Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Технология изготовления инактивированной вакцины против инфекционной бурсальной болезни

На правах рукописи

Для служебного пользования

№ 6 дсп от 08.02.2000 г. экз. N9

//

УДК 619:616.476-022.6:615.371

ГУСЕВ Сергей Александрович

ТЕХНОЛОГИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ

16.00.03 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте

защиты животных

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, старший

научный сотрудник БОРИСОВ A.B.

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор РАХМАНОВ A.M. (ВНИИЗЖ, г. Владимир);

доктор биологических наук

ФОМИНА Н.В. (МГАВМ и Б, г. Москва).

Ведущее учреждение: Всероссийский государственный научно-

исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ, г. Москва).

Защита состоится « 4-» апреля 2000 года в 11 ч. на заседании диссертационного совета Д 120.60.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных Минсельхозпрода России по адресу: 600900, г. Владимир, п/о Юрьееец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ Автореферат разослан « 3 » марта 2000 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета _Г.М. Семенова

л

/7 М J

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) широко распространена во многих странах мира, наносит большой экономический ущерб и представляет постоянную существенную угрозу птицеводству. ' '

Вирус ИББ вызывает высококонтагиозное заболевание молодняка кур 2-15-недельного возраста, которое характеризуется поражениями фабрициевой сумки, почек, диареей, внутримышечными геморрагиями с последующей иммунодепрессией (Allan W.H., 1972; Fadly А.М.,1976; Rosenberger J.K.,1979). Для профилактики ИББ используют живые и инактивированные вакцины. Инактивированные вакцины, применяемые для вакцинации взрослого птицепоголовья, должны отвечать высоким требованиям по безвредности и иммуногенной активности. С целью создания инактивированной вакцины против ИББ с высокими иммунобиологическими свойствами необходимо отработать методы получения вирусного сырья, его очистки и инактивации. Использование традиционных способов очистки вируссодержащей суспензии хлороформом, полиэтиленимином (ПЭИ) и полиэтиленполиамином (ПЭПА) не всегда обеспечивает получение стерильной и высокоиммуногенной вакцины. Для повышения иммуногенной активности вакцины требуется дальнейшая оптимизация в ней количества антигена и подбор эффективных адъювантов. Решение перечисленных 'вопросов по созданию или усовершенствованию сорбированных и эмульсионных вакцин против инфекционной бурсальной болезни, обеспечивающих надежную защиту птицепоголовья от ИББ, является актуальной задачей и требует проведения дальнейших исследований.

Цели и задачи исследования. Цель исследований состояла в

разработке технологии изготовления и схемы применения инактивированной

вакцины против ИББ. Для выполнения вышеуказанной цели были t

поставлены следующие задачи:

подобрать оптимальную систему культивирования для получения вируса ИББ с высокой биологической активностью;

разработать способ очистки вируса ИББ от балластных белков;

изучить динамику инактивации вируса ИББ с помощью различных инактивантов;

подобрать адъювангы, обеспечивающие повышение иммуногенности вакцин;

отработать компонентный состав сорбированной и эмульсионной форм инактивированной вакцины против ИББ;

разработать технологию получения инактивированной вакцины против ИББ и подготовить необходимую нормативно-техническую документацию;

определить иммуногенную активность разработанной инактивированной вакцины против ИББ с учетом динамики титров антител и устойчивости птиц к контрольному заражению;

испытать инаюивированную вакцину против ИББ в лабораторных и производственных условиях.

Научная новизна. Выбрана чувствительная система культивирования вируса ИББ штамм «БГ» с использованием СПФ-эмбрионов кур.

Подобран оптимальный метод очистки вирусной суспензии от балластных белков хлороформом в концентрации 1,0% в сочетании с центрифугированием при 2500 об/мин.

Отработан режим инактивации инфекционности вируса ИББ штамма «БГ» аминоэтилэтилениммном в концентрации 0,1% в течение 24 часов при температуре 27°С.

Подобраны адьюванты для вакцины из инактивированного вируса ИББ штамм «БГ».

Разработана технология изготовления инактивированной вакцины против ИББ из штамма «БГ».

Практическое значение работы. Разработаны, одобрены ученым советом ВНИИЗЖ и утверждены Департаментом ветеринарии

Минсельхозпрода России нормативные документы на получение инактивированной вакцины против ИББ, в которые входят:

Технические условия на вакцину против инфекционной бурсальной болезни жидкую сорбированную инакгивированную;

Инструкция по изготовлению и контролю жидкой сорбированной инактивированной вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц (болезни Гамборо) из штамма «БГ»;

Наставление по применению вакцины против инфекционной бурсальной болезнии (ИББ) жидкой сорбированной инактивированной.

Апробация результатов работы. Материалы диссертации были доложены на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 1998-1999 гг. и на нучной конференции ВНИИЗЖ (г. Владимир, 1998 г.).

, Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе патент на изобретение № 2127603: «Инактивированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Рабо'та иллюстрирована 8 рисунками и 14 таблицами. Список используемой литературы включает 197 наименований, из них 36 работ отечественных и 161 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту:

- обоснование выбора чувствительной системы для культивирования вируса ИББ;

- разработка оптимального метода очистки вируса ИББ;

- разработка методики инактивации инфекционности вируса ИББ формальдегидом и аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ);

- разработка оптимального ингредиентного состава инактивированной вакцины против ИББ;

- изучение условий использования гидроокиси алюминия с сапонином и масляного адъюванта ВНИИЗЖ для получения вакцины;

- разработка лабораторного технологического регламента изготовления и биологического контроля инакгивированной вакцины против ИББ;

- испытание серий инактивированой вакцины против ИББ в лабораторных и производстенных условиях.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Вирус. В опытах использовали культуральный вирус ИББ штамм «Винтерфилд 2512» с биологическим титром не менее 7,0 lg ТЦСЫмл. Эмбриональный штамм «БГ» вируса ИББ с биологическим титром не менее 6,0±0,3 Ig ЭИД50/мл и эталонный патогенный штамм 52/70-М вируса ИББ с титром 4,5 Ig ЭИД5о/мл.

Подопытные животные. Для экспериментов использовали цыплят мясных и яичных пород, неиммунных к ИББ, 20-30-дневного возраста массой 150-К350 г и молодняк 90-110-дневного возраста массой 1,0+1,5 кг.

Культуры клеток и куриные эмбрионы. В опытах использовали: первичную культуру фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), а также эмбрионы СПФ-кур германской фирмы «Lohmann Tierzucht».

Культивирование вируса ИББ. Культивирование вируса ИББ проводили в СПФ-змбрионах кур. Для инкубации отбирали биологически полноценные яйца массой не менее 50 г, не более шестисуточного срока хранения от момента яйцекладки до начала инкубирования. Заражение эмбрионов проводили шприцем с тонкой иглой на ХАО в области естественной пуги в объеме 0,2 мл, содержащем не менее 1000 ЭИД5о/мл. Зараженные СПФ-эмбрионы кур помещали в термостат при температуре 37,5°С и проводили ежедневно овоскопию через каждые 3 часа в течение 144 часов инкубации. Все погибшие и оставшиеся в живых после 144 часов инкубации эмбрионы охлаждали при 2^6°С, вскрывали и отбирали

хориоаллантоисные оболочки, экстраэмбриональную жидкость и тушки эмбрионов с характерными изменениями (отечность головы, кровоизлияния, изменения печени). Вируссодержащую суспензию проверяли на стерильность и гемагглютинирующую активность в капельной РГА.

Очистка вируссодержащей суспензии. Для очистки вируса ИББ от балластных белков в суспензию ИББ вносили 0,5% хлороформа и смесь гомогенизировали в течение 30 минут. Полученную суспензию очищали центрифугированием на сепараторе Альфа-Лаваль, со скоростью 1500 об. /мин.

Инактивация вируса ИББ. Инактивацию инфекционное™ вируса проводили формальдегидом в концентрации 0,5% в течение 24 часов при температуре 37°С.или аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,1% в течение 24 часов при температуре 27 °С.

Изготовление вакцины. Эмульсионную форму вакцины готовили путем смешивания 10%-ой суспензии инактивированного вируса ИББ и масляного адъюванта в соотношении 1:1; тип эмульсии «масло в воде». Сорбированную форму вакцины готовили путем смешивания 10%-ой суспензии инактивированного вируса ИББ с 3%-ым раствором геля ГОА. Сорбированная вакцина содержала в своем составе: антигенный материал 60-80%; АЭЭИ 0,1+0,3%; 3%-ый раствор ГОА 17,7-5-39,4%; 10%-ый раствор сапонина 0,5+2,0%. Все компоненты брались по массе.

Контроль вакцин. Контроль эмульсионной и сорбированной форм инактивированной вакцины против ИББ осуществляли определением стерильности, полноты инактивации, безвредности и антигенной активности препарата.

Определение стерильности общей пробы вакцины проводили в соответствии с ГОСТом 280085-89 «Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности». Вакцину считали стерильной при отсутствии роста микрофлоры в посевах.

Проверку на полноту инактивации осуществляли методом трехкратных «слепых» пассажей вакцины на развивающихся СПФ-эмбрионах кур 9-11-суточного возраста.

Проверка на безвредность. Контроль вакцины на безвредность проводили на курах 110-120-суточного возраста. Вакцину вводили стерильным шприцем в мышцу бедра или груди в объеме 5,0 мл двумя инъекциями по 2,5 мл справа и слеза. За привитой птицей наблюдали в течение 10 суток. Вакцину считали безвредной, если все цыплята в течение указанного времени оставались живыми без клинических признаков заболевания и на месте введения вакцины не было следов воспалительной реакции.

Проверка антигенной активности. Перед проведением испытания цыплят проверяли на отсутствие антител к вирусу ИББ в РДП и ИФА. Для проверки антигенной активности вакцины использовали цыплят 30-суточного возраста. Цыплятам вводили вакцину в объеме 0,5 мл однократно внутримышечно (в мышцу бедра или груди). Через 21 сутки после вакцинации у всех иммунизированных цыплят индивидуально отбирали кровь и контролировали сыворотки на наличие антител к вирусу ИББ в РДП и ИФА. Обработка полученных в ИФА результатов проводилась согласно прилагаемым к тестам инструкциям. Далее в тексте значения титров представлены в виде величин, обратных разведениям. Вакцину считали иммуногенной, если титр антител не менее, чем у 80% вакцинированных цыплят через 21 сутки после вакцинации был не ниже, чем 1 log2 в РДП и 500 в ИФА.

Статистическая обработка результатов исследований. Для

обработки результатов исследований использовали статистические методы, применяемые в биологии, предложенные Кербером и модифицированные И.П. Ашмариным (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выбор системы культивирования вируса ИББ для

производства инактивированной вакцины

/

На начальном этапе разработки технологии изготовления инактивированной вакцины против ИББ в качестве вирусного антигена использовали пораженные фабрициевы сумки больных цыплят, которые получали из неблагополучных по ИББ гттицехозяйств.

Первые экспериментальные серии инактивированной вакцины, изготовленные из фабрициевых сумок больных цыплят, с успехом применяли в птицехозяйствах Пензенской, Владимирской, Челябинской, Рязанской и ряда других областей России. В это же время для специфической профилактики ИББ начали широко применять живые вакцины против ИББ из штамма «БГ» и «Винтерфилд 2512». Применение этих вакцин позволило в короткие сроки купировать вспышки заболевания и уменьшить отход молодняка птиц. В связи с этим количество источников получения «бурсального сырья» резко уменьшилось. В некоторых случаях отобранный бурсальный антиген был контаминирован различными патогенными агентами вирусного и микробного происхождения, что привело в ряде случаев к осложнениям после применения инактивированной вакцины на основе бурсального антигена. В связи с этим нами была проведена работа по разработке технологии изготовления инактивированной вакцины против ИББ на основе вирусного сырья, полученного на СПФ-эмбрионах кур и культуре клеток.

Система культивирования вакцинных штаммов «БГ» и «Винтерфилд 2512» вируса ИББ была отработана при разработке живых вакцин и позволяла получать вирусное сырье из штамма «БГ» с биологической активностью не ниже 5,0 lg ЭИД5о/мл, и из штамма "Винтерфилд 2512" с биологической активностью не ниже 6,5 lg ТЦД50/МЛ.

В дальнейших исследованиях по разработке оптимальных режимов и методов очистки, инактивации, ингредиентного состава параллельно

использовали оба вирусных антигена, полученные в разных системах культивирования.

Разработка оптимального метода очистки вируса ИББ

Для повышения иммуногенности и снижения реактогенности инакгивированной вакцины необходимо добиться освобождения исходной вирусной суспензии от примесей балластных белков. Перед нами стояла задача - отработать оптимальный способ очистки вируссодержащей суспензии для изготовления инакгивированной вакцины против ИББ.

В качестве исходного материала при разработке оптимального режима очистки вирусного сырья использовали 10% суспензию эмбрионального вируса ИББ штамм «БГ» с титром инфекционной активности 6,0±0,3 1д ЭИД50/мл и штамм «Винтерфилд 2512» с титром инфекционной активности 7,00±0,11 1д ТЦДго/мл. Вирусную суспензию охлаждали до 4°С и далее подвергали обработке различными детергентами (хлороформ и фреон-113). Последовательным изменением их концентрации в вируссодержащей суспензии подбирали оптимальное количество. Качество очищенных вируссодержащих суспензий оценивали по количеству балластного белка, который исследовали спекгрофотометрически при длине волны 280 нм.

Очищенные различными методами вируссодержащие суспензии использовали для изготовления лабораторных образцов инактивированной вакцины против ИББ. Антигенную активность инактивированной сорбированной вакцины против ИББ определяли на цыплятах, которых иммунизировали внутримышечно в объёме 0,5 мл. Через 21 день исследовали сыворотки крови на наличие антител в ИФА.

Результаты опытов представлены в таблице 1, из которой видно, что при очистке вируса ИББ с помощью различных концентраций детергентов наиболее оптимальные результаты получены при применении центрифугирования в сочетании с обработкой 1,0% хлороформом.

Сорбированная вакцина, полученная из очищенного вышеуказанным способом вируссодержащего материала, вызывала выработку у цыплят боле

высоких титров антител в ИФА (8800±150), в то время, как при использовании других способов очистки, титр антител в ИФА колебался от 6100 до 8500.

Таблица 1

Характеристика суспензий вируса ИББ штаммов «БГ» и «Винтерфилд 2512», очищенных различными методами (п=3).

Метод очистки вирусной суспензии Штаммы вируса Концентрация балластного белка (мг/мл) Прозрачность % Титр антител в ИФА

Исходная неочищенная суспензия Винтерфилд 2512 3,210±0,491 - 3820±130

БГ 3,20510,510 0 4560±120

Осаждение белка центрифугированием при 2500 об./мин Винтерфилд 2512 2,720 ±0,336 16 6950 ±130

БГ 2,730±0,301 15 7800±170

0,5% хлороформ и центрифугирование Винтерфилд 2512 1,425±0,134 58 7350±120

БГ 1,420±0,091 56 8400±120

1,0% хлороформ и центрифугирование Винтерфилд 2512 1,250±0,142 62 7600±140

БГ 1,307±0,111 60 8800±150

2,0% хлороформ и центрифугирование Винтерфилд 2512 1,310±0,151 65 6200±130

БГ 1,238±0,132 61 7450±130

0,5% фреон-113 и центрифугирование Винтерфилд 2512 0,920±0,108 71 7120±130

БГ 0,Э23±0,142 72 8415±150

1,0% фреон-113 и центрифугирование Винтерфилд 2512 0,61010,098 83 7350±140

БГ 0,613±0,082 81 8500±140

2,0% фреон-113 и центрифугирование Винтерфилд 2512 0,450±0,069 86 6100±130

БГ 0,467+0,067 85 6400±130

уровень значимости, р< 0,025 0,001

При сравнительном анализе титров антител в ИФА у цыплят, привитых образцами сорбированной вакцины, изготовленными из различных штаммов, наилучшие результаты получены при использовании штамма «БГ» вируса ИББ. Так, при очистке вирусных суспензий выбранным ранее способом, титры антител в ИФА при использовании штамма «БГ» составили 8800±150, а при применении штамма «Винтерфилд 2512» - 7600±140.

Разработка методики инактивации вируса ИББ

Для инактивации вируса ИББ были испытаны формальдегид и аминоэтилэтиленимин. В качестве исходного материала при разработке оптимального режима инактивации вируса ИББ под действием формальдегида использовали эмбриональный вирус ИББ штамм «БГ» и культуральный вирус штамм «Винтерфилд 2512» с титром инфекционной активности не менее 6,0±0,1 1д ЭИД5о/мл и 7,00±0,11 1д ТЦД^мл, соответственно. При проведении экспериментов по изучению условий инактивации вируса ИББ использовали различные концентрации формальдегида и АЭЭИ, разную температуру и время экспозиции с инактивантом.

На основании проведенных опытов установлено, что формальдегид и АЭЭИ обладали выраженным инакгивирующим действием в отношении вируса ИББ. Инфекционная активность возбудителя при этом находилась в прямой зависимости от концентрации инактиванта, времени контакта с вирусом и температуры реакционной смеси. Инактивацию вируса ИББ проводили формальдегидом, используя 5% водный раствор. Реактив добавляли к вирусной суспензии до конечной концентрации его в смеси {в %): 0,1; 0,3 Д5; 1,0 и выдерживали в течение 72 часов при 37°С и при 27°С. Полученные данные по инактивации вируса ИББ штамм «БГ» представлены на рис. 1 и 2.

Инактивацию вируса ИББ аминоэтилэтиленимином осуществляли, используя его в конечных концентрациях (в %): 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 с последующим перемешиванием вирусной суспензии в течение 36 часов при 27°С. Полученные данные представлены в табл. 2.

Полученные результаты по кинетике инактивации вируса ИББ формальдегидом или АЭЭИ позволили определить оптимальные условия при которых происходит полная и необратимая потеря вирусом инфекционности.

Исходный вирус 0,1% формальдегида 0,3% формальдегида 0,5% формальдегида 1% формальдегида

12 18 24

Время инактивации (часы)

Рисунок 1. Динамика инактивации вируса ИББ (штамм формальдегидом при температуре 37°С.

кБГ»)

Исходный вирус 0,1% формальдегида 0,3% формальдегида 0,5% формальдегида 1% формальдегида

12 18 24 48

Время инактивации (часы)

Рисунок 2. Динамика инактивации вируса ИББ (штамм «БГ») формальдегидом при температуре 27°С,

Таблица 2

Динамика инактивации вируса ИББ под действием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) (п=3)

№№ п.п. Время инактивации, часы Конечная концентрация АЭЭИ (%)

0,05 0,1 0,2 0,3

Инфекционный титр вируса штаммов*

БГ Винт. 2512 БГ Винт. 2512 БГ Винт. 2512 БГ Винт. 2512

1 Исходный вирус 6,00±0,10 7,00±0,11 6.00±0,10 7,00±0,11 6,00*0,10 7,00±0,11 6,00±0,10 7,00±0,11

2 4 5,75+0,10 6,55±0,11 5,50±0.11 6,10±0,19 4,85±0,11 5,85±0,12 3,95±0,10 5,00±0,20

3 8 5,15±0,15 6,10±0,13 4,10±0,15 4,85±0,10 3,22±0,1Б 3,90±0,11 2,85±0,10 2,30±0,14

4 12 4,10±0,11 5,60±0,14 2,28±0,12 3,50±0,12 1,75±0,11 1,75±0,11 1,10±0,04 0,85±0,15

5 16 3,34±0,15 4,72±0,10 1,20±0,11 2,3010,15 0,50±0,04 0,30±0,02 0 0

6 20 2,45±0,11 3,90±0,12 0,75±0,06 0,55±0,03 0 0 - -

7 24 2,10±0,12 2,25±0,14 0 0 0 0 - -

■8 28 1,22±0,11 1,45±0,09 0 0 - - - -

9 32 0,58±0,02 0,61 ±0,04 - - - - - -

10 36 0 0 - - - - - -

уровень значимости, р< 0,005 0,005 0,010 0,005 0,005 0,005 0,005 0,050

Примечание: *-титр инфекционности штамма "БГ" указан в ЭИД50/мл, штамма «Винтерфилд 2512» - в ТЦД50/мл

При применении формальдегида оптимальный режим инактивации вируса ИББ штамм «БГ» составил: 0,5%-ная конечная концентрация реагента с экспозицией в течение 24 часов при температуре 37°С. Аналогичные результаты были получены при инактивации вируса ИББ штамм «Винтерфилд 2512».

Обработка вирусной суспензии ИББ препаратом АЭЭИ выявила следующий оптимальный режим инактивации: 0,1% конечная концентрация реагента с экспозицией в течение 24 часа при температуре 27°С.

Для определения уровня иммунного ответа из инактивированных разными реагентами вирусных суспензий были приготовлены образцы вакцин и испытаны на цыплятах.

Сравнительное изучение инактивированных вирусных, препаратов показало, что вирус ИББ, инактивированный АЭЭИ, обладал более высокой антигенной и иммуногенной активностью в сравнении с вирусом, инакгивированным формальдегидом.

Установлено, что титр антител в сыворотке крови цыплят в ИФА на 21 день после иммунизации формолпрепаратом составил для штамма «БГ» 4800±120 и для штамма «Винтерфилд 2512» - 4200±110, а после применения АЭЭИ - 8400±200 и 6100±100, соответственно.

Полученные результаты позволили сделать вывод, что в дальнейшей работе в качестве вакцинного штамма целесообразнее применять штамм «БГ» вируса ИББ.

Разработка оптимального ингредиентного состава инактивированной вакцины против ИББ

При разработке технологии получения инактивированной вакцины против ИББ была поставлена задача создания вакцины, стабильной по составу, обладающей выраженным антигенным эффектом, высокоиммуногенной и безвредной для птицы, и приемлемой в экономическом и технологическом плане.

В наших исследованиях вакцинные препараты готовили из инактивированного эмбрионального вируса ИББ штамм «БГ», который соединяли с гидроокисью алюминия (ГОА) или с масляным адъювантом ВНИИЗЖ в различных сочетаниях. При использовании ГОА в качестве адъюванта изучали оптимальные условия сорбции гелем вирусного антигена: концентрацию, сорбционную емкость и рН суспензии, температуру и время сорбционного процесса. Для определения полноты сорбции гелем ГОА инактивированного антигена цыплятам 30-дневного возраста внутримышечно в область бедра вводили надосадочную жидкость в количестве 0,5 мл. В качестве контроля через 21 сутки после введения в ИФА исследовали сыворотку крови цыплят. Результаты опытов по сорбционной способности ГОА в отношении антигена вируса ИББ представлены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты сорбции антигена вируса ИББ при различной концентрации

геля ГОА, рН и экспозиции

Продолжительность сорбции, ч

№№ п.п. рн среды Концентрация ГОА, % 12 18 24

Отношение числа иммунных к вирусу ИББ цыплят к числу вакцинированных

1 0,5 7/10 5/10 3/10

2 7,2-7,4 1,0 4/10 2/10 н.о.*

3 1,5 3/10 н.о.* н.о.*

4 0,5 8/10 5/10 2/10

5 7,6-7,8 1,0 4/10 3/10 н.о.*

6 1,5 2/10 1/10 н.о."

7 7,2-7,4 контроль 0% 10/10 10/10 10/10

Примечание -н.о * - не обнаружено

Из приведенных данных установлено, что оптимальным количеством ГОД при величине рН 7,2+7,8 являлась 1% конечная концентрация, при которой в течение 24 часов проходила максимальная сорбция вируса ИББ, при этом в надосадочной части жидкости не было такого количества инактивированного вируса ИББ, который способен вызвать иммунную реакцию у подопытных цыплят. ,

. Для максимального повышения иммунного ответа организма цыплят на введение антигена вируса ИББ также было изучено влияние сапонина на иммуногенность инактивированной сорбированной вакцины против ИББ. С этой целью к инактивированной сорбированной вакцине против ИББ добавляли 10%-ный раствор сапонина в различных количествах. После этого вакцинировали этим препаратом цыплят 30-дневного возраста, неиммунных к ИББ, а через 21 сутки сыворотки крови исследовали в ИФА на наличие антител к ИББ. Контролем служила вакцина, в которую не добавляли сапонин.

Результаты исследований показали, что 1,5 мг сапонина в дозе является оптимальным количеством. При этой концентрации наблюдался максимальный иммунный ответ у подопытной птицы на введение инактивированной сорбированной вакцины против ИББ, который составил в ИФА-8400±150.

Таким образом, результаты опытов по изучению условий использования ГОА и сапонина для получения инактивированной вакцины против ИББ позволили определить оптимальные количества адъювантов: 1% конечная концентрация ГОА и 1,5 мг сапонина на дозу вакцины при длительности сорбции 24 часа, температуре 2*8°С, рН 7,4+7,6. Эти концентрации обеспечивали получение вакцины с максимальной иммуногенностью.

В целях получения эмульсионных форм вакцины в наших исследованиях был использован масляный адъювант ВНИИЗЖ. Адъювант представляет собой смесь синтетического масла и неионогенных поверхностно-активных веществ (спан-80, ланолин, эмульгатор ВНИИЖ).

В процессе использования адъюванта ВНИИЗЖ были изготовлены и испытаны образцы инактивированных эмульгированных вакцин против ИББ вакцины с различным соотношением антигена и адъюванта.

Испытание полученных образцов вакцинных препаратов проводили на цыплятах 30-дневного возраста, свободных от антител к вирусу ИББ, которым вводили препарат в дозе 0,5 мл внутримышечно, в грудную мышцу. На 21 сутки сыворотки крови иммунизированных птиц исследовали в РДП и ИФА. Результаты исследований показали, что наиболее выраженный иммунный ответ получен у цыплят при использовании препарата с соотношением антигена и адъюванта 1:1, титр антител в ИФА составил 12640±140, а в РДП - 5,2±0,2 log2.-

Приготовленные образцы инактивированной эмульсионной вакцины против ИББ были испытаны на безвредность на цыплятах 90-110-суточного возраста, которым вводили препарат в грудную мышцу в дозе 1,5 мл. Отмечено,что видимых отклонений от физиологических норм в поведении подопытных птиц не регистрировалось. На месте введения через 10 суток не наблюдали видимых признаков воспалительной реакции.

Также на цыплятах, у которых предварительно было проведено исследование сывороток крови на отсутствие антител к вирусу ИББ, испытали различные формы инактивированной вакцины с целью определения напряженности и продолжительности иммунитета.

Испытуемые формы вакцины вводили птицам однократно внутримышечно в грудную мышцу в дозе 0,5 мл. За птицами вели наблюдение в течение 12 месяцев. На 7, 14, 21 и 30 сутки, через 2, 4, 6, 9 и 12 месяцев после вакцинации проводили убой подопытных птиц с целью визуального осмотра места введения и получения сывороток крови для серологического исследования в ИФА. Данные опыта представлены в табл. 4.

Результаты эксперимента показали, что эмульсионная вакцина, в сравнении с ГОА-формой, обладала более выраженной антигенной активностью и индуцировала в организме привитых птиц образование более высокого уровня специфических антител против вируса ИББ.

Таблица 4

Ответная реакция птиц в различные сроки после введения эмульсионной и сорбированной форм инактивированной вакцины против ИББ (п=5)

Формы вакцины Показатели Сроки убоя птиц после вакцинации

7 сут. 14 сут. 21 сут. 30 сут. 2 мес. 4 мес. 6 мес. 9 мес. 12 мес.

Эмульсионная Титр антител в ИФА 7150± 140 10400± 220 12600± 250 12550± . 255 11130± 180 10550± 170 102001 160 9870± 130 9540± 120

Результаты осмотра места введения Следы эмульсии Следы эмульсии Следы эмульсии Следы эмульсии Следы эмульсии Следы эмульсии Следы эмульсии Следы эмульсии Следы эмульсии

Сорбированная Титр антител в ИФА 3600± 110 5640± 130 7550± 200 7350± 220 6830± 250 6540± 140 6320± 130 6000± 110 5800± 140

Результаты осмотра места введения Следы ГОА Следы ГОА Видимых изменений нет - - - - - -

уровень значимости, р< 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001

Таким образом, полученные результаты свидетельствовали о том, что обе формы инактивированной вакцины, приготовленные из инактивированного АЭЭИ антигена вируса ИББ, обладали высокой иммуногенной активностью, были безвредны для организма птиц в дозе 0,5 мл и 1,5 мл и обеспечивали однородный и высокий уровень антител в течение 12 месяцев {срок наблюдения).

Разработка технологического регламента изготовления и

биологического контроля инактивированной вакцины против ИББ

С учетом предварительных результатов испытания инакгивированных препаратов вируса ИББ определены исходные данные оптимального ингредиентного состава инактивированной вакцины против ИББ и основные параметры производства и биологического контроля препарата.

Разработанная нами технология изготовления вакцины против ИББ из штамма «БГ» включает следующие процессы:

I. получение и контроль матровой расплодки вируса ИББ;

II. получение и контроль производственной расплодки вируса ИББ;

III. приготовление вирусной суспензии для производственной серии

вакцины;

IV. очистка вируса ИББ;

V. инактивация и контроль полноты инактивации вируса;

VI. получение инактивированной вакцины;

VII. расфасовка вакцины;

VIII. контроль вакцины;

IX. этикетировка, упаковка и хранение вакцины.

Биологический контроль инактивированной вакцины против ИББ включает в себя проверку на стерильность, полноту инактивации, безвредность и иммуногенную активность.

Испытание экспериментальных серий инактивированной вакцины против ИББ в производственных условиях

Для проведения испытаний была приготовлена экспериментальная серия инактивированной сорбированной вакцины на основе эмбрионального вируса ИББ штамм «БГ». Определение иммуногенной эффективности вакцины было

проведено в условиях неблагополучной по ИББ птицефабрики «Юрьевецкая» в 1995 г.

Работу по испытанию вакцины проводили комиссионно. Вакцину применяли на стаде (11040 птиц), размещенном в двух корпусах №4 и №8. В птичнике №4 было вакцинировано 5510 кур родительского стада в возрасте 110-112 дней, размещенных в левой секции корпуса. Аналогичное количество птиц из этой же партии было оставлено в качестве контроля в правой секции корпуса, имеющей отдельный вход. В птичнике №8 было вакцинировано 5530 голов кур родительского стада в возрасте 115-118 дней, размещенного в правой секции корпуса. Для контроля было оставлено такое же количество одновозрастных птиц, размещенных в левой секции корпуса. Вакцину вводили в соответствии с Временным наставлением по ее применению методом однократной внутримышечной инъекции (в мышцу бедра) в дозе 0,5 мл на голову.

Результаты испытаний показали,что сорбированная вакцина не вызывала у привитых птиц поствакцинальных осложнений общего или местного характера, что указывало на её безвредность. Анализ сохранности птиц в ходе опыта не выявил существенных отличий по группам.

Таблица 5.

Результаты сравнительных исследований в ИФА сывороток кропи, полученных до и после вакцинации против ИББ

с s то Титр антител в ИФА

с. Ol X г ¡S с с До вакцинации после вакцинации (сутки)

Of с: С- 21 30 60 90 120 180

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 4 опытная 2200± 130 8680± 110 8340± 110 8120± 270 7910± 180 7530± 90 6920± 230

2 контрольная 2180± 120 2250± 185 2005± 260 1910± 150 1850± 110 1670± 320 1330± 80

3 8 опытная 2150± 120 8550± 115 8490± 330 7840± 210 7610± 115 7200± 160 6850± 260

4 контрольная 2300± 110 2120± 100 1990± 220 1810± 120 1730± 170 1520± 100 1205± 75

уровень значимости, р< 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001 0,001

Для определения антигенной активности испытуемой серии инактивированной сорбированной вакцины в условиях птицехозяйства у птиц из

опытных и контрольных групп отбирали по 100-150 проб сывороток крови до вакцинации и такое же количество проб через 21,30,60,90,120,180 дней после нее. Сыворотки исследовали в ИФА на наличие антител к вирусу ИББ. Результаты исследований представлены в табл. 5, из которой видно, что титры антител к вирусу ИББ в сыворотке крови увеличились после вакцинации инактивированной сорбированной вакциной против ИББ в среднем в 3,0-3,5 раза, что подтверждает высокую антигенную активность испытуемой вакцины.

Сравнительная оценка пассивного иммунитета против ИББ

у цыплят, полученных от непривитых и вакцинированных

кур

Целью данных исследований являлась сравнительная оценка пассивного («материнского») иммунитета у цыплят яичных и мясных пород, полученных от родителей, непривитых и привитых инактивированной сорбированной вакциной против ИББ.

Исследования по сравнительной оценке пассивного иммунитета проводили на 45 птицефабриках России яичного и мясного направлений. У цыплят в возрасте 1, 3, 6, 9, 12, 15, 18 и 21 суток, полученных от родителей невакцинированных и вакцинированных инактивированной вакциной против ИББ, отбирали сыворотки крови, которые исследовали в ИФА на наличие антител к вирусу ИББ с помощью коммерческих наборов ИФА, изготовленных во ВНИИЗЖ. Положительными считали сыворотки крови с титром антител в ИФА 400 и выше. Всего было отобрано и исследовано более 5000 проб сывороток крови.

Результаты исследований представлены на рис. 3 и 4.

Из рис. 3 видно, что средний титр пассивных антител в ИФА у цыплят яичного направления, полученных от вакцинированных родителей, составил 6645, в то время, как у цыплят, полученных от невакцинированных родителей, он был ниже и составил 2339.

7000

6000 -

< 5000 -

о

4000 -

ю

е- зооо -

Ь 2000 -

1000 -

от невакцинированных родителем от вакцинированных родителей

6 9 12 15

Возраст цыплят (сутки)

Рисунок 3. Сравнительная оценка уровней материнских антител против ИББ у цыплят, полученных от кур яичных пород, иммунизированных инактивированной вакциной против ИББ и невакцинированных.

Рисунок 4. Сравнительная оценка уровней материнских антител против ИББ у цыплят, полученных от кур мясных пород, иммунизированных инактивированной вакциной против ИББ и невакцинированных.

К 18-суточному возрасту титры антител снизились и составили 985 и 248, соответственно, а к 21 суткам пассивные антитела обнаруживались только у цыплят, полученных от вакцинированных родителей.

Из рис. 4 видно, что такая же тенденция наблюдалась и у цыплят мясного направления, но уровень пассивных антител у них снижался быстрее и к 15-суточному возрасту только у цыплят, полученных от вакцинированных родителей, было обнаружено в сыворотках крови присутствие пассивных антител к вирусу ИББ.

Результаты исследований позволили сделать вывод, что инакгивированная сорбированная вакцина против ИББ, используемая для вакцинации взрослого маточного поголовья, обеспечивала выработку однородного пассивного иммунитета у цыплят, что создавало надежную защиту цыплят от инфицирования вирусом ИББ в раннем возрасте. Отмечено также, что пассивные антитела в сыворотках крови у цыплят яичных пород сохранялись до 21 суток, в то, время как у цыплят мясных пород-до 15 суток.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология изготовления инактивированной вакцины против инфекционной бурсальной болезни.

2. Выбрана система получения вируссодержащего сырья с высокой биологической активностью с ипользованием СПФ-эмбрионов кур, обеспечивающая получение вакцин, создающих напряженный и длительный иммунитет у цыплят против ИББ.

3. Отработан оптимальный метод очистки вируссодержащего сырья от балластных белков при помощи хлороформа в концентрации 1% и последующего центрифугирования при 2500 об/мин.

4. Предложен метод инактивации вируса ИББ штамм «БГ» аминозтилэтиленимином в концентрации 0,1% в течение 24 часов при температуре 27°С, обеспечивающий полную потерю инфекционности при сохранении иммуногенных свойств вируса.

5. Определены параметры инактивирукхцего действия формальдегида на вирус ИББ, при которых достигается полная инактивация вируса - конечная концентрация 0,5% формальдегида, температура 27°С в течение 24 часов.

6. Установлено, что ГОА, используемая в качестве адъюванта в концентрации 1% (рН 7,4*7,6) в сочетании с сапонином (1,5 мг на дозу вакцины), повышают иммуногенность инактивированных вакцин.

7. Показано, что масляный адъювант ВНИИЗЖ при смешивании с антигеном из штамма «БГ» в соотношении 1:1 повышает иммуногенную активность эмульсионной вакцины.

-238. Обоснован компонентный состав сорбированных и эмульсионных вакцин, что обеспечивает их высокую иммуногенность, а также седиментационную устойчивость эмульсионных вакцин.

9. Установлено, что инакгивированная сорбированная вакцина против ИББ при вакцинации взрослого маточного поголовья обеспечивает получение однородного пассивного иммунитета у цыплят, что создает надежную защиту цыплят от инфицирования вирусом ИББ в раннем возрасте.

10. Показано, что пассивные антитела в сыворотке крови у цыплят яичных пород, полученных от вакцинированных родителей, сохраняются до 21 суток, а у цыплят мясных пород - до 15 суток.

11. В результате производственных испытаний в условиях птицехозяйств было показано, что сорбированная вакцина не вызывает побочных и аллергических реакций, обеспечивает надежную профилактическую защиту птицепоголовья от заболевания ИББ и может успешно использоваться для массовой иммунизации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании результатов научных исследований по разработке технологии изготовления инактивированной вакцины против ИББ и испытанию вакцины в лабораторных и производственных условиях была составлена нормативно-техническая документация на изготовление, биологический контроль и применение жидкой сорбированной инактивированной вакцины против ИББ:

1. Инструкция по изготовлению и контролю жидкой сорбированной инактивированной вакцины против инфекционной бурсальной болезни птиц (болезни Гамборо) из штамма «БГ», утвержденная директором ВНИИЗЖ 08.01.96 г.;

2. Технические условия на вакцину против инфекционной бурсальной болезни жидкую сорбированную инактивировзнную, утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 3.04.95 г. по 3.10.97 г. (ТУ 08064-19-62-95);

3. Технические условия на вакцину против инфекционной бурсальной болезни жидкую сорбированную инактивировэнную, утвержденные

Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 15.02.97г. без ограничения срока действия (ТУ 9384-014-00008064-97);

4. Временное наставление по применению вакцины против инфекционной бурсальной болезни (ИББ) жидкой сорбированной инактивированной, утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России N213-4-2/408 02.10.95 г.

5. Наставление по применению вакцины против инфекционной бу реальной болезни (ИББ) жидкой сорбированной инактивированной, утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России №13-42/864 12.02.97 (без ограничения срока действия).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гусев С.А., Оковытая Т.В., Мудрак Н.С., Борисов A.B., Федосеев К.Ю., Михалишина З.Я., Гирин. М.В., Гусев A.A., Дрыгин В.В. Сравнительная оценка пассивного иммунитета против ИББ у цыплят, полученных от непривитых и вакцинированных кур.// Современные аспекты вет.патол. ж-ных: Матер, конф., посвящ. 40-летию ВНИИЗЖ.-Владимир,1998.-С.192-196.

2. Гусев С.А., Борисов A.B., Михалишина З.Я. Очистка вируса инфекционной бурсальной болезни.// Произв. и контр. мед.,вет преп., опыт применения и реализации их в странах СНГ: Тез. докл. конф., посвящ. 30-летию ФГУП ПЗБ, Вольгинский, 19S9.-C.57.

3. Гусев С.А., Михалишина З.Я., Борисов A.B., Борисов В.В. Изучение условий инактивации вируса инфекционной бурсальной болезни.// Вет. мед. ммвщ. тем. наукзб1р. -Харив, 1399,- Вып.76.-С.127-131.

4. Гусев С.А., Борисов A.B., Михалишина З.Я., Оковытая Т.В. Исследование различных адъювантов для инактивированных вакцин против инфекционной бурсальной болезни.// Произв' и контр, мед.,вет преп., опыт применения и реализации их в странах СНГ: Тез. докл. конф., посвящ. 30-летию ФГУП ПЗБ, Вольгинский, 1999.- С.56.

5. Борисова O.A., Борисов В.В., Гусев С.А., Борисов A.B., Михалишина З.Я., Волкова МА. Изучение антигенной активности ассоциированной

инактивированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости, инфекционного бронхита и инфекционной бурсальной болезни кур.// Произв. и контр. мед.,вет прел., опыт применения и реализации их в странах СНГ: Тез. докл. конф., посвящ. 30-летию ФГУП ПЗБ, Вольгинский, 1999,- С. 53.

6. Гусев A.A., Дрыгин В.В., Борисов A.B., Марков Г.В., Кузнецов В.Н., Михалишина З.Я., Кузнецов Ю.В., Гусев С.А., Щербакова П.О., Федосеев К.Ю. Разработка и внедрение средств диагностики и специфической профилактики ИББ. -ВНИИЗЖ. -ГНТП «Вет. благополучие» (этап 08.02.М). (заключительный) Владимир, 1995. -научный отчет №186. -85 с.

7. Борисов A.B., Борисов В.В., Гусев A.A., Кузнецов В.Н., Михалишина З.Я., Гусев С.А., Смоленский В.И., Норкина С.Н. Инактивированная вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц: Патент № 2127603 РФ. Заявл.: 23.02.98; Опубл.: 20.03.99.

Отпечатано на полиграфической базе отдела координации научных исследований, информации и международных связей ВНИИЗЖ

Тираж 80 экз.; март 2000 г.