный путем клонирования в культуре ФЭК под агаровым покрытием, эпизоотический штамм «27/94» выделенный в отделе вирусологии ВНИВИП в 1983 г, эталонный вирулентный штамм «52/70», полученный из Англии в 1986, а также вирусвак-цина «П-2» производства Германия.

Штаммы вируса ИББ хранили в лиофилизированном виде при температуре + 4 - 8° и при минус 20° в нативном виде.

В лабораторных опытах при изучении эффективности вирусвак-цины использовали 10 тыс. куриных эмбрионов, 65 тыс. цыплят кроссов «Бройлер» и «Хайсекс - белый», экспериментально зараженных вирусом ИББ.

Штаммы вируса ИББ, использованные в данной работе, проверяли по морфологическим, серологическим, антигенным, культуральным, вирулентным свойствам, а также по степени их устойчивости к воздействию физико-химических факторов по общепринятым методикам.

Морфологические свойства вируса изучали электронно - микроскопически совместно со старшим научным сотрудником ВНИВИП Баку-линым В.А.

' Предварительно материал осветляли в течение 10 минут низкоскоростным центрифугированием при 5000 об/мин, затем 1,5 ч при 30000 об/мин на ультрацентрифуге «Бэкман» в роторе Т-30. Центрифугат обрабатывали общепринятыми методами негативного контрастирования и иммунной электронной микроскопии.

В опытах по изучению интерфероногенной активности в качестве тест вируса использовали вирус везикулярного стоматита, штамм «Индиана», адаптированный к культуре клеток ФЭК (титр вируса - 5 ^ ТЦДбо/мл), и вирус ньюкаслской болезни, штамм Ла — Сота с активностью - 9 ЭИДзо/мл.

Для определения интерфероногенной активности испытуемый материал прогревали 30 мин на водяной бане при 70°С. Полноту инактивации вируса ИББ проверяли путем заражения культуры ФЭК. Полученные препараты интерферона центрифугировали 30 мин при 3000 об/мин и титровали методом уменьшения репродукции бляшек в культуре ФЭК.

Для изучения цикла репродукции штаммы вируса ИББ наносили на культуру ФЭК в дозе 0,1-1,0 ТЦД 50/мл на клетку и для адсорбции выдерживали 60 мин при 37°С, затем флаконы трехкратно отмывали раствором Хенкса, добавляли поддерживающую среду 199 с 2% сывороткой крупного рогатого скота и антибиотиками. Нулевую пробу брали сразу после отмывки. Зараженную и незараженную (контроль) культуру клеток инкубировали в стационарных условиях при 37°С. Степень развития ци-топатического эффекта устанавливали просмотром испытуемого материала под световым микроскопом через определенные промежутки времени. Одновременно отбирали пробы для определения титра вируса в жидкой и клеточной фазах.

При исследовании внутриклеточного вируса ИББ культуральную жидкость сливали в отдельный сосуд, а во флаконы в таком же объеме добавляли среду 199. Вирус освобождали из клеток быстрым трехкратным замораживанием при -20°С и оттаиванием при 37°С.

Образцы вируссодержащей жидкости делили на две части и до титрования на инфекционную и интерфероногенную активность хранили в холодильнике при-20°С. .

Активность внутри- и внеклеточного вируса ИББ в культуре ФЭК рассчитывали по методу Рида и Менча.

Бляшкообразуюшую способность вируса ИББ изучали по методике, изложенной в работе B.R. Cho et al. (1979).

Вирус культивировали в первично - трипсинизированной культуре и перевиваемых культурах клеток млекопитающих Vero и BGM - 70.

Пересев перевиваемых культур проводили каждые 3-4 дня после образования сплошного монослоя. Посевная концентрация клеток составляла -600-700 тыс./мл.

Первично - трипсинизированую культуру клеток куриных эмбрионов получали стандартным методом.

Концентрацию клеток доводили до 600-700 тыс подсчетом клеток в камере Горяева.

Для окраски клеток при подсчете использовали 0,5% водный раствор трипановой сини, которым концентрированную суспензию клеток разводили 1:20.

Заполнив камеры окрашенной суспензией, подсчитывали только живые клетки, окрашенные в голубой цвет в отличие от темных погибших клеток, и вычисляли их количество (х) в 1 мл концентрированной суспензии по формуле:

„ я-20-10000

X - искомое число клеток в 1 мл;

сX— количество клеток во всех квадратах;

20 - разведение суспензии клеток.

Биологические, антигенные и иммуногенные свойства вакцины изучали на СПФ - эмбрионах и цыплятах, а также цыплятах с материнским иммунитетом.

Вирус ИББ выделяли из фабрициевой сумки, печени, селезёнки, почек и тимуса 10-11 суточных СПФ - эмбрионов кур. При изучении биологических свойств вируса на СПФ - цыплятах патматериалом служил гомогенат зародышей, хорион-аллантоисная оболочка (ХАО) и алланто-исная жидкость заражённых эмбрионов.

Перед заражением эмбрионов готовили 10% вируссодержащую суспензию по общепринятой методике с добавлением антибиотиков из расчёта 100 ЕД/мл, проверяли на стерильность, инокулировали на ХАО в

объёме 0,2мл, затем инкубировали и вели наблюдение в течение 6-7 дней. Погибших в течение 24ч эмбрионов не учитывали.

При вскрытии зародышей с характерными признаками ИББ пат-материал пассировали 3-4 раза на СПФ - эмбрионах. Биологическую активность вируса определяли с использованием первично-трипсинизированной культуры фибробластов эмбрионов с учётом развития специфического цитопатического эффекта и антигенной активности с использованием РН и РДП.

Реакцию нейтрализации в культуре клеток проводили с использованием 100-200 ТЦД 50/мл вируса и 20 нейтрализующих доз сыворотки, определяемых титрованием вируса и антител.

Вируссодержащую культуральную жидкость предварительно центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 мин. Из надосадочной жидкости готовили десятикратные разведения на растворе Хенкса (10'1 -10"7). По 0,2 мл каждого разведения вируса, начиная с конечного, вносили в пробирки с культурой клеток, предварительно промыв монослой раствором Хенкса. Зараженную культуру клеток для контакта вируса с клетками выдерживали при 37°С в течение 60 мин, затем добавляли поддерживающую среду. Для контроля культуры клеток четыре пробирки оставляли не зараженными. Опытные и контрольные пробирки инкубировали при 37°С.

Учет результатов проводили на 5 и 7 сутки. Реакцию считали положительной, если специфическая сыворотка нейтрализовала ЦПД вируса в 50% пробирок, инокулированных вируссывороточной смесью. В отдельных опытах постановку РН осуществляли на СПФ - эмбрионах кур 10-11 - суточной инкубации.

РДП по методике Алиева А. С. и соавт.(1991г.) применяли для изучения преципитирующих антител в сыворотке крови цыплят, вакцинированных вирусом ИББ. В качестве антигена использовали гомогенат фабрициевых сумок цыплят, зараженных вирулентным штаммом «52/70» вируса ИББ.

Оценку иммуногенной активности вакцинного штамма «СТ» проводили на СПФ — цыплятах. При этом учитывали клинические признаки, патологоанатомические изменения, бурсальный индекс у цыплят в опытных и контрольных группах, 50%-ую иммунизирующую дозу (ИД50) определяли на СПФ - цыплятах 14дн возраста. Десятикратные разведения вакцинного штамма выпаивали цыплятам соответствующей группы. На 14-й день после иммунизации цыплят опытной и контрольной групп заражали йнтраназально вирулентным штаммом «52/70»в объеме 0,2 мл, содержащей 100 ИД50/МЛ. Наблюдение за птицей вели в течение 10 дней. По количеству защищенных цыплят высчитывали 50 % иммунизирующую дозу.

Оценку состояния фабрициевой сумки цыплят, до и после вакцинации и контрольного заражения, проводили по индексу — показателю соотношения массы сумки к массе тела цыпленка.

Устойчивость штамма «СТ» вируса ИББ к воздействию температуры изучали путем титрования вируссодержащей культуральной жидкости на культуре ФЭК после хранения ее в холодильнике при +4-6 0 С, в

термостате при 37 0 С водяной бане при +56, +60 +70°С в течение 0, 5 и 1 ч и в замороженном состоянии при - 35 0 С.

Устойчивость вируса к воздействию эфира и хлороформа изучали путем титрования вируссодержащей культуральной жидкости на культуре ФЭК после обработки ее 20% жирорастворителем. Контролем служила вируссодержащая культуральная жидкость, не подвергавшаяся обработке указанными жирорастворителями.

Для определения устойчивости вируса к различным значениям рН среды вируссодержащую культуральную жидкость по 2 мл разливали в пробирки, затем при помощи 0,1м раствора соляной кислоты и 0,1ы раствора едкого натра устанавливали рН. Правильность показаний рН контролировали на ионометре. Приготовленную вируссодержащую культуральную жидкость с указанными различными значениями рН в течение 1 ч выдерживали при комнатной температуре, затем рН в вируссодержащей культуральной жидкости доводили до значения 7, 4 - 7, 6 и проверяли биологическую активность вируса путем титрования на культуре клеток ФЭК.

На всех этапах исследований вируссодержащий материал провеяли на стерильность путем высева по 0, 25 мл вирусной суспензии в две пробирки с мясо - пептонным агаром (МПА), мясо — пептонным бульоном (МПБ), мясопептонным печеночным бульоном под вазелиновым маслом (МППБ) и среду Сабуро. Питательные среды с посевами выдерживали в течение 10 суток в термостате при 37-38°С (среду Сабуро -20-24°).

Отсутствие контаминации гемагглютинирующими вирусами проводили путем постановки реакции гемагглютинации с эритроцитами петуха. Отсутствие агглютинации вирусом инфекционного бронхита и аденовирусами птиц проводили заражением в аллантоисную полость СПФ -эмбрионов кур 9-10-дн инкубации в объеме 0,2 мл. Предварительно к вируссодержащей жидкости добавляли иммунную сыворотку в равном объеме. Полученную смесь оставляли на контакт в течение 1 ч при комнатной температуре. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубировали в течение 10 дней при температуре 37,5°С и относительной влажности 60-70 %. Эмбрионы просматривали ежедневно на овоскопе. Погибшие в течение 24 ч после заражения не учитывались. Все эмбрионы, павшие со 2 по 10-й день, а также оставшиеся в живых через 10 дней после инокуляции исследуемого материала, вскрывали и просматривали на наличие изменений, характерных для инфекционного бронхита и аденовирусной инфекции.

Контроль за отсутствием вируса оспы и инфекционного ларин-готрахеита проводили путем заражения 10-11 дневных эмбрионов на ХАО смесью вируса с иммунной сывороткой в объеме 0, 2 мл. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубировали в горизонтальном положении в течение 7 дней при температуре 37, 5 0 С и относительной влажности 60 - 70%.

Контроль на отсутствие вируса болезни Марека и энцефаломиелита проводили путем заражения 5 -6 дневных эмбрионов в желточный мешок смесью вируса с иммунной сывороткой в объеме 0, 2 мл. Заражен-

ные и контрольные эмбрионы инкубировали в течение 10 дней при температуре 37, 5° С.

Реверсибельность и стабильность иммуногенных свойств вакцинного штамма «СТ» определяли 20 последовательными пассажами в культуре клеток и 8 пассажами на цыплятах, полученных от кур СПФ-хозяйства.

Сохраняемость лиофилизированного вируса штамма «СТ» в ампулах и флаконах емкостью 20 и 250 см3при температуре хранения +4 -6°С и -15-18°С определяли титрованием в культуре ФЭК через 3, 6, 12, 18 и 24 месяца. О сохраняемости вируса судили по титру инфекционной активности.

Полученный экспериментальный материал обработан методом вариационной статистики (Е. К. Меркурьева и соавт., 1991).

В материалах исследований результаты математической обработки показаны:

- без литера обозначения - р > 0,05; -с литером обозначения -*-р < 0,05;

- с литером обозначения -**-р < 0,01;

- с литером обозначения -***-р < 0,001.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Изучение биологических свойств вакцинного штамма «СТ» вируса инфекционной бурсалыюй болезни кур.

В этой серии опытов использовали вирулентные' («52/70», «27/94») и вакцинные («П-2», «Д-78») штаммы вируса ИББ, которыми заражали эмбрионы различного происхождения.

Анализ результатов исследований дают основание считать, что наиболее чувствительными к вирусу ИББ являются эмбрионы СПФ и куры безлейкозной линии русской белой породы и перепелок, наименее чувствительными - эмбрионы уток. При заражении эмбрионов кур породы белый леггорн линий ь4 и К-5, русской белой линии 9787 и нечистоли-нейных вирус их гибели не вызывал.

После десяти последовательных пассажей вируса на СПФ - эмбрионах и эмбрионах кур безлейкозной линии отмечали повышение титра вируса, что, очевидно, связано с адаптацией его к данной системе.

Зараженные эмбрионы, независимо от используемого для инокуляции штамма, в значительной степени отставали в росте и развитии, особенно была заметна задержка образования перьев по сравнению с эмбрионами в контроле.

Заражение СПФ - эмбрионов на ХАО показало, что изучаемые штаммы вируса ИББ являются патогенными для 10-12 суточных СПФ -эмбрионов. Характерна 80-100% гибель эмбрионов на 3-6 сутки после заражения их эталонными и вакцинными штаммами в разведении 1:10. Павшие эмбрионы значительно отстают в росте и развитии. Однако при заражении эпизоотическим штаммом процент гибели СПФ — эмбрионов

на первом пассаже составил - 34,0%, втором -63,0%, третьем - 85,0 и на пятом пассаже - 100%.

Патологические изменения у павших эмбрионов при заражешш разными штаммами вируса ИББ были одинаковы и проявлялись в виде разлитых геморрагий на коже в области головы, шеи и конечностей. Зараженные эмбрионы заметно отставали в росте и развитии по сравнению с контрольными. Хорион-аллантоисная оболочка была утолщена, отечна и имела геморрагии. Наиболее характерные изменения отмечались в печени: резкое увеличение, наличие на поверхности и в паренхиме множественных некротических очажков различной величины, иногда она имела желтоватый цвет.

Результаты проверки биологической активности штаммов вируса ИББ на уровне разных пассажей на СПФ - эмбрионах кур показали, что по мере увеличения числа пассажей вируса на эмбрионах повышается его титр, что, очевидно, связано с адаптацией его к данной системе. Однако биологическая активность вируса колебалась в зависимости от исследуемого штамма и количества проведенных пассажей.

Титр для штаммов вируса «52/70», «Д-78», «27/94», «П-2» на первом пассаже был низким и составил 4,52±0,12, 3,98±0,21, 2,97±0,19и 3,91±0,20^ ЭИД50/МЛ соответственно.

В дальнейшем разница показателей титров изучаемых штаммов вируса ИББ была существенной и статистически достоверной ( р<0,05).

Максимальное накопление вируса было на пятом пассаже и составило 10 б,0,Ю 5"5, 10 4,5 10 5'°ЭИД50 /мл. При дальнейшем культивировании этих штаммов на эмбрионах показатели инфекционной активности сохранялись на том же уровне.

Наибольший титр вируса 10 б07ЭИД 50 /мл при заражении эпизоотическим штаммом отметили после 7-го пассажа.

Пик накопления вируса при заражении эталонными и эпизоотическим штаммами отмечался через 72 ч после заражения в гомогенатах зародышей и ХАО и составлял б,0±0,23; 5,75±0,17; 5,5±0,26; 5,0±0,14 ^ ЭИД50/мл соответственно. Максимальный титр штаммов «Д-78» и «П-2» ЭИД50/мл наблюдали через 96 ч при титрации гомогената зародышей, затем он снижался до 5,0±0,29,4,84±0,31 1§ЭИД50/мл через 120 ч после заражения. Задержка накопления штаммов «Д-78»и «П-2» в зародышах СПФ -эмбрионов указывает на то, что данные штаммы окончательно не адаптировались к СПФ - эмбрионам кур.

В аллантоисной жидкости концентрация вируса во всех случаях была 4,0^ЭИД5о/мл.

Таким образом, максимальная инфекционная активность штаммов вируса ИББ установлена в зародышах и ХАО зараженных эмбрионов, что дает основание рассматривать эти части эмбриона как место вирусной репродукции. Выявленная закономерность позволяет рекомендовать отбор зародышей и ХАО через 72 ч после заражения для накопления вирусной массы.

Сравнительный анализ динамики накопления вируса в эмбрионах, зараженных разными штаммами, свидетельствовал о том, что инфекционный процесс в эмбрионах имеет одинаковую картину и почти не зависит от штамма, используемого для заражения. Исключением являются штаммы «Д -78» и «П-2»,которые ранее были адаптированы к культуре клеток и при заражении СПФ - эмбрионов накапливаются в высоких титрах через 96 ч.

При определении чувствительности клеточных культур установлено, что вирус ИББ (шт."52/7О", «Д-78», «П-2» и "27/94") во всех 10 пассажах в культуре ФЭК и ПЭК размножался с наиболее выраженным цито-патическим эффектом и накоплением с высокой биологической активностью. Однако штаммы вируса ИББ значительно различались по способности размножаться как в первичной, так и перевиваемой культурах клеток. В результате пассажей на соответствующих культурах наблюдалась адаптация штаммов, но в культуре клеток типа Vero и BGM -70, хотя титры вируса от пассажа к пассажу увеличивались, но не достигали тех уровней, которые были установлены в культуре ФЭК и ПЭК. Штаммовые различия имелись также и при репродукции их в культуре ФЭК и ПЭК. Максимальные титры вируса выявлены в культуре ФЭК и ПЭК при заражении штаммами «Д-78» и «П-2», тогда как при заражении штаммами "52/70" и "27/94" выход был минимальным.

Динамика проявления цитопатических изменений в клетках при заражении их штаммами вируса «Д-78» и «П-2» отличается от сроков наступления деструктивных изменений при заражении культур клеток штаммами "52/70" и "27/94". Если штаммы «Д-78» и «П-2» вызывали ци-топатогенные действия в большинстве культур через 36-48 ч после заражения, то у двух других штаммов вируса они проявлялись через 72-96 ч. Обращает внимание более продолжительный срок проявления цитопато-генного действия вируса в перевиваемых клетках независимо от штамма, использованного для заражения.

Как показали исследования на основе цитопатического эффекта, инфекционная активность вируса ИББ может быть определена в культуре ФЭК и ПЭК. Перевиваемые клетки типа VERO и BGM-70 для этих целей в наших опытах оказались менее эффективными. Данные по инфекционной активности вируса при титрации на этих клетках и в культуре ФЭК и ПЭК не совпадают и дают большое расхождение.

Таким образом, изучение различных видов клеток для накопления и титрации вируса ИББ показало возможность использования культуры ФЭК и ПЭК для проведения исследований, однако доступность и экономичность культуры ФЭК делает ее наиболее выгодной для этих целей.

Кроме того, отмечена различная степень цитопатической активности, а также неодинаковые сроки ее проявления у разных штаммов вируса. Наиболее выраженным цитопатическим действием и максимальным накоплением вируса - 106,6 ТЦД50/МЛ минимальные сроки (48 ч) были ус-

тановлены в опытах, где культуру ФЭК заражали штаммом «Д-78».

Цитопатогенное действие вируса ИББ проявлялось в виде очагов дегенерации, состоящих из округлых, слегка увеличенных в размере и преломляющих свет клеток на фоне сохранившейся целостности монослоя, выраженной зернистости в цитоплазме. Контрольная ткань в это время представляла собой ровный монослой.

Выраженное накопление вируса 5,5±0,15 ^ ТЦД50/МЛ присходит через 24 часа и достигает максимума 6,2±0,08 ТЦД50/мл через 48 ч при множественности заражения 0,01 1« ТЦД50/мл. Введение высоких доз вируса хотя и вызывает сокращение времени максимального накопления вируса до 24 ч, но при дальнейшем пассировании наступает снижение титра вируса на 1-2 Накопление вируса коррелировало с развитием ци-топатических изменений.

Учитывая результаты опытов по заражению культур клеток разными дозами вируса, в качестве заражающей дозы использовалась 0,01 ТЦДзо на клетку.

По литературным данным феномен снижения титра вируса при заражении в высоких дозах связан с накоплением дефектных частиц вируса, которые способны размножаться в присутствии полноценных вирио-нов и при этом интерферировать с ними, что в конечном итоге приводит к снижению титра вируса.

Инфекционные вирионы и Ди-частицы функционально зависимы друг от друга. Взаимодействие этих вариантов приводят к цикличности их репродукции. Если Ди оказываются в относительном большинстве, то они ингибируют репродукцию полноценного вируса. Последний, будучи в малом количестве, недостаточно активно влияет на формирование Ди и интенсивность их образования начинает падать. В связи с этим репродукция полноценных вирионов вновь возрастает до тех пор, пока их множественность не становится оптимальной для генерации Ди.

Таким образом, из испытанных культур клеток наиболее эффективной оказалась культура фибробластов эмбрионов кур, особенно при заражении ее штаммом «Д-78». Максимальное накопление вируса установлено при множественности заражения 0,01 ТЦД50 через 24 ч после инокуляции, хотя цитопатогенное действие проявлялось через 48 ч.

Результаты исследований бляшкообразующей способности апато-генных штаммов вируса ИББ на агаре Дифко показали, что при заражении куриных фибробластов вирусом ИББ под агаровым покрытием образовывались бляшки размером 0,5-5 мм. Они появлялись на 3-4-е сутки после заражения культуры. При изучении влияния различных концентраций агара установлено, что оптимальным содержанием агара является 1 %, при котором вирус индуцировал образование наибольшего количества бляшек.

Для изучения чувствительности метода бляшек были проведены параллельные титрования вируса по цитопатогенному действию и методом бляшек. Установлено, что инфекционность вируса, определяемая методом бляшек, составила 107,0 - 107"5 БОЕ/мл, по цитопатической активности 105 5 - 106'5 ТЦД50/мл. Титры, полученные методом бляшек, несколько выше

титров, выраженных в ТЦД50. Разница между БОЕ и ТЦЦ50 составила 1-1,5 1«.

Популяции вируса ИББ по признаку размера бляшек выявили их неоднородность. Частота распределения бляшек различного диаметра была такова, что 70% составляли бляшки диаметром 0,5-1,5 мм и 30% - диаметром 3 мм, то есть вирусная популяция имела, в основном, мелкобля-шечную характеристику.

Для изучения корреляции между размером бляшек вируса, образуемых под агаровым покрытием, и патогенностью его для цыплят провели клонирование вариантов вируса ИББ, образующих крупные и мелкие бляшки под агаром.

Бляшки диаметром 1±0,5 мм считали мелкими и обозначали б-, диаметром 2,5±0,3 мм - крупными и обозначали

Было изучено по 6 клонов каждого варианта вируса в процессе 5 пассажей. Для получения клонов извлекали столбик агара над бляшкой, растирали в 1 мл среды 199, вносили в пробирки с монослоем культуры ФЭК, инкубировали 2-3 суток при 37°С. Наличие вируса регистрировали по цитопатическому эффекту.

Клон считали однородным, если пассируемый вариант вируса индуцировал образование только крупных или мелких бляшек.

Исследования патогенности вариантов культурального вируса ИББ в сравнении с патогенным штаммом "27/94" на чувствительных цыплятах показали (табл. 1.), что крупнобляшечные варианты вызывали поражения клоакальной сумки, которые выявлялись при вскрытии зараженных цыплят (10%) и гистологических исследованиях (60%). Варианты вируса ИББ, образующие мелкие бляшки, оказались апатогенными для СПФ-цыплят.

Таблица 1.

Патогенность для СПФ-цыплят вируса ИББ эпизоотического штамма «27/94» и двух вариантов штамма «Д-78» в культуре ФЭК, п=5

Ма п/п Показатель Процент поражения цыплят, зараженных разными штаммами вируса

Контрольная «27/94» «Д-78» в" «Д-78»

1 Гибель - 2 - -

2 Клиника - 80 - -

3 Патанатомия - 100 - 10

4 Патоморфоло-гия фабрицие-вой сумки - 100 - 60

Таким образом, генетическую однородность вирусной популяции штамма «Д-78» можно контролировать по размеру бляшек, что коррелирует с апатогешюстью его для цыплят. В опытах по клонированию бляшек установлена стабильность формирования бляшек одинакового размера.

Репродуктивные и протективные свойства выделенного клона вируса свидетельствуют о наличии инфекционной активности и иммуноген-ности, что подтверждено также лабораторными и производственными испытаниями.

При получении мелкобляшечиого клона вируса ИББ, его паспортизации для депонирования проведена значительная работа, подтвердившая существенные различия данного клона от исходного вируса, что позволило нам в дальнейшем мелкобляшечный клон вируса ИББ обозначить как штамм «СТ».

3.2. Патогенность вируса ИББ для цыплят.

У зараженных цыплят эталонным («52/70») и эпизоотическим («27/94») штаммами через 36-40 ч у 30-40% наблюдали вялость, общее угнетение. Несколько позднее наступала сонливость, птица сидела скученно, нахохлившись, со втянутой в туловище головой и опущенными крыльями. Развитие выраженных клинических признаков болезни отмечали на 5-6-е сутки, а на 8-9 сутки состояние цыплят быстро улучшалось. Смертность среди цыплят, зараженных эпизоотическим штаммом, составила 35%, а при заражении эталонным штаммом вируса — 40%.

Вакцинные штаммы «СТ» и «П-2» не вызывали клинических признаков заболевания у цыплят в течение 15 суток наблюдения. Птица была подвижна, охотно поедала корм.

При вскрытии павших и убитых больных цыплят, где для заражения использовали штаммы «52/70» и «27/94», наиболее выраженные изменения обнаруживали в фабрициевой сумке, у зараженных штаммами «СТ» и «П-2» поражение фабрициевой сумки и паренхиматозных органов выявить не удалось, что служило показателем авирулентности данных штаммов для цыплят.

Изучение инфекционного процесса у 35-дневных цыплят, зараженных разными штаммами вируса ИББ установлено, что на 2-7-е сутки после заражения вирусом ИББ (штаммы - «52/70» и «27/94») цыплята были угнетены, плохо поедали корм, наблюдалась диарея. Кал был жидкий, с неприятным запахом и большим количеством мочекислых солей.

От цыплят изолирован вирус из фабрициевой сумки, печени, селезенки, а в некоторых случаях из тимуса. В результате титрации вируса, выделенного из разных органов, установлено, что наибольшее накопление его (106,2 ЭИД50/МЛ) происходило в фабрициевой сумке через 72-96 ч после заражения.

Результаты опытов по заражению цыплят четырьмя штаммами вируса ИББ показали, что штаммы «52/70» и «27/94» вызывают сходные клинические признаки, патологоанатомические изменения, характерные для данной инфекции. В то же время среди цыплят, зараженных штаммами «СТ» и «П-2», не были отмечены видимые клинические признаки и патологоанатомические изменения.

При патоморфологических исследованиях фабрициевых сумок у зараженных цыплят штаммом «52/70» наблюдали некроз лимфоцитов и других клеточных элементов фолликулов, образование в их мозговом слое некротических очагов. Иногда выявляли случаи общего некроза большинства фолликулов, а у цыплят, зараженных штаммом «СТ», выявлены единичные фолликулы с некротическими фокусами в мозговом слое при сохранившемся корковом.

Результаты изучения патогенности разных штаммов вируса ИББ для цыплят свидетельствуют о том, что штамм «СТ» является авирулент-ным.

3.3. Морфология вируса.

Электронно-микроскопическое исследование культурального, эмбрионального вируссодержащего материала и гомогената фабрициевых сумок цыплят, зараженных разными штаммами вируса ИББ, обработанных методом негативного контрастирования, и последующее сравнение электроннограмм различных штаммов вируса ИББ показало полную их морфологическую идентичность.

Вирус ИББ обнаруживали в препаратах в виде отдельных вирио-нов или их скоплений с характерной икосаэдрической формой.

Вирусные частицы обладали кубическим типом симметрии, имели размеры 55-65 нм, содержали на грани по 4 капсомера величиной 8-9 нм. Вирионы не имели суперкапсидной оболочки, нуклеоид был покрыт одним слоем капсомеров.

В отдельных препаратах наблюдали цилиндрические формы вируса, иногда слегка изогнутые на одном конце. Вирионы с характерной структурой были округлой формы, диаметром 55 нм и более, цилиндрические структуры - 30-40; 93-570 нм. Последние имели один слой капсомеров размером 8-9 нм. Располагались цилиндрические структуры одиночно или группами по 2-6 параллельно друг другу, плотно прилегали или были разделены одиночными округлыми вирионами. Встречались цилиндрические структуры только в сочетании с типичными вирусами ИББ, частота обнаружения их в общем количестве исследованного материала незначительна (4 из 28 случаев).

Зависимости между формированием цилиндрических форм и биологической моделью, в которой культивировали вирус, не установлено.

В литературе имеются сведения о предрасполагающем влиянии смешанной инфекции на развитие аномальных форм вируса. Однако цилиндрических вирусоподобных структур в аллантоисной жидкости эмбрионов кур, зараженных патогенным штаммом «52/70» вируса ИББ и контаминированных аденовирусом, не регистрировали.

Иммунной электронной микроскопией с использованием антисыворотки к вирусу ИББ подтвердили вирусспецифичность цилиндрических структур, а иммуносорбентным методом и декорированием выявили анти-

генное родство их с вирусом ИББ.

Таким образом, морфогенез вируса ИББ сопровождается образованием антиген-родственных цилиндрических вирусоподобных структур, формирующихся в различных биологических моделях при использовании как вакцинных, так и патогенных штаммов вируса.

3.4. Гемагглютиннрующая и интерферогенная активность

вируса.

Вирус ИББ не обладает гемагглютинирующей способностью, поэтому проверка штаммов вируса на наличие контаминации гемагглютини-рующими агентами крайне важна.

Результаты опытов показали, что различные штаммы вируса ИББ, культивируемые на цыплятах, куриных эмбрионах и в культуре клеток, не вызывали агглютинацию эритроцитов петуха, барана, кролика, крысы, гуся, морской свинки и мыши. Вирус ныокаслской болезни, использованный в качестве контроля, агглютинировал эритроциты разных видов млекопитающих и птиц.

Таким образом, полученные результаты показывают, что штаммы вируса ИББ не обладают гемагглютинирующей активностью.

Интерфероны, продуцирующиеся в организме животных и птиц, являются одним из факторов неспецифической резистентности организма при вирусных заболеваниях. Однако они не могут спонтанно продуцироваться интактными клетками, следовательно, для образования интерферона (ИФ) нужны индукторы, каковыми могут быть синтетические и природные высокомолекулярные и низкомолекулярные препараты.

При изучении взаимосвязи между репродукцией различных по патогенности штаммов вируса ИББ и синтезом ИФ, выяснено действие экзогенного ИФ на размножение вируса и его интерфероногенную активность в культуре ФЭК.

Результаты изучения динамики накопления внутри- и внеклеточного вируса в культуре ФЭК при заражении эталонным («52/70») и вакцинным («СТ») штаммами вируса ИББ свидетельствуют о том, что в первые 2 ч в культуралыгой среде выявляли лишь остаточный вирус, затем титр его повышался. Оба штамма вируса ИББ в культуре ФЭК размножались одинаково. Вирус с титром 1,51 ^ ТЦД50/МЛ при заражении культуры ФЭК штаммом «СТ» зарегистрировали в клеточной фазе через 4 ч, а при инфицировании штаммом «52/70» - через 6 ч. Максимальный титр 4,51 ^ ТЦД50/МЛ внутриклеточного вируса отмечали спустя 24 ч. В дальнейшем активность внутриклеточного вируса штамма «52/70» оставалась почти без изменений, а «СТ» - несколько снижалась.

Максимальное количество интерферона в зараженной вирусом ИББ культуре ФЭК отмечали при наивысшей концентрации вируса в монослое. Аналогичную связь обнаружили 1.Се1Ь е1 а1. 2003 г.

Предварительный контакт клеток с интерфероном почти полностью подавлял репродукцию вируса, титр его в среде не превышал 1,5 ^ ТЦД50/мл в течение 5 суток (срок наблюдения) - это на 4,5-5,0 ^ ниже активности вируса в контроле (культуру ФЭК не обрабатывали интерфероном). В этих флаконах отсутствовало цитодеструктивное действие вируса.

Степень резистентности клеток при использовании интерферона в концентрации 25 ИЕ/мл в 2 раза ниже, чем в дозе 160 ИЕ/мл.

Следовательно, резистентность клеток находится в прямой зависимости от концентрации интерферона: увеличивая или уменьшая его дозу, можно регулировать уровень клеточного иммунитета.

3.5. Иммунодепрессивная и иммуногенная активность штамма «СТ».

Контроль вакцинного штамма на отсутствие иммунодепрессивно-го влияния является обязательным условием при разработке вирусвакци-ны против ИББ.

Результаты проверки вакцинного штамма на иммунодепрессив-ную активность, проведенные в сравнении с вирулентным вирусом, согласуются с данными литературы и не оставляют сомнения в том, что его применение даже среди СПФ — птиц в суточном возрасте не оказывает влияния на развитие иммунных процессов (табл, 2.).

Таблица 2.

Иммунодепрессивное влияние вируса ИББ на цыплят при вакцинации против ньюкаслской болезни, п=10

№№ п/п Группа цыплят Штамм вируса ИББ Вакцинированно против ныокас-лаской болезни Средний геометрический титр антигемагглю-тиннов через сут. 1о§2

7 14

1 Опытная «СТ» Ла-Сота 9,2 12,5

2 Опытная «52/70» Ла-Сота 3,4 3,1

3 Контрольная - Ла-Сота 10,5 14,2

4 Контрольная - - — 1,0

Результаты исследований дают основание считать, что вакцинный штамм «СТ» вируса ИББ безвреден для суточных цыплят, тогда как иммунодепрессивное влияние вирулентного штамма вируса для этой категории цыплят достаточно выражено.

В то же время введение цыплятам с материнскими антителами даже вирулентного штамма не оказывает влияния на результаты реакции птиц против ньюкаслской болезни.

Следовательно, пассивные антитела предупреждают не только клиническое проявление заболевания среди цыплят, но и обеспечивают сохранность морфологической структуры фабрициевой сумки, что необходимо учесть при составлении схемы вакцинации против ИББ.

При оценке иммуногенной активности штаммов использовали цыплят, доставленных из хозяйства, где не регистрируется острое течение инфекционных заболеваний, в том числе ИББ. При многократных исследованиях сыворотки крови цыплят 28-суточного возраста в РДП, во всех случаях получены отрицательные результата, хотя в суточном возрасте количество положительно реагирующих проб в РДП, составляло 100%. В опытах использовали вакцинный штамм «СТ», которым иммунизировали цыплят 14-, 21-й 28-дневного возраста однократно с водой в дозе 4 ^ ТЦД50/МЛ на голову.

Контрольное заражение цыплят из всех групп проводили вирулентным штаммом "52/70" вируса ИББ в дозе 100 ИДзо/мл через 21 день после вакцинации. Опыты проводили в сравнении с коммерческой вакциной (П-2).

Результаты исследований показали, что иммунизация цыплят разного возраста вакцинным штаммом «СТ» обеспечивает различный процент защиты. Наибольший иммунологический эффект (95%) вакцинный штамм обеспечивает при иммунизации цыплят в 28-суточном возрасте. Введение этой же дозы вакцины цыплятам 14- и 21-суточного возраста создает иммунитет у 75% и 80% птицы соответственно.

Таким образом, проверку иммуногенной активности вакцинных штаммов вируса ИББ следует проводить на цыплятах 28-суточного возраста из промышленного стада или на СПФ-птице 7-и 14-суточного возраста.

Иммуногенная активность (ИмД5о/мл) вакцинного штамма «СТ», титрованного на цыплятах 28-дневного возраста, составила 1,36 ^ ТЦД50/мл.

3.6. Контагиозность, безвредность и реверсибсльность штамма «СТ».

Изучение возможности контактной передачи вакцинного штамма от иммунизированной птицы к неиммунной в условиях неблагополучия хозяйства имеет большое значение, так как цыплята с материнским иммунитетом, по мере снижения его уровня, могут быть в контакте с вак-

цинным штаммом и отвечать иммунологической реакцией.

С этой целью СПФ-цыплят в количестве 20 голов разделили на две группы и содержали в двух изолированных боксах. 10 цыплят опытной группы были иммунизированы вакцинным штаммом «СТ» с водой в дозе 3,3 ^ ТЦЦ50/мл в 14-суточном возрасте. Остальных 10 цыплят этой группы не иммунизировали. Контролем служили 10 неиммунизированных цыплят, содержащихся в отдельном боксе.

Контрольное заражение проводили в 28-суточном возрасте. Наблюдения за зараженной птицей вели в течение 10 суток.

Иммунизация СПФ-цыплят аттенуированным штаммом вируса ИББ вызвала выраженную сероконверсию у иммунизированных и контактных цыплят. Однако у последних специфическая сероконверсия носила несколько менее выраженный характер. Введение вирулентного вируса ИББ при контрольном заражении сопровождалось дальнейшим увеличением титра специфических антител.

Феномен контагиозности считаем полезным свойством вакцинного штамма «СТ», так как он может способствовать иммунизации птиц, содержащихся совместно с вакцинированными и позволяет устранить возможные погрешности при проведении специфической профилактики ИББ.

Живые вакцины имеют ряд преимуществ перед инактивирован-ными. Они являются более высокоиммуногенными, значительно дешевле и просты в употреблении, так как их можно применять интраназалыю, окулярно, методом выпаивания и аэрозольно.

Вместе с тем, основным недостатком живых вакцин является их реактогенность.

В связи с этим при разработке вакцины против ИББ штамм «СТ» проверяли на безвредность. Для этого СПФ-цыплятам 14-суточного возраста вводили перорально вирус в дозе 4,3 ^ТЩЦо/мл и в контроле оставляли 15 невакцинированных СПФ-цыплят. Наблюдения вели в течение 14 сут.

Из обобщенных данных этих исследований (табл. 3.) следует, что во всех опытах вакцинный штамм «СТ» при введении цыплятам в десятикратной дозе не вызывал клинических признаков заболевания и пато-логоанатомических изменений в течение всего срока наблюдения. В фаб-рициевой сумке цыплят подопытных групп не выявлены патологоанато-мические изменения, характерные для ИББ. Установленные морфологические изменения в пределах 1,8 баллов следует рассматривать как иммунологическую реакцию организма на введение вируса ИББ.

Проверку вакцинного штамма «СТ» вируса ИББ на реверси-бельность проводили 10 последовательными пассажами на СПФ-цыплятах 21-суточного возраста. Для этого СПФ-цыплятам в количестве 20 голов перорально вводили 0,5 мл вакцинного штамма в дозе 5,4 ^ ТЦД50/МЛ. В опыте использован вирус 10 пассажа в культуре ФЭК с активностью 6,3 ^ ТЦД50/мл.

Таблица 3.

Реактогснность вакцинного штамма «СТ» вирусвакцины против

ИББ, п=5

Результаты исследований

Исследуемый вариант Номер пассажа Кол-во цыплят Клиниче- Паталогоа-натомиче-ские Паталогомор- Бусаль- ный индекс

ские фологические

Штамм «СТ» 1 15 0/15 0/15 0,95 4,1

«« 5 15 0/15 0/15 0,20 4,5

и 10 15 0/15 0/15 1,10 4,4

4С 20 15 0/15 0/15 0,75 4,4

Контроль - 15 0/15 0/15 0,50 4,9

Примечание: в знаменателе - количество исследований;

в числителе - количество положительных результатов

На 4 сутки после введения вакцинного штамма половину цыплят убивали, извлекали у них фабрициевые сумки, за остальными в течение 15 суток вели клинические наблюдения, после чего патологический материал от них исследовали гистологически, а сыворотку крови проверяли в РДП с антигеном вируса ИББ. Второй и последующие пассажи проводили, как и первый, но в качестве вируссодержащего материала брали гомогенат фаб-рициевых сумок цыплят предыдущего пассажа в разведении 1:10. Одновременно патологический материал каждого пассажа исследовали гистологически.

Данные исследования показали, что на протяжении Юти пассажей на СПФ-цыплятах вакцинный штамм не вызывал клиническую и па-талогоанатомическую картину заболевания, то есть, пассирование вируса не приводило к усилению его вирулентности на СПФ- цыплятах.

3.7. Влияние светолазернон обработки икубационных яиц на иммуногениую активность вирусвакцины из штамма «СТ».

Вирусвакцина против ИББ оказывает иммунодепресивное влияние на организм птицы, что в свою очередь вляиет на поствакцинальный иммунитет.

Обработка эмбрионов в процессе инкубации малыми дозами излучения лазера ЛГН-104, ламп ДНЕСГ- 500, ДРТ-400 и БУВ -15 не подавляют, а стимулирует развитие птицы в натальный период. Вывод жизнеспособных цыплят нарастает с увеличением интервалов между светообра-ботками, достигая максимального значения при 4-, 5-, 6-, и 7-дневных интервалах.

Выведенные суточные цыплята отличаются большей подвижностью, реакцией на корм и воду.

Инкубационные яйца перед закладкой для инкубации подвергали обогреву лучистой энергией газоразрядной лампы ДНЕСГ-500 длиной волны 630-650 нм дозой на поверхности яиц 23.1 эрг в экспозиций 5 минут с последующей обработкой светом гелий-неонового лазера ЛГИ- 104, длиной волны 632,8 нм, поверхностной плотностью потока оптического излучения 50 мВт/см2. С ртутно - кварцевой лампы ДРТ- 400, длиной волны 185-400 нм, средней дозой на поверхности яиц 20 мэр/ч в экспозициях по 3 минуты.

Для определения положительного эффекта напряженности иммунитета у цыплят, полученных из яиц после светолазерной обработки эмбрионов, были проведены исследования.

Первичную вакцинацию цыплят во всех опытных группах проводили в 7, 14 и 21- дневном возрасте. Ревакцинация во всех группах проводилась через семь суток после первой вакцинации. Заражение цыплят подопытных и контрольной групп проводили вирулентным штаммом «52/70» в дозе 100 ИД 5о/мл через 14 суток после ревакцинации по возрастным группам цыплят.

Опыты показали, что при ревакцинации цыплят через 7 суток эффективность применения вакцины среди птицы с пассивным иммунитетом и прошедшие комплексную светолазерную обработку значительно выше.

Результаты исследования уровня пассивного иммунитета у цыплят в контрольной и опытных группах в зависимости от возраста птиц показали, что в 7- суточном возрасте титр составил 4,7 к^2, затем постепенно снижался и составил в возрасте 14 суток - 3,2 1а&2, в 21-суток - 2,8 1о§2, 28 суток и старше их уровень был ниже 2,0 ^2 (табл.4).

Титры вируснейтрализирующих антител во всех группах после ревакцинаций имели тенденцию к увеличению. Наиболее высокий уровень антител установлен в 4-5-6 группах, полученных после комплексной прединкубационной светолазерной обработки эмбрионов и вакцинированных двукратно вирус вакциной из штамма «СТ».

Таким образом, лучшие результаты напряженности иммунитета и выживаемости птицы, контактирующей с вирусом инфекционной бурсальной болезни, а также улучшение физиологических показателей жизнеспособности цыплят в процессе выращивания наблюдается при комплексной предынкубационной светолазерной обработке эмбрионов кур.

Однако необходимо учитывать, что в зонах циркуляций высокопатогенного вируса заражение птиц происходит до того, как применяющиеся апатогенные вакцинные штаммы могут преодолеть барьер материнских антител, а также, учитывая то, что стадо имеет «мо-заику»иммунитета в среднем титре антител, применение светолазерной обработки, способствующей выравниванию и улучшению по-ствакциналыюго иммунитета, является актуальным

Таблица 4

Эффективность вакцинации против ИББ птиц экспериментальной вирус вакциной из штамма «СТ» после прединкубационной светола-зерной обработки эмбрионов кур, п=5

Группа цыплят, полученных после светолазерной Возраст птицы при вакцинации Средний геометрический титр антител до Результаты контрольного заражения Иммунных %

№ № обработки и вакцинированные вирус-вакциной из штамма «СТ» пер ВИЧ но вторим но вак-ци-нации зараж ения Кол- во цыплят Заболело выжило

1 7 14 4,7 5,6 100 3 97 97

2 ЛНГ-104 14 21 3,2 6,65 100 1 99 99

3 21 28 2,8 7,5 100 0 100 100

4 | А СС 7 14 4,8 6,2 100 1 100 99

5 2 11-2 о & а** к ч в 5 [1 и о о К г; <= х о а ^ ^ С: 3 с <-> н ш тг £ а 5 | = н 14 21 3,1 8,7 100 0 100 100

6 21 28 2,8 8,75 100 0 100 100

7 7 14 4,3 5,2 100 4 96 96

8 • = - " *} ® О Св 5. 14 21 2,7 6,15 100 3 97 97

9 Си а О. £С К 1С 21 28 2,0 7,2 100 0 100 100

10 Контроль - - 1,6 100 100 0 0

3.8. Влияние бентонитовых глин на формирование иммунитета против ИББ.

Применение живых вакцин, в частности, против ИББ, оказывает некоторое негативное действие на иммунную систему, в том числе на фабрициеву сумку.

По данным Дзагурова Б.А. (2003), бентонитовые глины при скармливании птице стимулируют резистентность и повышают продуктивность.

Обнаруженные в Республике Северная Осетия Алания бентонитовые глины, сходны по своему внешнему виду и физико- химическим свойствам с цеолитами, которые были условно названы «Ирлит -I» и «Ир-лит -7».

Ирлиты обладают уникальными адсорбционными, ионообменными молекулярно ситовыми, каталитическими свойствами, обуславливающими их положительное влияние на физиологическое состояние птицы. Ирлиты как цеолиты и бентониты способны адсорбировать углекислый газ, метан, сероводород, аммиак, некоторые азотистые соединения. Проходя с кормом через желудочно-кишечный тракт, удаляют из просвета желудочно-кишечного тракта избыток жидкости, вредные газы, эндотоксины, благодаря чему предотвращается понос у птицы.

Химический состав ирлитов включает большой набор макро- и микроэлементов. Относительная мягкость и присутствие в породе значительного количества монтмориллонитов обуславливает распад ирлитов в желудке на мельчайшие частицы, что исключает травмирование слизистой желудочно-кишечного тракта.

В связи с этим, для определении эффективности добавок ирлитов 1 и 7 и их смеси в комбикормах для птицы, были поставлены опыты на суточных цыплятах. Для исследования было отобрано 5 групп цыплят (1-контрольная и 4- опытные по 200 голов в каждой).

Молодняку 1-2-и 3- опытных групп дополнительно к основному рациону скармливали ирлит 1 и 7(1:1) по 4%, для 4-группы-6,0% от сухого вещества рациона.

Птица имеет короткий пищеварительный тракт, и питательные вещества кормовой массы по нему проходят быстро, не успевая полностью всасываться в организм, что существенным образом увеличивает количество используемого корма.

Любые факторы, снижающие скорость прохождения корма , повышают эффективность действия пищеварительных ферментов на расщепление корма и в конечном счете повышают конверсию корма.

Коэффициенты переваримости питательных веществ во всех опытных группах были выше, чем в контрольной. Наиболее высокие коэффициенты переваримости были получены в 3-опытной группе, которая получала 4% смеси ирлитов. В этой группе переваримость сырого протеина была выше на 5,8%, а жира - на 5,9%, клетчатки - на 3,4% , БЭВ - на 4,5%, чем в контроле.

Следовательно, смесь ирлитов 1 и 7 (1:1) в дозе 4,0% оказала наиболее благотворное влияние на переваримость питательных веществ рациона.

Биохимическими исследованиями выявлено, что наиболее благоприятное действие на организм птицы оказала смесь ирлитов 1 и 7 (1:1) в дозе 4% от сухой массы рациона. Таким образом, проведенные исследования показали, что добавление в рацион птицы ирлитов способствует повышению резистентности птицы, следовательно, может усиливать поствакцинальный иммунитет против ИББ птиц.

Известно, что последствия иммунодепрессивного влияния вируса ИББ особенно сильно проявляются у цыплят раннего возраста и выражаются двояко: во-первых, снижением иммунного ответа больной птицы на введение других антигенов, во-вторых, увеличением срока персистен-ции в организме инфекционного агента, по отношению к которому имму-нодепрессия была проявлена.

С учетом вышеизложенного проведены исследования по определению эффективности вирус вакцины из штамма «CT» при эптералыюм методе применения с добавлением в корм смеси ирлитов 1и7(1:1)в дозе 4% сухой массы рациона.

В опытах использовали экспериментальную вакцину, проверенную на стерильность, безвредность, имеющую титр биологической актив-

ности 10 6'5 ТЦД50/МЛ. В опыте использовались цыплята 7-, 14-, 21- и 28-суточного возраста. Молодняку 1-,2-,3-, и 4- опытных групп в рацион ввели с первого дня жизни, смесь ирлитов для цыплят 5-, 6-, 7-и 8- групп смесь ирлитов из рациона исключили.

Вторичную вакцинацию во всех группах птиц проводили через 7 суток после первой.

Заражение цыплят подопытных групп вирулентным штаммом «52/70» в дозе 100 ИД 50 / мл проводили через 14 суток после ревакцинации.

Результаты исследований показали (табл. 5.), что титр антител в группах, где в рацион добавляли смесь ирлитов 1 и 7, выше, чем в группах, где ирлиты не добавляли в рацион птицы, а процент защиты после контрольного заражения составил в 1- и 4- группах 96,6 - 100 %, а в группах 5 и 8 ниже в среднем на 1-2 % .

Таким образом, эффективность вирусвакцины из штамма «СТ» при энтеральном методе применения с добавлением в корм смеси ирлитов 1 и 7 (1:1) в дозе 4% сухой массы рациона способствует повышению устойчивости птицы и одновременно стимулирует образование более высокого иммунитета против инфекционной бурсальной болезни.

Таблица 5.

Эффективность вакцинаций против ИББ птиц вирусвакциной из штамма «СТ» с применением ирлитов, п=5

№№ Группа цыплят Возраст птицы при вакцинации Средний геометрический титр антител до Результаты контрольного заржения 1 Иммунных %

I | первично вторично вакцинации заражения Кол-во цыплят заболело выжило 1

1 Вакцинарно с добавлением смеси ирлитов в рацион 7 14 4,4 6,8 100 4 97 96,6

2 14 21 2,7 8,0 100 3 97 97

3 21 28 2,0 8,75 100 0 100 100

4 28 35 1,6 8,60 100 0 100 100

5 Вакцинарно без добавления смеси ирлитов в рацион 7 14 4,3 4,4 100 5 95 95

6 14 21 2,6 7,25 100 4 96 96

7 21 28 2,1 8,1 100 0 100 100

8 28 35 1,7 8,0 100 0 100 100

9 Контрольная - - 1,7 100 100 0 0

4. ТЕХНОЛОГИЯ ИЗГОТАВЛЕНИЯ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ИЗ ШТАММА «СТ» И ИЗУЧЕНИЕ ЕЁ СВОЙСТВ

При разработке технологии изготовления сухой вирусвакцины из штамма «СТ» были проведены исследования по определению оптимальной иммунизирующей дозы, сроков сбора вируссодержащей культуральной жидкости и изучение влияния среды высушивания на сохранение активности вируса в процессе лиофилизации.

Исследования показали, что оптимальная заражающая доза, обеспечивающая получение вирусного материала с наибольшей инфекционной активностью, составила 0,01 ТЦД50 на клетку, сроки сбора вируссодержащей культуральной жидкости - 48-72 ч после заражения культуры, а биологическая активность вируса при использовании защитной среды ВГНКИ и обезжиренного молока сохранялась в течение 12 мес при температуре 4-8°С на уровне 6,2 ^ ТЦД 50/мл.

4.1. Стабильность биологических свойств.

Установлено, что биологическая активность вирулентных и ави-рулентных штаммов при пассировании на эмбрионах и в культуре клеток сохраняется на одном уровне, что свидетельствует о стабильности данного признака для указанных штаммов вируса ИББ.

При заражении цыплят вирусом на уровне 5-, 10-, 15- и 20-го пассажей заболевание у цыплят проявлялось однотипно и характеризовалось, как правило, острым течением, отказом от корма, угнетением и диареей. Во всех случаях отмечали падёж птицы.

Изучение патогенности < вакцинного штамма «СТ» разных пассажей на чувствительных цыплятах показало, что он является стабильно авирулентным.

На основании экспериментальных данных изучения иммунобиологических свойств вакцинного штамма «СТ» против ИББ, в соответствии с приказом Директора ФГУ ВГНКИ, было проведено комиссионное испытание штамма «СТ» вируса ИББ.

Испытание штамма проводили согласно плану апробации, утверждённому директором (ФГУ ВГНКИ) ветпрепаратов.

Штамм был проверен на стерильность, контамацию микоплазма-ми и вирусами, биологическую активность, безвредность, иммуногенность и специфичность.

Комиссия отметила, что апробируемый штамм «СТ» свободен от контаминатов, биологически активен (титр вируса 6,5 ^ ТЦД50/мл), безвреден для цыплят, обладает выраженными иммуногенными свойствами и рекомендован как производственный штамм.

4.2. Отработка режима лиофилизации для производства ви-русвакцины ИББ.

Создание новых биопрепаратов медицинского и ветеринарного назначения предусматривает изготовление их в сухом виде.

В качестве стабилизатора использовали обезжиренное молоко и защитную среду по прописи ВГНКИ.

Опыты по определению оптимального состава защитных добавок при лиофильной сушке показали, что вакцинный штамм «СТ» на уровне 10-го пассажа сохраняет инфекционную активность в течение 12 мес при 4-8°С.

Опытные серии вакцины из штамма «СТ» готовили из лиофили-зированной маточной расплодки 10-го пассажа (активность 6,2 1§ ТЦД50/мл). Заражение культуры клеток ФЭК вирусом ИББ проводили из расчета 0,01 ТЦД50 на клетку.

Для изготовления вакцины использовали стерильную в бактериальном отношении культуральную жидкость, которую сливали в асептических условиях в один сосуд и проверяли на наличие контаминации ге-магглютинирующими вирусами. Перед лиофилизацией вируссодержащую массу смешивали в равных по объему соотношениях со стерильной защитной средой (обезжиренное молоко и среда ВГНКИ), разливали в ампулы по 5 мл, флаконы вместимостью 40 см3 по 10 мл или флаконы вместимостью 250 смЗ по 40 мл, а затем лиофилизировали. Результаты приведены в таблице 6.

Таблица 6.

Биологическая активность вирусвакцины из штамма «СТ» при различных условиях лиофилизации и сроках хранения

Условия лиофилизации вируса Исходная В ТЦД50/ мл После сушки в ТЦД50/м л Срок в месяцах

Стабилизатор фасовка Объем (мл) Наличие

3 6 12 18 24

ВГНКИ ампулы 5 вакуум 6,2 6,2 6,2 6,1 6,0 6,2 6,0

флаконы 10 вакуум 6,2 6.2 6,1 6,2 6,2 6,2 6,1

С ( 5 азот 6,2 6,1 6,1 6,0 6,1 6,1 6,1

« 1 40 вакуум 6,2 6,0 6,0 6,1 6,0 6,0 6,0

( с 40 азот 6,2 6,1 6,1 6,0 6,1 6,1 6,1

Обезжиренное молоко ампулы 5 вакуум 6,2 6,2 6,2 6,0 6,2 6,1 6,0

флаконы 10 вакуум 6,2 6,2 6,0 6,2 6,1 6,2 6,1

5 азот 6,2 6,0 6,0 6,0 6,1 6,0 6,0

( 4 40 вакуум 6,2 6,1 6,1 6,1 6,0 6,1 6,0

1 « 40 азот 6,2 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0 6,0

Результаты исследований свидетельствуют об одинаковой эффективности защитных сред разного состава. Лиофилизация вакцины как в ампулах под вакуумом, так и во флаконах под вакуумом или азотом обеспечивает сохранность его иммунобиологических свойств. Подтверждением тому служат данные по биологической активности и результаты проверки на иммуногенную активность.

Учитывая то, что обезжиренное молоко более доступно и использование его для производства вакцины экономически выгодно, считаем лиофилизацию вакцины против вируса ИББ целесообразно проводить с обезжиренным молоком.

Лиофилизация культуральной вируссодержащей суспензии обеспечивала получение аморфной мелкозернистой массы, которая при добавлении физиологического раствора или дистиллированной воды быстро растворялась (1-2 мин). Массовая доля влаги в изготовленных опытных сериях сухой вирусвакцины колебалась от 2,6 до 2,8%

Опытные серии вакцины были свободны от бактериального и грибкового загрязнения.

Безвредность каждой серии вакцины и иммуногенность всех серий вакцины проверяли в виварии ВНИВИП на 20 цыплятах путем выпаивания десятикратной дозы вакцины (4,3 ^ ТЦД50/мл).

Иммуногенность опытных серий вакцины проверяли на цыплятах путем выпаивания с питьевой водой в объеме по 10 мл из разведений 1:500 и 1:1000.

По результатам исследований, все вакцинированные цыплята после контрольного заражения оказались иммунными, за исключением цыплят из группы, где вакцину разводили 1:1000. В этой группе из 100 зараженных 8 цыплят заболели, 3 пали. Контрольные цыплята заболели в 100% случаев, а отход среди них составил 28%.

Рассматривая в целом полученные данные, можно констатировать, что изготовленные опытные серии вирусвакцины (3 млн. доз) были безвредны для цыплят и иммуногенны.

Таким образом, изготовление и испытание вакцины из штамма «СТ» в лабораторных условиях показали возможность накопления вируссодержащей жидкости в больших объемах и получения биопрепарата, безвредного для цыплят и обеспечивающего защиту при заражении их вирулентным штаммом.

4.3. Определение 50%-ной иммунизирующей дозы опытных серий вакцины.

Иммунизирующую активность (ИмД50) трех серий вакцины (две серии с титром 6,00 ^ и одна серия - 6,20 ^ ТЦД50/мл) определяли путем выпаивания ее с питьевой водой.

Разведенный вирус (10"'-10"5) выпаивали с питьевой водой по 5 мл на каждого цыпленка. На каждое испытуемое разведение вируса брали по 10 СПФ-цыплят 14-дневного возраста. В качестве контроля использо-

вали 10 СПФ-цыплял, которых до контрольного заражения содержали изолированно.

Через 14 сут после вакцинации опытные и контрольные группы цыплят заражали вирулентным штаммом «52/70» в дозе 100 ИД50/МЛ. За инфицированной птицей вели ежедневное наблюдение в течение 10 сут. Павших птиц подвергали патологоанатомическому вскрытию.

В результате исследований установлено, что иммунизирующая доза опытных серий вакцины из штамма «СТ» при выпаивании вакцины с питьевой водой составила 1,43 ^ ТЦД50/МЛ.

4.4. Срок образования и продолжительность иммунитета у птиц, привитых вирусвакциной «СТ».

В лабораторных исследованиях определен срок наступления и длительность иммунитета у СПФ-цыплят, однократно привитых путем выпаивания экспериментальной вакцины с питьевой водой.

В опытах использованы 140 СПФ-цыплят 14-суточного возраста, которых выпаивали вакциной в разведении 1:500 по 5 мл при инфекционной активности 6,2 ^ ТЦД50/мл. Контролем служили 70 невакцини-рованных цыплят.

Наличие иммунитета проверяли через 7, 10, 14, 21, 28, 42, 56 суток после однократной вакцинации путем определения уровня вируснейт-рализующих антител в сыворотке крови и контрольного заражения вирулентным штаммом «52/70» вируса ИББ. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 7.

Таблица 7.

Напряженность иммунитета при однократной вакцинации 14-суточных СПФ-цыплят вакциной из штамма «СТ», п=5

Сроки ис- Средний геоме- Результаты контрольного заражения

следования трический титр

(сут.) в РН (1о§2) кол-во заболело выжило процент

цыплят зашиты

7 3,2 10 6 4 40,0

10 4.8 10 3 7 70.0

14 8,6 10 0 10 100.0

21 8,8 10 0 ю 100.0

28 9,4 10 0 10 100,0

42 8,4 10 0 10 100,0

56 8,0 10 0 10 100,0

Контрольные 70 70 0 0

невакцинированные

Установлено, что цыплята, однократно привитые сухой вирус-вакциной из штамма «СТ» путем выпаивания с питьевой водой, через 14 суток после вакцинации и в течение 56 суток были иммунны в 100%-ах случаев, а в контрольной группе все цыплята заболели с характерной картиной заболевания, отход составил 24,3%.

Активность вируснейтрализурцих антител спустя 7 суток после вакцинации составила 3,2 ^2, к 14 суткам - 8,6 к^2. Максимальный титр антител выявлен на 28 сутки после вакцинации и сохранялся практически на этом уровне до конца опыта.

Таким образом, проведенные исследования в экспериментальных условиях свидетельствуют о высокой иммуногенной активности вакцины из штамма «СТ».

4.5. Показатели однократной и двукратной иммунизации птиц вирусвакциной «СТ».

В лабораторных условиях ВНИВИП » на цыплятах 7-, 14-, 21-й 28-суточного возраста породы "Хайсекс белый" были испытаны различные схемы иммунизации птиц против ИББ путем выпаивания экспериментальной вакцины из штамма «СТ» с инфекционной активностью 6,2 ТЦД50/мл.

Вакцину в разведении 1:500 выпаивали цыплятам первой группы по 4 мл, второй - по 5 мл, остальным возрастным группам - по 10 мл. В опытных и контрольной группах было по 25 цыплят.

Перед вакцинацией у цыплят каждой возрастной группы определяли уровень пассивного иммунитета по наличию вируснейтрали-зуюищих и вируспреципитирующих антител.

Иммуногенность вакцины оценивали на 21 сутки по данным серологических исследований в РДП и РН, результатам контрольного заражения и патологоанатомическим изменениям в фабрициевой сумке цыплят опытных и контрольной групп после заражения их вирулентным штаммом «52/70».

Результаты исследований показали (табл.8), что устойчивость к контрольному заражению имели 60% цыплят, вакцинированных в 7-суточном возрасте. Птица, иммунизированная в 14-суточном возрасте, имела защиту против патогенного вируса ИББ в 65% случаях.

Вакцинация молодняка в 21- и 28-суточном возрасте обеспечивала стойкий иммунитет у 75 и 90% цыплят соответственно.

Результаты исследований на наличие пассивного иммунитета у птицы показали, что уровень пассивного иммунитета в 7-суточном возрасте был 5,4 1о§2, к 14-дневному возрасту титр антител снизился до 3,6 1о§2, а у 28-суточшх цыплят составил 1,8

Таблица 8.

Результаты контрольного заражения птицы, однократно вакцнниро-____ ванной против ИББ, п=5_

Группа Возраст при Кол-во Средний геометрический титр антител до: Результаты контрольного заражения

цыплят вакцинации цыплят вакцина ции зара же-ния кол-во цыплят заболело выжило % защи ты

Вакцинированные 7 25 5,4 3,8 20 11 11 60,0

Контрольная 7 25 — 1,8 20 18 2 ю,

Вакцинированные 14 25 3,6 4,4 20 7 13 65,0

Контрольная 14 25 — 1,2 20 20 0 0,0

Вакцинированные 21 25 2,8 5,6 20 5 15 75,0

Контрольная 21 25 — 1,0 20 20 - 0 0,0

Вакцинированные 28 25 1,8 7,0 20 2 18 90,0

Контрольная 28 25 - 1,0 20 20 0 0

Через 21 сутки после вакцинации титр вируснейтрализующих антител у птицы, привитой в 7-суточном возрасте, составил 3,8 1о§2. Применение вакцины у 14-суточных цыплят вызвало увеличение титра вирус-нейтрализущих антител до 4,4 Наиболее высокий ответ установлен при вакцинации в 21 - и 28-суточном возрасте (5,6 и 7,0

Литературные данные и анализ эпизоотических вспышек ИББ в нашей стране показывают, что наиболее восприимчивый возраст птиц к данному возбудителю - 30-40 суток.

Следовательно, однократная вакцинация цыплят в 7- и 14-суточном возрасте не может обеспечить профилактику острых вспышек заболевания среди цыплят в возрасте 30-40 суток.

В связи с этим проведены опыты по двукратной вакцинации птицы в дозе 3,3 ^ ТЦД50/мл на голову.

С этой целью было сформировано 10 групп цыплят. Первичную вакцинацию первых трех групп проводили в 7-суточном возрасте. Цыплята 4, 5 и 6 групп привиты первично в 14-суточном возрасте, 7, 8 и 9 группах вакцину применяли в 21-суточном возрасте. Ревакцинация во всех привитых группах проводилась соответственно через 7, 10 и 14 суток после первой.

Заражение цыплят подопытных групп вирулентным штаммом «52/70» в дозе 100 ИД50/мл проводили через 21 сутки после ревакцинации.

Установлено, что двукратно привитые цыплята старше 21 -дневного возраста спустя 21 сутки после второй вакцинации были иммунны в 100% случаев, при заболеваемости всех контрольных цыплят (табл. 9).

На напряженность иммунитета значительное влияние оказывает интервал между первой и второй прививками. Разница в проценте защиты цыплят, вакцинированных в 7 суток и ревакцинированных через 7 и 14 суток, при контрольном заражении составила 10%.

Опыты показали, что при ревакцинации через 14 суток эффективность применения вакцины среди птицы с пассивным иммунитетом значительно выше. Об этом свидетельствуют данные по применению препарата в 14- и 24-суточном возрасте, где цыплята имели 100% защиту.

: Результаты исследований уровня пассивного иммунитета у цыплят в контрольной группе в зависимости от возраста птицы показали, что в 7-суточном возрасте титр составил 4,5 1о£2, затем постепенно снижался до 2,7 log2 в возрасте 14 суток; в 21-суточном возрасте - 2 1о§2, а в возрасте 28 суток и старше их уровень был ниже 1,8 Iog2.

Титры вируснейтрализующих антител во всех группах после ревакцинации имели тенденцию к увеличению. Наиболее высокий уровень антител установлен в группе цыплят, вакцинированных в 14-и 21-суточном возрасте и ревакцинированных через 14 суток.

Таблица 9.

Результаты двукратной вакцинации птицы вирусвакциной из штамма «СТ», п=5

Группа цыплят Возраст при вакцинации Средний геометр, титр Кол-во цыплят Результаты контрольного заражения

первичная вторичная до заражения после заражения сол-во цыплят заболело выжило % защиты

Вакцинирован 7 14 4,5 4.80 25 20 3 17 85,0

«4 7 17 4,0 6,80 25 20 1 19 95,0

и_ 7 21 3,2 7,00 25 20 1 19 95,0

<( 14 21 2,7 7,25 25 20 1 19 95,0

14 24 2,5 7,50 25 20 0 20 100,0

«1 14 28 2.3 8,60 25 20 0 20 100,0

21 28 2.0 8,75 25 20 0 20 100,0

—'. 21 31 1,8 8,60 25 20 0 20 100,0

4< 21 35 1,6 8,80 25 20 0 0 100,0

Контрольная - _ 1,80 225 180 180 0 0

Таким образом, апробируемые схемы вакцинации с учетом уровня пассивного иммунитета оказались весьма эффективными и должны быть скорректированы в зависимости от эпизоотической ситуации в

конкретном птицеводческом хозяйстве. По результатам исследований разработаны временные наставления по применению вакцины из штамма «СТ» и предложили для неблагополучных по ИББ хозяйствах схему двухкратной иммунизации: первая — в 7-10-дневном возрасте, повторно — через 10-14 суток в зависимости от сроков проявления заболевания.

В хозяйствах, где вспышки заболевания отмечаются в 25-30 суточном возрасте, птицу необходимо ревакцинировать не позднее, чем через 10 суток, а в хозяйствах, где заболевание регистрируется у цыплят более старшего возраста (35-40 суток), повторную вакцинацию лучше проводить через 14 суток

5. ПРОТИВОЭПИЗООТИЧЕСКАЯ И ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ИББ

Применение вирусвакцины из штамма «СТ» позволило значительно улучшить экономические показатели хозяйств за счёт повышения сохранности и увеличения среднесуточного прироста живой массы цыплят.

В связи с неблагополучием Баксанской птицефабрики Кабардино-Балкарской республики и неудовлетворительными данными серологических исследований птицы, провели испытания лабораторных серий вакцинного штамма «СТ» в сравнении с вакциной «Винтерфильд 2512»

Производственная проверка проводилась на птице кросс «СК -Русь». Привито по 30000 цыплят вакциной из штамма «СТ» и «Винтерфильд 2512».

Вакцинацию против инфекционной бурсальной болезни проводили согласно временному наставлению по применению сухой вирусвакцины против ИББ из аттенуированного штамма «СТ».

На основании эпизоотологических данных, клинической картины, результатов патологоанатомического вскрытия и лабораторных исследований, проведенных на факультете ветеринарной медицины Горского ГАУ (экспертиза № 16 от 15.04.2003г.), диагностирована инфекционная бурсальная болезнь кур.

На основании плана мероприятий по оздоровлению хозяйства (акт от 25.04.2003г.) нами был поставлен производственный опыт по испытанию эпизоотической эффективности вакцин против вируса инфекционной бурсальной болезни. Вакциной из штамма «СТ» цыплят-бройлеров выпаивали двукратно в 7 и 17 дневном возрасте. Контролем служили не-вакцинированные цыплята в количестве 10000 гол.

Поствакцинальных осложнений не отмечено.

Сохранность составила у цыплят, иммунизированных вакцинным штаммом «СТ» - 96,9%, вакциной «Винтерфильд 2512» - 95,4%, в контрольной - 91,7%.

Таким образом, вакцинация птицы из штамма «СТ» позволила повысить сохранность цыплят бройлеров на 5,2% и на 3,7% в группе, привитых вакциной «Винтерфильд 2512».

Приросты цыплят в первой группе повысились с 1565 до 1778 граммов и во второй группе с 1565 до 1679 граммов.

Производственные испытания по применению вирусвакцины из штамма «СТ» с использованием лучистой энергии проведены иа Ардонской птицефабрике РСО-Алания.

Вакцинацию птицы против инфекционной бурсалънон болезни проводили согласно временному наставлению по применению сухой культуралыюй вирусвакцины против указанной инфекции, утвержденной 12 января 2004г департаментом ветеринарии МСХ РСО-Алания.

Целью испытания явилось изучение противоэпизоотической и экономической эффективности вирусвакцины в сочетании с действием светолазерного облучения инкубационных яиц.

У цыплят-бройлеров, полученных из эмбрионов, облученных в процессе инкубации лазером ЛГН - 104, лампами ДНЕСГ - 500, ДРТ -400 и БУВ - 15, побочных явлений не наблюдалось. Суточные цыплята отличаются большой подвижностью, хорошей реакцией на корм и воду. '

В результате применения вакцины из штамма «СТ» против ИББ установлено следующее:

1. Сохранность поголовья повысилось на 18,9%.

2. Среднесуточные приросты увеличились иа 10,5 г.

3. Снижены затраты корма на 1 кг прироста на 1,7 кг.

Дополнительный экономический эффект от применения вакцины из штамма «СТ» после светолазерной обработки инкубационных яиц составил 128 тыс. руб., в том числе 6,8 руб на голову.

Производственные испытания вирусвакцины против инфекционной бурсальной болезни из штамм «СТ» с использованием бентонитовых глин (ирлитов) в дозе 4% от сухой массы рациона, проведенные на Госплемптицепредприятии «Михайловское» РСО-Алания показали, что включение ирлитной подкормки в рацион бройлеров опытных групп дало прирост живой массы на 136 г. выше, чем в контрольной. Расход корма на единицу продукции снизился по сравнению со 2-ой группой на 0,4 кг, а титр антител в группах, где в рацион добавляли смесь ирлитов 1 и 7, выше, чем в группах, где ирлиты не добавляли в рацион. Следовательно, защита после контрольного заражения составила в 1 и 2 группе 96,6 и 97%, что на 1- 1,5 % выше, чем в группах вакцинированных без добавления ирлитов в рацион. Общий экономический эффект от применения вакцины и добавки в рацион смеси ирлитов составил 141356 рублей, в том числе на 1 голову 80 коп..

Применение вирусвакцины в угрожаемых и неблагополучных хозяйствах подтвердило образование у вакцинированной птицы напряженного иммунитета, что наряду с санитарно-карантинными мероприятиями способствовало ликвидации очагов болезни.

6. выводы

1. Вакцинный штамм вируса «СТ» культивируется на эмбрионах кур, вызывая 100% гибель в течении 6-ти суток после заражения. Максимальное накопление вируса в эмбрионах отмечается к 72 ч после заражения и составляет 6,0 - 6,2 ЭИДбо/мл.

2. Вирус штамма «СТ» безвреден для СПФ-цыплят при окулярном, интраназальном и пероралыюм применении.

3. Штамм «СТ» вируса ИББ репродуцируется в культуре клеток куриных эмбрионов, вызывает выраженный цитопатический эффект и накапливается в титре 6,2 ^ ТЦД50 1 мл в течение 48 ч. Гетерологичные культуры клеток слабо чувствительны к штамму «СТ»

4. Установлены оптимальные условия культивирования вакцинного штамма «СТ» вируса ИББ в первичной культуре ФЭК, включающие заражение 24 ч монослоя вирусом в дозе 0,01 ТЦД50 на клетку, использование поддерживающей среды без сыворотки КРС и сбор биомассы через 46 ч культивирования при 37°С. При этих условиях выращивания вирус накапливается в титре 106-106'5 ТЦД5о/мл.

5. Получен мелкобляшечный вариант вируса ИББ - штамм «СТ», который характеризуется биологической и иммуногенной активностью и стабильностью. Мелкобляшечный вариант (б") вакцинного штамма «СТ» репродуцируется в культуре клеток куриных эмбрионов в высоких титрах, безвреден для цыплят разного возраста и обладает высокими иммуногенными свойствами.

6. Вакцинный штамм «СТ» обладает термостабильностыо, контагиозностыо и лишен иммунодепрессивных и реактогенных свойств для цыплят всех возрастов.

7. Оптимальные дозы светолазерной обработки инкубационных яиц стимулируют иммуногенную активность вирусвакцины из штамма «СТ».

8. Комплексная светолазерная обработка эмбрионов и добавление в рацион ирлитов 1и7(1:1)в дозе 4% от массы сухого вещества корма повышают эффективность применения вирусвакцины из штамма «СТ».

9. Вирусвакцина на основании мелкобляшечного штамма «СТ» предназначена для специфической профилактики ИББ в угрожаемых и неблагополучных птицехозяйствах с острым и скрытым проявлением болезни.

10. Наиболее эффективна двукратная вакцинация птицы с интервалом 10-12 суток методом выпаивания. Сроки вакцинации устанавливаются в зависимости от наличия и уровня пассивных антител.

11. Применение вакцины из штамма «СТ» в неблагополучных и угрожаемых хозяйствах по ИББ наряду с организационными, технологическими и ветеринарно-санитарными мероприятиями обеспечивает профилактику и ликвидацию заболевания.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Изготовлена и испытана вирусвакцина сухая из штамма «CT» против инфекционной бурсалыюй болезни.

2. Результаты диссертационной работы нашли отражение в нормативно-технической документации на опытно-промышленное производство «Вакцины против инфекционной бурсальной болезни», утвержденной директором ВНИВИГ1.

3. Временное наставление по применению вирусвакцины сухой против инфекционной бурсальной болезни из штамма «CT».

Утверждено департаментом ветеринарии МСХ PCO - Алания 4 августа 2004г. '

' 4. Временная инструкция по профилактике и ликвидации заболевания птиц инфекционной бурсальной болезни птиц. Утверждено департаментом ветеринарии МСХ PCO-Алания 17 марта 2004г.

5. Вакцинный штамм «CT» вируса инфекционной бурсалыюй болезни депонирован в коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве № 124-ДЕП от 2 февраля 2006 г в (ФГО «ВГНКИ»).

6. Материалы, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе на факультетах ветеринарной медицины Ставропольского ГАУ, Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины, Кабардино-Балкарской ГСХА и Горского ГАУ.

8. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Годизов, П. X. Оценка напряжённости иммунитета у цыплят, вакцинированных против болезни Гамборо. / П. X. Годизов. //Всесоюзная конференция молодых ученных и аспирантов по птицеводству: тезисы, доклады, ВНИТИП, М., 1989, с.90.

2. Алиев, А. С. Оценка эффективности вирусвакцины против болезни Гамборо в лабораторных условиях. / А. С. Алиев, Ф. С. Кудрявцев, П. X. Годизов. // Сб. научн. трудов ВНИВИП «Комплексная система ветеринарных мероприятий в птицеводстве - резерв повышения эффективности производства», Л., 1989, с.40-42.

3. Алиев, А. С. Адаптация вируса болезни Гамборо к линии перевиваемых клеток ВСМ - 70. / А. С. Алиев, П. X. Годизов, В. А. Дьяченко, О. С. Ермолаева. // Тез. докл. научно-производственной конференции «Ветеринарные проблемы птицеводства» - Л., 1990, с. 8-9.

4. Алиев, А. С. Использование полиэлектролитных комплексов в качестве стабилизаторов при сублимационной сушке вируса инфекционной бурсалыюй болезни кур. / А. С. Алиев, П. X. Годизов, В. А. Дьяченко, А. И. Пштипенко, О. С. Ермолаева. // Тез. докл. научно-производственной конференции «Ветеринарные проблемы в птицеводстве», Л., 1990, с. 9-11.

5. Годизов, П. X. Удостоверение авторского штамма «СТ» вируса болезни Гамборо, реизолированного из коммерческого штамма против названной болезни ГКВ №2247 /А. С. Алиев, Ф. С. Кудрявцев, П. X. Годизов // Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского Академия медицинских наук СССР, 1990.

6. Годизов, П. X. Оценка иммуногенности и определение оптимальной иммунизирующей дозы сухой вирусвакцины из штамма «СТ» при различных методах вакцинации. / П. X. Годизов, М. Н. Мамукаев. // Тез. докл. научно-производственной конференции. Горского ГАУ, 1995, с. 134-135.

7. Годизов, П. X. Динамика жизнеспособности птиц при обработке суточных цыплят излучением гелий - неонового лазера. / П. X. Годизов, М. Н. Мамукаев, И. И. Кцоева. // Информационный листок Владикавказ ЦНТИ 1999, №68-70-99, с 2.

8. Годизов, П. X. Жизнеспособность бройлеров при светолазерной обработке эмбрионов кур оптимальными дозами. / П. X. Годизов, М. Н. Мамукаев, И. И. Кцоева. // Информационный листок, Владикавказ ЦНТИ 1999, №68-71-99, с 2.

9. Годизов, П. X. Влияние уровня материнского иммунитета на эффективность вакцинации против болезни Гамборо. / П. X. Годизов. // Владикавказ ЦНТИ 1999, №68-73-99, с 2.

10. Годизов, П. X. Иммунодепрессивное действие вакцинного штамма «СТ» на цыплят. / П. X. Годизов, М. Мамукаев. // Материалы международной научно-практической конференции: «Экологически безопасные технологии в сельскохозяйственном производстве 21 века» Горский ГАУ, Владикавказ: Иристон, 2001, с. 431-432.

11. Годизов, П. X. Патогенность вируса инфекционной бурсальной болезни для цыплят. / П. X. Годизов. // Известия Горского ГАУ, Владикавказ, 2003, том 40, с. 61.

12. Годизов, П. X. Патогенность вируса инфекционной бурсальной болезни для эмбрионов кур. / П. X. Годизов. // Материалы научно-практической конференции молодых учёных Горского ГАУ, выпуск 1, 2003, с. 47-48.

13. Годизов, П. X. Влияние вируса инфекционной бурсальной болезни на вес клоакальной сумки. / П. X. Годизов. // Сборник научных трудов Севе-ро-Осетинского отделения Академии наук высшей школы РФ, Владикавказ, №1,2003, с.81-82.

14. Годизов, П. X. Определение биологической активности нескольких штаммов вируса инфекционной бурсальной болезни в различных клеточных культурах. / П. X. Годизов. // Сборник научных трудов СевероОсетинского отделения Академии наук высшей школы РФ, Владикавказ, №1,2003, с. 83-84.

15. Годизов, П. X. Патоморфология инфекционной бурсальной болезни кур. / П. X. Годизов. // Сборник научных трудов Северо-Осетинского отделения Академии наук высшей школы РФ, Владикавказ, №1, 2003, с. 82.

16. Годизов П. X. Определение различной степени цитопатической активности вируса инфекционной бурсальной болезни кур. / П. X. Годизов //

Сборник научных трудов Северо-Осетинского отделения Академии наук высшей школы РФ, Владикавказ, №1,2003, с. 84.

17. Годизов, П. X. Особенности специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни кур. / П. X. Годизов. // Монография, Владикавказ, 2004, с. 86.

18. Годизов П.Х. Сохранность бройлеров при светолазерной обработке инкубационных яиц и суточных цыплят. / П.Х. Годизов, М.Н. Мамукаев, Б.З. Цалиев // Информационный листок, ИЛ №-68-038-04, Владикавказ, 2004, с. 2.

19. Годизов, П.. X. Патогенность для цыплят различных штаммов вируса инфекционной бурсальной болезни кур. / П. X. Годизов. // Вестник ветеринарии, 2004, №4, с. 29-32.

20. Годизов, П. X. Иммуномодулирующие и общестимулирующие свойства гелий-неонового лазерного облучения и бентонитовых глин. / П. X. Годизов. // Вестник ветеринарии, 2004, №4, с. 75-80.

21. Годизов П. X. Реактогенные и иммуногенные свойства вакцины против инфекционной бурсальной болезни из штамма «СТ». / П. X. Годизов // Актуальные проблемы производства свинины в РФ. Мат. межд. конф., Персиановка, 2004, с.123-125.

22. Годизов, П. X. Иммунодепрессивное влияние вируса инфекционной бурсальной болезни при вакцинации против Ныокаслской болезни / П. X. Годизов. //Актуальные проблемы производства свинины в РФ. Мат. межд. конф., Персиановка, 2004, с. 125-127.

23. Годизов, П. X. Безвредность вакцины против инфекционной бурсальной болезни из штамма «СТ». / П. X. Годизов. //Актуальные проблемы производства свинины в РФ. Мат. межд. конф. Персиановка, 2004, с. 127-128.

24. Годизов, П. X. Особенности условий лиофилизации, хранения и влияния физико-химических факторов на вирус инфекционной бурсальной болезни. / П. X. Годизов. //Актуальные проблемы производства свинины в РФ. Мат. межд. конф. Персиановка, 2004, с. 128.

25. Годизов, П. X. Метод повышения специфической устойчивости к инфекционной бурсальной болезни кур. / П. X Годизов, M. Н. Мамукаев, В. А. Арсагов, А. С. Алиев. //Актуальные вопросы производства и применения биологических препаратов. Мат.межд.конф. Алматы, 2004, с.210-214.

26. Годизов, П. X. Эффективность вирусвакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц. / П. X. Годизов, А. С. Алиев. // Актуальные вопросы производства и применения биологических препаратов. Мат. межд. конф. Алматы, 2004, с. 214-218.

27. Годизов, П. X. Влияние ирлитов на формирование специфического иммунитета против инфекционной бурсальной болезни и стимулирующее действие на продуктивность птицы. / П. X. Годизов, Б.А. Дзагуров, А.С. Алиев. // Актуальные вопросы производства и применения биологических препаратов. Мат. межд. конф. Алматы, 2004, с. 218-222.

28. Годизов, П. X. Эффективность вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц из штамма «СТ». / П. X. Годизов, А. С. Алиев. // Птица и птицепродукты, М., 2004, №6, с. 78-82.

29. Годизов, П. X. Реверсибельность вакцины против инфекционной бур-сальной болезни. / П. X. Годизов, В. А. Арсагов. // Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основы повышения продуктивности и производства экологически чистой продукции животноводства. Мат. межд. конф. Горского ГАУ, 2005, с. 112.

30. Годизов, П. X. Иммуногенные свойства вакцинного штамма «СТ». / П. X. Годизов, В. А. Арсагов, М. Н. Мамукаев. //Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основы повышения продуктивности и производства экологически чистой продукции животноводства. Мат. межд. конф. Горского ГАУ, 2005, с. 113.

31. Арсагов, В. А. Условия хранения и влияние температуры на вирус инфекционной бурсальной болезни. / В. А. Арсагов, П. X. Годизов. // Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основы повышения продуктивности и производства экологически чистой продукции животноводства. Мат. межд. конф. Горского ГАУ, 2005, с. 108. • •

32. Арсагов, В. А. Влияние вируса болезни Гамборо при вакцинации против болезни Ньюкасла. / В. А. Арсагов, П. X. Годизов. //Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основы повышения продуктивности и производства экологически чистой продукции животноводства. Мат. межд. конф. Горского ГАУ, 2005, с. 109.

33. Годизов, П.Х. Стимулирующее действие гелий-неонового лазера и бентонитовых глин на формирование иммунитета против болезни Гамборо. / П.Х. Годизов, A.C. Алиев. // Мат. 1-ого международного ветеринарного конгресса по птицеводству, Москва, 2005, с 215-221.

34. Годизов, П.Х. Иммунодепрессивное влияние различных штаммов вируса инфекционной бурсальной болезни. / П.Х. Годизов, A.C. Алиев. // Мат. 1-ого международного ветеринарного конгресса по птицеводству, Москва, 2005, с 141-144.

35. Годизов, П.Х. Влияние бентонитовых глин на повышение специфического иммунитета против инфекционной бурсальной болезни. / П.Х. Годизов. // Птица и птицепродукты, М., 2005, № 6, с. 34-36.

36. Годизов, П. X. Научно-теоретические основы производства вакцинного штамма «СТ». / П. X. Годизов, А. Ф. Дмитриев, М. Н. Мамукаев. //Монография, Владикавказ, 2006, с. 115.

37. Годизов, П. X. Иммунологические свойства и технология производства вакцинного штамма «СТ». / П. X. Годизов, М. Н. Мамукаев. // Монография, Владикавказ, 2006, с. 85

38. Годизов, П. X. Вакцинный штамм «СТ», профилактика инфекционной бурсальной болезни. / П. X. Годизов, М. Н. Мамукаев. // Монография, Владикавказ, 2006, с. 89

39. Годизов, П. X. Диагностика инфекционной бурсальной болезни. / П. X. Годизов, А. С. Алиев. // Птицеводство, М., 2006, №1, с. 18- 19.

40. Годизов, П. X. Влияние лучистой энергии на напряженность иммунитета к инфекционной бурсальной болезни кур./ П. X Годизов.// Птица и птицепродукты.М; 2006 - №1, с. 33-35.

41. Годизов, П. X Повышение иммунитета против инфекционной бурсаль-ной болезни птиц / П. X Годизов.// Птицеводство. М; 2006 - №5>С.;Зг-33.

42. Годизов, П. X Удостоверение авторского штамма «СТ» вируса ИББ полученный путём клонирования методом бляшек. / П. X Годизов.// Регистрационный номер штамма «СТ» 124 - ДЕП Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ). 2006 г.

43. Годизов, П. X. Способ профилактики инфекционной бурсальной болезни кур. Патент на изобретение № Заявка № 2004109454 от 29.04.2004 г. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ, Москва ФИПС от 15 февраля 2006.

ДЛЯ ЗАМЕТОК

Лицензия: JIP. Ла 020574 от 6 мая 1998 г.

Подписано в печать 29.03.2006 г. Бумага офсетная. Печать офсетная. Бумага 60X84 1/16 Усл. печ. л. 2,5. Тираж 150. Заказ 17.

362040, Владикавказ, ул. Кирова, 37г Типография *Горский госагроуниверситет»