Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка средств и методов диагностики и специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни

/А/^г, ( .. ч - .. и 7 гт

и и

На правах рукописи

Для служебного пользования № 38 дсп от 21.03.2000 экз. № ¡3

УДК 619:616.476-002.6-084:616-078.33

БОРИСОВ Александр Владимирович

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ

16.00.03 "Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология"

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Владимир-2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных Минсельхозпрода России

Научный консультант - доктор ветеринарных наук, профессор, член-корреспондент РАСХН, лауреат Государственной премии РФ Гусев Анатолий Алексеевич

Официальные оппоненты:

- доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ Рахманов Анатолий Михайлович

- доктор ветеринарных наук, профессор Придыбайпо Николай Дмитриевич, (ВНИВИП, г. Санкт-Петербург);

- доктор ветеринарных наук, профессор Куриленко Анатолий Нестерович, (МГАВМ и Б, г.Москва).

Ведущая организация - Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ, г. Москва).

Защита состоится «16» мая 2000г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 120.60.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (600900, г. Владимир, пос. Юрьевец, ВНИИЗЖ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ.

Автореферат разослан «10» апреля 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.М. Семенова

1. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность темы. Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) гистрируется во многих странах мира, включая Российскую Федерацию, и носит значительный экономический ущерб птицеводству, который падывается из прямых потерь (гибель, потеря продуктивности), затрат на оведение ветеринарно-санитарных и других мероприятий. Опасность спространения инфекционной бурсальной болезни резко возросла в связи с явлением высоковирулентных штаммов вируса, которые вызывают актически 100% заболеваемость цыплят, падеж молодняка яичных пород от до 80% и бройлеров - от 20 до 50%. В период с 1991 по 1993 г.г. в ссийской Федерации зарегистрировано несколько вспышек заболевания, званных высоковирулентными штаммами вируса ИББ.

Так, в 1993 г. отход птицы от ИББ в Российской Федерации составил 55,5 тыс. голов, что составляет 34,7% от общего падежа, вызванного Секционными болезнями.

Применение импортных биопрепаратов из «промежуточных» штаммов и мертвенной живой вакцины против ИББ из штамма «ВНИВИП» не зспечивало ожидаемого эффекта.

Все это определило необходимость совершенствования и разработки )ых более эффективных средств и методов диагностики и профилактики ИББ.

Разработкой эффективных средств защиты цыплят от высоковирулентных зммов вируса ИББ занимались многие исследователи [Бирман Б.Я. с соавт., )6; Кои\мепЬоуеп В., Воз I., 1994], которые отмечали, что с помощью живых цин из «промежуточных» штаммов невозможно добиться оздоровления цехозяйств. Применение в Европе в последние годы «горячих» вакцинных зммов, способных создавать надежную защиту на фоне материнского сивного иммунитета, привело к положительным результатам.

Высокая устойчивость вируса ИББ в окружающей среде в большинстве чаев является одной из причин его длительного персистирования в цехозяйствах и эндемичности заболевания в регионах.

Во многих странах мира, включая Российскую Федерацию, наряду с (эективными ветеринарно-санитарными мероприятиями проводится научно-снованная планируемая стратегия комплексной вакцинопрофилактики ИББ с эльзованием современных средств и методов диагностики.

Для осуществления постоянного эпизоотологического монитеринга за

е®ММВКАйюлят; 1ми вируса ИББ, вызывающими вспышки заболевания,

дарственная

1блиотека

2000 __

требуется совершенствование методов диагностики, предполагающ повышение их чувствительности и специфичности, а также возможность только выявлять, но и идентифицировать вирус.

В последние годы широкое распространение нашел метод полимеразн цепной реакции (ПЦР) для диагностики и идентификации различных вирусов их штаммов [Jackwood D.I. с соавт., 1996; Lin T.L. с соавт.; 1994,1995; Tham К. с соавт., 1995; Ture О. с соавт., 1998].

Использование метода ПЦР позволяет выявлять не только инфекционн! вирус, но и фрагменты вирусного генома, т.е. наиболее точно и достовер устанавливать штаммовую принадлежность вируса. Сравнительный анал соответствующих аминокислотных последовательностей полевых и вакцинн штаммов позволяет выявить вакцинные штаммы, имеющие наименьш отличия от полевых. Это имеет определяющее значение для выбора полевс изолята вируса, пригодного Для создания живой вакцины против ИББ.

При разработке оптимальных схем иммунизации птиц против ИББ усил исследователей направлены на достижение баланса между оптимальн! уровнем материнского иммунитета и иммуногенной активностью вакцинн штаммов [Hitchner D.B., 1976; Rosales A.G. с соавт., 1989; Wyeth P.I., Cullen G. 1976, 1978, 1992].

Возраст птиц, при котором иммунизация наиболее эффективна, являет решающим фактором, обеспечивающим их защиту от заражения и заболевак ИББ.

Для определения наличия у птиц антител к вирусу ИББ в Российо Федерации до 1993 г. применяли реакцию диффузионной преципитац которая обладает низкой чувствительностью, значительной трудоемкость« дает результат только через 24-48 ч. после постановки [Алиев A.C. с coai 1989, 1990; Phillips W.E., 1981].

Более чувствительная и специфичная реакция нейтрализации применялась из-за отсутствия СПФ-эмбрионов, к тому же продолжительность постановки составляет 5-7 суток [Phillips W.E., 1981; Winterfield R.W.; Thac H.L., 1978].

Для экспресс-диагностики ИББ, массового эпизоотологическ обследования птицепоголовья и определения оптимальных сроков иммуниза1 цыплят живыми вакцинами потребовалась разработка набора для определе> наличия антител к вирусу ИББ иммуноферментным методом.

Эффективность иммунизации живыми вакцинами во многом зависит от дородности материнского иммунитета. Для обеспечения однородного и тряженного иммунитета против ИББ у цыплят потребовалось создание 1активированной вакцины против ИББ для иммунизации ремонтного злодняка. Важнейшим моментом в ликвидации очагов заболевания и ¡допущении развития эпизоотии ИББ в Российской Федерации является одпние живой вакцины из «горячего» штамма, способного преодолевать перинский иммунитет у цыплят, вызывать образование раннего ютвакцинального иммунитета и, тем самым, оказывать конкуренцию ||соковирулентным полевым штаммам.

В регионах с развитым птицеводством, где отсутствуют острые вспышки болевания, для специфической профилактики ИББ необходимо использовать 1вые вакцины из «промежуточных» штаммов, имеющих наименьшие отличия полевых штаммов, вызывающих субклиническую форму заболевания, вводящую в ряде случаев к иммунодепрессии.

Таким образом, разработка новых средств и методов диагностики и ¡ецифической профилактики инфекционной бурсальной болезни является туальной проблемой и имеет важное народнохозяйственное значение.

1.2. Цель и задачи научных исследований. Главной целью ¡следований являлась разработка и внедрение в ветеринарную практику [эфективных средств и методов диагностики и специфической профилактики |фекционной бурсальной болезни.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие |дачи:

изучить эпизоотическую ситуацию по ИББ в России с 1990 по 1999 г.г.; разработать стратегию и тактику борьбы с ИББ и на основе экспериментальных исследований создать новые средства и методы диагностики и специфической профилактики;

разработать метод индикации и штаммовой дифференциации вируса ИББ и изучить с помощью методов молекулярной биологии генетические взаимоотношения штаммов вируса ИББ с целью определения пригодности полевых изолятов и музейных вакцинных штаммов для конструирования живых вакцин против ИББ;

разработать экспресс-метод диагностики ИББ и создать набор для определения наличия антител к вирусу ИББ методом иммуноферментного анализа;

изыскать в естественных условиях полевой изолят вируса ИББ, пригодн для создания живой вакцины против ИББ и провести его аттенуацию; изучить иммунобиологические свойства вакцинных штаммов из коллекц ВГНКИ и ВНИИЗЖ и селекционировать наиболее перспективные из ж отвечающие современным требованиям к продуцентам профилактическ биопрепаратов;

разработать технологические регламенты получения живых инактивированной вакцин против ИББ, методы контроля качества вакцт наставления по их применению;

изучить эффективность разработанных вакцин против ИББ лабораторных и производственных условиях;

подготовить нормативно-техническую документацию на разработана биопрепараты и осуществить их промышленное производство; внедрить в производство и широкую ветеринарную прат диагностикумы и биопрепараты для специфической профилактики ИББ. 1.3. Научная новизна. С помощью разработанного метода штаммов дифференциации вируса ИББ на основе ПЦР и секвенирования исследова] полевые изоляты и вакцинные штаммы вируса ИББ, выявлены генетическ группы штаммов, отличающиеся степенью антигенного родства, патогенное™ созданы новые профилактические препараты на основе близкородственн вакцинных штаммов.

Впервые в Российской Федерации выделен в естественных услови полевой изолят вируса ИББ, который подвергнут аттенуации и получ «горячий» вакцинный штамм «БГ» для промышленного изготовлен вирусвакцины сухой против инфекционной бурсальной болезни.

На основании эпизоотологических обследований, результат лабораторных экспериментов и данных молякулярно-биологическ исследований для производства живой вакцины против ИББ «промежуточного» штамма предложен вакцинный штамм «Винтерфилд 251^ который имеет максимальное антигенное родство с полевыми изолятами виру ИББ.

Предложенные вакцинные штаммы «БГ» и «Винтерфилд 251 селекционированы, всесторонне изучены и депонированы в ВГН1 ветпрепаратов.

На основе вакцинных штаммов «БГ» и «Винтерфилд 2512» разработа! технологии изготовления живых вакцин против ИББ.

Научно обоснованы и экспериментально подтверждены иммунизирующие озы, способы введения и схемы применения живых вакцин против ИББ из ггаммов «БГ» и «Винтерфилд 2512».

Показано, что живая вакцина против ИББ из штамма «БГ» обладает ысокими защитными свойствами в неблагополучных птицехозяйствах, где ИББ ыла вызвана высоковирулентными штаммами, а живая вакцина из штамма Винтерфилд 2512» обеспечивала надежную защиту птиц при эофилактических вакцинациях в благополучных хозяйствах.

Для создания однородного и напряженного материнского иммунитета у ыплят впервые в Российской Федерации разработана инактивированная идкая сорбированная вакцина против ИББ для иммунизации ремонтного олодняка родительских стад. При изготовлении вакцины определены 1тимальные условия получения вирусного сырья, отработаны методы очистки инактивации, обоснованы ингредиентный состав и методы контроля.

Новизна полученных результатов подтверждена тремя патентами на юбретения: «Штамм «БГ» вируса инфекционной бурсальной болезни птиц и жцина против инфекционной бурсальной болезни птиц», патент РФ №2127602 ■ 21.11.1997 г.; «Вакцина против'инфекционной бурсальной болезни птиц», ггент РФ № 2127604 от 14.04.1998 г.; «Инактивированная вакцина против Секционной бурсальной болезни птиц», патент РФ №2127603 от 23.02.1998 г.

1.4. Практическая значимость. Полученные результаты научных •.следований легли в основу 34 нормативных документов, методик, инструкций, азаний и рекомендаций по диагностике, специфической профилактике и >рьбе с ИББ, которые одобрены ученым советом ВНИИЗЖ, утверждены ректором института или Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода эссии.

На основании проведенных исследований пазработаны и утверждены в тановленном порядке НТД на следующие биопрепараты, которые широко 1едрены в ветеринарную практику:

вирусвакцина сухая против ИББ из штамма «БГ», за период с 1994 по 1999 г.г. выпущено 2,2 млрд. доз вакцины;

вирусвакцина живая культуральная против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512», за период с 1994 по 1999 г.г. выпущено 1,23 млрд. доз вакцины; вакцина против ИББ жидкая сорбированная инактивированная, за период с 1994 по 1999 г.г. выпущено 33,5 млн. доз вакцины.

набор для определения антител к вирусу ИББ методе иммуноферментного анализа, за период с 1995 по 1999 г.г. выпущено 45£ наборов ИФА;

набор для определения антител к вирусу ИББ иммуноферментны методом при тестировании сывороток в одном разведении, за 1999 выпущено 47 наборов ИФА.

1.5. Основные положения диссертационной работы, выносимые ь защиту:

анализ и обобщение эпизоотических данных по ИББ в России; метод индикации и штаммовой дифференциации вируса ИББ на осное ПЦР и прямого секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК; разработка и внедрение в ветеринарную практику набора дг определения антител к вирусу ИББ методом иммуноферментного анализ получение вакцинного штамма «БГ» путем аттенуации полевого изолята адаптации его к системе культивирования в СПФ-эмбрионах; разработка технологий изготовления и биологического контроля живых инактивированной вакцин против ИББ;

оценка иммуногенных и антигенных свойств живых вакцин против ИББ лабораторных и производственных условиях;

оценка иммуногенных и антигенных свойств инактивированной вакцик против ИББ и изучение иммунитета, передаваемого потомству; научное обоснование и экспериментальное подтверждение стратег! применения разработанных вакцин против ИББ и I противоэпизоотическая эффективность.

1.6. Апробация. Основные материалы диссертации доложены обсуждены на Межрегиональных координационных совещаниях по проблел «Ветеринарная практика в промышленном птицеводстве» и научно-практическ! конференциях-семинарах специалистов по птицеводству стран СНГ (Ломоносо 1996, 1997, 1998), на Всероссийских и Международных научно-практическ! конференциях (Владимир, 1995, 1998), на российско-американском симпозиул «Проблемы инфекционной патологии птиц» (Санкт-Петербург, 1996), I Международной конференции «Актуальные проблемы биотехнологии растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 1996), на > Интернациональном конгрессе всемирной птицеводческой ассоциации (Венгри Будапешт, 1997), на Международной конференции «Современные мето,с

офилакгики инфекционных болезней птиц» (Киев, 1998), на 10-ой (ропейской птицеводческой конференции (Израиль, 1998), на Всероссийской нференции «Производство и контроль медицинских и ветеринарных епаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ, посвященной 30-тию ФГУП ПЗБ (Вольгинский, Владимирской области, 1999), на Всероссийских зональных совещаниях-семинарах ветеринарных специалистов (Новосибирск, 96; Красноярск, 1997; Уфа, 1997; Казань 1998, 1999; Тюмень, 1999), на :ероссийских и зональных совещаниях-семинарах руководителей и главных теринарных специалистов птицехозяйств и объединений (Свердловск, 1995; 1жний Новгород, 1996; Брянск 1997; Москва, 1998, 1999), на совещаниях-минарах директоров и главных специалистов производственно-научных стем «Свердловск», «Смена», «Можайское», «Сибирь», «Александровский», онкурсный» (1996, 1997, 1998, 1999), на совещаниях-семинарах ветеринарных ециалистов птицехозяйств Украины (Киев, 1998) и Белоруссии (Минск, 1998), а кже на заседаниях методического и ученого советов ВНИИЗЖ (1994-1999г.г.).

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 52 научные боты, в т.ч. получены 3 патента РФ на изобретения, утверждено в тановленном порядке 34 нормативных документа (технические условия, ставления по применению, инструкции, методики, указания, рекомендации).

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 359 раницах и состоит из введения, обзора литературы, собственных следований, выводов и практических предложений, содержит 59 таблиц и 23 сунка. Список использованной литературы включает 623 наименования, из х 71 отечественных и 552 зарубежных. В приьожении представлены копии кументов, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и актическую значимость.

В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и азывали практическую и консультативную помощь A.A. Гусев, В.В. Дрыгин, А. Перевозчикова, J1.0. Щербакова, Н.С. Мудрак, Т.В. Оковытая, В.Н. знецов, Ю.В. Кузнецов, С.А. Гусев, З.Я. Михалишина, К.Ю. Федосеев, В.Ю. лаков, М.В. Гирин, В.В. Борисов, В.И. Смоленский, С.Н. Норкина, С.К. Старов, И. Ломакин, Г.В. Марков, O.A. Борисова, В.Н. Ирза, за что приносим им рдечную благодарность. Выражаем искреннюю признательность за помощь и м сотрудникам, которые перечислены в качестве соавторов в списке бликаций по теме.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

В работе использовали следующие материалы: Вакцинные и вирулентные штаммы вируса ИББ и БН:

- вакцинный штамм "Винтерфилд 2512" вируса ИББ;

-вакцинный штамм "БГ" вируса ИББ;

- вакцинный штамм "Ла-Сота" вируса болезни Ньюкасла;

- вирулентный контрольный штамм "52/70-М" вируса ИББ;

- вирулентный контрольный штамм "Т" вируса болезни Ньюкасла. Вакцины:

- вирусвакцина сухая против ИББ из штамма "БГ;

- вирусвакцина живая культуральная против ИББ из штамма "Винтерфи/ 2512";

- вакцина против ИББ жидкая сорбированная инактивированная;

-сухая вирусвакцина против Ньюкаслской болезни птиц из штамма "J1 Сота". Диагностикумы:

-наборы для определения антител к вирусу ИББ методе иммуноферментного анализа;

-наборы для определения антител к вирусу ИББ иммуноферментнь методом при тестировании сывороток в одном разведении;

- наборы Flock Chek для обнаружения антител к возбудителям ИББ, ИБ ИАЦ, БН, ИЭМ, реовирусной инфекции, респираторного микоплазмоз лейкоза, ретикулозндотелиоза и ринотрахеита индеек производства IDEX (США);

-наборы для обнаружения антител к возбудителям ИББ, ИБК, ИЛТ, Б1 ИЭМ, реовирусной инфекции, гриппа, лейкоза, респираторно! микоплазмоза, синовиального микоплазмоза и пастереллеза производстЕ Kirkegaard Perry Laboratories (KPL, США);

- лабораторные серии наборов РДП для диагностики ИББ.

Обработку результатов, полученных в ИФА, проводили согласн прилагаемым инструкциям. Установленные значения титров представлены виде величин, обратных разведениям. Куриные эмбрионы:

эмбрионы от безлейкозных кур из ОНЦ РАМН; СПФ-эмбрионы фирм "Lohmann Tierzucht", "Spafas"; "Hy-Vac".

1тицы:

- цыплята и куры различных возрастов мясных и яичных пород и кроссов;

- СПФ-цыплята;

- цыплята, полученные от безлейкозных кур из ОНЦ РАМН (г.Москва). питательные среды, реактивы, растворы и сыворотки:

- ростовая питательная среда РС-ЗМ;

- фетальная сыворотка различных фирм-производителей;

- сыворотка крови северных оленей;

- сыворотка крови крупного рогатого скота; -трипсин 200 FIP-V/g фирмы "Merck" (Германия);

- L-глутамин фирмы "Fluka" (Швейцария);

- гидролизат лактальбумина (Edamin S) фирмы "Sigma" (США);

- мясо-пептонный бульон (МПБ);

- мясо-пептонный агар (МПА);

- мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) под вазелиновым маслом;

- среда Сабуро; -соево-казеиновый бульон;

- тиогликолевая среда;

-формалин технический (ГОСТ 1625-61);

- димер этиленимина с содержанием основного вещества АЭЭИ 25%; -фреон 113 (ГОСТ23844-79);

- 3% гель гидрата окиси алюминия (ГОА);

- пеногаситель марки КЭ-1221 ТУ 6-02690-7;

- сапонин фирмы "Fluka" (Швейцария); -полигексаметиленгуанидингидрохлорид (ТУ 10-09-41-90);

- азид натрия фирмы "Fluka" (Швейцария); -хлорметан (хлороформ) очищенный, ГОСТ 20015-88;

- масляный адъювант ВНИИЗЖ на основе минерального масла "Маркол-52";

- масляный адъювант Монтанид ИЗА 70 фирмы "Seppic", Франция.

Методы исследования Определение титра инфекционности вируса Титр инфекционности вируса ИББ определяли на СПФ-эмбрионах 10-гточного возраста при заражении на ХАО в области искусственной пуги и на атрасах с первичной культурой клеток ФКЭ. Учет результатов титрования на ПФ-эмбрионах проводили в течение 216 часов по количеству павших и живых лбрионов с характерными поражениями. Учет результатов титрования на

культуре клеток ФКЭ проводили по ЦПД вируса в течение 120 часов. Ти вируса определяли по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина.

Определение стерильности Определение стерильности проводили по ГОСТ 28085-89 и cornac: "Руководству МЭБ по стандартам для диагностических тестов и вакцин" (19S на бактериальное загрязнение, исключение контаминации грибами микоплазмами. При проверке на бактериальное загрязнение проводили высе! на пробирки со средами МПА, МПБ, МППБ и тиогликолевой средой, а п| исследовании на грибковую контаминацию - на пробирки со средой Сабуро.

Испытуемые образцы при проверке на отсутствие микоплазм растворя; стандартным PPLO-бульоном. В качестве индикатора использовали феноловк красный. Об отсутствии роста микоплазм в жидкой среде судили по сохранен! бульоном красного цвета.

Определение иммуногенности вакцин Для определения иммуногенности живых вакцин против ИББ использова. СПФ-цыплят и серонегативных коммерческих цыплят яичных и мясных пор различных возрастов. Иммуногенность живых и инактивированных вакц оценивали по титрам антител, определяемым в ИФА, РДП и РН использованием наборов ВНИИЗЖ, IDEXX и KPL (США) и путем контрольнс заражения привитых цыплят вирулентным штаммом "52/70-М" вируса ИББ.

Определение безвредности живых вакцин Проверку на безвредность проводили на цыплятах 24-28-суточнс возраста, которым выпаивали десятикратную иммунизирующую дозу. В течен десяти суток цыплята должны оставаться клинически здоровыми и живыми. Определение безвредности образцов инактивированных вакцин Сущность метода заключается в выявлении реактогенного действ вакцины на привитом молодняке по клиническому состоянию и наличию реакц на месте введения. Контроль вакцин на безвредность проводили на ремонтн молодке 90-120-суточного возраста, которой вводили вакцину в мышцы бед или груди в объеме 5 мл двумя инъекциями по 2,5 мл справа и слева. Вакци считали безвредной, если все птицы в течение 10 суток оставались живыми б видимых клинических отклонений и на месте введения препарата не бы следов воспалительной реакции.

Оценка иммунодепрессии вакцинных штаммов Проверку исходных штаммов "БГ' и "Винтерфилд 2512" иммунодепрессию проводили на СПФ-цыплятах согласно "Руководству МЭБ

тандартам для диагностических тестов и вакцин" [379]. Оценку ммунодепрессии проводили по степени защиты против БН после контрольного зражения вирулентным штаммом "Т-53" в дозе 103 ЛД5о/о,2МЛ внутримышечно зуппы СПФ-цыплят, привитых против ИББ и БН, и группы СПФ-цыплят, ривитых только против БН. Если защита против БН в испытуемой группе птиц, акцинированных против ИББ, значительно меньше, чем в контрольной группе, э считается, что штамм вызывает иммунодепрессию.

Проверка штамма «БГ» на реверсию С этой целью проведено 10 последовательных пассажей штамма «БГ» ipyca ИББ на СПФ-эмбрионах и 8 пассажей на СПФ-цыплятах.

Проверка на полноту инактивации вируса Полноту инактивации вируса ИББ в инактивированной вакцине определяли этодом трехкратных "слепых" пассажей вакцины на СПФ-эмбрионах. Сущность этода заключается в потере способности инактивированного вируса ИББ к »продукции в чувствительной тест-системе, что подтверждается отсутствием ¡менений и гибели СПФ-эмбрионов в течение 216 часов инкубирования в ютьем пассаже.

Методы изготовления и исследований инактивированных вакцин Приготовление вирусной суспензии

Вирусным сырьем при изготовлении вакцин служили тушки КЭ и

шангоисная жидкость, зараженные производственным штаммом «БГ» вируса

5Б. Сырье хранили в стеклянных флаконах не более 2 месяцев при

мпературе минус 40°С. Вирусный материал измельчали на коллоидных

эльницах и смешивали с буферным раствором до соотношения 1:10. В

юизводственных условиях 10% вируссодержащую суспензию получали,

мельчая материал на 2-3 коллоидных мельницах в смеси с буфером,

пользуемым для приготовления вакцины. По окончании размола суспензию

бирали в реактор и выдерживали в течение 1-1,5 час при температуре 6-12°С

1Я экстракции вируса.

Очистка вируссодержащей суспензии Очистку вируссодержащей суспензии проводили через 1-1,5 час после энчания размола путем добавления в суспензию флокулянта ВПГдо конечной чцентрации 0,005-0,04% и хлороформа - в количестве 1%. Отделение лластных белков проводили низкоскоростным центрифугированием (2500-

3000 об/мин в течение 20-30 мин), а в производственных условиях сепарированием на сепараторе «Альфа-Лавапь».

Инактивация вируса ИББ Инактивацию вируссодержащей суспензии проводили аминоэтш этиленимином (АЭЭИ), который добавляли из расчета 0,1% (конечна концентрация в растворе), при температуре 27°С и pH 7,4-7,8 в течение 24-4 часов. Рабочий 10% раствор АЭЭИ готовили, исходя из концентрации димер этиленимина в исходном препарате, на стерильной деминерализованной вод< не позднее, чем за 30 минут до внесения в вирусную суспензию.

Изготовление эмульсионной формы вакцины Опытные образцы эмульсионной вакцины готовили путем смешивания 10е инактивированной суспензии вируса ИББ и масляного адъюванта соотношениях 1:1,1:2 и 1:3. Смесь гомогенизировали в течение 5 мин при 300 об/мин до получения однородной эмульсии. Опытно-промышленные сери вакцин получали с использованием тех же компонентов, но эмульгировани проводили на гомогенизаторе «Сильверсон 450». Стабильность эмульси определяли центрифугировпнием при 3000 об/мин в течение 30 мин и поел хранения в термостате при 37°С в течение 10 суток.

Постановка полимеразной цепной реакции Химические реагенты

Для приготовления буферных растворов и растворов для ферментативнь реакций использовали химические реактивы фирм "Serva",. "Sigma", "Fluka "Merck", "Pharmacia", "Promega", а также радионуклиды у-32Р]-аденозин-5 трифосфат, [а-32Р]-дезоксиаденозин-5'-трифосфат производства фирм «Изотоп» (г.Обнинск). Ферменты

ч

В работе использовали РНК-зависимую ДНК-полимеразу (ревертазу) вирус миелобластоза птиц (Омутнинский химический завод); Tag ДНК-полимера: (Promega); ДНК-лигазу Т4 (Биотех); рестриктазы (Биотех); полинуклеотидкина: (Promega); протеиназу К (Serva).

Оборудование

В работе использовали следующее оборудование: микроцентрифуг Eppendorf, модель 5414 (Германия); центрифуга Beckman модель J2-2' высокоскоростная центрифуга Son/al, модель OTD65B (США); источник питания LKB, модели 3371Е и 2297 (Швеция), Pharmacia, модели EPS 3500XL GPS 200/400 (Швеция); термостаты Millipore (США) и Eppendorf, модель 532(

амплификаторы MiniCycler и РТС-100™ фирмы MJ Reasearch (США); встряхиватель Eppendorf модель 5432; холодильники ОКА, Sanyo, проточный спектрофотометр Uvikord LKB (Швеция), спектрофотометр Shimadzu (Япония).

Постановка реакции

Суммарную РНК выделяли из вируссодержащей суспензии, используя набор реактивов RNAgents Total RNA isolation System (Promega, США). Для OT-ПЦР использовали две пары праймеров, фланкирующих вариабельную область гена VP2.

Амплифицированные в ПЦР фрагменты кДНК очищали с помощью набора 'Wizard PCR Preps" (Promega). Циклическое секвенирование фрагментов кДНК проводили с использованием набора "fmol DNA Sequencing System Sample" ¡Promega). При этом использовали внутренние праймеры (PR2 и PR3).

Синтезированные в секвенирующих реакциях фрагменты кДНК фракционировали в тонких клиновидных (0,2-1,2 мм) полиакриламидных гелях с <онцентрацией акриламида 6 - 7%, содержащих 7М мочевину.

По окончании электрофореза гель отмывали от мочевины, высушивали при 100-200°С и проводили радиоавтографию на пленку РМ-В (Тасма, г. Казань).

Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых числот

При выборе оптимальных для праймеров участков генома использовали программы "ALIGN" (Scientific & Educational Software), OLIGO (версия 3.3). Для выявления вариабельных участков генома вируса ИББ использовали программу "SQMAX", разработанную специалистом ВНИИЗЖ Зинковским Ю.В.

Для анализа установленных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей штаммов вируса ИББ использовали пакет прикладных программ SeqProgs (Data handling for molecular epidemiology), зерсия 1.0 (N.J.Knowles, IFAH, Великобритания). Статистическая обработка результатов исследований

Использовали общепринятые способы статистической обработки }кспериментально полученных выборок варьирующих переменных. Определяли дисперсию, стандартное отклонение и доверительный интервал средних жачений. Корреляцию связанных переменных оценивали соответствующими юэффициентами. Значимость всех опубликованных величин была не ниже íepBoro критериального порога (р<0,05).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Анализ эпизоотической обстановки по ИББ в Российской Федерации за 1990-1999г.г.

Первая вспышка ИББ в России была зарегистрирована среди молодняка на Братцевском птицеводческом объединении Московской области в 1980г.

В 1990-1992гг. заболевание было зарегистрировано в Брянской области на птицефабриках "Победа" и "Снежка", в Республике Коми - на "Интинской" и "Ухтинской" птицефабриках и в Тюменской области ("Боровская" птицефабрика). В птицехозяйствах Республики Коми был получен эффект после иммунизации живой вакциной из штамма "ВНИВИП". Однако, на птицефабриках "Снежка" и "Победа" полного оздоровления после применения импортных и отечественной живых вакцин достигнуть не удалось и отход птицы от ИББ оставался на высоком уровне.

Заболеваемость и летальность среди молодняка на этих фабриках было очень высокой и превышала показатели потерь от ИББ при более ранни> вспышках. В это же время в Белоруссии на ряде птицефабрик ("Дубовляны" "Волковысская" и др.) отмечено возникновение ИББ с практически 100% охватов поголовья молодняка и высоким процентом смертности.

В мае 1993г. заболевание с большими потерями отмечено на тре> птицефабриках Пензенской области и "Новгородской" птицефабрик« Новгородской области. В дальнейшем количество вспышек ИББ с большим! потерями молодняка стало неуклонно расти и охватывать новые регионь Российской Федерации.

Заболевание молодняка ИББ в острой форме с 1993 по 1999гг регистрировалось, только по нашим данным, в 156 птицехозяйствах. Однако, эт! данные нельзя считать полными, так как во многих регионах в случа« заболевания ветспециалисты проводили иммунизацию птиц вирусвакцино! сухой против ИББ из штамма «БГ» и в кратчайшие сроки ликвидировал! вспышки без объявления ограничений.

Динамика увеличения количества неблагополучных административны: регионов Российской Федерации за 1993-1999гг. показывает, что ИББ 1 клинической форме регистрировали в 53 (74,6%) из 71 региона с развитыл птицеводством. Максимальное развитие ИББ получила в 1995 г. и 1996 г., когд; заболевание проявилось в 29 административных регионах, что составило 40,8°У от общего числа.

В 18 субъектах РФ заболевание, вызываемое высоковирулентными таммами, не проявлялось, что связано с низкой плотностью птицепоголовья и юевременной специфической профилактикой с использованием живых вакцин.

По нашим данным, из 163 вспышек ИББ в 154 случаях (94,5%) 1ецифическая профилактика не проводилась и только в 9 случаях (5,5%) (болевание регистрировали в птицехозяйствах, где проводили иммунизацию элодняка живыми вакцинами из «промежуточных» штаммов.

На долю птицефабрик яичного направления приходится 115 случаев 0,5%) от общего числа неблагополучных хозяйств, а на долю мясного - 48 9,5%).

Следует отметить, что при возникновении острой вспышки ИББ первыми |болевают цыплята старших возрастных групп, а затем инфекция аспространяется на более молодых цыплят.

Официальные статистические данные о заболевшем и павшем молодняке гр за период с 1993 по 1999 гг. подтверждают, что заболевание в 1994-1995гг. это взято под контроль за счет масштабного применения живых вакцин, ачиная с 1996г., наблюдалось снижение показателей заболеваемости и лертности, хотя количество неблагополучных пунктов (46) в этот год было аксимальным. Эффективная стратегия вакцинопрофилактики дала ощутимые эзультаты в 1998-99 гг., когда показатели заболеваемости и смертности были эименьшими.

2.2.2. Штаммовая дифференциация вируса ИББ с использованием методов молекулярной биологии

В связи с появлением и распространением высоковирулентных изолятов ируса ИББ возникла необходимость разработки высокочувствительных и тецифичных методов, позволяющих не только выявлять вирус ИББ, но и роводить идентификацию и дифференциацию вакцинных штаммов и полевых золятов, а также изучать генетическую вариабельность вируса ИББ.

В связи с этим мы считали целесообразным разработать и включить в кем у лабораторной диагностики ИББ метод индикации и штаммовой ифференциации вируса ИББ на основе ПЦР и секвенирования.

На основе результатов собственных исследований, а также данных ЕМВ1_, ыл создан банк данных, включающий последовательности вариабельной Власти гена УР2 отечественных и зарубежных полевых изолятов и вакцинных ггаммов вируса ИББ. Анализ накопленных данных позволяет представить ариабельность вируса и определить генетическое родство между разными

штаммами. В соответствии с гомологией нуклеотидных последовательносте! вариабельной области гена VP2 штаммы вируса ИББ, выделенные в различны: регионах мира, можно разделить на 5 генетических групп. Первая группа (I объединяет высоковирулентные штаммы, выделенные в Великобритании Голландии, Японии, Израиле и Китае. Вторая группа (II) включает вакцинньи штаммы PBG98, Cu-1, D78 и слабопатогенные изоляты из Японии и Китая Антигенные варианты, выделенные в США, образуют группы III и IX/ Классические вирулентные штаммы 52/70 и STC объединяются в V группу.

Первые пробы патматериала были получены нами в 1993 г. птицефабрик, где наблюдались острые вспышки ИББ. В результат проведенных исследований были выявлены изоляты вируса ИББ, которы отличались по своей структуре от классических патогенных штаммо! американских антигенных вариантов, вакцинных штаммов и характеризовала высокой степенью гомологии с высоковирулентными изолятами I группы.

В последующие годы было показано, что в пробах патматериалов птицефабрик, где наблюдали острое течение ИББ с высоким уровне смертности, выявляются изоляты вируса, относящиеся к I группе. При этом ря изолятов, выделенных во время острых вспышек ИББ на птицефабрика географически удаленных друг от друга, имели идентичные нуклеотиднь последовательности вариабельной области гена VP2.

Среди изолятов вируса ИББ, выделенных в 1995, 1996, 1999 гг., крол< изолятов I группы, установлены изоляты II группы, близкие к вакциннь штаммам Cu-1 и PBG98. Не исключено, что они были выделены t птицефабриках, где применялись близкие по структуре вакцинные штаммы.

В период с 1994 по 1999 г. наряду с изолятами, относящимися описанным выше двум группам, с периодичностью 1-3 раза в год бы; выявлены изоляты с оригинальной структурой вариабельной области гена VP Сравнение со всеми имеющимися в банке данных последовательностяг, штаммов вируса ИББ показывает, что эти, изоляты уникальны и отличаются > других штаммов и друг от друга.

Редкое выявление изолятов с оригинальной структурой вариабельн< области гена VP2, а также изолятов, относящихся ко II группе, по ва видимости, связано с особенностями выборки, т.к. на исследование, к правило, поступает патматериал с птицефабрик, где в данный моме отмечается вспышка ИББ, а оригинальные изоляты выявляются птицефабриках, где отсутствуют клинические проявления ИББ.

. За время наблюдения было отмечено повторное выделение идентичных ти близких по структуре изолятов вируса ИББ в патматериале с одной и той же 1тицефабрики. На трех птицефабриках были выявлены изоляты I группы с щентичной структурой с разницей во времени выявления 1-1,5 года.

О происходящем генетическом дрейфе вирусов, циркулирующих на ¡тицефабриках, свидетельствует то, что изоляты, отличающиеся по 2 и.о., были |бнаружены на "Тольяттинской" птицефабрике в 1997 г. и 1998 г., по 4 н.о. сличались изоляты IBDVRF-08/96 и IBDVRF-12/99, выявленные на тицефабриках "Бройлер" Иркутской области, а также IBDVRF-08/94 и IBDVRF-6/98 с птицефабрики "Рассвет" (Тульской области, разница во времени ыявления которых составляет около 3,5 лет.

Полученные данные свидетельствуют о том, что вирус может длительное ремя персистировать на птицефабриках.

Анализ первичной структуры вариабельной области гена VP2 течественных полевых изолятов вируса ИББ позволил выделить две основные эуппы изолятов. Первая, более многочисленная группа (63 изолята) обладает ольшим сходством с высоковирулентными штаммами, выделенными в еликобритании (CS89, 74/89А, 661) и Голландии (DV86). Одиннадцать, ходящих в эту группу изолятов, по нуклеотидной последовательности олностью идентичны штамму 661, пять изолятов имеют последовательности, нелогичные последовательностям штамма DV86, три изопята идентичны 1тамму 7489А, остальные 44 изолята имеют от 1 до 10 нуклеотидных отличий.

Вторую группу составляют шесть изолятов, обладающих высокой гепенью гомологии нуклеотидных последовательностей (около 98,5%) с акцинными штаммами Си-1 и PBG98.

В 9 пробах патматериала были выявлены изоляты вируса ИББ, арактеризующиеся оригинальной структурой.

В 31 пробе патматериалов, полученных от птиц, иммунизированных живой акциной на основе штамма «БГ», выявлен вакцинный штамм «БГ».

Анализ показывает, что нет четкой корреляции между разделением золятов на группы и географическим местом их выделения. Тот факт, что эюоковирулентные штаммы, выделенные в Европе, имеют эследовательности, идентичные или близкие к таковым большинства эссийских изолятов, позволяет предположить, что они имеют общее хэисхождение.

Вполне вероятно, что появлению высоковирулентных штаммов вируса ИББ на территории России и других стран СНГ могла способствовать система комплектации племенных птицеводческих хозяйств молодняком, закупленным у зарубежных фирм.

Применение на птицефабриках России и других стран СНГ вакцин протиЕ ИББ, закупленных у ведущих зарубежных фирм Франции, Хорватии, Голландии США, Германии и других стран, а также некоторых отечественных вакцин, npv соблюдении всех условий и сроков вакцинации, не всегда обеспечивает эффективную защиту. Одной из причин неэффективности вакцинации могут быть различия в антигенной структуре вакцинных штаммов и полевых изолято! вируса ИББ.

Для выявления генетической вариабельности вакцинных штаммов вирус. ИББ, а также возможных отличий в первичной структуре основной конформационного эпитопа, были исследованы 15 образцов вакцинны: препаратов, имеющихся в коллекции ВНИИЗЖ.

В результате сравнительного анализа было показано, что Winterfield 251: (Италия, 1993), Winterfield 2512 (Югославия, 1993) и PBG98 (Голландия, 1993 г. имеют идентичные последовательности. Последовательности штаммо ВНИВИП (Россия, 1995), UnivaxBD (США, 1987), LZD228 (Голландия, 1988,' LZD228 (Франция, 1981) также идентичны. По 2 н.о. отличается от этой групп! штаммов Gumboral СТ (Франция, 1994). Чуть больше отличий имеют Си-1 Виг706 (Франция, 1995), TAD5000 (Германия, 1997) и D78 (Голландия, 1994 Различие перечисленных выше штаммов по нуклеотидной последовательност вариабельной области гена VP2 составляет не более 2 %, что позволяв объединить их в одну группу (II группа) и предположить, что они имеют обще происхождение.

Четыре из пятнадцати исследованных вакцинных штаммов являютс представителями других генетических групп, так как обладают рядом отличий с II группы. Примерно на 4% от II группы отличается штамм 228 (Голландия,1994); на 5,5% - два штамма: 1-65 (Израиль, 1996) и Bursine-(США, 1996); на 6,8% - штамм «БГ» (Россия).

Сравнительный анализ аминокислотных последовательносте вариабельной области VP2 показал, что ,исследованные вакцинные штаммь относящиеся к разным генетическим группам вируса ИББ, имеют отличающуюс первичную структуру основного конформационного эпитопа. Из всех вакциннь штаммов только штамм «БГ» имел структуру, наиболее близкую к большинст!

зтечественных изолятов (I группы), и отличается от них всего по 2-3 а.о. Закцинный штамм 228Е имеет отличия на 7 а.о., а остальные вакцинные итаммы (РВ698, \Мп1егПе1с1 2512, ВНИВИП, ипп/ахВО, 1_г0228, СитЬога! СТ, ;и-1, Виг706, 078, Вигете-2 и 1-65)-более чем на 10 а.о.

Теоретический расчет вторичной структуры показал, что выявленные зтличия аминокислотных последовательностей вариабельной области \/Р2 13олятов I группы от вакцинных штаммов (кроме «БГ») могут являться причиной вменения конформации основного эпитопа и, соответственно, антигенных :войств полевых изолятов по отношению к вакцинным штаммам.

На основании проведенных исследований были разработаны Методические указания по индикации генома и штаммовой дифференциации мруса ИББ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенированием ¡ариабельной области гена УР2", которые были утверждены Департаментом ¡етеринарии МСХ и П РФ 21.02.1997 г. и вошли в "Методические указания по 1иагностике заболеваний с-х животных методом полимеразной цепной реакции", зекомендованные в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.

2.2.3. Разработка набора для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни методом иммуноферментного анализа* Сложная эпизоотическая ситуация по ИББ в 1993-1995гг. потребовала доведения НИР по разработке и созданию набора для определения антител к зирусу ИББ иммуноферментным методом, которая включала в себя следующие этапы: отработку технологических вопросов получения биологических и <имических компонентов набора, оптимизацию условий постановки ИФА, табораторные и производственные испытания. Из всего разнообразия испытанных систем постановки ИФА (конкурентный анализ, двойной "сэндвич" и др.) предпочтение было отдано непрямому варианту как наиболее практичному, менее трудоемкому и выполнимому при минимальном лабораторном эбеспечении.

С целью проверки чувствительности и специфичности ИФА были доведены опыты, где динамику и уровень накопления антител определяли 1араллельно в РДП и в ИФА. При исследовании сывороток крови кур из зазличных областей России на наличие антител к вирусу ИББ в реакциях ИФА и ЭДП были получены сопоставимые результаты, что позволило рекомендовать 4ФА для практического применения. -

' Данным раздел выполнен совместно с сотрудником ВНИИЗЖ Окопы нш Т.Н.

За период с 1994 по 1999гг. с помощью наборов ИФА во ВНИИЗЖ исследовано около 100000 проб сывороток крови птиц различных возрастных групп из более чем 500 птицехозяйств Российской Федерации. С 1994г. во ВНИИЗЖ организовано постоянное обучение ветеринарных специалистов специализированных областных лабораторий и птицефабрик по серомониторингу с применением разработанных наборов.

Всего за период с 1994 по 1999гг. реализовано 4557 наборов ИФА для определения антител к вирусу ИББ.

Нормативная документация на набор для определения антител к вирусу ИББ методом иммуноферментного анализа без ограничения срока действия утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России (ТУ 9388028-00495527-99, наставление по применению № 13-7-2/1888 от 28.02.2000 г.).

Были проведены исследования по созданию набора для определения титров антител к вирусу ИББ в сыворотках крови птиц при исследовании проб в' одном выбранном разведении. Для прогнозирования титра антител по значению S/P (отношение оптической плотности испытуемой сыворотки к значению оптической плотности положительной контрольной сыворотки за вычетом из обоих значений оптической плотности отрицательного контроля), измеренному для одного разведения сыворотки, используют уравнение стандартной кривой, полученное методом линейной регрессии на основании титра, определенного методом последовательных разведений данной сыворотки.

В качестве меченых детекторных антител был апробирован антикуриный иммунопероксидазный конъюгат, а в качестве субстрата при отработке условий постановки реакции испытывали стабильный пероксидазный субстрат АБТС фирмы KPL (США).

После отработки условий постановки и учета результатов ИФА были проведены сравнительные исследования полевых сывороток крови цыплят с применением разрабатываемого набора и набора фирмы KPL для определения антител к вирусу ИББ.

Установлено, что случаи несовпадения результатов не превышали 3%. Корреляция между коммерческим набором KPL и тестируемым набором составила 87%.

Нормативная документация на набор для определения антител к вирусу ИББ иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России

ТУ 9388-020-00495527-99, временное наставление по применению набора № 13-7-2/1903 от 09.03.2000 г.).

На основании проведенных исследований по ИФА были разработаны ¡Методические указания по определению антител к вирусу ИББ в сыворотках :рови кур иммуноферментным методом», которые утверждены Департаментом ютеринарии Минсельхозпрода России 09.10.1997г. и вошли в «Методические 'казания по диагностике заболеваний с-х животных иммуноферментным летодом», рекомендованные в качестве пособия для работников ветеринарных ^агностических лабораторий.

!.2.4. Разработка технологии изготовления и контроля вирусвакцины сухой против ИББ из штамма «БГ»*

Необходимость создания живой вакцины против ИББ из «горячего» штамма газникла в связи с появлением высоковирулентных штаммов, вызвавших гальшой отход молодняка птиц.

В 1994г. на птицефабрике «Уральская» Оренбургской области возникла юпышка ИББ среди бройлеров. Лабораторному исследованию был подвергнут отологический материал (фабрициевы сумки и селезенки), который отобрали )т больных бройлеров, доставленных во ВНИИЗЖ.

Из полученного патматериала готовили 20% гомогенат, который 1ентрифугировали при 3000 об/мин, и надосадочную жидкость фильтровали 1ерез мембранный фильтр F 8148 с диаметром пор 0,22 мкм для очистки от юзможной бактериальной контаминации.

Полученным материалом инфицировали СПФ-эмбрионы на ХАО через ;стественную пугу. Через 120 часов инкубирования были обнаружены первые югибшие эмбрионы со специфическими изменениями, характерными для ИББ.

Уже через 12 пассажей на СПФ-эмбрионах аттенуируемый полевой изолят ie вызывал клинической формы заболевания у восприимчивых цыплят. В ;альиейшем провели несколько пассажей в первично-трипсинизированной ультуре ФКЭ и 20 пассажей на СПФ-эмбрионах. Полученному штамму было ;ано название «БГ» и 21.06.1996г. он был депонирован в Государственной :оллекции вирусов ВГНКИ ветпрепаратов под регистрационным номером «БГ» 02 «ДЕП». Штамм «БГ» вируса ИББ был проверен на реверсибельность, ширулентность, иммунодепрессию, стерильность, контаминацию микоплазмами i вирусами, иммуногенность.

Результаты проверки на стерильность показали отсутствие в матровых 1асплодках штамма «БГ» бактериальной микрофлоры, грибков и плесени. При

ДаппыП ратдел выполнен совместно с сотрудником ВНИИЗЖ Кузнецовым П. П. '

проверке матровых расплодок штамма «БГ» вируса ИББ на жидких и плотны) РР1_0-средах контаминации микоплазмами не обнаружено.

Исходный штамм «БГ» проверяли на возможную контаминацик посторонними патогенными и вакцинными микроорганизмами и вирусами путеь* его введения различными способами 50 СПФ-цыплятам в возрасте 15 суток. Е сыворотках крови через 28 суток после введения исходного штамма «БГ> обнаружены антитела к вирусу ИББ, а к остальным возбудителям инфекцм (ИБК, ИЛТ, ИАЦ, БН, ИЭМ, ССЯ-76, реовирусный теносиновит, грипп, лейкоз пастереллез, сальмонеллез, ринотрахеит индеек, ретикулоэндотелиоз микоплазмоз) антитела не выявлены, что свидетельствует об отсутствш контаминантов в исходном штамме «БГ». '

Обязательным этапом в исследованиях по оценке штамма «БГ» вирус; ИББ являлась его проверка на возможность реверсии.

С этой целью провели 10 последовательных пассажей, выделенной штамма «БГ» на 580 СПФ-эмбрионах и 8 пассажей на 240 СПФ-цыплятах.

Результаты экспериментов показали отсутствие реверсии штамма «БГ: вируса ИББ. При проведении пассажей обоих вирусных материалов СПФ цыплята не погибали, не были угнетены, хорошо поедали корм и нормальн развивались. Массы тела контрольных и опытных цыплят достоверно н отличались.

Во всех сыворотках крови от опытных СПФ-цыплят обнаружены антитела вирусу ИББ, титры которых не зависели от пассажа, незначительно колебалис при исследовании в РДП от 3,6±0,2 лог2 до 4,8±0,3 лог2 и в ИФА в значениях о 2230±105 до 3800±205. У цыплят обеих групп на всех пассажных уровня отмечены макроскопические изменения фабрициевой сумм характеризующиеся её уменьшением без видимых патологических изменений.

Данный факт свидетельствует о высокой способности штамма «БГ приживляться и репродуцироваться в организме цыплят, что обеспечивает и защиту от заражения высоковирулентными штаммами возбудителя.

Дифференциальными отличиями макроскопических изменени фабрициевой сумки при воздействии штамма «БГ» и полевы высоковирулентных штаммов вируса ИББ является то, что после заражени полевыми штаммами на поверхности фабрициевой сумки появляетс желтоватый желатинообразный транссудат, покрывающий серозну поверхность. Структура и складчатость фабрициевой сумки становятс заметными и ее нормальный серо-белый цвет превращается в желтоват!

эемовый. В полости фабрициевой сумки при острой форме заболевания и /бклиническом течении обязательно обнаруживают серозно-гнойное эдержимое или фибрин. В пораженной фабрициевой сумке на поверхности или а складках наблюдают кровоизлияния при обеих формах течения заболевания.

Все указанные признаки при репродукции штамма «БГ» в фабрициевой /мке полностью отсутствуют и изменения сводятся лишь к уменьшению органа размерах.

Результаты проверки штамма «БГ» на иммунодепрессию показали, что он э обладал выраженной иммунодепрессией. Цыплята опытной и контрольной )упп в течение всего эксперимента выглядели клинически здоровыми и не эболели БН после контрольного заражения. Средние значения титров антител вирусу БН в РТГА у цыплят опытной группы составили 7,00±0,19 лог2, а у ыплят контрольной группы - 7,20±0,17 лог2.

Значения титров антител в ИФА к вирусу ИББ у цыплят опытной группы элебались от 2402 до 7441, а среднее значение титра составило 4940±302.

Определение степени иммунодепрессивного действия штамма «БГ» в эставе живой вакцины проводили также на коммерческих цыплятах яичной эроды в возрасте 15 суток.

Прирост массы тела во всех группах был примерно одинаковым. Титры нтител в ИФА и РТГА к вирусу БН у цыплят обеих групп не имели ^щественных различий. Средняя величина титров антител к вирусу БН в РТГА цыплят, привитых только против БН, составила 6,59+0,11 лог2, а у цыплят, ммунизированных против БН и ИББ -6,52±0,15 лог2. Средние величины титров нтител в ИФА были равны 1742+444 и 1700±321, соответственно.

Таким образом, эксперименты по определению степени иммунодепрессии, роведенные на СПФ и коммерческих цыплятах с использованием в качестве ндикатора вакцинации против БН, убедительно доказывают, что штамм «БГ» яруса ИББ не обладает иммунодепрессивным действием.

После проверки штамма «БГ» на реверсию, иммунодепрессию и ммуногенность первоочередной задачей перед нами стояла отработка птимальных условий культивирования штамма с целью получения вирусного ырья с высокой биологической активностью и пригодного для изготовления ивой и инактивированной вакцин против ИББ.

Для производства противовирусных вакцин с применением КЭ из чествующих методов заражения наиболее часто используют инфицирование аллантоисную полость (АП) и на хориоаллантоисную оболочку ^^АО). В

качестве потенциально возможных были проверены способы заражения СПФ-куриных эмбрионов в АП, на ХАО через искусственную воздушную камеру и на ХАО через естественную пугу по способу, основанному на легкой щадящей скарификации подскорлупной оболочки и внесении вирусного материала между ХАО и подскорлупной оболочкой на границе пуги.

Показано, что при заражении СПФ КЭ через естественную пугу и искусственную воздушную камеру специфическая гибель эмбрионов составляет более 90% и значительно выше, чем при заражении в АП.

Анализ экспериментальных данных по определению уровня накопления штамма «БГ» вируса ИББ подчеркивает преимущество заражения на ХАО в сравнении с инфицированием в АП. Максимальная биологическая активность штамма «БГ» при заражении в АП составляет 5,60±0,06 1д ЭИДбо/мл, в то время как при инфицировании на ХАО в период 72-120 часов она значительно выше и колеблется от 5,80±0,08 до 6,80±0,03 1д ЭИД50/мл.

Выбирая из двух способов заражения на ХАО более эффективный, в конечном итоге, остановились на заражении СПФ-КЭ на ХАО через естественную лугу. При этом способе заражения специфическая гибель СПФ-КЭ за период 72-120 часов на 3,6% выше, чем при инфицировании через искусственную воздушную камеру. Процесс инфицирования на ХАО через искусственную воздушную камеру является более трудоемким и увеличивает время заражения при масштабировании процесса получения вирусного сырья. Отмечено, что при заражении на ХАО через искусственную воздушную камеру потребуется в 1,7 раза больше площади инкубаторного парка, чем при заражении на ХАО через естественную пугу. В связи с тем, что по биологической активности получаемого вируса существенных различий при обоих способах заражения не выявлено, способ инфицирования СПФ-КЭ на ХАО через естественную пугу был выбран как наиболее приемлемый для масштабного получения вирусного сырья.

Процесс получения вирусного сырья для производства живой вакцины против ИББ с использованием СПФ-КЭ предусматривает трудоемкий этап сбора отдельных частей эмбриона.

В связи с этим были проведены исследования, касающиеся определения максимального накопления вируса в различных частях эмбриона (голова, тушка, печень, ХАО и аллантоисная жидкость) и установлено, что через 72-120 часов после заражения в СПФ-КЭ происходят дегенеративные изменения, приводящие к увеличению массы тушки на 19%, головы на 14,9%, печени на

11,7% и ХАО на 25%. В то же время объем аллантоисной жидкости уменьшается 1а 19,7%. При вскрытии погибших СПФ-КЭ отмечали отечность головы и шеи, фовоизлияния на голове и кончиках пальцев, поражения печени, почек и

:ердца. ХАО обычно слегка набухшая.

Максимальное накопление вируса ИББ, штамм «БГ», отмечается в голове и

ютрошенной тушке эмбриона и составляет 7,15±0,03 и 7,10±0,01 1д ЭИД50/мл, ^ответственно. Минимальный инфекционный титр вируса регистрировали в <АО - 4,40±0,04 1д ЭИД50/мл.

Учитывая, что биологическая активность вируса ИББ штамм "БГ в непотрошенной тушке довольно высока и составряет 6,94+0,02 1д ЭИД5о/мл, и ^значительно уступает активности вируса в отдельных частях эмбриона, в дальнейшем для промышленного приготовления вирусного сырья при 1роизводстве сухой вирусвакцины против ИББ из штамма "БГ' использовали 1епотрошенные тушки и аллантоисную жидкость. Хориоаллантоисные оболочки У1я получения вирусного сырья не использовали ввиду их небольшой массы, трудоемкости и больших временных затрат на их извлечение и низкой Зиологической активности. Аллантоисную жидкость, в которой биологическая активность вируса ИББ также достаточно высока (6,85±0,07 1д ЭИД50/мл), 1спользовали в качестве дополнения к буферному раствору при изготовлении юлуфабриката вакцины.

После получения вирусного сырья для производства живой вакцины 1зучали влияние процесса неоднократного замораживания-оттаивания на выход зируса из клеток, подбирали оптимальную стабилизирующую среду для пиофилизации и компонентный состав полуфабриката вакцины, режим чиофилизации полуфабриката, обеспечивающий минимальные потери 1нфекционности вируса.

Трехкратное замораживание-оттаивание приводит к наиболее полному освобождению вирусных частиц из клеток СПФ-КЭ и повышению титра 1нфекционности на 0,85 1д ЭИД50/мл.

Полученные экспериментальные данные послужили основанием для ¡ведения в технологию изготовления живой вакцины против ИББ из штамма "БГ" )тапа трехкратного замораживания-оттаивания.

В исследованиях по подбору оптимальной защитной среды для 1Нофилизации и хранения сухой вирусвакцины против ИББ из штамма "БГ", )беспечивающей сохранение высокого уровня биологической активности ¡ируса, в качестве потенциальных стабилизаторов брали защитную среду

ВНИИЗЖ, растворы сахарозы, ГЛА, пептона и желатина различных концентраций и в разных комбинациях друг с другом.

Отмечено, что наиболее выраженными протективными свойствами обладает защитная среда ВНИИЗЖ, при использовании которой потери титра инфекционности вируса были наименьшими и составляли 0,25±0,04 1д ЭИД50/мл.

Использование других защитных сред приводило к большим потерям инфекционности - от 0,75 до 2,00 1д ЭИД50/мл. Без применения защитных сре,п титр инфекционности после лиофилизации снижался на 2,50 1д ЭИД50/мл.

Наряду с выбором стабилизирующей среды проведены исследования пс подбору оптимального компонентного состава вакцины. С этой целью пру получении полуфабриката вакцины против ИББ из штамма «БГ» к вирусному сырью добавляли стабилизирующую среду ВНИИЗЖ в конечной концентрацм 5, 10 и 15%. После этого образцы полуфабриката вакцины с разнымк количествами стабилизирующей среды лиофилизировали одновременно I-проводили определение иммуногенной активности вакцины на цыплятах. Дл? этого предварительно готовили 10-кратные разведения образцов вакцин с минимальным, средним и максимальным компонентным составом и каждыи разведением иммунизировали по 30 цыплят методом выпаивания Иммуногенную активность лиофилизованной вакцины оценивали п( результатам контрольного заражения вирулентным вирусом цыплят опытной I контрольной групп через 14 суток после введения вакцины.

Разведение 1:10000 вакцины, содержащей 85% вирусного сырья с титро(> инфекционности 6,71 1д ЭИД50/мл и 15% защитной среды, обеспечило защит 86,7% иммунизированных цыплят.

При использовании 10000-кратного разведения вакцины, содержащей 90°/ вирусного сырья и 10% защитной среды ВНИИЗЖ, было защищено 96,7%, а пр| наличии в препарате 95% вирусного сырья и 5% защитной среды - 90е/ поголовья.

Таким образом, результаты проведенных исследований указывают, чт< лучшие показатели иммуногенности были получены когда полуфабрика вирусвакцины до лиофилизации содержал 90% вирусного сырья и 10°/ защитной среды ВНИИЗЖ.

Оценку иммуногенной активности вирусвакцины сухой против ИББ и штамма «БГ» проводили в лабораторных и производственных условиях по ряд параметров.

Для определения оптимальной иммунизирующей дозы взяли сухую вирусвакцину против ИББ из штамма «БГ» с инфекционным титром 6,0 1д ЭИД50/мл и развели её так, чтобы в 1 мл содержалось 1,10, 50, 100, 1000 и 10000 ЭИД50. Каждое из разведений вакцины выпаивали 30 цыплятам и через 14 суток после введения проводили контрольное заражение вирулентным вирусом. Установлено, что сухая вирусвакцина против ИББ из штамма "БГ обладает высокой иммуногенной активностью и при введении даже 50 ЭИД50 на голову обеспечивает защиту 83,3% привитых цыплят от заболевания. Вакцина в дозе 100 ЭИД50 на голову защищает 93,4% поголовья, а в дозах 1000 и 10 000 ЭИД50 на голову - всех иммунизированных цыплят.

В условиях неблагополучных по ИББ хозяйств и при острых вспышках возможно наличие различных факторов, которые могут повлиять на снижение активности вакцинного штамма. В связи с этим, оптимальной иммунизирующей дозой для гакцины из штамма «БГ» мы рекомендуем считать 1000 ЭИД50 на голову, т.е. дозу, обеспечивающую в экспериментах полную защиту привитых цыплят от заболевания.

Важными моментами при определении стратегии применения вакцины является время образования антител и наступления защиты у цыплят. В эксперименте иммунизировали 200 серонегативных цыплят в дозе 1000 ЭИД50 на голову путем выпаивания. Через каждые 2 суток после прививки убивали по 20 голов, отбирали пробы крови, фабрициевых сумок и селезенок. Сыворотки крови исследовали в ИФА на наличие антител, а гомогенат фабрициевых сумок и селезенок в непрямом сэндвич-варианте ИФА - на наличие антигена вируса ИББ. Полученные результаты отражены на рис.1.

0 2 4 6

10 12 14 16 18 20

время после вакцинации, сутки

Рис. 1. Показатели титров антигена в гомогенате и антител в сыворотках крови цыплят в динамике после вакцинации.

Установлено, что антиген штамма «БГ» вируса ИББ обнаруживается в гомогенате фабрициевых сумок и селезенок в высоком титре (3640) на 4 сутки после вакцинации, а дальше титры антигена снижаются и к 10 суткам в гомогенатах он не обнаруживается.

Антитела к вирусу ИББ в ИФА регистрируются у 70% поголовья уже на 6 сутки после иммунизации в титре 1664±203. На 8 сутки у всех привитых цыплят обнаружены антитела в титре 2908±282. В дальнейшем на 20 сутки уровень антител в сыворотках крови повышается (титр в ИФА - 8139+382).

Полученные экспериментальные данные" свидетельствуют о высокой иммуногенной активности штамма «БГ» и способности вирусвакцины против ИББ обеспечить раннюю защиту цыплят от заболевания. Наличие высокого титра антигена на 4 сутки после прививки свидетельствует о быстром размножении вакцинного штамма «БГ» в организме восприимчивых птиц.

Можно предположить, что на 3-4 сутки после прививки сухой вирусвакциной против ИББ из штамма «БГ» цыплята будут устойчивы к заражению высоковирулентными штаммами. Это предположение было проверено в условиях, неблагополучной по ИББ, птицефабрики «Пензенская», где установлено, что при применении вакцины в начале вспышки ИББ удавалось добиться защиты птицепоголовья и свести потери молодняка до минимума (2,5+5,2%). В птичниках, где в начале вспышки прививка против ИББ не проводилась, смертность достигала 69% поголовья. В дальнейшем, этот способ применения вирусвакцины против ИББ из штамма «БГ» использовали в десятках птицехозяйств в случае возникновения острых вспышек заболевания.

При определении стратегии вакцинопрофилактики ИББ в неблагополучных и угрожаемых хозяйствах необходимо учитывать, что молодняк до 150-суточногс возраста может болеть в острой клинической форме, а в более старшем возрасте возможна скрытая 'персистенция вируса ИББ. В связи с этим, в ряде птицехозяйств после вакцинации молодняка проводили отбор проб сывороток крови у птиц в возрасте 2,3,4,5,7,9,11,13 и 15 месяцев с целью определения напряженности и длительности иммунитета. Установлено, что иммунитет к ИББ сохраняется до 15-месячноги возраста, т.е. до конца эксплуатации кур-несушек. В течение срока наблюдения титры антител в ИФА с возрастом незначительно снижались и оставались достаточными для защиты птиц от заболевания.

Живые вакцины против ИББ применяются в большинстве случаев методом выпаивания. Альтернативными методами применения вакцины могут быть окулярный, интраназальный, аэрозольный, подкожный и внутримышечный.

В экспериментах по испытанию эффективности различных методов введения установлено, что все способы обеспечивают полную защиту цыплят от заболевания ИББ при контрольном заражении вирулентным штаммом вируса. Титры антител в ИФА при разных методах иммунизации имеют незначительные различия, но более высокие значения (6125±158) получены при выпаивании вакцины. С учетом этого, данный метод был рекомендован для практического применения, как наименее трудоемкий.

Важнейшим условием успешной иммунизации цыплят против ИББ является правильное определение сроков их вакцинации. Для определения уровня пассивных материнских антител у цыплят, при котором штамм «БГ» после введения вызывает образование иммунитета, использовали 420 цыплят 8, 10, 12, 14, 16, 18 и 20-суточного возраста, полученных от кур-родителей одного возраста.

Перед введением вакцины, методом выпаивания в дозе 1000 ЭИД50, у цыплят отбирали кровь из подкрыльцовой вены и определяли наличие материнских антител в ИФА. Через 14 суток после вакцинации у тех же цыплят отбирали и исследовали пробы сывороток крови.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при среднем титре материнских антител в ИФА, равном 1801+434, вирусвакцина против ИББ из штамма «БГ» приживляется в организме цыплят и вызывает выработку иммунитета (табл. 1).

Таблица 1

Иммуногенная активность вакцины из штамма «БГ» при иммунизации

цыплят с разным уровнем материнских антител

№№ п/п Возраст цыплят, сут. % цыплят, имеющих материнские антитела Титры материнских антител а ИФА Бурсаль-ный индекс после иммунизации % ЦЫПЛЯТ, имеющих антитела после прививки Титры антител после прививки в ИФА

1 8 100 4696±317 4,09±0,32 0 н.о.

2 10 100 415И218 4,77±0,22 0 н.о.

3 12 100 18011434 1,45±0,08 100 1687+192

4 14 93,2 1362±152 1,26±0,05 100 3388+360

5 16 85,7 1331±120 1,66±0,13 100 2983±365

6 18 81.1 1295±96 1,28+0,06 100 5597±532

7 20 80,9 1166±160 1,38±0,07 100 4607+590

Примечание: н.о. - не обнаружено

В лабораторных экспериментах и в условиях птицехозяйств проведена

»

сравнительная оценка иммуногенности различных живых вакцин против ИББ.

Так, в лабораторных условиях на 180 цыплятах были испытаны следующие живые вакцины против ИББ: Тавиар (Италия); Гумбораль СТ (Франция); 'живая вакцина против ИББ (Болгария) и вирусвакцина сухая против ИББ из штамма «БГ».

При контрольном заражении через 21 сутки после вакцинации процент защиты цыплят, иммунизированных различными вакцинами, составил: после введения вакцины Тавиар-46,2; болгарской вакцины - 66; Гумбораль СТ - 86,6; вакцины из штамма «БГ» (однократно и двукратно) - 100%. В контрольной группе заболело ИББ 83,2% цыплят и пало 16,6%.

Серия опытов по сравнительной оценке иммуногенности различных живых вакцин против ИББ проводили на 150 СПФ-цыплятах 14-суточного возраста. Использовали вакцины «Тавиар» (Италия), «Д-78» (Голландия), «Гумбораль СТ» (Франция), из штамма «ВНИВИП» (Россия) и из штамма «БГ».

Максимальную полную защиту от заболевания ИББ обеспечила сухая вирусвакцина из штамма «БГ». Вакцины из штамма Д-78 и Гумбораль СТ защитили 73,3 и 76,7% привитых цыплят, соответственно. Низкие показатели защиты, равные 60,0 и 46,7%, получены при использовании вакцин «Тавиар» и из штамма «ВНИВИП» соответственно.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что вирусвакцина сухая против ИББ из штамма «БГ» является более эффективной по сравнению с исследованными импортными образцами вакцин.

На птицефабрике «Дубовляны» Республики Беларусь ИББ возникла в июле 1992г. и продолжалась по август 1995г. В этом хозяйстве применялись две живые вакцины против данного заболевания: сухая вирусвакцина против ИББ из штамма «ВНИВИП» и сухая вакцина против ИББ из штамма Д-78 фирмы «Интервет» (Голландия). За 3 года применения этих вакцин оздоровления фабрики от ИББ не было достигнуто. В августе 1995г. на фабрике начали применять сухую вирусвакцину против ИББ из штамма «БГ». Сохранность птиц при применении голландской вакцины на поголовье в 182,8 тыс. птиц колебалась по птичникам от 65,8 до 85,1%, в то время как при использовании вакцины из штамма «БГ» на поголовье в 94,4 тыс. птиц она составляла 91,2+93,6%. Сохранность птицы в возрасте 70 суток в корпусах, где применяли живую вакцину из штамма «БГ», была на 19,6% выше показателя, полученного при использовании вакцины из штамма Д-78. В декабре 1995г. ограничения по ИББ, наложенные на птицехозяйство были сняты.

При эпизоотологических обследованиях на ИББ обнаружено, что в условиях птицеводческих хозяйств уровень пассивного материнского иммунитета неоднороден.

Так в возрасте 7-8 суток у 10,8% цыплят отсутствуют антитела к вирусу ИББ и они могут быть инфицированы полевым изолятом, а в возрасте 15-16 суток уже 23,5% цыплят не имеют антител к этому вирусу.

Зачастую для инкубации закладываются инкубационные яйца, полученные от родителей разных возрастных групп, что делает практически невозможным установление точной даты вакцинации полученных цыплят против ИББ. Все вышеуказанные факторы наталкивают на мысль о необходимости проведения двукратной вакцинации цыплят против ИББ, несмотря на то, что вирусвакцина из штамма «БГ» при однократном применении дает гарантированную полную защиту цыплят от заболевания и способна конкурировать с высоковирулентными полевыми изолятами вируса ИББ.

Одним из немаловажных качеств живых вакцин является стабильность иммуногенных свойств при хранении.

Показано, что титр инфекционности штамма «БГ» вируса ИББ за 24 месяца хранения при температуре 2+8°С снизился всего лишь на 0,17 1д ЭИД50/мл.

Вакцина через 12 и 24 месяца хранения индуцировала выработку стойкого иммунитета к ИББ у цыплят, что подтверждено их полной защитой при контрольном заражении вирулентным штаммом вируса ИББ.

Титры антител в ИФА и РДП у цыплят, привитых свежеприготовленной и хранившейся вакциной, имели высокие значения и существенно не отличались.

Полученные результаты указывают на высокую устойчивость штамма «БГ» вируса ИББ при хранении и надежные протективные свойства защитной среды ВНИИЗЖ.

После успешного проведения широких производственных испытаний на сухую вирусвакцину против ИББ из штамма «БГ» была утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 18.02.1998г. нормативно-техническая документация без ограничения срока действия (ТУ 9384-00600008064-98, наставление по применению вакцины № 13-4-2/1168 от 18.02.1 Э98г).

За период с 1994 по 1999гг. сухая вирусвакцина против ИББ из штамма «БГ» применялась в России в 162 неблагополучных птицехозяйствах. Вакцина широко применяется также в Белоруссии, Украине, Молдавии, Узбекистане и Казахстане.

Данные по производству сухой вирусвакцины против ИББ из штамма «БГ» и количеству неблагополучных птицехозяйств, где было ликвидировано заболевание с помощью данной вакцины, представлены на рис.2.

1991 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 Рис.2. Данные о производстве вакцины из штамма «БГ» и количестве ликвидированных вспышек за период с 1994 по 1999гг.

Разработанная эффективная схема купирования острых вспышек заболевания в птицехозяйствах основана на поголовной иммунизации в очаге заболевания всей птицы в возрасте от 5 до 150 суток сухой вирусвакциной против ИББ из штамма «БГ».

За 1994-1999гг. во ВНИИЗЖ выпущено более 2,2 млрд.доз сухой вирусвакцины против ИББ из штамма «БГ», применение которой предотвратило массовое распространение заболевания, до минимума сократило потери от болезни и стабилизировало ситуацию по ИББ на территории Российской Федерации и других стран СНГ. На штамм «БГ» вируса ИББ и вакцину против ИББ из этого штамма был получен патент РФ № 2127602 (заявка № 97119124 от 24.11.1997 г.).

2.2.5. Разработка технологии изготовления и контроля живой культуральной вирусвакцины против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512»* Для специфической профилактики ИББ в благополучных птицехозяйстаах, в случае отсутствия высоковирулентных штаммов вируса ИББ, рекомендуется использовать живые вакцины из «промежуточных» штаммов, которые индуцируют выработку иммунитета у молодняка кур.

В ряде стран мира широко используется для изготовления живых вакцин против ИББ штамм «Винтерфилд 2512», который вследствие пассирования

'Длимый рапсл выполнен совместно с сотрудником ВГНКИ ветлреларатов НоркиноЛ С.11.

различными способами имеет несколько модификаций (2512-Р48, 2512-Р84, 2512-Р85, клон 2512, 1-2512, 3-2512, Н-2512) и различные характеристики (иммуногенность, патогенность и др.).

В результате проведения трех перемежающихся пассажей на СПФ-эмбрионах и СПФ-цыплятах нами был получен модифицированный штамм «Винтерфилд 2512», отличающийся от исходного более высокой иммуногенной активностью.

Полученные результаты позволили депонировать штамм, который был зарегистрирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ ветпрепаратов 21.06.S5r. под регистрационным номером «Винтерфилд» 84-ДЕП.

На неблагополучной по ИББ птицефабрике «Коминтерновская» Одесской области Смоленский В.И. с соавт. [1995] испытали на 41340 цыплятах 5 экспериментальных серий живых вакцин, изготовленных из различных штаммов и коммерческую вакцину против ИББ из- штамма Д-78 (Интервет, Голландия). Они установили, что заболеваемость и летальность (1,2%) были наименьшими в группе цыплят, привитых вакциной из штамма «Винтерфилд 2512».

Проведенные нами полевые испытания подтвердили правильность выбора штамма «Винтерфилд 2512», как перспективного вакцинного штамма, для производства живой вакцины против ИББ.

После поиска и выбора перспективного штамма «Винтерфилд 2512» для производства живой вакцины против ИББ была поставлена задача по определению оптимальной клеточной системы для получения максимального урожая вируса.

Полученные экспериментальные результаты показали, что первично-трипсинизированная монослойная культура ФКЭ является наиболее продуктивной и имеет преимущество над перевиваемыми линиями клеток млекопитающих.

Штамм «Винтерфилд 2512», полученный на монослойной культуре ФКЭ имел биологическую активность 7,50±0,15 1д ТЦД50/мл, в то время как эиологическая активность вирусного сырья из перевиваемых линий клеток была значительно ниже и колебалась от 5,90±0,20 до 6,75±0,201д ТЦЦ50/мл.

На основании проведенных исследований определена оптимальная схема получения вирусного сырья с титром инфекционности не менее 7,4+7,6 дТЦД50/мл, пригодного дня изготовления живой культуральной вирусвакцины против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512» (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика этапов получения вирусного сырья при изготовлении _вакцины из штамма 'Винтерфилд 2512"_■

№ п/п Название этапов Характеристика

1 Культура клеток Первично-трипсинизированная культура ФКЭ

2 Питательная среда РС-ЗМ

3 Сыворотка крови и концентрация в ростовой среде фетальная сыворотка 5 %

4 Культуральные сосуды клинские матрасы объемом 1,5 л

5 Температура выращивания 38,0 ± 0,5°С

6 Множественность заражения 0,1+1,0 ТЦЦ50 на клетку

7 Посадочная доза 130±10 млн.клеток на сосуд

8 Плотность монослоя 500+700 тыс. клеток на 1 см*

9 Время выращивания 48 часов

В связи с закупками больших партий СПФ-яиц у фирм ЬоЬтапп, Spafas и НуЛ/ас проведены исследования по замене культурапьной системы получения вирусного сырья на выращивание вируса ИББ штамм «Винтерфилд 2512» в10-суточных СПФ-эмбрионах.

Отмечено, что штамм «Винтерфилд 2512» размножается несколько быстрее и вызывает специфическую гибель СПФ-эмбрионов раньше, чем штамм «БГ». Основная масса СПФ-эмбрионов погибает в период между 48 и 72 часами (52,0%) и меньше менаду 72 и 96 часами (19,4%).

При выращивании • вируса ИББ, штамм «Винтерфилд 2512», на СПФ-эмбрионах получали вирусное сырье с титрами инфекционности в диапазоне от 6,5 до 7,2 1д ЭИД50/мл.

I

В дальнейшем, начиная с 1999г., при промышленном изготовлении живой культуральной вирусвакцины против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512» использовали систему получения вирусного сырья на СПФ-эмбрионах, которая более технологична, менее трудоемка и не требует больших затрат на закупки специального оборудования, компонентов сред, фетапьной сыворотки, химреактивов и лабораторной посуды.

В технологическом цикле изготовления живой культуральной вирусвакцины против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512» для получения полуфабриката использовали вирусное сырье культурапьного и эмбрионального происхождения и стабилизирующую среду ВНИИЗЖ в различных пропорциях. Содержание вирусного сырья в диапазоне 85-95% и 5-15% защитной среды ВНИИЗЖ является оптимальным. Потери вируса при использовании эмбрионального

вирусного сырья были несколько ниже, чем при применении культурального вирусного сырья, что обусловлено наличием белков КЭ, которые обладают стабилизирующим эффектом.

Лиофильное высушивание полуфабриката вакцины против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512» проводили по режиму, отработанному для лиофилизации полуфабриката вакцины против ИББ из штамма «БГ». Продолжительность процесса лиофилизации полуфабриката на основе эмбрионального вирусного сырья была на 4-8 часов дольше, чем при использовании культурального вируса.

Для определения безопасности штамма «Винтерфилд 2512» вируса ИББ, т.е. неспособности его вызывать видимые изменения фабрициевой сумки, проведены эксперименты на 60 СПФ-цыплятах.

Установлено, что вакцинный штамм «Винтерфилд 2512» при введении цыплятам в различных дозах не вызывает макроскопических изменений фабрициевой сумки. Бурсальные индексы у вакцинированных и контрольных цыплят до контрольного заражения были практически одинаковыми и находились в предела^ от 5,03 до 5,29.

Бурсальные индексы у незаболевших цыплят в обеих вакцинированных группах были в пределах от 4,64 до 4,84. Средняя масса фабрициевой сумки у вакцинированных цыплят после контрольного заражения была несколько выше по сравнению со средней массой фабрициевой сумки до контрольного заражения, что является физиологической нормой, связанной с ростом птиц.

В контрольной группе 90% цыплят заболели ИББ с клиническими признаками и через 10 суток средняя масса фабрициевых сумок уменьшилась в 4,6 раза, а БИ уменьшился в 5,5 раза, что наглядно свидетельствует о макроскопических изменениях фабрициевых сумок после заражения цыплят вирулентным штаммом вируса ИББ.

Таким образом, показано, что вакцинный штамм «Винтерфилд 2512» вируса ИББ не вызывает видимых макроскопических изменений фабрициевой сумки у цыплят, иммунизированных различными дозами вакцины.

В связи с тем, что исходный штамм был получен с неизвестными характеристиками, нами проведена его проверка на иммунодепрессию согласно «Руководству МЭБ по стандартам для диагностических тестов и вакцин» [1996].

Установлено, что штамм «Винтерфилд 2512» при проверке на 40 СПФ-цыплятах не обладает иммунодепрессией. Цыплята опытной и контрольной

групп в течение всего эксперимента выглядели клинически здоровыми и не заболели БН после контрольного заражения.

Средние значения титров антител к вирусу БН у цыплят опытной группы в РТГА составили 7,40 ± 0,17 лог2, а у цыплят контрольной группы - 7,60+0,20 лог2,т. е. не имели статистически достоверных различий.

Титры антител в ИФА к вирусу ИББ у цыплят опытной группы колебались от 958 до 1924 (среднее значение титров составило 1282 ± 58), что говорит о иммуногенной активности штамма «Винтерфилд 2512» при проверке на СПФ-цыплятах.

Определение оптимальной иммунизирующей дозы живой культурапьной вирусвакцины из штамма «Винтерфилд 2512» проводили на 120 СПФ-цыплятах 14-суточного возраста. После введения СПФ-цыплятам 10000 и 100000 ТЦД50 вакцинного вируса титры ВН-антител в РН составили 10,7±0,2 и 11,8±0,3 лог2, соответственно и в ИФА 1620±181 и 1845±254, соответственно. Степень защиты от контрольного заражения была высокой и равнялась 96,7 и 93,3%, соответственно. После иммунизации СПФ-цыплят в дозе 1000 ТЦДзд защита была низкой (всего 53,3%). Анализ полученных результатов позволяет определить оптимальную иммунизирующую дозу живой культуральной вирусвакцины против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512», которая составляет 10 000 ТЦДю на голову (рекомендована для практического применения).

В опытах на 140 СПФ-цыплятах по определению сроков появления антител установлено, что ВН-антитела к вирусу ИББ обнаруживали в РН.на 15 сутки после иммунизации, а антитела в ИФА регистрировали позднее, на 18 сутки после прививки. В дальнейшем, уровни титров антител повышаются и достигают максимума на 24 сутки после иммунизации и составляют в РН 11,4±0,5 лог2 и в ИФА 1848±166.

В лабораторных опытах на 120 СПФ-цыплятах показано, что при* всех испытанных способах введения вакцины из штамма «Винтерфилд 2512» (выпаивание, окулярный, интраназальный и внутримышечный) обеспечивается высокая степень защиты (более 90% при контрольном заражении).

ВН-антитела накапливаются в крови в высоких титрах от 10,0±0,5 лог2 при интраназальном введении до 12,6±0,7 лог2 при внутримышечном способе. Средние значения титров ВН-антител при выпаивании вакцины и внутримышечном введении примерно равны, но первый способ предпочтительнее для иммунизации молодняка вследствие меньшей

трудоемкости и отсутствия стрессовых ситуаций, связанных с внутримышечной инъекцией.

Обязательным требованием для живых вакцин является сохранение иммунобиологических характеристик препарата при длительном хранении. Этмечено, что потери титра инфекционности вакцины из штамма «Винтерфилд 2512» после хранения при температуре 2-10"С в течение 12 месяцев незначительны и составляют 0,24 1д ТЦДзд/мл.

Свежеприготовленная вакцина обеспечивала полную защиту 30 СПФ-дыплят от контрольного заражения, а после хранения в течение 12 месяцев 33,3% иммунизированных цыплят были защищены от инфекции, что указывает на высокую устойчивость вакцинного штамма «Винтерфилд 2512» при хранении.

В благополучных птицехозяйствах самым сложным фактором для достижения успешной вакцинопрофилактики с использованием препаратов из «промежуточных» штаммов вируса ИББ является определение уровня 1ассивных антител в крови цыплят, при котором вводимая вакцина вызывает зыработку иммунитета и обеспечивает защиту привитого поголовья.

С этой целью от кур родительского стада одного возраста были получены 240 цыплят, которых иммунизировали в возрасте 10,12,14,16,18,20 и 22 суток кивой культуральной вирусвакциной из штамма «Винтерфилд 2512» в дозе ЮООО ТЦД50 на голову путем выпаивания.

Установлено, что штамм «Винтерфилд 2512» индуцирует выработку антител к вирусу ИББ у цыплят при значении татра пассивных ВН-антител ниже 5,5 лог2. Следует отметить, что при определении сроков иммунизации в яицехозяйствах при серологическом исследовании сывороток крови молодняка I ИФА необходимо проводить прививку при значениях титров ниже 1:400.

На благополучной по ИББ птицефабрике «Александровский ППР» 3язанской области на поголовье 24 тыс. птиц была проведена проверка живой ультуральной вирусвакцины из штамма «Винтерфилд 2512» на напряженность 1 длительность иммунитета после однократной и двукратной прививок.

Сроки иммунизации определяли по данным серологических исследований :ывороток крови в ИФА. Цыплят первой группы (12 тыс. голов) прививали щнократно в возрасте 17 суток, когда пассивные материнские антитела к вирусу 1ББ обнаруживали в ИФА у 20% поголовья в титре 526±45. Вторую группу (12 ыс. голов) прививали двукратно в возрасте 7 и 17 суток. В период проведения 1ервой иммунизации у 20% цыплят отсутствовали пассивные антитела в ИФА, а \а момент повторного выпаивания вакцины пассивные материнские антитела

обнаружены в тех же титрах, что у цыплят первой группы. Иммуногенную активность вакцины после одно- и двукратной прививок оценивали в ИФА у цыплят в возрасте 40, 60, 90, 120, 150, 210, 270, 330 и 390 суток, т.е. до конца эксплуатации птицы.

Анализ полученных данных показывает, что двукратная вакцинация обеспечивает выработку более стойкого и продолжительного иммунитета. Наивысшее среднее значение титра антител отмечено у цыплят в возрасте 40 суток, которое составило 3497±137. Затем уровень антител постепенно снижается и у 84% обследованного поголовья в возрасте 13 мес. среднее значение титра антител составило 1975±113. Напряженность иммунитета у цыплят, привитых однократно, несколько ниже, хотя обеспечивается защита 84% птиц от заболевания до 150-суточного возраста, т.е. крайнего значения возраста, в котором птицы могут заболеть ИББ с характерным симптомокомплексом.

У взрослой птицы в возрасте 9 мес. антитела к вирусу ИББ обнаруживаются у 76% поголовья, а в более старшем возрасте процент положительно реагирующих уменьшается. Этот момент является неблагоприятным, т.к. среди серонегативных кур возможна циркуляция полевого изолята вируса ИББ, которую трудно обнаружить.

В связи с полученными данными и сложностями, часто связанными с наличием неоднородного пассивного иммунитета у цыплят, двукратная иммунизация молодняка живой культуральной вирусвакциной против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512» более эффективна в сравнении с однократной прививкой.

В 1993г. экспериментальные образцы вирусвакцины из штамма «Винтерфилд 2512» по разрешению Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России испытывали в Пензенской области в условия> неблагополучной Пензенской ИПС. Параллельно в этом регионе применяла живую вакцину из штамма «ВНИВИП» и экспериментальную живую вакцину против ИББ производства ВНИТИБП.

Падеж птиц в птичниках, где применялась вакцина из штамма «ВНИВИП» составлял от 12 до 39%, при использовании вакцины ВНИТИБП он был ниже v колебался от 5,8 до 23,9%. При применении экспериментальной вирусвакцинь из штамма «Винтерфилд 2512» отход птиц был значительно снижен, с 27,7% дс 2,7%.

Наиболее эффективной из испытанных препаратов оказалась экспериментальная вирусвакцина из штамма «Винтерфилд 2512». Следует отметить, что применение данной вакцины, как и многих других из «промежуточных» штаммов, не обеспечивает полного оздоровления после прививки в условиях неблагополучных хозяйств.

В 1993г. и начале 1994г. живой вакцины из «горячего» штамма в Российской Федерации не было и борьба с ИББ в неблагополучных пунктах проводилась более успешно с использованием вакцины из штамма «Винтерфилд 2512». При использовании вакцины в 15 неблагополучных хозяйствах удавалось снизить смертность цыплят с 15-40% до 1-5%, что подтверждено актами о производственных испытаниях.

После создания в 1994-1995гг. вирусвакцины сухой против ИББ из штамма "БР рекомендовано ее использовать в неблагополучных хозяйствах, а вакцину из штамма «Винтерфилд 2512» лишь в благополучных птицефабриках.

После проведения широких производственных испытаний вакцины Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 04.02.1997г. была утверждена нормативная документация на препарат без ограничения срока действия (ТУ 9384-008-00008064-97, наставление по применению вакцины № 13-4-2/865 от 12.02.1997г).

В настоящее время вакцина широко применяется в большинстве благополучных птицехозяйств, проводящих специфическую профилактику ИББ, находящихся в различных регионах Российской Федерации, Белоруссии и Украины.

За период с 1994 по 1999гг. во ВНИИЗЖ выпущено и реализовано 1,23 млрд. доз вакцины, что свидетельствует о широком применении препарата для профилактики ИББ. В 1999 г. на вакцину был получен патент РФ № 2127604 (заявка № 98107110 от 14.04.1998 г.).

2.2.6. Разработка технологии изготовления и контроля жидкой сорбированной инактивированной вакцины против ИББ*

Технология производства инактивированной вакцины против инфекционной бурсальной болезни является сложным процессом, включающим следующие технологические этапы: получение матровой и производственной расплодок вируса ИББ, очистка вирусного материала с последующей инактивацией, приготовление адъюванта, составление препарата и его контроль на стерильность, безвредность, полноту инактивации и антигенную активность.

'ДанныП раздел выполнен совместно с сотрудником ВНИИЗЖ Гусевым С.А.

Массовое производство вируса возможно в различных системах культивирования: на восприимчивых цыплятах, на СПФ-эмбрионах и на культуре клеток ФКЭ.

В экспериментах нами было показано, что ингртивированная вакцина, изготовленная из фабрициевых сумок, отобранных от цыплят, инфицированных вирулентным штаммом «52/70-М», имела наибольшую антигенную активность в ИФА (10044И48). Однако, получение вирусного сырья из фабрициевых сумок от СПФ-цыплят требует больших затрат, а при использовании коммерческих цыплят возможна контаминация антигена посторонними вирусами, а также микоплазмами и бактериями. Образец инактивированной вакцины с использованием штамма «Винтерфилд 2512», полученного на культуре клеток ФКЭ и на СПФ-эмбрионах, вызывал у привитых цыплят образование антител к вирусу ИББ в невысоких титрах. Вакцинный штамм «БГ», репродуцированный в СПФ-КЭ, при испытании его в составе инактивированной вакцины на цыплятах индуцировал у них накопление антител к вирусу ИББ в ИФА на уровне 8500±120, что свидетельствует о его высокой антигенной активности.

В дальнейших исследованиях по отработке режимов очистки, инактивации, ингредиентного состава инактивированной вакцины против ИББ использовали вирусную суспензию из штамма «БГ».

Вирусная суспензия, полученная на СПФ-эмбрионах, содержит большое количество балластных белков, которые при иммунизации молодняка кур могут привести к поствакцинальным осложнениям.

Для удаления балластных белков из суспензий вируса ИББ были испытаны и сравнены следующие методы: низкоскоростное центрифугирование; применение различных концентраций детергента хлороформа и поликатионного флокулянта высокомолекулярного полигексаметиленгуанидингидрохлорида (ВПГ) в сочетании с низкоскоростным центрифугированием или сепарированием.

Очистка суспензии вируса ИББ с помощью хлороформа в конечной концентрации от 0,5% до 4,0% снижала количество балластного белка на 18% и повышала показатель прозрачности до 60%. Однако, при увеличении концентрации хлороформа до 2% и выше наблюдалось снижение инфекционной активности очищенных суспензий. Очистка вирусной суспензии ВПГ с увеличением концентрации также приводила к уменьшению содержания балластного белка и снижению инфекционности вируса ИББ.

Способ совместной обработки вирусного материала ВПГ в концентрации 1,02% и хлороформом 0,5% позволил максимально удалить балластный белок ¡ез снижения инфекционного титра вируса ИББ.

Хранение вакцин, полученных из вируса ИББ, очищенного тремя ¡азличными способами, при температуре 4-8°С в течение 12 месяцев, привело к ^значительному снижению антигенной активности, что свидетельствует о ¡охранении иммунобиологических свойств препарата.

При определении оптимального метода инактивации вируса ИББ стояла задача подбора эффективного инактиванта и оптимальных параметров процесса инактивации, обеспечивающих полное и необратимое подавление лнфекционности возбудителя при максимальном сохранении антигенности зириона и специфической антигенной активности инактивированных вирусных препаратов.

Для инактивации к вирусным суспензиям добавляли АЭЭИ до конечной концентрации 0,05; 0,1; 0,2 и 0,3% и через определенные интервалы времени отбирали пробы для титрования. Инактивацию вируса ИББ проводили при температурном режиме 27°С, который является наиболее щадящим.

Вирус ИББ полностью терял инфекционную активность через 16-20 часов инактивации при концентрации инактиванта 0,3%. Уменьшение концентрации АЭЭИ до 0,05% требовало увеличения срока инактивации до 36-40 часов.

Инактивация АЭЭИ в концентрации 0,2-0,3% оказывала влияние на иммунобиологические свойства вируса ИББ, что подтверждается снижением антигенной активности образцов вакцин. Так, средний титр антител к вирусу ИББ у цыплят, иммунизированных вакциной из вируса, инактивированного АЭЭИ в концентрации 0,1%, составил 8400±200, в то время как титры антител у цыплят, вакцинированных образцами препарата из антигенов, инактивированных АЭЭИ в концентрации 0,2 % и 0,3% составили 5400±130 и 3600+110, соответственно.

Таким образом, был отработан режим инактивации вируса ИББ с помощью АЭЭИ, не оказывающего существенного влияния на его иммунобиологические свойства. Этот режим инактивации вируса ИББ имел следующие параметры: концентрация АЭЭИ - 0,1%, температура смеси при инактивации - 27°С, рН вирусной суспензии 7,2+7,6 и время инактивации -24 час.

При подборе адъюванта для изготовления инактивированной вакцины против ИББ использовали широко применяемые в производстве ветеринарных вакцин: гель гидроокиси алюминия (ГОА) производства ВНИИЗЖ и водный раствор сапонина.

Гель ГОА, внесенный в опытные образцы вакцины против ИББ, повышал их антигенную активность пропорционально увеличению его концентрации. Так, вакцина без ГОА обусловливала образование антител на уровне 32401210, а препараты с ГОА - от 4608±230 до 5920±80 (в ИФА).

Введение в состав инактивированной сорбированной вакцины против ИББ водного раствора сапонина в количестве от 0,1 до 2,0 мг/доза приводило к повышению антигенной активности препарата в сравнении с вакциной без сапонина. Наиболее высокие показатели антигенной активности были зарегистрированы в вакцинах, содержащих в своем составе сапонин в концентрации 1,0-1,5 мг на одну прививную дозу. При этом следует отметить, что у привитых цыплят не отмечалось негативных отклонений в общем клиническом состоянии.

Таким образом, результаты опытов по изучению использования ГОА и сапонина для повышения антигенной активности инактивированной вакцины против ИББ позволили определить оптимальное количество этих адъювантов в составе препарата: ГОА -1% и сапонин -1,0-1,5 мг/доза, соответственно.

Последнее время в птицеводстве ряда стран мира широко используются инактивированные вакцины против ИББ на основе масляных адъювантов.

В связи с этим была поставлена задача изучить иммунобиологические свойства инактивированной вакцины против ИББ, изготовленной на основе двух масляных адъювантов: Монтанид ИЗА70 и ВНИИЗЖ.

Результаты исследований масляных вакцин против ИББ свидетельствуют о том, что образцы вакцин на основе масляного адъюванта ВНИИЗЖ обладали более высокой стабильностью при различных температурах, чем образцы препарата на базе Монтанид ИЗА 70. Однако, последние имели ниже показатели вязкости, что делает вакцину более удобной при парентеральном введении. Образцы инактивированной вакцины против ИББ, приготовленные с адъювантом Монтанид ИЗА 70 в соотношении 1:2 и 1:3, показали более выраженную антигенную активность в сравнении с' вакцинами на основе масляного адъюванта ВНИИЗЖ.

Эксперименты по продолжительности и напряженности иммунитета юказали, что все образцы инактивированной вакцины были антигенно активны 1 обусловили напряженный иммунитет у кур на протяжении 12 месяцев (срок шблюдения). Однако, вакцина на основе адъюванта Монтанид ИЗА 70 )бладала более выраженной антигенной активностью и индуцировала в )рганизме привитых птиц образование более высокого уровня специфических жтител против вируса ИББ в сравнении с препаратом на основе адъюванта ЗНИИЗЖ и сорбированной формой вакцины.

Изучение динамики образования антител у вакцинированных птиц юказало, что достаточная иммунная реакция проявлялась уже на 7 сутки после ¡акцинации, достигала максимальных значений в ИФА к 21 суткам после шмунизации. Контроль клинического состояния подопытных птиц в ходе жсперимента не выявил существенных отклонений общего и местного сарактера в группах вакцинированных птиц, но следует отметить, что эмульсия с адъювантом ВНИИЗЖ сохранялась на месте введения в течение всего срока шблюдения (12 месяцев). Контрольное взвешивание птиц в разных группах юказало, что средняя живая масса курицы в вакцинированных группах :ущественно не отличалась от таковой в контрольной группе. Эти данные :видетельствуют о том, что все образцы инактивированной вакцины против ИББ зыли безвредны для птиц.

Образцы инактивированной вакцины против ИББ, полученной на основе различных адъювантов обладали выраженной антигенной активностью в течение 12 месяцев после изготовления (гарантийный срок реализации закцины).

При изучении иммунобиологических свойств инактивированной вакцины 1ротив ИББ в производственных условиях было показано, что вакцина не аызывала у привитых птиц поствакцинальных осложнений местного или общего сарактера, что свидетельствует о её безвредности. Анализ сохранности птиц в соде опыта не выявил существенных отличий по опытным и контрольным руппам птиц.

Титры антител к вирусу ИББ в сыворотках крови у птиц увеличились после шмунизации в среднем в 3,5-4 раза, что подтверждает высокую антигенную активность испытуемой инактивированной вакцины.

В комплексе мероприятий по ликвидации ИББ основное внимание оделяется последовательному применению живых и инактивированных вакцин.

Наличие однородного пассивного иммунитета у молодняка позволяет точнс определить время оптимальной прививки живыми вакцинами и получить теп/ самым надежный иммунный ответ, защищающий цыплят от заболевания ИББ Для этого инактивированные вакцины инокулируют ремонтному молодняку е возрасте 110-120 суток, ранее иммунизированному живыми вакцинами.

Нами на 45 птицефабриках РФ проведена сравнительная оценке пассивного «материнского» иммунитета у цыплят яичных и мясных пород полученных от родителей, не привитых и иммунизированных инактивированноР сорбированной вакциной против ИББ.

При исследовании в ИФА средний титр пассивных антител против ИББ у цыплят, полученных от вакцинированных родителей, на 1 сутки составлял 664£ у кур яичных пород и 3850 - у мясных, а средний титр антител у цыплят полученных от невакцинированных родителей был ниже и составлял 2339 V 1724, соответственно. С увеличением возраста цыплят титр пассивных антитег снижался вне зависимости от вакцинации и породы кур, но уменьшение титроЕ антител происходило неодинаково. Так, у цыплят яичного направления полученных от невакцинированных родителей, к 15 и 18 суткам титры пассивны) антител против ИББ составили 438 и 248, а к 21 суткам жизни их уже не обнаруживали. У цыплят, полученных от вакцинированных родителей, титрь антител в этом возрасте были гораздо выше и имели в ИФА значения 1046 и 98£ соответственно, и даже к 21 суткам жизни в крови цыплят обнаруживал1 пассивные антитела.

Такая же тенденция наблюдалась и у мясных цыплят, но уровен! пассивных антител у них снижался быстрее, чем у яичных цыплят и к 12 суткаи жизни составлял значение 296 в ИФА у цыплят, полученных от непривиты: родителей, и 1590 - у цыплят, от вакцинированных родителей. К 15 суткал жизни только у цыплят, полученных от вакцинированных родителей, был< обнаружено в сыворотке крови присутствие пассивных антител к вирусу ИББ.

Результаты исследований позволили сделать вывод, что жидка! сорбированная инактивированная вакцина против ИББ, используемая- ДЛ5 вакцинации взрослого маточного поголовья, способствовала созданик однородного пассивного иммунитета у цыплят, что обеспечивало их надежнук защиту от инфицирования вирусом ИББ в раннем возрасте. Отмечено, чтс пассивные антитела в сыворотках крови сохранялись дольше (до 21 суток) ; цыплят яичных пород, чем у цыплят мясных пород (до 15 суток).

После успешных испытаний в производственных условиях была утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России НТД на вакцину против ИББ жидкую сорбированную инактивированную без ограничения срока действия (ТУ 9384-014-00008064-97, утверждено 04.02.1997 г., наставление по применению № 13-4-2/864 от 12.02.1997 г.). За период с 1994 по 1999 гг. выпущено 33,5 млн. доз вакцины. В 1999 г. на вакцину был получен патент РФ №2127603 (заявка № 98102970 от 23.02.1998 г.).

Полученные результаты исследований использованы в разработке 34 нормативных, инструктивных и других документов, которые утверждены в установленном порядке и применяются при серийном производстве диагностикумов и средств специфической профилактики против ИББ.

Потребности птицеводства России в биопрепаратах для специфической профилактики инфекционной бурсапьной болезни практически полностью удовлетворяются за счет производства разработанных нами живых и инактивированной вакцин.

3. ВЫВОДЫ

1. Анализ эпизоотической ситуации по инфекционной бурсальной болезни в Российской Федерации за последнее десятилетие (1990-1999гг.) свидетельствует о широком распространении болезни. Особенно напряженное эпизоотическое положение по ИББ отмечали в 1993-1997г.г. Инфекционную бурсальную болезнь зарегистрировали в 53 административных регионах в которых заболело 20,6 млн. птиц при летальности равной 22,5%. При этом на долю птицефабрик яичного направления приходится 70,5%, на долю мясного -29,5% неблагополучных хозяйств.

2. Разработан метод индикации и штаммовой дифференциации вируса ИББ с использованием ПЦР и прямого секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК, который позволил выявить широкий спектр штаммов вируса, циркулирующих на территории России и других стран СНГ.

3. Проведенный анализ генетической вариабельности 109 полевых лзолятов вируса ИББ, и 15 вакцинных штаммов вируса с использованием юзданного банка данных нуклеотидных последовательностей отечественных и зарубежных штаммов показал, что независимо от географического места зыделения изоляты вирусов можно разделить на 3 группы. Основная группа

включает 63 изолята, близких по структуре к высоковирулентным штаммам, ранее выделенным в европейских странах, что подтверждает предположение о заносе вируса, вызвавшего в 1993-1997г.г. острые вспышки ИББ в Российской Федерации и других странах СНГ.

4. Для проведения массового серологического мониторинга разработана и широко внедрена в ветеринарную практику иммуноферментная тест-система определения антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур при тестировании методом последовательных разведений и при использовании одного разведения сыворотки. Диагностическая ценность разработанного метода подтверждена успешным осуществлением научнообоснованной системы мероприятий по борьбе с ИББ.

5. Методом селекции впервые получен вакцинный штамм «БГ» вируса ИББ, который обладает выраженными антигенными и иммуногенными свойствами. Штамм «БГ» адаптирован к репродукции в СПФ-куриных эмбрионах и сохраняет устойчивость биологических свойств в процессе многократных пассажей, при этом отсутствуют явления реверсии и иммунодепрессии. По первичной структуре основной антигеннозначимой области белка УР2 штамм «БГ» наиболее близок к большинству отечественных высоковирулентных изолятов вируса ИББ.

6. Установлено, что оптимальной системой культивирования штамма «БГ» являются 10-суточные СПФ-куриные эмбрионы, при заражении которых на хориоаллантоисную оболочку в области естественной пуги через 72-120 часов инкубации вирус накапливается в тушках эмбрионов в титрах от 6,0 до 7,0 1д ЭИД50/мл.

7. Разработана и освоена в промышленных условиях технология изготовления сухой вирусвакцины против ИББ из штамма «БГ», предназначенной для применения в угрожаемых и неблагополучных птицехозяйствах, где циркулируют высоковирулентные штаммы возбудителя. Вакцина безвредна, антигенно активна, высокоиммуногенна при различных способах введения и сохраняет свои иммунобиологические свойства при длительном хранении (до 24 месяцев - срок наблюдения).

8. Сухая вирусвакцина против ИББ из штамма «БГ» обусловливает размножение вакцинного штамма в фабрициевой сумке цыплят на 3-4 сутки и выработку стойкого иммунитета на 6-8 сутки после прививки у цыплят, которые имели титры пассивных антител ниже 1:1800 при исследовании в ИФА. При этом приобретенный иммунитет сохраняется до конца эксплуатации птиц.

9. Широкое применение сухой вирусвакцины против ИББ из штамма «БГ» в 162 неблагополучных птицеводческих хозяйствах на поголовье более 1,5 млрд. цыплят способствовало купированию очагов болезни и обеспечению их дальнейшего благополучия по ИББ.

10. Отработаны оптимальные условия масштабного культивирования вакцинного штамма « Винтерфилд 2512» в первичной культуре ФКЭ и в СПФ-куриных эмбрионах, позволившие получать вирус с высоким титром инфекционности. Подтверждено отсутствие реактогенности, реверсии, иммунодепрессии у штамма «Винтерфилд 2512», который после прививки не вызывает изменений в фабрициевой сумке у цыплят.

11. Разработана и освоена в промышленных условиях технология изготовления живой культуральной вирусвакцины против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512», предназначенной для проведения профилактических прививок в благополучных птицехозяйствах. Вакцина внедрена в широкую ветеринарную практику и в дозе 104 ТЦД50 после двукратного выпаивания с интервалом 10-14 суток индуцирует выработку иммунитета не менее, чем у 90% цыплят через 15-18 суток.

12. Впервые разработана технология изготовления инактивированной сорбированной вакцины против ИББ, включающая следующие основные этапы: получение вируса, путем культивирования штамма «БГ» в СПФ-эмбрионах; комплексная очистка его низкоскоростным центрифугированием с совместным применением детергента хлороформа (0,5%) и флокулянта высокомолекулярного полигексаметиленгуанидингидрохлорида (0,02%); инактивация 0,1% аминоэтилэтиленимина; добавление адъювантов (гель гидроокиси алюминия - 1% и сапонин - 1,5 мг на дозу); проведение биологического контроля препарата.

13. Установлено, что при использовании инактивированной сорбированной вакцины против ИББ для прививок кур родительских стад обеспечивается передача однородного пассивного иммунитета потомству, защищающего его от инфицирования вирусом ИББ в раннем возрасте. Пассивные антитела к вирусу ИББ сохраняются до 21 суток у цыплят яичных пород и до 15 суток у цыплят мясных пород, полученных от вакцинированных родителей.

14. Показана принципиальная возможность защиты от инфекционной бурсальной болезни цыплят с наличием пассивных антител после подкожногс или внутримышечного введения в 10-15 суточном возрасте инактивированной сорбированной вакцины.

15. Разработана комплексная система специфической профилактики ИББ с применением в производственных условиях живых и инактивированной вакцин с учетом данных массового серологического мониторинга и осуществления ветеринарно-санитарных мероприятий, которая обусловливает успешное предупреждение и купирование вспышек заболевания. Предложенная и внедренная система мероприятий позволила в 1998-1999г.г. значительно уменьшить число вспышек, существенно снизить напряженность эпизоотической ситуации и экономический ущерб от ИББ.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты научных исследований были использованы и вошли в следующие нормативно-технические документы, инструкции, методики, указания и рекомендации, которые внедрены в ветеринарную практику и предложены для практического использования:

1. Временная инструкция по изготовлению и контролю сывороток и иммуноглобулинов для серологических и иммунохимических реакций, используемых в диагностических целях при болезни Гамборо (утверждена директором ВНИИЗЖ 17.06.1993г.);

2. Временная инструкция по изготовлению и контролю антигенов вируса инфекционного бурсита кур для иммунохимических реакций, используемых в диагностических целях (утверждена директором ВНИИЗЖ 07.10.1993г.);

3. Методика культивирования и титрования вируса ИББ в первично-трипсинизированной культуре клеток фибробластов куриных эмбрионов (утверждена директором ВНИИЗЖ 29.06.1994г.);

4. Временная инструкция по изготовлению и контролю диагностикумов и наборов для определения антител против вируса ИББ кур иммуноферментным методом (утверждена директором ВНИИЗЖ21.10.1994г.);

5. Технические условия (ТУ 08064-19-10-95) на набор для определения антител к вирусу ИББ методом иммуноферментного анализа (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 15.11.1994г.);

6. Временное наставление по применению набора для определения антител к вирусу ИББ методом иммуноферментного анализа (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 01.02.1995г.)

7. Технические условия (ТУ 08064-19-05-95) на вирусвакцину живую культуральную против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 17.01.1995г.);

8. Временное наставление по применению вирусвакцины живой культуральной против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512» № 13-4-2/235 (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 17.01.1995г.);

Э. Инструкция по изготовлению и контролю живой культуральной вакцины против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512» (утверждена директорами ВНИИЗЖ 1 ВГНКИ ветпрепаратов 17.01.1995г.);

Ю. Технические условия (ТУ 08064-19-06-95) на вирусвакцину сухую против 4ББ из штамма «БГ» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 17.01.1995г.);

И. Временное наставление по применению вирусвакцины живой сухой против 1ББ из штамма «БГ» № 13-4-2/234 (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 17.01,1995г.);

\2. Инструкция по изготовлению и контролю живой сухой вакцины против ИББ 13 штамма «БГ» (утверждена директорами ВНИИЗЖ и ВГНКИ ветпрепаратов 7.01.1995г.);

13. Методика изготовления препаратов вирусного антигена, конъюгированного с корпускулярным маркером, для выявления антител при ИББ (утверждена директором ВНИИЗЖ 25.01.1995г.);

14. Методика выделения и оценки РНК вируса ИББ (утверждена директором ВНИИЗЖ 25.01.1995г.);

15. Методика выявления и дифференциации вируса ИББ с использованием полимеразной цепной реакции и секвенирования амплифицированных фрагментов генов (утверждена директором ВНИИЗЖ 25.01.1995г.);

16. Технические условия (ТУ 08064-19-62-95) на вакцину против ИББ жидкую сорбированную инактивированную (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 03.10.1995г.);

17. Временное наставление по применению вакцины против ИББ жидкой сорбированной инактивированной № 13-4-2/408 (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 02.10.1995г.);

18. Инструкция по изготовлению и контролю жидкой сорбированной инактивированной вакцины против ИББ из штамма «БГ» (утверждена директором ВНИИЗЖ 08.01.1996г.);

19. Технические условия (ТУ 9384-008-00008064-97) на вирусвакцину живую культуральную против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512» (утвер:эдены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 04.02.1997г.);

20. Наставление по применению вирусвакцины живой культуральной против ИББ из штамма «Винтерфилд 2512» № 13-4-2/865 (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 12.02.1997г.);

21. Технические условия (ТУ 9384-014-00008064-97) на вакцину против ИББ жидкую сорбированную инактивированную (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 04.02.1997г.);

22. Наставление по применению вакцины против ИББ жидкой сорбированной инактивированной № 13-4-2/864 (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 12.02.1997г.);

23. Методические указания по индикации генома и штаммовой дифференциации вируса ИББ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенированием вариабельной области гена УР2 (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 21.02.1997г.);

24. Методические указания по определению антител к вирусу ИББ в сыворотке крови кур иммуноферментным методом (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 09.10.1997г.);

25. Технические условия (ТУ 9384-006-00008064-98) на вирусвакцину сухую против ИББ из штамма «БГ» (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 18.02.1998г.);

26. Наставление по применению вирусвакцины сухой против ИББ из штамма «БГ» N9 13-4-2/1168 (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 18.02.1998г.);

27. Методика получения антигена вируса ИББ для иммуноферментного анализа (утверждена директором ВНИИЗЖ'28.10.1999г.);

28. Методические рекомендации по взаимному перерасчету показателей титра антител к вирусу ИББ , установленных в сыворотках крови кур средствами различных диагностических наборов ИФА (утверждены директором ВНИИЗЖ 28.10.1999г.);

29. Методические рекомендации по определению титра антител к вирусу ИББ в :ыворотках крови кур в непрямом варианте иммуноферментного анализа :пособом одного разведения с использованием различных хромогенных :убстратов (утверждены директором ВНИИЗЖ 28.10.1999г.);

30. Инструкция по изготовлению и контролю диагностикумов и наборов для определения антител против вируса ИББ иммуноферментным методом 'утверждена директором ВНИИЗЖ 06.12.1999г.);

31. Технические условия (ТУ 9388-020-00495527-99) на набор для определения антител к вирусу ИББ иммуноферментным методом при тестировании :ывороток в одном разведении (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 09.03.2000г.);

32. Временное наставление по применению набора для определения антител к зирусу ИББ иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном зазведении № 13-7-2/1903 (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 09.03. 2000г.);

33. Технические условия (ТУ 9388-028-00495527-99) на набор для определения антител к вирусу ИББ иммуноферментным методом (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 28.02.2000г.);

34. Наставление по применению набора для определения антител к вирусу 4ББ иммуноферментным методом № 13-7-2/1888 (утверждено Департаментом зетеринарии Минсельхозпрода России 28.02.2000г.);

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Борисов A.B., Кузнецов В.Н. Оценка эффективности различных живых вакцин против инфекционной бурсапьной болезни птиц// Вирусн. бол. с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-пракг. конф. - Владимир, 1995. - С. 222.

2. Борисов A.B., Кузнецов В.Н., Кузнецов Ю.В., Гусев A.A. Иммуногенность различных живых вакцин против инфекционной бурсапьной болезни птиц // Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Владимир, 1995.-С. 233.

3. Борисов A.B., Кузнецов В.Н., Кузнецов Ю.В., Федосеев К.Ю., Гусев A.A. Отработка схемы иммунизации птицы против инфекционной бурсапьной болезни вирусвакциной сухой из штамма "БГ // Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-пракг. конф. - Владимир, 1995. - С. 234.

4. Борисов A.B., Мудрак Н.С., Колосов С.Н., Федосеев К.Ю. Предварительная оценка динамики материнских антител к вирусу ИББ у цыплят для выбора оптимальных сроков вакцинации// Вирусные болезни' с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Владимир, 1995. - С. 234.

5. Борисов A.B., Гусев A.A., Дрыгин В.В., Марков Г.В., Тараненко А.Г., Перевозчикова H.A., Кузнецов В.Н., Федосеев К.Ю., Мудрак Н.С., Борисов В.В., Михалишина З.Я., Романова А.М., Кузнецов Ю.В., Гусев A.A., Литвинов С.А., Щербакова Л.О., Колосов С.Н., Щербаков A.B., Оковытая Т.В., Патрикеев В.Г., Смоленский В.И., Норкина С.И. Разработка средств и методов специфической профилактики энтерита норок и болезни Гамборо II ГНТП "Ветеринарное благополучие (этап 08.02М)" : Науч. отчет № 186, ВНИИЗЖ. - Владимир, 1995. -151 с.

6. Борисов A.B., Гусев A.A. Разработка мер по диагностике и профилактике инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц (болезни Гамборо) в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации// Пробл. инфекционной патологии с.-х. ж-ных: Тез. докл. конф., посвящ. 100-лет. ... вируса ящура. -Владимир, 1995. - С. 139-143.

7. Борисов A.B. Профилактика бурсальной болезни птиц II Уральские нивы. -1995.-№4-6.-С. 23-28.

8. Борисов В.В., Михалишина З.Я., Борисов A.B., Старое С.К., Гусев A.A., Борисова O.A., Патрикеев В.Г. Ассоциированная инактивированная вакцина против синдрома снижения яйценоскости и инфекционной бурсальной болезни кур // Проблемы инфекционной патологии с.-х. ж-ных: Тез. докл. конф., посвящ. 100-лет.... вируса ящура. - Владимир, 1995.-С. 151-152.

9. Гусев A.A., Борисов A.B. Опытная технология изготовления и выпуска вакцины живой сухой против инфекционной бурсальной болезни из штамма "БГ7/ Отчет по реализации проекта, ВНИИЗЖ. - Владимир, 1995. -18 с.

10. Гусев A.A., Борисов A.B. Разработка и организация промышленного производства более эффективных средств диагностики и специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни птицII раздел 3 в международном проекте "Новое поколение противовирусных вакцин ": Науч. отчет №184, ВНИИЗЖ. - Владимир, 1995. -С.103-124.

11. Дудников Л.А., Сарбасов A.B., Федосеев К.Ю., Борисов A.B. Оптимальные условия определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни в реакции встречного иммунофореза// Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Владимир, 1995. - С. 240.

12. Литвяков С.А., Марков Г.В., Тараненко А.Г., Романова А. М., Борисов A.B. Отработка оптимальной защитной среды для лиофилизации и хранения вирусвакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц// Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Владимир, 1995. - С. 287.

13. Литвяков С.А., Марков Г.В., Тараненко А.Г., Борисов A.B. Отработка оптимального режима лиофилизации вирусвакцин против инфекционной бурсальной болезни птиц // Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Владимир, 1995. - С. 286.

14. Михалишина З.Я., Борисов A.B., Федосеев К.Ю., Гусев A.A. Иммуногенная активность экспериментальных образцов инактивированной сорбированной вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц// Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Владимир, 1995.-С. 236.

15. Мудрак Н.С., Оковытая Т.В., Щербакова Л.О., Федосеев К.Ю., Борисов A.B. Оптимизация условий постановки непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни// Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Владимир, 1995. - С. 245.'

16. Мудрак Н.С., Федосеев К.Ю., Оковытая Т.В., Кузнецов В. Н., Борисов

A.B. Сравнительная оценка ИФА и РДП в диагностике инфекционной бурсальной болезни// Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Владимир, 1995. - С. 246.

17. Оковытая Т.В., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Борисов A.B. Количественная оценка концентрации антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни в сыворотках крови кур по одному разведению в иммуноферментном тесте// Проблемы инфекционной патологии с.-х. ж-ных: Тез. докл. конф., посвящ. 100-лет.... вируса ящура. <- Владимир, 1995. - С. 162-163.

18. Шажко Ж.А., Егорова А.И., Кременчугская С.Р., Фомина Т.А., Герасимов

B.Н., Борисов A.B., Котова М.В., Перевозчиков В.А., Мамков Н.С. Некоторые научно-практические аспекты получения диагностикумов на болезнь Гамборо // Ин-т эксп. клин. вет. мед.: Информ. бюлл. - Харьков, 1995. - С. 154.

19. Щербакова Л.О., Колосов С.Н., Щербаков A.B., Дрыгин В.В., Борисов A.B., Гусев A.A. Антигенная вариабельность штаммов вируса инфекционной бурсальной болезни птиц (ИББ), использующихся в качестве вакцин// Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Владимир, 1995. - С. 236.

20. Щербакова Л.О., Фалина Г.М., Борисов A.B., Дрыгин В.В. Выделение, очистка и концентрирование вируса инфекционной бурсальной болезни птиц (ИББ) // Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. -Владимир, 1995. - С. 239.

21. Щербакова Л.О., Колосов С.Н., Щербаков А.В., Борисов А. В., Дрыгин

B.В., Гусев А.А. Изучение изолятов вируса инфекционной бурсальной болезни птиц (ИББ), выделенных на территории России и стран СНГ в течение 1993-1994 гг. методом прямого секвенирования // Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-пракг. конф. - Владимир, 1995. - С. 243.

22. Щербакова Л.О., Щербаков А.В., Дрыгин В.В., Борисов А.В. Использование ПЦР при постановке диагноза инфекционной бурсальной болезни птиц (ИББ) II Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-пракг. конф. - Владимир, 1995. - С. 248.

23. Щербакова Л.О., Щербаков А.В., Борисов А.В., Дрыгин В.В. Условия выделения вирусспецифической РНК ИББ для полимеразной цепной реакции/У Вирусные болезни с.-х. ж-ных: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. - Владимир, 1995.-С. 247.

24. Scherbakova L.O., KolosovS.N., Scherbakov A.V., Brygin V.V., BorisovA.V., GusevA.A. Antigenic variability of infectious bursal disease virus (IBDV) strains used as vaccines: Abstr. // 25th World Vet. Congr., Yokohama, Japan, 1995. - Yokohama, Japan, 1995.-P. 153.

25. Scherbakova L.O., KolosovS.N., Scherbakov A.V., Borisov A.V., Drygin V.V., GusevA.A. Studies of infectious bursal disease (IBD) virus field samples isolated in Russia and CIS-countries during 1993-1994 by direct sequencing// 25th World Vet. Congr., Yokohama, Japan, 1995.-Yokohama, Japan, 1995.-P. 263.

26. Щербакова И.О., Колосов C.H., Борисов A.B., Дрыгин В.В., Гусев А.А. Изучение вариабельности изолятов вируса ИББ, выделенных на птицефабрика* России в 1993-1996 гг. II Актуал. пробл. биотехнологии в растениеводстве и ветеринарии: Тез. докл. конф. - М., 1996. - С. 95.

27. Щербакова Л.О., Борисов А.В., Дрыгин В.В., Гусев А.А. Сравнение антигенозначимой области VP2 вакцинных штаммов и изолятов ИББ выделенных на территории России в 1993-1996 гг. II Актуал. пробл биотехнологии в растениеводстве и ветеринарии: Тез. докл. конф,- М., 1996. -

C. 94-95.

28. Борисов А.В., Темниханов ЮД. 1нфекцмна бурсапьна хвороба птиц'| II Вет мед. УкраЫи. -1997. - № 4. - С. 18-20.

29. Bottcher В., Kiselev N.A., Stel'maschuk V.Y., Perevozchikova N.A., Boriso\ A.V., Crowther R.A. Threedimensional structure of infectious bursal disease viru: determined by electron cryomicroscopy // J. Virolology. - 1997. - V. 71, N 1. - P. 325 330.

30. Norkina S.N., Smolensky V.I., Drygin V.V., Borisov A.V. Assesment of efficacy of live vaccines derived from different strains against Gumboro disease (IBD): Abstr. / 11th Int. Congr. World Vet. Poultry Assoc., Budapest, 1997. - Budapest, 1997. - P 196.

31. Scherbakova L.O., Borisov A.V., Drygin V.V., Gusev A.A. Identification о infectious bursal disease virus (IBDV) by the PCR in feed mixtures fed on poultry farms of the Russian Federation// 11 Int. Congr. World Vet. Poultry Assoc. Budapest, 1997. - Budapest, 1997. - P. 268.

32. Scherbakova L.O., Kolosov S.N., Borisov A.V., Drygin V.V., Gusev A.A Study on variability of IBDV isolates collected on poultry farms of the Russiar Federation //11th Int. Congr. World Vet. Pc-ultry Assoc., Budapest, 1997. - Budapest 1997.-P. 267.

33. Борисов A.B., Щербакова Л.О., Дрыгин S.S., Гусев A.A. Штаммовая дифференциация вируса ИББ на основе ПЦР и прямого секвенирования // Совр. аспекты вет. патологии ж-ных: Мат. конф., посвящ. 40-лет. ВНИИЗЖ. -Владимир, 1998. - С. 203-215.

34. Гусев A.A., Борисов A.B., Перевозчикова H.A., Дрыгин В.В., Смоленский В.И., Мудрак Н.С., Оковытая Т.В., Кузнецов В.Н., Щербакова Л.О. Методические указания по определению антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни в сыворотках крови птиц иммуноферментным методом// Метод, указания по диагностике заболеваний с.-х. ж-ных иммуноферментным методом. - Владимир, 1998. - С. 33-37.

35. Гусев С.А., Оковытая Т.В., Мудрак Н.С., Борисов A.B., Федосеев К.Ю., Михалишина З.Я., Гирин М.В., Гусев A.A., Дрыгин В.В. Сравнительная оценка пассивного иммунитета против ИББ у цыплят, полученных от непривитых и вакцинированных кур// Совр. аспекты вет. патологии ж-ных: Мат. конф., посвящ. 40-лет. ВНИИЗЖ. - Владимир, 1998. - С. 192-196.

36. Щербакова Л.О., Дрыгин В.В., Борисов A.B., Борисов В.В., Гусе в A.A., Смоленский В.И. Анализ антигенозначимой области VP2 штаммов вируса инфекционной бурсальной болезни II Вестник РАСХН. - 1998. - № 5. - С. 60-64.

37. Щербакова Л.О., Дрыгин В.В., Борисов A.B., Гусев A.A. Методические указания по индикации генома и штаммовой дифференциации вируса ИББ методом полимеразной цепной реакции и секвенированием вариабельной области гена VP2II Метод, указания по диагностике заболеваний с.-х. ж-ных методом полимеразной цепной реакции. - Владимир, 1998. - С. 157-168.

38. Щербакова Л.О., Ломакин А.И., Борисов A.B., Дрыгин В.В., Гусев A.A. Сравнительный анализ вариабельной области гена VP2 изолятов вируса инфекционной бурсальной болезни // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. -1998.-№1.-С. 35-40.

39. Smolensky V.l., Borisov A.V., Drygin V.V. Scherbakova L.O. Peculiarities of epidemiological signs of infectious bursal disease (IBD) in Russia// 10th Europ. Poultry Conf., Israel, 1998.- Israel, 1998.-P. 79.

40. Smolensky V.l., Borisov A.V., Drygin V.V. Scherbakova L.O. Prophylactic of infectious bursal disease in Russian Federation: Abstr. // 10th Europ. Poultry Conf., Israel, 1998. - Israel, 1998. - P. 78.

41. Борисов A.B., Борисов B.B., Старое C.K., Ирза В.Н. Використания живих та ¡нактивованих вакцин для профтактики вирусних хвороб птиц// Вет. мед. Укради. - 1999. - № 1.7 С. 10-11.

42. Борисов A.B., Борисов В.В., Гусев A.A., Кузнецов В.Н., Михалишина З.Я., Гусев С.А., Смоленский В.И., Норкина С.Н.. Пат. РФ № 2127603, Кл. 6 А 61 К 39/12, С 12 N 7/00. Инактивированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц/ Заявл. 23.02.98.; Опубл. 20.03.99.

43. Борисов A.B., Кузнецов В.Н., Гусев А. А., Кузнецов Ю.В., Смоленский В.И., Норкина С.Н.. Пат. РФ № 2127602, Кл. 6 А 61 К 39/12, С 12 N 7/00. Штамм "БГ вируса инфекционной бурсальной болезни птиц и вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц/Заявл. 24.11.97.; Опубл. 20.03.99.

44. Борисов A.B., Кузнецов В.Н., Гусев A.A., Кузнецов Ю.В., Смоленский В.И., Норкина С.Н.. Пат. РФ № 2127604, Кл. 6 А 61 К 39/12, С 12 N 7/00. Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц/ Заявл. 14.04.98.; Опубл. 29.03.99.

45. Борисов A.B., Гусев A.A., Дрыгин В.В. Разработка средств диагностики и специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни // Совр. аспекты патологии ж-ных: Докл. конф., посвящ. 40-лет. ВНИИЗЖ. - Владимир, 1999.-С. 90-117.

46. Борисова O.A., Борисов В.В., Гусев С.А., Борисов A.B., Михалишина З.Я., Волкова М.А. Изучение антигенной активности ассоциированной инактивированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76, инфекционного бронхита и инфекционной бурсальной болезни кур// Пр-во и контроль мед. вет. препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ: Тез. докл. конф., посвящ. 30-лет. ФГУП ПЗБ. - Вольгинский, 1999. - С. 53.

47. Гусев. A.A., Старое С.К., Борисов В.В. Разработка комплекса средств специфической диагностики и профилактики вирусных болезней// Биотехнологии и ветеринария: Тез. докл. София, Болгария, 1999. - София, 1999. - С. 17-19.

48. Гусев С.А., Михалишина З.Я., Борисов A.B., Борисов В.В. Изучение условий инактивации вируса инфекционной бурсальной болезни// Вет. мед.: МЬквщ.тем. наук. зб.-Харюв, 1999.-Вып.76.-С. 127-131.

49. Гусев С.А., Борисов A.B., Михалишина З.Я., Оковытая Т.В. Исследование различных адъювантов для инактивированной вакцины против инфекционной бурсальной болезни// Пр-во и контроль мед. вет. препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ: Тез. докл. конф., посвящ. 30-лет. ФГУП ПЗБ. - Вольгинский, 1999. - С. 56.

50. Гусев С.А., Борисов A.B., Михалишина З.Я. Очистка вируса инфекционной бурсальной болезни// Пр-во и контроль мед. вет. препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ: Тез. докл. конф., посвящ. 30-лет. ФГУП ПЗБ. -Вольгинский, 1999. - С. 57.

51. Дрыгин В.В., Борисов В.В., Старое С.К., Борисов A.B., Андреев В.Г., Гусев A.A. Молекулярная эпизоотология некоторых вирусных болезней птиц на территории Российской Федерации // Совр. аспекты патологии ж-ных: Докл. конф., посвящ. 40-лет. ВНИИЗЖ. - Владимир, 1999. - С. 90-117.

52. Оковытая Т.В., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Борисов A.B. Взаимный перерасчет показателей титра антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни в сыворотке кур, исследованных при использовании различных иммуноферментных наборов// Пр-во и контроль мед. вет. препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ: Тез. докл. конф., посвящ. 30-лет. ФГУП ПЗБ. - Вольгинский, 1999. - С. 84-85.

Отпечатано на полиграфической базе отдела координации научных исследований, информации и международных связей ВНИИЗЖ

Тираж 100 экз., апрель 2000 г.