Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Усовершенствование технологии получения сухой вирусвакцины против болезни Марека

Для служебного пользования „ № 56 дсп от 25.10.2000 г. экз. № У/ На правах рукописи УДК 19:578.825.1:615.371:573.6:578

МЕЛЬНИКОВ ВЛАДИМИР ПЕТРОВИЧ

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОЙ ВИРУСВАКЦИНЫ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА

16.00.03 "Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Г ' Владимир - 2000

Работа выполнена в ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Научный руководитель - кандидат ветеринарных наук, старший научный

сотрудник Куляшбекова Шамшагуль Куляшбековна.

Официальные оппоненты: - доктор ветеринарных наук, старший научный

сотрудник Михалишин Валерий Васильевич (ВНИИЗЖ, г. Владимир); - доктор биологических наук Фомина Наталья Васильевна (ВНИИВСГЭ, г. Москва).

Ведущая организация: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина (МГАВМиБ, г. Москва).

Защита диссертации состоится декабря 2000 г. в 1 у часов на

заседании диссертационного совета Д 120.60.01. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных по адресу: 600900, г. Владимир, пос. Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ. Автореферат разослан ноября 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Г. М. Семёнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Болезнь Марека (БМ) относится к группе наиболее опасных инфекционных заболеваний кур, возбудителем которой является ДНК-содержащий вирус, отнесенный к семейству герпесвирусов. Характерным для болезни является быстрое распространение инфекции среди восприимчивого поголовья. Заболеваемость птиц в невакцинированных стадах составляла 25-30% и может достигать 60%.

В последние годы болезнь Марека регистрируется_практически во всех странах мира с развитым промышленным птицеводством. Экономический ущерб от БМ складывается из падежа и вынужденного убоя птицы, снижения показателей продуктивности, а также из затрат на ветеринарно-санитарные мероприятия.

Однако в настоящее время во многих регионах мира отметили снижение способности вакцин защищать птиц от болезни Марека. Это связывают с появлением новых высоковирулентных штаммов вируса болезни Марека, наличием у цыплят высоких титров гомологичных материнских антител к вакцинному вирусу и снижением иммуногенности вакцин на основе вируса герпеса индеек.

Вакцинопрофилактика болезни Марека занимает ведущее место в борьбе с этим заболеванием. Для профилактики болезни Марека применяют различные вакцины, обладающие достоинствами и недостатками.

В настоящее время наиболее широко используются вакцины из смесей первого и третьего, второго и третьего и всех трех вирусных серотипов. Эти препараты производятся в жидкой (ассоциированной с клеткой) форме, требующей хранения в жидком азоте, так как из-за незначительной стабильности вирусов второго и первого серотипов вне клетки получить свободный от клеток препарат очень сложно. Однако в условиях Российской Федерации, когда птицефабрики Сибири и Дальнего Востока удалены от производителей вакцин, у хозяйств возникают трудности в транспортировке и хранении таких вакцин. Необходимо отметить, что эти препараты представлены живыми замороженными клетками с ассоциированным в них вирусом. Нарушение правил перевозки, применения способствует разрушению клеток, снижению

титра вируса и неравномерной дозировке, что является причиной отхода птицы от болезни Марека.

В связи с этим в удаленных регионах целесообразно применение вакцин из третьего серотипа, (вируса герпеса индеек), которые можно готовить в сухой форме, и для транспортировки которой не требуются специальные условия.

Учитывая вышеизложенное, усовершенствование технологии получения сухой вирусвакцины против БМ на основе вируса герпеса индеек с целью изготовления эффективного препарата является актуальной задачей.

С технологической точки зрения при промышленном производстве вакцин против БМ наибольший интерес представляет высокая эффективность выращивания клеток и максимальный выход вируса. Высокое накопление вируса болезни Марека связано с оптимальным подбором условий культивирования. Кроме этого, для получения качественных вакцин против БМ необходимо подбирать штамм вируса, обладающий высокой иммуногенной активностью, отработать метод, обеспечивающий максимальное освобождение вируса из клетки, а также подобрать разбавитель для лиофилизированных препаратов, обеспечивающий стабильность вируса в разведенном состоянии.

Указанные выше проблемы являются актуальными и послужили основной предпосылкой для исследований по усовершенствованию технологии получения сухой вирусвакцины против болезни Марека.

Цели и задачи исследования. Целью работы было усовершенствование технологии получения сухой вирусвакцины против болезни Марека из вируса герпеса индеек. Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- получить производственный штамм вируса герпеса индеек, обладающий высокой иммуногенной активностью;

- отработать параметры культивирования вируса герпеса индеек для получения сухой вирус вакцины против БМ в производственных условиях;

- подобрать питательные среды и компоненты, обеспечивающие потребности клеток и вируса;

- изучить условия получения высококачественного, свободного от клеток, зируса;

- изучить стабильность лабораторных образцов сухой вирусвакцины против Золезни Марека в процессе хранения при различных температурах;

- подобрать оптимальный разбавитель лиофилизированных препаратов;

- определить иммуногенные свойства лабораторных образцов сухой вирусвакцины против болезни Марека в лабораторных и производственных условиях.

Научная новизна. Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований:

- получен штамм вируса герпеса индеек («ВНИИЗЖ 110»), обладающий высокой иммуногенной активностью, пригодный для получения сухой вирусвакцины против болезни Марека;

- изучены иммунобиологические свойства вакцинного штамма «ВНИИЗЖ 110» вируса герпеса индеек;

- отработаны параметры культивирования производственного штамма «ВНИИЗЖ 110» вируса герпеса индеек в лабораторных и производственных условиях;

- отработаны условия получения высокоиммуногенного свободного от клеток вируса герпеса индеек штамма «ВНИИЗЖ 110»;

- изучена стабильность лабораторных образцов сухой вирусвакцины против БМ из штамма "ВНИИЗЖ 110" при различных температурах;

- подобран разбавитель лиофилизированных препаратов;

- определены иммуногенные свойства лабораторных образцов сухой вирусвакцины против БМ из штамма «ВНИИЗЖ 110» в лабораторных и производственных условиях.

Научная новизна диссертации подтверждена получением патента на сухую вирусвакцину против болезни Марека и способ ее изготовления (патент №2144376, 1999г.).

Практическая значимость результатов исследований. На основании проведенных исследований разработан комплект методических и нормативно-

технических документов, регламентирующих основные этапы получения сухой культуральной вирусвакцины против болезни Марека из штамма «ВНИИЗЖ 110», которые утверждены директором института и рассмотрены с положительным решением Ветфармбиосоветом.

Отработаны методы и условия культивирования вакцинного штамма «ВНИИЗЖ 110» в первичной культуре клетк куриных фибробластов и изучены оптимальные условия его выделения из клеток Подготовлены рекомендации по определению биологической активности клеточно-ассоциированного и свободного от клеток вируса болезни Марека.

Усовершенствована технология изготовления высокоиммуногенной сухой вирусвакцины против болезни Марека из штамма «ВНИИЗЖ 110» вируса герпеса индеек, создающая напряженный и продолжительный иммунитет у вакцинированных птиц.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

- штамм вируса герпеса индеек (штамм «ВНИИЗЖ 110»), обладающий высокой иммуногенной активностью при болезни Марека;

- параметры культивирования производственного пггамма "ВНИИЗЖ 110" вируса герпеса индеек;

- питательные среды и компоненты для культивирования клеток и вируса герпеса индеек (штамм «ВНИИЗЖ 110»);

- условия получения высокоиммуногенного свободного от клеток вируса герпеса индеек;

- параметры лиофильной сушки для получения сухой вирусвакцины против болезни Марека;

- сохраняемость сухой вирусвакцины против болезни Марека из штамма "ВНИИЗЖ 110" при различных температурах;

- разбавитель лиофилизированных препаратов;

- иммуногенная активность сухой вирусвакцины против болезни Марека из штамма "ВНИИЗЖ 110" в лабораторных и производственных условиях.

Апробация результатов работы. Материалы диссертации были доложены на международной научно-производственной конференции в ВНИВИПФиТ

г. Воронеже (1999 г.), и на международной научно-практической конференции в Белорусском НИИЭВ г. Минске (2000 г.), и на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 1998 и 1999 годах.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано б научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который включает 256 источников, в том числе 33 отечественных. Работа иллюстрирована 20 таблицами, 9 рисунками и дополнена приложениями.

Автор благодарит сотрудников ВГНКИ Смоленского В.И., Баррос Е.В., ВНИИЗЖ: A.B. Борисова, В.Г. Андреева, P.M. Оншценко, а также сотрудников отдела культивирования клеток и вирусов и ОКНИИ и MC за практическую и методологическую помощь при выполнении и оформлении диссертации.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусный материал. В работе использовали следующие штаммы вируса:

- штамм FC-126 вируса герпеса индеек с исходной активностью 7,4 х 105 ФОЕ/см3. Получен из Комптоновской лаборатории в 1994 г. (Великобритания).

- штамм "ВНИИЗЖ 110" вируса герпеса с исходной активностью 1,2 х 106 ФОЕ/см3. Получен во ВНИИЗЖ, депонирован во ВГНКИ.

- вирулентный штамм JM (любезно предоставлен сотрудником ВГНКИ Е.В. Баррос). Для контрольного заражения использовали цитрированную вируссодержащую кровь СПФ-цыплят.

- вирулентный штамм «Конкур» (любезно предоставлен сотрудником ВГНКИ Баррос Е.В). Для контрольного заражения использовали смесь нитрированной вируссодержащей крови и эпителия перьевых фолликул СПФ-цыплят в соотношении 1:1.

Культуры клеток. Для размножения и титрования вируса использовали первичные культуры клеток 10-12-суточных СПФ-эмбрионов кур. Температуру инкубации нормальных и зараженных клеточных культур поддерживали от 37,5°С до 38,5°С. Сроки культивирования зависели от целей работ и посевной концентрации и составляли от 24 до 120 часов.

Сосуды и аппараты. Промышленное и лабораторное культивирование клеток и вируса проводили в роллерных бутылях вместимостью 3 дм3, диаметром 100 мм. Для вращения бутылей использовали аппарат стеллажно-ярусного типа для вращения барабанов на 12 бутылей. Использовался принцип плавного вращения ростовой поверхности сосудов со скоростью вращения 10-12 об/час.

Питательные среды и растворы. Основной средой для промышленного культивирования вируса болезни Марека и клеток КФ была смесь равных объемов сред: 199, Игла и 0,5% гидролизата лактальбумина на солевом растворе Эрла (ГЛАЭ).

В опытах также использовали:

- среду Игла производства BioClot (ФРГ). Sigma (США);

- гидролизат лактальбумина производства "Дифко" (США), BioClot (ФРГ), Sigma (США);

- среду 199 производства BioClot (ФРГ). Sigma (ФРГ), HyClone (США);

- смесь равных объемов сред Игла и 199;

- смесь равных объемов сред ГЛАЭ и 199.

Ростовые питательные среды содержали 10% сыворотки крови крупного рогатого скота производства Витебского мясокомбината и ВНИВИ (Казань). К поддерживающей питательной среде добавляли сыворотку крови КРС до концентраций 5 и 2%. рН ростовой и поддерживающей сред был соответственно 7,1-7,3 и 7,4-7,6.

При лабораторном культивировании в поддерживающую среду добавляли сыворотку крови КРС до концентраций 2,3, 5,7%.

Кроме сыворотки крови крупного рогатого скота испытывали эмбриональную сыворотку крови КРС производства BioClot (ФРГ) и телячью сыворотку крови (Бионит, г. Владимир).

При размножении и титровании ВГИ, выделенного из перьевых фолликулов, применяли питательную среду, содержащую антибиотики: пенициллин -100 ЕД/ см3, стрептомицин - 100 мкг/см3 и нистатин - 50 мкг/см3.

Для обработки и трипсинизации тканей эмбрионов использовали солевой раствор Хенкса и 0,25% раствор трипсина производства "Дифко" (США), BioClot (ФРГ). MERCK (ФРГ), FLUKA (Швейцария), ICN Pharmaceuticals (США), а для дезагрегации клеточных кулмур - диспергирующий раствор, состоящий из 0,25% трипсина и 0,02% версена с добавлением 1% глюкозы.

Криозащитная среда для консервирования инфицированных ВГИ клеток состояла из 70% поддерживающей среды, 20% сыворотки КРС и 10% диметилсульфоксида (ДМСО).

Защитной средой внеклеточного ВГИ служила среда СФГА, содержащая (г/дм3): альбумин сывороточный (бычий, лиофилизированный) -10 (1%); КН2Р04 -0,5 (0,0038 М); К2НР04 - 1,25 (0,0072 М); сахароза - 7,45 (0,218 М); моноглютамат натрия - 0,83 (0,0049 М); рН среды СФГА был 6,9 - 7,2.

Внеклеточный вирус при титровании и перед введением цыплятам разводили защитной средой СФГА или дистиллированной водой. В отдельных опытах вирус при титровании разводили полиэтиленгликолевым разбавителем, забуференным физиологическим раствором и питательной средой Игла.

Забуференный физиологический раствор (рН 7,0 - 7,2) содержал ( г/дм3): NaCL - 8; Na2HP04 х 2Н20 - 1,3; КН2Р04 - 0,2.

Разбавитель представляет собой забуференный до рН 7,0-7,2 2%-ный бесцветный прозрачный раствор полиэтиленгликоля.

Экспериментальные животные. При изучении иммуногенной активности ВГИ опыты проводили на суточных СПФ-цыплятах и на бройлерных цыплятах.

Выделение вируса герпеса индеек из перьевых фолликул цыплят. Суточным СПФ-цыплятам вводили по 10000 ФОЕ/0,2 см3 ВГИ внутримышечно в область бедра. В качестве источника вируса использовали очины маховых перьев. Перья брали от цыплят в период с 8 по 20 сутки после вакцинации. Очины (3-8 мм) всех маховых перьев срезали ножницами и помещали в 0,25%-ньш раствор трипсина с температурой 37°С. Дезагрегацию ткани проводили дробно - 3 раза по 3-5 минут на магнитной мешалке. Действие трипсина прерывали добавлением 2%

сыворотки крови КРС. Полученную клеточную суспензию подвергали центрифугированию в течение 20 мин. при 1000 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляли, а осевшие клетки разводили в ростовой среде. Полученные клеточные вируссодержащие материалы криоконсервировали в защитной среде, содержащей ДМСО, или использовали для заражения культуры клеток.

Подготовка ткани к трипсинизации. Куриные эмбрионы 10-12-суточной инкубации доставляли из инкубатора в течение 10-30 минут. Поверхность скорлупы обрабатывали 70% этиловым спиртом, и каждое яйцо овоскопировали. На скорлупе простым карандашом отмечали границы воздушного пространства.

Перед трипсинизацией с разных лотков отбирали 3-5 эмбрионов, удаляли голову, конечности и взвешивали для определения необходимого для работы количества эмбрионов. Перед разделкой поверхность яйца обрабатывали йодированным спиртом (2%-ным раствором) и фламбировали. Затем в асептических условиях, с помощью стерильных инструментов и посуды стерильно срезали скорлупу над пугой так, чтобы кусочки скорлупы не попали на мембрану. Пинцетом разрывали подскорлуповую и хориоаллантоисную оболочки, обнажали и извлекали эмбрион.

Каждый эмбрион асептически извлекали в стерильные чашки Петри и, соблюдая условия стерильности, удаляли голову и конечности. В некоторых опытах эмбрионы измельчали ножницами на кусочки размером 1x2 или 3x5 мм3. Затем тушки собирали в банку и 3-5 раз промывали раствором Хенкса, содержащим по 200 ЕД/см3 пенициллина и стрептомицина, чтобы отмыть от слизи и кровяных элементов.

Отмытые тушки эмбрионов переносили в плоскодонную колбу емкостью 1-2 дм3, заливали раствором трипсина и подвергали трипсинизации.

Методы трипсинизации тканей.

Трипсинизацию ткани осуществляли: |

- дробным способом трипсинизации в колбах. Кусочки ткани заливали 0,25%-ным раствором трипсина с температурой 37°С в соотношении ткани и жидкости 1:5 и подвергали ферментативному разобщению на магнитных

мешалках. Дезагрегацию ткани проводили дробно - 3-4 раза по 3-5 минут при температуре 37°С. По мере отхождения клеток, трипсино-клеточную взвесь фильтровали через 2-3-слойный марлевый фильтр в .охлажденный центрифужный флакон, в который добавляли 2% к объему жидкости сыворотки крови крупного рогатого скота для нейтрализации действия трипсина. Отфильтрованную клеточную суспензию немедленно подвергали центрифугированию в течение 15 минут при 1000 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляли, а осевшие клетки разводили в ростовой среде. После подсчета клеток в камере Горяева суспензию разбавляли до требуемого объема ростовой средой и помещали в культуральные сосуды: В 3 дм3 роллерные бутыли вносили клеточную суспензию в объеме 350+100 см3 , в 50 см3 флаконы - 10 см3, с соответствующей концентрацией.

- одноэтапньш способом трипсинизации. Отмытые раствором Хенкса кусочки ткани загружали в колбу, вносили 0,25% раствор трипсина, колбу помещали на магнитную мешалку и перемешивали ткань до полного ее истощения (рыхлая, белесоватая ткань) при температуре 37°С. После чего клетки отделяли от трипсина и разводили питательной средой вышеописанным способом.

Условия культивирования. При выращивании клеток фибробластов эмбрионов кур во вращающихся бутылях учитывали сроки формирования и качество монослоя в зависимости от концентрации клеток при засеве и способа их получения.

При формировании монослоя клетки, выращенные на поверхности бутылей, заражали вирусом. Перед заражением проводили смену ростовой среды на поддерживающую среду. Затем вносили вирус в необходимой дозе, в зависимости от условий опыта. В соответствии с условиями опытов учитывали накопление вируса в зависимости от возраста культуры, посевной концентрации клеток, продолжительности культивирования, дозы заражения, пассажного уровня вируса, состава питательной среды, вида сыворотки и температуры инкубирования.

Бутыли с зараженными культурами клеток помещали на вращающиеся аппараты, и вирус культивировали от 48 до 120 часов. Доза заражения зависела от целей опытов и обычно составляла 10000 ФОЕ/см3. Объем вносимой в сосуд вируссодержащей суспензии во всех опытах составлял 1 см3. Продолжительность

культивирования зависела от величины ЦПД вируса. Съем инфицированных клеток осуществляли, когда специфические цитопатические изменения были отчетливо выражены на 80-90% площади клеточных культур. Собранные клетки использовали для заражения свежих культур, или разрушали в стабилизирующей среде для освобождения ВГИ.

При серийном пассировании вируса инфицированные культуры клеток обрабатывали диспергирующим раствором, состоящим из 0,25% трипсина и 0,02% версена с добавлением 1% глюкозы с температурой 37°С в течение 1-3 минут, не допуская отслоения клеток от стекла. Затем удаляли раствор трипсина и для лучшей дезагрегации культур сосуды с клеточными культурами выдерживали в течение 7-10 минут при (37+1)°С на роллерном аппарате при скорости вращения 812 об/час, после чего инфицированные клетки разводили в бессывороточной кулмуральной среде. При необходимости подсчета концентрации инфицированных клеток или определения биологической активности вируса осадок разводили из расчета 20 см3 культуралыюй среды на сосуд.

Вирус промежуточных пассажей и экспериментальные расплодки вируса в виде суспензии инфицированных клеток подвергали криоконсервированию и хранили в жидком азоте. Криоконсервирование инфицированных клеток проводили в защитной среде, содержащей 10% диметилсульфоксида (ДМСО), 20% нативной эмбриональной сыворотки и 70% ростовой среды. Замораживание клеток проводили методом постепенного понижения температуры по следующей схеме: охлаждение при 4°С проводили в течение 15-20 минут (включая время запайки); выдерживали 30 минут в холодильной камере при минус 40°С, затем выдерживали 40 минут при минус 70°С. Затем ампулы немедленно погружали в жидкий азот.

Отделение клеток от стекла. При проведении исследований по отработке методики сбора клеток и выделения из них вируса 24-120 часовые инфицированные культуры клеток делили на равные части, в одной из которых клетки отделяли от стекла механически, в другой - с помощью диспергирующего раствора, состоящего из 0,25% трипсина и 0,02% версена с добавлением 1% глюкозы.

При механическом отделении клеток поддерживающую среду удаляли и вносили в бутыли 20 мл защитной среды СФГА. Специальным скребком с резиновым наконечником клетки соскабливали с поверхности бутылей и разводили в запцггной среде.

При отделении клеток ферментативным способом в бутыли, освобожденные от поддерживающей среды, вносили по 60-90 см3 диспергирующего раствора с температурой 37°С. Монослой смачивали диспергирующим раствором в течение 13 минут, затем его удаляли, а бутыли вращали со скоростью 8-12 об/час 7-10 минут при (37+1)°С. По истечении времени в бутыли вносили 70 см3 поддерживающей среды без сыворотки, энергичным встряхиванием отслаивали клетки от стекла. Клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. Клеточный осадок разводили в среде СФГА из расчета 20 см3 на бутыль.

Выделение вируса из клеток. Взвешенные в защитной среде клетки переносили в охлаждаемые льдом цилиндрические флаконы и разрушали с помощью ультразвука на ультразвуковом дезинтеграторе УСХ-б00. Ультразвуковую обработку клеточной суспензии проводили при частоте 20 кГц+50 Гц, колебательной мощности 600 Вт в течение 10-500 секунд с чередованием озвучивания и остановки каждые 10 секунд. Во время экспозиции температуру образца поддерживали в пределах 0°С путем помещения емкости с обрабатываемой суспензией в тающий лед. В зависимости от условий эксперимента обрабатывали суспензии объемами от 100 до 500 см3. В некоторых экспериментах исследовали зависимость освобождения вируса из инфицированных клеток в зависимости от их концентрации.

Хранение клеточно-ассоциированного и свободного от клеток вируса. Для определения влияния температуры на биологическую активность вируса сухие вируссодержащие образцы помещали на хранение при следующих температурных режимах: минус 4°С, минус 10°С, минус (40+2)°С, и (22+3)°С. Клеточно-ассоциированный вирус хранили в жидком азоте при температуре минус 196°С. Через определенные отрезки времени образцы, хранившиеся при различных температурных режимах, исследовали на инфекционную активность и

сравнивали с исходной активностью вируса. Условия и сроки хранения вируса определяли в зависимости от степени снижения титра.

Лиофилизация ВГИ. Лиофильное высушивание вируссодержащих материалов проводили на сублимационной установке "Юзифруа" (Франция) на участке сушки под руководством A.B. Борисова.

Ультразвуковые лизаты инфицированных клеток сразу же после приготовления замораживали при температуре минус (40+2)°С и сохраняли при этой температуре до высушивания.

Вируссодержащий материал, расфасованный по 2 см3 в пенициллиновые флаконы, выдерживали перед сушкой не выше минус 45°С в течение 18-20 часов, затем герметизировали и вакуумировали до остаточного давления не более 1,1 -1,3x105 Па и содержали материал в течение 4 часов без подогрева полок. По истечении 4-х часов включали нагрев полок и доводили температуру до минус (35 + 5)°С, поддерживая в течение последующих 28 часов температуру материала на уровне минус (30±2)°С. Температуру материала повышали до 0°С в течение 1012 часов, а от 0°С до (25+2)°С в течение 8-12 часов.

Длительность досушивания вакцины при температуре (25+2)°С 5 часов при давлении в камере не более 1,3х105 Па, после чего процесс сушки считали законченным.

Общая продолжительность сушки - в пределах 48 - 52 часов. Массовая доля влаги сухих образцов вируса была в пределах 1,5-2,5%.

Определение стабильности вируса при разведении. В качестве разбавителей для свободного от клеток вируса использовали защитную среду СФГА (контрольная среда), дистиллированную воду, полиэтиленгликолевый разбавитель, забуференный физиологический раствор и питательную среду Игла. Сухие образцы с известным титром разводили каждым из указанных разбавителей до концентрации 2000 ФОБ в 0,2 см3 (прививная доза) и выдерживали при различной температуре: 6°С, (22+3)°С и (38+2)°С. Вирус разведенных образцов титровали сразу и через 1-2 часа после разведения. Полученные результаты сравнивали с исходной активностью вируса, разведенного в среде СФГА.

Определение биологической активности. Определение накопления нативного клеточно-ассоциированного и внеклеточного вируса проводили путем титрования в культуре клеток КФ СПФ-эмбрионов кур.

Для титрования вирусов использовали суточную культуру клеток, выращенную во флаконах емкостью 50 см3. Перед титрованием из флаконов удаляли ростовую питательную среду и вносили поддерживающую. Вирусный материал разводили в десятикратном разведении от 10"1 до 10"4. Для разведения нативного вируса можно использовать любую питательную среду. На каждое разведение вируса использовали по 4 флакона с инокуляцией вируса путем внесения по 0,5 см3 соответствующего разведения. Через 48 часов культивирования поддерживающую среду во флаконах заменяли свежей. Через 120 часов после инокуляции вирусом клеточные культуры окрашивали амидовым черным по общепринятой методике и проводили учет фокусов цитопатического действия вируса.

При титровании свободного от клеток вхгруса для десятикратного разведения использовали среду СФГА. Из флаконов с монослоем удаляли ростовую среду и вносили по 0,1 см3 соответствующего разведения вируса. Вирус распределяли по поверхности монослоя, после чего флаконы переносили в термостат на 35-45 минут. Затем во флаконы вносили поддерживающую среду в объеме 7,0 см3, и флаконы вновь переносили в термостат. Через 24 часа инкубации проводили замену поддерживающей среды и продолжали инкубировать вирус в течение 120 ч. По окончании инкубации из флаконов удаляли поддерживающую среду и окрашивали аналогично вышеуказанным методом.

Титр вируса выражали в абсолютных фокусообразующих единицах (ФОЕ) в 1 см3, или в виде десятичных логарифмов числа ФОЕ в 1 см3 (^ФОЕ/ см3).

Определение иммуногенности вируса. Иммуногенность определяли на цыплятах, используя метод контрольного заражения, разработанный во ВНИВИП. Цыплят иммунизировали в суточном возрасте, а через 14 дней цыплят заражали вирулентным вирусом болезни Марека (штаммами Конкур и 1М). С этой целью цыплятам вводили вируссодержащий материал внутримышечно в объеме 0,2 см3. Учет результатов проводили при падеже цыплят в контрольной группе; для штамма «Ж» он составил 60%, а для штамма «Конкур»- 85%.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных данных проводили, используя пособия П.Ф. Рокитского "Биологическая статистика" и книгу Г.Ф. Лакина "Биометрия"'.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выбор системы культивирования

Целями исследований были выбор способа и условий ферментативного дезагрегирования тканей и сырья для изготовления культуры клеток, которая могла бы быть использована в качестве субстрата для культивирования вируса герпеса индеек.

С целью уменьшения риска эндогенного загрязнения тканевого материала для приготовления первичных культур часто пользуются тканями животных, выращенных в контролируемых условиях.

Изучали возможность использования СПФ-эмбрионов фирм Lohmann Tierzucht, Hy-Vac и SPAFAS для приготовления первичнотрипсинизированной культуры клеток. Сравнивали выходы клеток, полученных в результате дезагрегации, и накопление вируса герпеса индеек, выращенного на культуре из этих клеток. В опытах было установлено, что наибольший выход клеток с одного эмбриона был на СПФ-эмбрионах фирмы Hy-Vac - 157,5 млн/см3, несколько меньший на эмбрионах фирмы SPAFAS - 153,6 млн/см3. Продукция фирмы Lohmann Tierzucht показала наименьший выход клеток - 142,5 млн/см3. Кроме этого, полученные результаты позволили сделать вывод, что при одинаковых посевных концентрациях клеток величины урожая вируса в испытанных культурах клеток статистически не отличались.

Одним из существенных этапов при выращивании трипсинизированных клеток является подготовка ткани к дезагрегации. Обычно ткань, предназначенную для трипсинизации, измельчают ножницами. Однако в асептических условиях измельчить большую массу ткани очень трудно. Как показали наши исследования, при трипсинизации измельченной и неизмельченной ткани получены статистически недостоверные величины выходов клеток на один грамм ткани.

Целью следующих исследований было обоснование выбора метода трипсинизации. Сравнивали выход клеток с 1 г эмбриональной ткани и количество клеток, отделенных от стекла на вторые сутки, культивирования при одинаковой посевной концентрации. Культуру клеток получали, применяя два метода: дробную 4-цикловую трипсинизацию при (37+0,5)°С, время контакта с диспергирующим раствором - 3-5 минут, и одномоментную трипсинизацию (37+0,5)°С, с одним циклом контакта с диспергирующим раствором в течение 35+5 минут.

Опыты показали, что при данных условиях трипсинизации значения выходов клеток с 1 г эмбриональной ткани при дезагрегации ткани дробным методом были выше, чем при применении одномоментного метода. При этом достоверных различий в ростовых свойствах клеток, полученных обоими методами, не обнаружили. Было установлено, что в культурах клеток КФ, полученных как методом одномоментной, так и дробной трипсинизации вирус герпеса индеек накапливается в статистически тождественных величинах.

Таким образом, был сделан вывод, что для получения достаточного количества изолированных жизнеспособных, клеток следует использовать СПФ-эмбрионы фирмы Ну-Vac, а в качестве методики для дезагрегации ткани - дробную трипсинизацию.

Получение модифицированного штамма вируса герпеса индеек

Данный этап работы был посвящен исследованию возможности повышения и стабилизации выхода вируса и его иммуногенных свойств.

Известно, что стабилизация биологических свойств вируса герпеса индеек может быть достигнута путем перемежающегося пассирования штаммов in vitro и на естественно восприимчивых животных.

Вирус герпеса индеек штамм FC-126 ВГИ поступил во ВНИИЗЖ из Великобриташш без указания количества пассажей вируса в культуре клеток. Исходный материал в культуре клеток размножался с образованием ЦПД-фокусов округлой формы с "разорванными" краями, диаметром 2 мм и более. Биологическая активность составляла 5,0 1цФОЕ/см3. При пассировании штамма наблюдали нестабильность накопления вируса. Это свидетельствовало о снижении

его технологической ценности, в связи с чем, нами был испытан метод перемежающихся пассажей через организм СПФ-цыплят и культуру клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур. Для этого суточным СПФ-цыплятам ввели вирус герпеса индеек штамм РС-126 в дозе 10000 ФОЕ/0,2 см3.

В качестве источника вируса использовали о чины маховых перьев СПФ-цыплят. Перья брали от цыплят в период с 8 по 20 день после вакцинации. Ткань перьевых фолликул, подвергнутую ферментативному разобщению, вносили на монослой клеток, выращенный в 50 см3 флаконах - примерно 5000 эпителиальных клеток перьевых фолликул на флакон.

Через трое суток провели "слепой" пассаж, то есть клетками, снятыми с одного флакона без проявления характерного ЦПД, заразили 2 флакона с культурой (1:2).

На втором пассаже через 48 часов обнаружили первые очаги ЦПД вируса, которое характеризовалось появлением поликариоцитов по всему монослою.

Через 72 часа провели третий пассаж. Заражение проводили из расчета 1:5. Материалом третьего пассажа заражали СПФ-цыплят. Доза заражения составляла 10000 ФОЕ/0,2 см3.

Подобным образом были проведены три цикла перемежающихся пассажей через организм СПФ-цыплят и культуру клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур. В третьем цикле вирусная популяция изменилась по признаку формирования фокусов ЦПД (фокусы с ровными краями и средним диаметром 1,17+0,19 мм). Наблюдаемые изменения, очевидно, были генетически обусловлены. О чем свидетельствовали данные ПЦР, где полученный штамм имел нуклеотидные замены в фрагменте генома §В 966-1296Н С на Т в позиции 1038Н, А на в в позиции 1200Н, С на Т в позиции 1175Н.

В результате был получен модифицированный вариант вируса герпеса индеек, который был обозначен как штамм "ВНИИЗЖ". Дальнейшие исследования были посвящены сравнению иммунобиологических свойств исходного штамма и полученного варианта.

Сравнение биологических свойств исходного штамма и полученного варианта

Размножение вируса в культуре клеток является многофакторным процессом. Подбор оптимальных режимов культивирования, удовлетворяющих специфические потребности инфицированной культуры, имеет важное практическое значение.

Сравнивали особенности культивирования штаммов ЕС-126 и "ВНИИЗЖ". При этом обращали внимание на факторы, влияющие на формирование монослоя клеток КФ и накопление вируса.

Накопление вируса во вращающихся бутылях зависит в первую очередь от качества монослоя клеток и сроков его выращивания. В наших опытах при заражении культуры клеток вирусом штамма РС-126 на 24-48 час инкубирования, для штамма "ВНИИЗЖ" - 48-72 час, как правило, наблюдалось удовлетворительное размножение вируса (5,58 - 5,91 1§ФОЕ/см3). Внесение вируса в более поздние сроки культивирования не обеспечивало получения высоких титров вируса.

На срок формирования монослоя и накопление вируса влияет посевная доза клеток. Оптимальной посевной концентрацией клеток КФ при засеве является 1200+0,1 тыс/см3. Достоверных различий в величинах накопления вирусов обоих штаммов не обнаружили.

Накопление вируса зависит от дозы заражения. Определяли связь между дозой заражения вируса герпеса индеек двух штаммов, временем культивирования и урожаем вируса. Испытывали заражающие дозы 500, 1000, 10000 и 50000 ФОЕ/см3. Определяли сроки культивирования в интервале от 24 до 200 часов (до наступления ЦПД на 80% площади монослоя).

Было установлено, что указанная степень поражения монослоя обуславливала накопление вируса в тиграх от 5,50 до 6,09 ^ФОЕ/см3. При этом время ее развития зависело от величины заражающей дозы. Например, если при дозе вируса в 1000 ФОЕ до развития ЦПД в указанных масштабах было необходимо не менее 120 часов, то для дозы 10000 ФОЕ этот период ограничивался 72 часами. При этом просматривалась тенденция, что при всех испытанных дозах заражения штамм "ВНИИЗЖ" демонстрировал несколько большее накопление.

Сравнивали накопление штаммов РС-126 и "ВНИИЗЖ" ВГИ при непрерывном пассировании их в культуре клеток фибробластов куриных эмбрионов. Провели шесть непрерывных пассажей. Исходным материалом служила клеточно-ассоциированная вирусная суспензия с активностью 1,0х106 ФОЕ/см3. Доза заражения на первом пассаже составила 10000 ФОЕ/см3. Вирус культивировали в первом пассаже до появления ЦПД в 70-80% монослоя, а последующие пассажи проводили из расчета 1:100. Следует отметить, что степень накопления штамма "ВНИИЗЖ" была выше, чем штамма РС-126.

_Таким образом, проведенные исследования позволили считать штамм "ВНИИЗЖ" перспективным для производства вакцин против болезни Марека. Был сделан вывод, что в аспекте технологии для культивирования штамма "ВНИИЗЖ" оптимальными следует признать следующие условия: возраст культуры клеток при заражении - 24-48 часов, концентрацию клеток при посеве - 1200+0,1 тыс/см3, заражающую дозу в 10000 ФОЕ/см3.

Определение иммуногенных свойств исследуемых штаммов

Необходимо учитывать, что получение вируссодержащей суспензии с высокой биологической активностью не указывает на то, что из этой суспензии можно получить эффективный препарат, так как известно, что титр биологической активности не коррелирует с иммуногенностью препарата, полученного из этой суспензии.

Сравнивали иммуногенные свойства штаммов "ВНИИЗЖ" и ЕС-126 по эффективности действия через контрольное заражение вирулентным штаммом. Оценкой иммуногенного действия штамма считали показатель эффективности вакцинации (Э), который вычисляли по формуле: Э = [(А-В)/А]х100%, где Э -оценка эффективности в процентах; А - доля заболевшей и павшей от болезни Марека птицы в контрольной группе; В - доля заболевшей и павшей от болезни Марека птицы в вакцинированной группе.

Было установлено, что штамм "ВНИИЗЖ" демонстрировал большую эффективность вакцинации (96%), чем его родительский вариант (84,6%).

На штамм "ВНИИЗЖ" был составлен паспорт и проведено его депонирование во ВГНКИ под номером 110.

Изучение условий культивирования штамма "ВНИИЗЖ 110" ВГИ

Существенное влияние на качество культур клеток и накопление вирусов оказывают питательные среды и сыворотки крови. Для поддержания жизнеспособности клеток оказались пригодными различные среды, используемые для выращивания однослойных культур. В предварительных опытах питательные среды ГЛАЭ, Игла и 199 при условии добавления 10% сыворотки обеспечивали хорошее размножение клеток и накопление вируса, при этом наиболее удачной была среда 199. Однако среда 199 является одной из наиболее сложных по компонентному составу сред, что обуславливает ее высокую себестоимость и ограничивает возможности ее использования в производстве. В связи с этим задача данного этапа исследований состояла в изучении свойств смесей на основе среды 199. Нами были сравнены три состава среды: первый - смесь равных объемов сред Игла и 199; второй - смесь равных объемов сред ГЛАЭ и 199 и третий - смесь равных объемов сред Игла, ГЛАЭ и 199.

Полученные результаты позволили считать, что при данных условиях выращивания культуры клеток и вируса все испытанные среды оказались равноценными.

Для роста культуры клеток необходимо наличие сывороточного белка, который играет роль адгезивного фактора и выполняет трофическую функцию. Состав сыворотки зависит от возраста, пола, состояния здоровья, условий питания доноров, а также от особенностей ее приготовления и хранения.

В наших опытах были изучены ростовые свойства трех видов сыворотки крови: крупного рогатого скота (КРС), эмбриональной сыворотки крови и телячьей сыворотки крови. Опыты показали, что телячья сыворотка не удовлетворяла потребностям роста культуры (срок формирования монослоя - 4-5 суток; урожай клеток - 8,9+0,8 млн/см3). Наилучшие результаты получены при использовании эмбриональной сыворотки крови (срок формирования монослоя -2-3 суток, урожай клеток - 13,6+0,8 млн/см3). Кроме этого, было установлено, что в культурах клеток КФ, полученных как при использовании эмбриональной сыворотки крови, так и сыворотки крови КРС, вирус герпеса индеек накапливается в статистически равных величинах.

Однако сочли, что в технологическом аспекте целесообразнее использовать смесь, состоящую из равных объемов сред 199, ГЛАЭ и Игла, а в качестве добавки

- сыворотку крови КРС.

Получение клеточно-свободного вирусного материала

Освобождение вируса из клеток осуществляли по методике, разработанной Калнеком (Calnek B.W. et al., 1970 г.), который предложил для разрушения инфицированных клеток применять ультразвук, а в качестве стабилизатора вируса

- защитную среду СФГА.

Ультразвуковую обработку проводили на дезинтеграторе VCX-600 при частоте 20 кГц+50 Гц, колебательной мощности 600 Вт. В доступной нам литературе не содержится сведений о применении при изготовлении вакцины против болезни Марека дезинтеграторов подобного типа. Поэтому перед нами была поставлена задача определить оптимальные параметры разрушения клеток с целью освобождения вируса.

Процесс освобождения вируса из инфицированных клеток при помощи ультразвука требует определенного времени. Устанавливали продолжительность периода, необходимого для наиболее полного освобождения вируса, при озвучивании вируссодержащих суспензий объемами 100, 200, 300, 400 и 500 см3. Временной диапазон составлял от 50 до 500 секунд с шагом 50.

Было установлено, что освобождение вируса из инфицированных клеток зависит как от времени ультразвуковой обработки, так и от объема озвучиваемой вируссодержащей суспензии. Для суспензии объемом 100 см3 наибольший выход вируса наблюдали при обработке суспензии в течение 200 секунд. Для суспензий объемом 200 и 300 см3 - пик выхода вируса наблюдали при времени обработки 250 ceityHÄ. Для суспензии объемом 400 и 500 см3 максимум выхода вируса был во время 250-300 секунд. Дальнейшая ультразвуковая обработка не приводила к увеличению выхода вируса.

Поэтому в следующих исследованиях работали с объемом вируссодержащей суспензии 500 см3 и при продолжительности озвучивания - 300 секунд.

Далее определяли оптимальную концентрацию клеток в озвучиваемой суспензии, обеспечивающую высокий титр вируса. Для концентрирования

суспензии клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин. 20 минут, разводили небольшим объемом питательной среды и проводили подсчет клеток в камере Горяева. Затем разводили клеточную суспензию до необходимой концентрации. Сравнивали следующие концентрации клеток: 10, 20, 30 и 40 млн/см3. Время озвучивания - 300 секунд, объем вируссодержащей суспензии -300 см3. Согласно полученным данным установлено, что при данных условиях ультразвуковой дезинтеграции инфицированных клеток наибольший выход вируса наблюдался при концентрации вируссодержащих клеток от 10 до 20 млн/см3, однако при концентрации клеток более 20 млн/см3 увеличение выхода вируса не наблюдали.

Таким образом, сделали вывод, что увеличивать концентрацию озвучиваемых клеток более 20 млн/см3 нецелесообразно.

Хранение материала до и после ультразвуковой обработки с использованием защитных сред

В процессе массового изготовления лиофшшзированной вакцины против болезни Марека на различных стадиях технологического процесса возникает необходимость в хранении вируссодержащей суспензии, а также готового продукта.

Определяли оптимальную температуру хранения нативных образцов свободного от клеток материала при различных температурах (4°С, минус 15°С, минус 40°С). Срок хранения составлял один год (время наблюдения).

Во всех пробах до начала хранения определяли титр биологической активности методом титрования в культуре клеток, а затем в этих же пробах определяли титр биологической активности через 3, 6 и 12 месяцев хранения. В опытах было установлено, что биологическая активность образцов, содержащихся при температуре минус 40°С, на снижалась в течении всего срока наблюдения. При других температурных режимах полная сохранность вируса не обеспечивалась.

Лиофилизированные экспериментальные серии препарата исследовали на стабильность биологической активности в процессе хранения в течение одного

года (срок наблюдения) при различных температурах: (22+3)°С, (4+2)°С, минус (15+2)°С и минус 40°С.

При этом установлено, что внеклеточный вирус штамма «ВНИИЗЖ», лиофилизированный в защитной среде СФГА,* сохранял исходную активность при температуре минус 40°С в течение одного года. Однако необходимо отметить, что лиофилизированный препарат, не снижая своей активности, может храниться при температуре (4+2)°С (условия бытового холодильника) в течение 3 месяцев.

Подбор разбавителя для сухого препарата

Исследовали стабильность лиофилизированных образцов при разведении в различных разбавителях. Сухие образцы с известным титром разводили каждым из разбавителей до первоначального объема (2 см3) и выдерживали при различной температуре: (4+2)°С, (22+3)°С и (37+1)°С. Вирус хранили в течение двух часов после разведения (срок наблюдения). До и после хранения определяли биологическую активность методом титрования в культуре клеток.

Было установлено, что разведение экспериментальных серий сухих вакцин в физиологическом растворе, среде Игла и полготиленгликолевом разбавителе приводило к быстрой инактивации вируса. Лучшие результаты получены при разведении вакцины средой СФГА (сохранность вируса при температуре (4+2)°С -100%, при (22±3)°С - 88,9%, при (37+1)°С - 81,9%). Согласно нашим экспериментам разведение вакцины дистиллированной водой также обеспечивало хорошую сохранность вируса: при (4+2)°С - 93,2%, при (22+3)°С - 82,9%, при (37±1)°С-75,7%.

Изучение иммуногенных свойств экспериментальных образцов вакцины

Перед нами была поставлена задача изучить иммуногенное действие экспериментальных серий лиофилизированного препарата с определением иммунизирующих доз. Испытывали следующие дозы: 500, 1000 и 2000 ФОЕ/О,2см3. Опыт проводили на бройлерных цыплятах кросса "Смена".

Для этого были сформированы 5 групп суточных бройлерных по 50 голов каждая:

- первая группа - контроль опыта;

- вторая группа - контроль вирулентного вируса;

- третья группа - вакцинирована вирусом штамма ВНИИЗЖ в дозе 500

ФОБ;

- четвертая группа - вакцинирована вирусом штамма ВНИИЗЖ в дозе 1000 ФОЕ;

- пятая группа - вакцинирована вирусом штамма ВНИИЗЖ в дозе 2000

ФОЕ;

Через 14 дней после вакцинации цыплята групп 2, 3 и 4 были подвергнуты контрольному заражению вирулентным штаммом "Конкур" вируса БМ.

Продолжительность опыта зависела от падежа 85% голов контрольной группы, что составило 150 дней. На протяжении всего опыта за птицей вели клиническое наблюдение. Весь падеж вскрывали и учитывали патологические изменения внутренних органов.

Эффективность вакцинации определяли после убоя опытной птицы с учетом патологоанатомических изменений, как при вскрытии, так и данных вскрытия павшей в процессе опыта птицы.

Результирующей оценкой иммуногенного действия штамма считали показатель эффективности вакцинации (Э), который вычисляли по формуле: Э = [(А-В)/А]х100%, где Э - оценка эффективности в процентах; А - доля заболевшей и павшей от болезни Марека птицы в контрольной группе; В - доля заболевшей и павшей от болезни Марека птицы в вакцинированной группе.

Было установлено, что лиофилизированный лабораторный образец в дозе 500 ФОЕ на цыпленка защищал птицу на 87%; эффект вакцинации в группах, привитых лиофилизированными экспериментальными образцами в дозах 1000 и 2000 ФОЕ на цыпленка, составил 90%.

Полевые испытания лиофилизированных образцов проводили на бройлерных цыплятах в условиях птицефабрики "Васильевская" Пензенской области и на базе птицефабрики "Дружба" Брестской области республики Беларусь. На птицефабрике "Васильевская" было сформировано две группы: первая группа в количестве 42220 голов была контрольной, т.е. невакцинированной; вторая группа в количестве 78606 голов была

иммунизирована экспериментальным образцом вирусвакцины. На базе птицефабрики «Дружба» контрольная группа включала в себя 20240 голов, а опытная группа - 20320 голов. В течение всего опыта вели наблюдение за птицей, падеж вскрывали и учитывали патологоанатомические изменения. Сравнивали показатели сохранности птицы (доля выращенной птицы по отношению к поголовью, принятому на выращивание) и среднесдаточного веса.

В результате испытаний было установлено, что применение лиофилизированных образцов препарата на базе птицефабрики "Васильевская" увеличило сохранность птицы на 5,5% и повысило среднесдаточный вес на 30 грамм, в то время как в условиях птицефабрики "Дружба" в результате применения вакцины сохранность птицы увеличилась на 3,4%, среднесдаточный вес увеличился на 64 грамма.

Таким образом, проведенные нами исследования по усовершенствованию технологии получения сухой вирусвакцины против болезни Марека указали на высокую иммуногенную активность, защищающую цыплят от заболевания этой инфекцией и не дающей осложнений при вакцинации. Экспериментальные материалы вошли в нормативно-технические документы по производству этой вакцины. Разработанная сухая вирусвакцина против болезни Марека широко применяется в птицеводческих хозяйствах России.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована технология получения сухой вирусвакцины против болезни Марека на основе штамма «ВНИИЗЖ 110» вируса герпеса индеек, культивируемого в монослойной культуре клеток куриных фибробластов, с последующей лиофилизацией.

2. Путем перемежающихся пассажей через организм суточных СПФ-цыплят и культуру клеток куриных фибробластов получен производственный штамм вируса герпеса индеек (штамм «ВНИИЗЖ 110»), пригодный для производства сухой вирусвакцины против болезни Марека.

3. Экспериментально доказано, что производственный штамм «ВНИИЗЖ 110» вируса герпеса индеек, полученный из штамма РС-126, более иммуногенен по сравнению с исходным штаммом.

4. Установлено, что для получения качественных монослойных культур клеток метод дробной трипсинизации обеспечивает высокий выход клеток, при котором

получается на 12,3% клеток больше, чем при применении одномоментного метода трипсинизации.

5. Установлено, что для обеспечения высокого урожая штамма «ВНИИЗЖ 110» вируса герпеса индеек необходимо в поддерживающую среду, состоящую из равных объемов сред 199, Игла и ГЛАЭ, добавлять 2% сыворотки крови КРС и культивирование вести в течение 48 часов при заражающей дозе 104 ФОЕ/см3.

6. Определено, что для получения высококачественного свободного от клеток вируса герпеса индеек штамма «ВНИИЗЖ 110» необходимо отделять инфицированные клетки от стекла при помощи диспергирующего раствора, состоящего из 0,25% трипсина и 0,02% версена с добавлением 1% глюкозы с последующей обработкой ультразвуком не более 300 секунд. При этом количество клеток в суспензии не должно быть более 20 млн/см3.

7. Установлено, что сухая вирусвакцины против болезни Марека из штамма ВНИИЗЖ 110» перед употреблением должна бьггь разбавлена до первоначального объема раствором СФГА или дистиллированной водой. При этом при температуре (4+2)°С активность препарата не снижается в течение двух часов.

8. Установлено, что лабораторные образцы сухой вирусвакцины, полученные по усовершенствованной технологии, не снижают биологическую активность в процессе хранения при температуре (4+2)°С в течение трех месяцев, а при температуре минус 40°С - один год (срок наблюдения).

9. Изготовленные, по усовершенствованной технологии лабораторные образцы сухой вирусвакцины против БМ из пггамма «ВНИИЗЖ 110» при лабораторных и производственных испытаниях оказались иммуногенными. Эффективность вакцинации в лабораторных и производственных условиях была приблизительно одинакова.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Полученные экспериментальные материалы по приготовлению культуры клеток, культивированию ВГИ и разрушению инфицированных клеток вошли в нормативно-технические документы по производству сухой, вирусвакцины против болезни Марека из штамма "ВНИИЗЖ 110", которые рассмотрены, одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ, а также рассмотрены с положительным решением Ветфармбиосоветом:

- инструкция по изготовлению и контролю вирусвакцины против болезни Марека сухой культуральной;

- технические условия на вирусвакцину против болезни Марека сухую культуральную;

- наставление по применению вирусвакцины против болезни Марека сухой культур альной.

На основании материалов получен патент на сухую вирусвакцину против болезни Марека и способ ее изготовления (патент№2144376, 1999г.).

На основании проведенных исследований подготовлены, апробированы и утверждены директором ВНИИЗЖ следующие методические рекомендации, -которые предложены для практического применения:

- методические рекомендации по приготовлению свободного от клеток вируса болезни Марека;

- методические рекомендации по приготовлению клеточно-ассоциированного вируса болезни Марека;

- методические рекомендации по определению биологической активности клеточно-ассоциированного и свободного от клеток вируса болезни Марека;

i

- методические рекомендации по приготовлению питательных сред

и растворов применяемых для получения первичных клеток куриных фибробластов и культивирования вакцинных штаммов вируса болезни Марека.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куляшбекова Ш.К., Мельников В.П., Старов С.К., Бурдейная Л.В., Камалова Н.Е., Сарбасов А.Б. Изучение взаимодействия вируса болезни Марека и реовируса in vivo // Актуальные проблемы патол. с.-х. животных: Матер, междунар. науч. -практич. конф. - Минск, 2000.- С. 129-131.

2. Куляшбекова Ш.К., Гусев A.A., Мельников В.П. Получение свободного от клеток вируса герпеса индеек // Совр. аспекты патол. животных. - Владимир, 1999,- С. 85-90.

3. Куляшбекова Ш.К., Гусев A.A., Шажко Ж.А., Андреев В.Г., Мельников В.П. Способ повышения биологической активности и иммуногенных свойств

- производственного штамма FC-126 вируса герпеса индеек // Совр. аспекты вет.

татол. животных: Матер, конф., посвящен. 40-летию ВНИИЗЖ.- Владимир, 1998. ■ С. 146-152.

Куляшбекова Ш.К., Гусев A.A., Гусева Е.В., Баррос-Палома Е.В., Борисов A.B., Смоленский В.И., Мельников В.П. Сухая вирусвакцина против болезни Марека и ;пособ ее изготовления. А. с. 2144376 России.- 28.06.1999.

5. Мельников В.П., Куляшбекова Ш.К. Изучение свойств вируса герпеса индеек юсле длительного хранения в жидком азоте // Экологич. аспекты эпизоотол. и татологии животных: Междунар. науч.-произв. конф. - Воронеж, 1999,-С. 117-119.

5. Мельников В.П., Куляшбекова Ш.К. Культивирование вируса герпеса индеек на })ибробластах куриных-эмбрионов, используя различные питательные среды // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику: Матер, конф,- Владимир, 2000. (в печати).

Отпечатано на полиграфической базе отдела координации научных [сследований, информации и международных связей ВНИИЗЖ Тираж 80 экз., ноябрь 2000 г.