Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка ассоциированной вирусовакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской болезни птиц

На правах рукописи

УДК 619:610.371/372:636.52/56

РАЗРАБОТКА АССОЦИИРОВАННОМ ВИРУСВАКЦИШ ПРОТИВ ИШЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАЖИТА И НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ .

16.СО.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

' 1

X! /

'6 у --■■...

/ Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Покров - 1956

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательЬко> институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук КУШНИР А.Т

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор 'ХРИПУНОВ Е.М.

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук ДЫШН Л.А. (ВНЖЗВиЮ,

- кандидат ветеринарных наук ГОРЕВА И.П. (ВГНКИ).

Ведущее учревдение - ВШИ защиты животных.

диссертационного совета Д-120.61.01 во Всероссийском научно-ие довательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологи по адресу: 601120, г.Покров, Владимирской области, ВШИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ.

30

Защита состоится I марта 1996 г. в II

часов на засе

Автореферат разослан 1

января 1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Г.П.аЯ

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Специфическая профилактика вирусных болезней занимает значительное место в условиях современного ведения птицеводства.

3 целях обеспечения ветеринарного благополучия птицеводческих хозяйств возникает необходимость профилактических прививок против двух, трех и более болезней. В этих условиях недостаточно обоснованные.последовательность введения антигенов и интервалы между ними ведут к перегрузке иммунной системы птиц и не всегда обеспечивавт надежную защиту птицепоголовья от инфекционных болезней, так как часто происходит несоответствие сроков формирования защиты и начала заболевания.

С цель» сокращения графика прививок и снижения стрессового воздействия на птиц практикуется объединение вакцинных вирусов перед применением, но в этом случае необходимо проводить расчеты по калдому из них для определения соответствующих рабочих разведений и достижения сбалансированности доз (К.Г.Аспанидзе, 1971; Ю.С.Дутко, 1977; Н.А.Изотова и соавт., 1988; Р.А.Кадимов, В.В.Сафаров, 1974; А.В.Качахидзе, 1965; А.Т.Нушнир, 1995; Р.Чо-лакова, 1985; ИШег^еЫ , 1984).

В производстве ассоциированных вакцин практикуется смешивание двух и более вирусов перед лиофилизацией (А.А.Шевченко,1995), но такая технология изготовления не снимает вопроса экономичного ■• использования биологических систем для культивирования вирусов.

Не вызывает сомнения целесообразность использования ассоциированных препаратов, применение которых сокращает количество прививок, уменьшает расход материалов и затраты труда, снижает потери живой массы от стресс-факторов, связанных с иммунизацией (В.П.Ршсенко, 1983).

> 2

Таким образом, разработка массовой иммунизации птиц ассо: ированными вакцинами в сложной эпизоотической обстановке весы актуальна.

Птицу поражают многие инфекционные болезни, среди которы наиболее опасными являются ньакаслская болезнь (НБ) и инфекци ный ларинготрахеит (ИЛТ), которые могут привести к гибели все поголовья.

Для специфической профилактики указанных болезней примек эмбриональные моновакцины, производство которых влечет сущест ные экономические затраты из-за использования куриных эмбрион энергоемких технологических процессов, расхода сопутствующих териалов для культивирования каждого вируса в отдельности и т

3 большинстве птицеводческих хозяйств проводится специйи кая профилактика ИТ и НБ птиц. В связи с этим большое значен придается применению ассоциированной вакцины, преимущество ко рой заключается в создании иммунитета сразу к двум болезням о временно при экономии времени и трудозатрат.

Кроме этого, использование единой биологической системы льтизирования двух вирусов для получения ассоциированной вакц против указанных болезней считаем актуальным и экономически о равданным.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явл лась разработка ассоциированной вирусвакцины против инфекцион го ларинготрахеита и ньвкаслской болезни птиц.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать режим совместного культивирования вирусов ИЛТ и НБ птиц в одном курином эмбрионе.

(

2. Оценить иммунобиологические свойства экспериментальны образцов сухой ассоциированной вирусвакцины против ИЛТ и НБ п

3. Определить иммунологическую эффективность вирусов И1Т и НБ в составе ассоциированной вирусвакцины при различных методах применения. -------------

if. Разработать нормативно-техническую документацию на ассоциированную вирусвакцину против ИЛТ и НБ птиц.

5. Провести комиссионные испытания ассоциированной вирус-вакцины против ИЛТ и НБ птиц в институте и на птицефабриках.

Научная новизна. Впервые разработан способ совместного культивирования вакцинных вирусов ИЛТ и НБ с заданным уровнем биологической активности обоих вирусов, обеспечивающий получение ассоциированных вакцин, предназначенных для аэрозольного, интра-назального и орального применения.

Получена ассоциированная вирусвакцина против ИЛТ и НБ птиц для аэрозольного метода применения. Определены минимальные и оптимальные иммунизирующие дозы вирусов ИЛТ и НБ птиц при аэрозольном применении ассоциированной вирусвакцины.

Получена ассоциированная вирусвакцина против ИЛТ и НБ птиц для иктраназального и орального методов применения. Определены минимальные и оптимальные иммунизирующие дозы для указанных методов применения.

Ассоциированные вакцины стерильны, безвредны, ареактогенны и обладают высокой иммуногенной активностью.

Новизна полученных результатов подтверждена положительным решением ВНИИГОЗ на выдачу патента по заявке S 93007931 "Chocod получения ассоциированной вирусвакцины против инфекционного ла-ринготрахеита и ныжаслской болезни птиц".

Практическая значимость. В результате: выполненных исследо- -ваний разработаны ассоциированные вакцины против ИЛТ и НБ птиц для различных методов применения, которые могут успешно применяться в хозяйствах о различным направлением продуктивности птиц.

Вакцина получена в результате совместного культивирования вир; сов ИЛТ и НБ птиц в одном курином эмбрионе, что экономит количество трудовых и материальных затрат по сравнению с изготовж нием моновакцин. Использование ассоциированной вакцина в условиях производства обеспечивает формирование: напряженного имму] •гета сразу против двух болезней, дает возможность сократить ч: ло профилактических прививок и, тем самым, значительно снизит: уровень неблагоприятного стрессового воздействия на организм птиц, которое ведет к снижению мясной и яичной продуктивности

Ассоциированные вакцины прошли межведомственные комиссио ные испытания в птицехозяйотвах Московской области.

Основные положения диссертационной работа, выдвигаемые н заииту;

1. Эпизоотологическое обоснование, целесообразности созда и применения ассоциированной вируовахцины против ШТ и НБ пти в современных условиях.

2. Технология изготовления ассоциированной вакцины проти ИЛТ и НБ птиц, основанная на культивировании указанных вирусо: в одном курином эмбрионе.

3. Иммунологическая эффективность ассоциированной вакцин против ИЛТ и НБ птиц при различных методах применения.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на науч конференции ВНИИВВиМ (г.Покров, 1992); заседаниях Государстве кой межведомственной комиооии по испытанно ветеринарных биоло ческих препаратов в Российской Федерации; заседаниях ученого вета ВНИИВВиМ (1990-1994).'

При демонстрации в 1994 году во Всероссийском Выотазочно Центре ассоциированная вирусвакцина против ИЛТ и НБ птиц заня.

, I место, а её автора награждены золотой медалью. '

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных р

бот; получено положительное решение на патент; утверждены Департаментом ветеринарии РФ' 2 нормативно-технических документа по контролю и применений ассоциированной вакцины против ИЛТ .и НБ птиц; утверждена директором ВНИИВВиМ инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины.

Внедрение. Успешно проведены межведомственные комиссионные испытания вирусвакцины против ИЛТ и НБ птиц ассоциированной сухой (приказ Департамента ветеринарии РФ )Ь 26 от 10.08.94 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 15Ц страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений, содержит 31 таблицу, 3 рисунка. Список использованной литературы включает 323 источника, из них 208 отечественных и 115 зарубежных. Диссертация дополне--

г

на 12 приложениями, подтверждающими научную и практическую значимость отдельных этапов работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Вакцинные вирусы:

- ИЛТ, штамм "ЦНИИПП", клон "НТ", получен в лаборатории ВНИИВВиМ в 1978 году путем клонирования методом предельных разведений и последующего пассирования на хориоаллантоисной оболочке. куриного эмбриона при температуре. 34°С. Биологическая активность в нативном оостоянии 7,0 - 7,7 1« ЗИД^д^;

- НБ, штаммы "Ла-Сота" и "Бор-74 ВГНКИ", получены из ВГНКИ ветпрепаратов с биологической активностью оба 9,25 ЗИД^д^.

Вакцины:

- эмбрион-вирусвакцина против ИЛТ птиц из клона "НТ* штамма "ЦНИИЛП", изготовленная во ВНИИВВиМ о биологической активности»

7,0 - 7,4 lg ЗИД50/скЗ;

- вирусвакцина сухая против НБ птиц из штамма "Ла-Сота", изготовленная во ВНИИВВиМ, с биологической активностью 8,5 -

• ^ 3%0/см3;

- экспериментальные серии вирусвакцины против ИЛТ и НБ п

ассоциированной сухой, изготовленные во ВНИИВВиМ, с биологиче кой активностью по вирусу ИЛТ 7,0 - 1,4 lg ЭИД^^цЗ, по виру • НБ для аэрозольного применения 7,2 - 7,7 1еЭИД50/смЗ, а для других методов применения 9,25 lg ЗИД^д,,^.

Эпизоотические штаммы:

- штамм "Богатицевский" вируса ИЛТ птиц с инфекционной а тивностью 4,0 - 4,6 lg'%o/c'P' получен 113 проблемной лабора тории вирусологии Московской ветеринарной академии в 1972 год

- штамм "Т-53" вируса НБ с инфекционной активностью 7,51 ^50/0 2 см3, ПолУчен из ВГНКИ ветпрепаратов 15.06.87 г.

Для культивирования вируса ИЛТ использовали первично-три синизированные культуры клеток почки. 19-дневного КЗ, печени I дневного КЗ, куриных фибробластов. Из перевиваемых культур кл ток использовали культуры клеток почки сайги (ПС), почки эмбр на лося (ПЭЛ), почки, эмбриона котенка (Яз ), почки сибирского горного козерога (ПСПО, почки эмбриона свиньи (СПЗВ), почки : нисвиньи (IICiM), почки свиньи (ПКПС), почки поросенка (PK-I5). Первично-трипсинизированные культуры клеток готовили самостоя но, а перевиваемые культуры клеток получали в лаборатории "Ку, туры клеток с музеем клеточных штаммов" ВНИИВВиМ.

Питательные среды - ИГЛА МЭМ, гидролиза? лактальбумина н растворе Хенкса. Бактериологические среды - мясо-пептонный аг, (MIA), мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный печеночный i льон (ШПБ) под вазелиновым маслом, агар и бульон Сабуро, оре, Эдварда.

Физиологический раствор, 0,25^-ный раствор трипсина, 1^-ний раствор трипановой сини, йодированный спирт, дистиллированная вода. " "" ~

■ Стабилизатор пептонно-лактозный фосфатный (СП1Ф).

Аппаратура и оборудование:

- прямоструйный эжекторный генератор аарозолей ПЭГА-1;

- струйный аэрозольный генератор САГ—X;

- 'аэрозольная камера БОС-Ю объемом 1,05 м^;

- производственные помещения птицеводческих хозяйств объемом от 5,4 до 10 тыс. н^;

- аспиратор Мигунова о КПК-1;

- флуориметр;

- установка для лиофильной сушки.

Животные:

I

- куриные эмбрионы 7-10-дневного возраста;

- цыплята и куры яичных и мясник пород в возрасте 12-100

дней;

- петух породы Леггорн, неимиунный к НБ.

При культивировании вируса ИЛТ на первично-трипсинизирован-ных или перевиваемых культурах клеток в первом пассаже вирусный материал вносили в разведении 1:10, предварительно слив из матрасов старую ростовую среду.

В течение 24-144 ч после заражения культур клеток вели наблюдение за состоянием монослоя, формой клеток, образованием просветов и рН среды. Через 120-144 ч после заражения культур вирус-с о держащую суспензия и клетки подвергали замораживании и оттаиванию с целью увеличения выхода вируса из клеток.

При проведении последующих пассажей чаоть культурадьной суспензии о вирусным материалом центрифугировали 15 мкн при частоте 2500 об/мин и с полученным надосадком на поддерживающей среде

готовили разведение. 1:10 и вносили его на новые культуры клето

При оценке, культуральных виру с содержащих материалов и изг товлении вакцин биологическую активность производственных и эп зоотических штаммов определяли титрованием на КЗ с использован ем общепринятого метода, описанного в методических указаниях п применению аэрозолей вакцин для иммунизации птицы против НБ, а также используя методические указания ^ 044-3 по определению б ологической активности вирусвакцины против И ИТ птиц из клона "НТ" штамма "ЦНИИПП".

При разработке ассоциированной вакцины определяли иммункз рующую дозу вирусов ИЛТ и НБ, последовательность заражения ими КЗ, продолжительность и реяим инкубации КЗ.

Приготовленные серии вакцины проверяли на контаминацию бе териальной и грибной микрофлорой по ГОСТ 28085-89. Массовую дс влаги у лиофилизированнах серий ассоциированных вакцин определ ли по ГОСТ 24061-89. Безвредность и остаточную вирулентность е тигенов выявляли в опытах на 25-30-дневных цыплятах, неиммуннь к ИЛТ и НБ, путем внутримышечного введения препарата в объеме 1,0 см3 .(на НБ) и интратрахеального введения препарата в объе\ 0,5 см3 (на ИЛТ).

Растворимость лиофилизированной вакцины определяли раствс рением содержимого флакона при добавлении физиологического ра« вора до исходного объема вируса, затем флакон встряхивали в т« чение 2-3 минут.

Аэрозольную иммунизацию птиц в лабораторных условиях проз дили в статической камере, вакцину распыляли генераторами аэр< золей ПЭГА-1 из расчета I оМ объема камеры. Экспозиция и» низации составляла 20 минут. Для определения концентрации про< аэрозоля отбирали пробоотборником КПК-1 в течение 5 минут с о< емной скоростью 5 л/мин. Концентрацию аэрозолей вакцины опред(

(

ляли общепринятым флуориметрическим методом.

В производственных условиях ассоциированную вакцину распнля-- ли-генераторами аэрозолей САГ-1 или САГ-10 в помещениях, где одновременно размещалось от 35 до 62 тыс. голов птиц, руководствуясь методическими рекомендациями по аэрозольной иммунизации птиц.

При интраназальном методе, иммунизации готовили разведение вакцины 1:50, реоуспендируя содержимое- одной ампулы или флакона соответственно в 2С0 или 2С0 см"^ Физиологического растзора и вводили по 2 капли (0,2 см^/голозу) в каждое носовое отверстие.

Оральную иммунизацию цыплят проводили методом выпаивания с водой. С этой целью ассоциированную вакцину разводили 1:20, ре-суспендируя содержимое ампулы в 80 см"5, а Флакона - в 120 см^ кипяченой воды и выпакзали один раз в сутки два дня подряд из расчета 5 с:Р на одного цыпленка яйценоских пород до 25-дневного возраста и 10 а? на одного цыпленка мясных пород и взрослую птицу независимо от направления продуктивности.

Иммунологическую эффективность ассоциированной вакцины оценивали по величине минимальной иммунизирующей дозы, сроку наступления и продолжительности иммунитета, уровню накопления вирус-нейтрализующих и гемагглютинируящих антител, а также по устойчивости цыплят к контрольному заражению.

Минимальную иммунизирующую дозу (МИД) вычисляли по методу Спирнена-Кербера.

Для определения срока наступления и продолжительности иммунитета группу цыплят прививали аэрозольным или'другим методом оптимальной иммунизирующей дозой. Через различные сроки после однократной вакцинации (б, 10, 18, 30, 90, 180 и 2ВД дней) у цыплят брали кровь для серологических исследований и. не менее чем по 10-12 голов на каядыЯ изучаемый срок подвергали контрольному заражению штаммом "Богатищевский" в дозе 1000 ИД50/0 5 см3 интра-

трахеально и штаммом "Т-53" в дозе 10000 ЛД50/омЗ внутримышеч1

Титр гемагглютиниругащих антител у цыплят после прививки < ределяли в реакции задержки гемагглютинации (РЗГА) по методик! изложенной в методических указаниях по применению аэрозолей вг цин для иммунизации птиц против НБ.

Для определения вируснейтрализующих антител в крови приз! тых цыплят ставили реакцию нейтрализации (РН) на IO-дневных К используя постоянное количество сыворотки и прогрессивно нара< тающие 10-кратные разведения вирус-антигена по методике", опис! ной в стандарте СЭВ 1743-79 "Методы лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц".

Контрольное заражение цыплят проводили через 18 дней пос; одно- или двукратной вакцинации эпизоотическими штаммами зиру< ИЛТ и НБ в вышеуказанных дозах.

Реактогенность ассоциированной вакцины оценивали в течеш 10 суток после однократной иммунизации 25-30-дневных цыплят ш наличию поствакцинальных осложнений.

Длительность хранения ассоциированной вакцины изучали че] I, 3, б, 9 и 12 месяцев после изготовления при хранении вакцш в сухом месте при температуре 4-6°С и минус 45°С.

Статистическую обработку полученных результатов проводил] по общепринятой методике (И.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, 1962).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка способа совместного культивирования вирусов ИЛТ и НБ птиц

С целью снижения материальных затрат на получение вируснс сырья нами проведены исследования по адаптации вируса ИЛТ, клс "НТ", к первично-трипсинизированным и перевиваемым культурам ( ток. Из первично-трипсинизированных использованы культуры клет куриных фибробластов, печени 12-14-дневного КЗ и почки 19-дне:

КЗ. Методика получения последней нами усовершенствована.

Наиболее обнадеживающие результаты получены при культивиро-" в антивируса"ИЛТ на культуре почки 19-дневного КЗ,' в которой вирус сохранялся вплоть до 4-го пассажа. При аэрозольной вакцинации цыплят вируссодержацим материалом 1-го пассада с титром 5,95 lg ЭИД50/с}р иммунитет вырабатывался у 25-40;' привитых. При культивировании вируса ИЛТ в других первично-трипсинизированных культурах вирус после 3-го пассажа не обнаруживали.

При исследованиях по адаптации вируса ИЛТ к перевиваемым культурам клеток установлено, что в культурах свиного происхождения (ПКПС, PK-I5, СП2Б, ПСМ) вирус ИЛТ сохранялся до 2-3-х пассажей, а в культурах ПЗЛ, Fe , ПС, ПСГК не обнаруживался уже после первого пассажа.

В дальнейшей работе наше внимание было уделено совместному культивирозанив вирусов ИЛТ и НБ в развивающихся КЗ.

Известно, что оптимальными условиями для накопления вируса ИЛТ, клон "ИГ", в КЗ являются: инкубация зараженных в дозе 5-10 тыс. ЗИДздд, 2 см3 КЗ в течение II0-I20 ч при температура 34°С; для накопления вируса НБ - инкубация зараженных в дозе IOOOO ЭИДздд) £ си3 КЗ в течение 72-90 ч при температуре 37°С. Эти условия культивирования вирусов используются для наработки высокоактивного вируссодержащего сырья при производстве моновакцин.

При изготовлении ассоциированной вакцины против ИЛТ и НБ птиц нами испытано несколько режимов совместного культивирования и влияние различных заражающих доз на репродукцию вирусов в КЗ.

Нами показано, что в наивысшем титре (до 7,7 lg ЗЦздд,^) клон "НТ" накапливается при заражении КЗ в дозе 5000-10000 ЭИД 50/0,2 й\? и инкубации при температуре 34°С в течение 120 часов. # Дальнейшее повышение заражающей дозы вируса или увеличение сроков инкубации нецелесообразно, так как происходит гибель КЗ до 60-100#;

При различных заражающих дозах вируса НБ, штамм "Ла-Сотаи в наибольшем титре накапливается в КЗ, инкубируемых при 37°С.

При одновременном заражении КЗ вирусом НБ в дозе 316 ЗИД/< и различными дозами вируса ИЛТ от IOO до 100000 ЗИД^ и их совместном культивировании оказалось, что нет какого-либо заметно: интерферирующего или экзальтирующего действия на репродукцию в: руса ИЛТ со стороны вируса НБ по сравнению с монокультивирован

При одновременном заражении КЗ вирусом ИЛТ в дозе 8000 ЗИ, 50/0,2 см^ и различными дозами вируса НБ от 3,16 до 3160 ЭИД 50/0,1 см^ также не отмечено какого-либо подавляющего или усил ваюцего действия на репродукцию вируса НБ со стороны вируса ИЛ1 по сравнению с накоплением данных вирусов при монокультивирова

Максимальное накопление вируса НБ, штамм "Ла-Сота", при о, Наковых дозах заражения происходит при температуре 37°С. При з ражающей дозе вируса НБ в пределах 100-400 ЭИД50/0 х 01р. итам "Ла-Сота" при инкубации КЗ в течение 120 ч при температуре 37° накапливался до 9,3 lg ЭИДздд^.

В дальнейшем нами испытана возможность и эффективность со: местного выращивания вирусов ИЛТ и НБ птиц при последовательно заражении КЗ указанными вирусами, с тем, чтобы получить вирусс держащий материал для ассоциированной вакцины, предназначенной для аэрозольного метода применения.

В данном случае вирус ИЛТ должен иметь биологическую акти ность в пределах 7,0 - 7,7lg ЭИД50/омЗ, а вирус НБ - в предел 7,2 - 8,0 lg ЗИД50/омЗ.

Используя полученные результаты мы выбрали оптимальную за жающую дозу вируса И1Т, ороки и режим инкубации КЗ, описанные ранее.

Заражение КЗ вирусом НБ проводили в разных дозах через 48 72 и 96 часов с момента заражения КЗ вирусом ИЛТ и. инкубирован

вначале при температуре. 34°С о последующей инкубацией при Э7°С.

Били проведены опыты по заражении КЗ вирусом ИЛТ, а через 48 часов вирусом НБ в дозах 316 ЗИД^^цЗ и выше. Первые 48 часов КЗ инкубировали при 34°С, остальные 72 часа при 37°С. Нам не удалось получить вирус НБ с требуемой активностью, титр его доходил до 9,0 ig ЭИД50/ОМ3.

Необходимое накопление вируса НБ получено после заражения КЗ вирусом ИЛТ и инкубации при 34°С, а через 72 часа заражение вирусом НБ в дозе 3,16-10 ЗИД^/о j смЗ и дальнейшей инкубации КЗ при температуре 37°С. Вирус НБ при такой схеме культивирования накапливался в титрах 7,2 - 8,0 lg

При заражении КЗ вирусом НБ в дозе 3,16-10 ЗИД^дД) ¿ сн3 через 96 часов после заражения их вирусом ИЛТ накопление штамма

"Ла-Сота" не происходит.

(

Для получения ассоциированной вирусвакцины, предназначенной для орального и интраназального применения, необходимо было получить вируссодержацее сырье с активностью по вирусу ИЛТ в пределах 7,0 - 7,7 lg ЗИДдод,^, а по вирусу НБ с активностью не нижа 9,0 lg ЗВД50/смЗ.

Материал с требуемой активностью удалось получить при одновременном заражении КЗ вирусом ИЛТ в дозе 8000 ЗИД^Д) 2 см3 к вирусом НБ в дозе 100-400 SVUH^q/q ^ см3. Инкубирование происходило 120 часов при 34°С и весь процесс совместного культивирования вирусов происходил без дополнительных технологических операций.

3.2. Разработка лабораторных образцов ассоциированной вирусвакцины против ИЛТ и НБ птиц

Для наработки необходимого количества вируссодержащего сырья получена матровые расллодки вирусов ИЛТ и НБ соответственно о биологической активностью не ниже; 7,0 lg ЭВД^д^З и с гемагглвти-нирующим титром не ниже 1:512. Имея данные расплодкк вирусов при-

ступали к получению ассоциированной вакцины совместным культивированием вирусов в куриных эмбрионах.

При изготовлении ассоциированной вакцины для аэрозольное применения КЗ заражали вирусом ИЛТ в дозе 5-15 тыс. 3H%o/0,2< и инкубировали при 34°С. Через 72 часа КЗ заражали вирусом НБ дозе 2-IO ЗЗД50/0д и инкубировали далее при 37°С.

При получении ассоциированной вакцины для других методов применения готовили общую вируссодерасащув смесь, содержащую bi рус ИЛТ в дозе 5-15 тис. ЗД50/0 2 c¡43 и вирус НБ в дозе 100-

адо зид50/0Д смз.

Приготовленной суспензией КЗ заражали в аллантоисную пол< и инкубировали при 34°С в течение 120 часов. Зкстраэмбрионалы жидкость и пораженные ХАО от охлажденных КЗ отбирали от кажды)

20-30 КЗ в отдельные флаконы. Содержимое флаконов сливали в о<

!

сосуд в соотношении 2/3 часта ХАО и 1/3 часть аллантоисной аиу сти и проводили размол на коллоидной мельнице. После размола г руссодержащую суспензию центрифугировали 15 минут при частоте 2500 об/мин и в полученную надосадочную жидкость добавляли ш 400 ЕД/см^ пенициллина и 400 мкг/см^ стрептомицина.

При расфасовке по пенициллиновым флаконам в вируссодержаи суспензию после размола добавляли стабилизатор в соотношении с а при расфасовке по ампулам - в соотношении 3:1. При изготовле моновакцин против И1Т и НБ используют сходные режимы сушки. Дл получения ассоциированной вакцины за основу мы взяли режим суп используемый при производстве вакцины против ИЛТ птиц.

В результате исследований получены экспериментальные серп ассоциированной вакцины с биологической активностью по вирусу 7.2 - 7.7 цЗДДзд/ыР и по вирусу НБ 7,4 - 9,25 lg ЭИД50/смЗ Данным способом изготовлено 7 экспериментальных серий ассоциир ванной вакцины, из которых 3 использовали для дальнейших испыт

3.3. Изучение биологических свойств опытных образцов ассоциированной вакцины против И1Т и НБ птиц

3.3.1. Определение биологической активности ассоциированной вируезакцины

Одним из основных критериев биологических свойств вакцинных препаратов является изменение биологической активности вирусов во время лиоФилизации и стабильность закцини в процессе хранения.

3 опытах установлено, что актганостъ вакцинных штаммов после лкоФильнсй сушки остазтся на прежнем уровне или снижается незначительно, что свидетельствует об оптимальных условиях сушки ассоциированной вакцины.

3 процессе хранения при температуре 4—6°С через 10 месяцев

биологическая активность вакцинных штаммов падает до предельно

1

допустимого уровня, что и обусловило выбор срока годности готового препарата. При хранении вакцины в условиях низкой температуры при минус 45°С актизность вирусов ИЛТ и НБ в течение года снижалась незначительно.

3.3.2. Определение иммуногенных свойств ассоциированной вируезакцины при аэрозольном методе применения

При исследовании имкуногенности ассоциированной сухой вакцины определили, что МИД вируса ИЛТ при аэрозольной вакцинации составила 1,66+0,36 1в ЗИДдд, а оптимальная находится в пределах 342-510 ЭИДзд, что незначительно отличается от данных показателей при применении коммерческой вакцины против ИЛТ из клона "ИГ <Ш составила 1,7840,29 1в ЭИД^, а оптимальная 434-540 ЭИД^).

Проведены опыты по двукратной аэрозольной вакцинации цыплят ассоциированной вакциной с определением уровня вируснейтрализую-щих антител, сероконверсии и напряженности, иммунитета по контрольному заражению через 16-18 дней посла первой и через такой же пе-

риод после второй вакцинации. Посла первой вакцинации в дозах 383-532 ЗИД^д антитела накапливались в титрах 1,6-2,2 lg и к кс тролъному заражению были устойчивы 70-90$ привитых цыплят. Поел второй аэрозольной вакцинации в дозах 526-876 ЗИДзд ур0вень ан_

тител составил 1,8-2,75 lg , а напряженный иммунитет после конт рольного заражения формируется у 80-100$ цыплят.

У цыплят, аспирировавших дозы от 383 до 532 ЭИД^, напряже ный иммунитет против ИЛТ наступает к 18 дна, продолжается более 90 дней и к 240 дню иммунными остаются 40% вакцинированных цыплят. Имеет место зависимость уровня накопления антител с устойчивостью цыплят к контрольному заражению штаммом "Богатицевский В то ;se время с увеличением аопирируемой дозы у цыплят повышают ся титры антител. Уровень антител от 1,9 lg и выше свидетельствует о наличии напряженного иммунитета к ИЛТ у 60% и более привитых цыплят.

МИД вируса НБ после аэрозольной вакцинации ассоциированной вакциной оостазила 2,13+0,32lg ЭШЦд Оптимальная доза, дающая защитный эффект посла одноразовой прививки не менее чем у 80/5 цыплят, находится, в пределах 770-872 ЭИДц0 МИД вируса НБ после вакцинации коммерческой вакциной из штамма "Ла-Сота" составила 2,04+р,45 lg ЭИД50, а оптимальная находится в пределах 641 -950 ЭИД50.

После однократной иммунизации цыплят ассоциированной вакциной в дозах 630-985 ЭИД^ по вирусу НБ напряженный иммунитет вырабатывался к 10 дню более чем у 60% привитых и сохранялся на таком уровне до 180 дней.

Цыплята, получившие в первую вакцинацию дозы вируса НБ 630885 ЭИДэд, а во вторую - дозы в пределах 872-1206 ЭИД^, имели высокие серологичеокие показатели и устойчивый иммунитет.'

Так, после первой иммунизации гемагглютинируищие антитела

накапливались в титрах 3,42 - 4,68 iog2, а после второй - в титрах 4,1 - 6,36 iog2 . после контрольного заражения защита формировалась у 90-100$ привитых цыплят. Уровень накопления антител у цыплят коррелировал с устойчивостью их к контрольному заражению. Антитела в титре более 3,0 log2 свидетельствовали о напряженном иммунитете к НБ не менее 80$ вакцинированной птицы. С увеличением аспирируемой дозы выработка антител наступает в более ранние сроки.

Изучение резктогенных свойств ассоциированной вакцины при аэрозольном применении проводили иммунизацией цыплят в дозах, в несколько раз превыпааиих оптимальные. Ассоциированная закцина в дозе до 532 ЭИДвд по вирусу ИЛТ не вызывала видимых клинических реакций у цыплят, на дозы 3200 и 4600 ЭИД^ соответственно реагировали П;1 и 20;? цыплят.

3.3.3. Определение иммуногенных свойств ассоциированной вирусвакцины при интраназальном методе применения

Опыты по интраназальной вакцинации цыплят ассоциированной вакциной показали, что иммунитет к ИЛТ формируется после введения вакцинного вируса в дозах от 20 тыс. ЭЩЦд и более, обеспечивая защиту не менее 80^ привитых. МИД вируса ИЛТ составляет 3,51+ 0,42 ig ЗВДзд. Оптимальная иммунизирующая доза, определенная расчетным путем, находится в пределах 40-80 тыс. ЭИД^.

Для определения срока наступления и продолжительности иммунитета цыплята были привиты в дозе 40 тыс. ЭИДзд. Иммунитет к вирусу ИЛТ после интраназальной прививки начинает формироваться с 10 дней и сохраняется до 240 дней после однократной прививки.Максимальный уровень иммунитета по серологическим исследованиям и контрольному заражению наблюдался у цыплят в период о, 18 по 180 день после иммунизации. ЗЬпирируемые цыплятами дозы в пределах 40-640 тыс. ЭИДэд стимулируют образование вируснейтрализующих

антител в границах 2,0-2,5 lg .

МИД вируса НБ при интранаэальком применении ассоциирован вакцины находится в пределах 3,82+0,27 lg ЭИДэд. Иммунизируют дозы от,126000 ЗйДэд и более обеспечивают формирование иммуни та у всех привитых. Дозу 126000 ЭИДзд можно очитать близкой к оптимальной.

Для определения срока наступления и продолжительности ш.

нитева к НБ цыплята были привиты интраназальным методом accOL

рованной вакциной в дозе 400 тыс. ЭИД^. К 10-м суткам после

мунизации иммунитет формируется у 50£, к 18 суткам - у 100#

сохраняет достаточную напряженность до 180 дней после однокре

ной вакцинации. Наибольшее накопление гемагглатинирующих ант1

сохраняется через 18-30 суток после прививки. К 240 суткам ti

постепенно снижаются с 6,4 log, до 2,9 log,.

t * • * i

3.3А. Определение иммуногенных свойств ассоциированной вирусвакцины при оральном методе применения

МИД вакцинного вируса ИЛТ при оральном применении вакцш составила 4,89+0,26 lg ЭШЦд. Оптимальная иммунизирующая дозг учетом 100-кратного запаса находится в пределах 5,94-9,58 мл! ЗИДзд. Используя дозу около 870 тыс. ЭИД^, проведены акспер! ты по определению срока наступления и продолжительности имму! та после однократной выпойки ассоциированной вакцины. К 18 с; после иммунизации иммунитет образуется более чем у 40$ цыплят максимальный уровень его отмечается в период с 30 по 180 денз еле прививки о уровнем вируонейтрализующих антител в предела; 1,6 - 2,2 lg .

Возможность создания иммунитета к вирусу НБ путем оралы вакцинации известна давно, МИД штамма "Ла-Сота" в составе aci ированной вакцины 6,06+0,48 lg ЗИДэд, что на 4 порядка больш

чем при аэрозольной вакцинации.С учетом запаса оптимальная иммунизирующая доза колеблется в пределах от 40 млн до 356 млн ЭДзд. Используя оптимальную дозу в её наименьшем значении определяли срок наступления и продолжительность иммунитета к НЕ после однократной выпойки ассоциированной вакцины. Устойчивый иммунитет у цыплят по результатам контрольного заражения и серологических исследований формируется с 18 суток (5,7 1<^2 ) и сохраняется у части привитых до 240 суток.(1,9 1ов2 ). Нарастание актигемагглятсникоз происходит насколько позже по оразнениа с другими методами вакцинации.

Закциннае вирусы ИЛТ и НБ в составе ассоциированной вакцины сохранили свои иммунобиологические свойства, характерные "для них в состава соответствующих моновакцин. На основании полученных результатов предлагается использозать ассоциированную вакцину для профилактики ИЛТ и НБ птиц в хозяйствах яичного и мясного направлений продуктивности з оптимальных дозах и те же сроки, предусмотренные наставлениями по применению соответствующих моновакцин против ИЛТ и НБ птиц.

3.4. Комиссионные институтские и производственные испытания ассоциированной вирусвакцкны против ИЛТ и НБ птиц

Комиссионные испытания по определении стерильности, биологической актизности, безвредности и иммуногеиности проведены о опытной серией Й 2 ассоциированной вирусвакцины, изготовленной 16.02.95 г.

В результате проведенных испытаний показано, что вакцина не кенташширована бактериальной и грибной микрофлорой; биологическая активность по вирусу ИЛТ составила 7,01е ЭИДдод^З, а по вирусу НБ - 7,4 1в ЗИД50/омЗ.

Безвредность и иммуногенность вакцины проверяли на цыплятах ■

25-дневного возраста, восприимчивых к ИЛТ и НБ. Контроль безв] ности вакцины в отношении вируса НБ проводили путем внутримыак ного введения разведения 1:50 в объеме 0,5 сьР (158 тыс. ЗИД^, вируса НБ). Контроль безвредности вакцины в отношении вируса ! проводил:; интратрахеальным введением вируса ИЛТ з дозе 3000 3 50/0,5 см^. В течение 10 суток наблюдения у цыплят отсутствов изменения некротического характера на месте введения вакцины отклонения от физиологической нормы.

Через 18 дней после интраназальной иммунизации (доза вир ИЛТ - 40 тис. ЗИД50, доза вируса НБ - 100 тыс. ЭИД50) 20 голо цыплят разделили на 2 группы и заразили одну интратрахеально штаммом "Богатищэвский" в дозе 1000 ИД^д, а цыплят другой гру внутримышечно штаммом "Т-53" в доза 10000 ЛД^.

Урозень антнгемагглвтининов у цыплят к НБ перед контрол! зараяением составил 5,5 log^ , а напряженный иммунитет у 90% цинированных цыплят. Против ИЛТ устойчивый иммунитет зыработ; у 80íí интраназально вакцинированных цыплят. Неимкунные цыпля1: при контрольном заражении переболели и пали.

Комиссионные испытания ассоциированной вирусвакцины в yi виях института и производства подтвердили результаты лаборат! исследований и показали, что ассоциированная вакцина безвред: иммуногенна для цыплят яичного и мясного направлений продукт: ности и в оптимальных дозах не вызывает поствакцинальных pea и осложнений. Так, при испытаниях в условиях Томилинской пти фабрики на птице породы "Ломан-Браун" при первой иммунизации лята аспирировали 400 ЭИД^ вируса ИЛГ и 800 ЗИДзд вируса НБ Через 18 дней после второй иммунизации, при которой цыплята чили 600 ЗИЛ50 вируса ИЛТ и 1200 ЭИД50 вируса НБ, вся привит птица имела напряженный иммунитет к обоим вирусам, выявленны контрольном заражении и серодиагностике.

При испытаниях ассоциированной вакцины на Петелинсхой птицефабрике после однократной аэрозольной иммунизации бройлеры получили ВДО ЭИД50 против ИЛТ и £00 ЗЙД50 против НБ. Через 18 дней после вакцинации 90^ цыплят имели напряженный иммунитет к ИЛТ с титром преципитирующих антител 3,2 log2 . Против НБ иммунитет вырабатывался у всех циплят и титры антигемагглютининов составили 5,9 iog2 .

Таким образом, ассоциированная вакцина по показателям безвредности, реактогенности и иммуногенности не уступает соответствующим моноэакцинам против ИЛТ и НБ птиц.

В производственных условиях при использовании ассоциированной вирусвакцины время проведения прививок сокращается в 2 раза, уменьшаются затраты труда на проведение вакцинации ветеринарными специалистами'(расчет вакцины идет лишь по вирусу ИЛТ, разводится одна вакцина вместо двух).

t. В HB О J Ы

1. Впервые показана принципиальная возможность и эффективность совместного культивирования вирусов ИЛТ, клон "НГ", и НБ, штамм "Ла-Сота", в одном курином эмбрионе, что позволило снизить материальные затраты на получение вируссодержащего сырья для изготовления ассоциированной вирусвакцины, предназначенной для аэрозольного, интраназального и орального методов применения.

2. Ассоциированная вирусвакцина безвредна и ареактогенна для цыплят с 15-20-дневного возраста в оптимальных дозах независимо от направления продуктивности.

3. Ассоциированная вирусвакцина наиболее эффективна при применении указанными методами по схеме: первая вакцинация цыплят-бройлеров в возрасте 15-20 дней, цыплят яичных пород - в возрасте,' 25-27 дней и повторно через 16-18 дней с последующей

ревакцинацией через каждые 6 месяцев.

4. Иммунологическая эффективность ассоциированной вирус-вакцины не отличается от таковой при применении соответствую! моновакцин против ИЛТ и НБ птиц.

5. Ассоциированная вирусзакцина при аэрозольном примене! обеспечивает стабильную иммунологическую эффективность при б: логической активности по вирусу ИЛТ не ниже 7,0 ig ЗИДзд/^' а по вирусу НБ - в пределах 7,2 - 7,7 lg ЭИДс0/смЗ. Минимал: ная иммунизирующая доза вируса ИЛТ составляет 45,7 ЗЩЦд, а : руса НБ - 136,5 ЗИДзд. Оптимальная иммунизирующая доза вирус ИЛТ составляет 400 - 600 ЭИД^, а вируса НБ - 800 - 1200 ЗИД Напряженный иммунитет после однократной аэрозольной вакцинац в оптимальных дозах против НБ и ИЛТ Формируется на 12-15 сут и сохраняется не менее 6 месяцев.

6. Ассоциированная вирусвакцина при интраназальном прим нении обеспечивает получение стабильного иммунологического с фекта при биологической активности по вирусу ИЛТ не ниже 7,С ЭИД50/смЗ. а по вирусу НБ - не ниже 9,0 lg ЗИД50//смЗ. Миния ная иммунизирующая доза вируса ИЛТ составляет 3230 SHUjq, а руса НБ - 6600 ЭДОЦд. Оптимальная иммунизирующая доза вирусе ИЛТ составляет 60000 ЭИД50, а вируса НБ - 400000 ЭИДзд. Hani женный иммунитет после однократной интраназальной иммунизащ в оптимальных дозах формируется на 14-17 сутки и сохраняете; не менее б месяцев против обеих инфекций.

7. Ассоциированная вирусвакцина при оральном приме нети эффективна при биологической активности по вирусу ИЛТ не низ 7.0 lg ЭИД5о/смЗ, а по вирусу НБ - не ниже 9,0 lg Минимальная иммунизирующая доза вируса ИЛТ составляет 77600 а вируса НБ - II40000 ЗИДэд. Оптимальная иммунизирующая до вируса ИЛТ составляет 7,76 млн ЭИД^, а вируса НБ - 198 млн

Напряженный иммунитет после однократной оральной вакцинации в оптимальных дозах формируется к 21-30 суткам против ИЛТ и сохраняется не менее трех месяцев, а к НБ - к 20-25 суткам и сохраняется ггакже не менее трех месяцев.

8. Ассоциированная зирусвакцина против ИЛТ и НБ с положительным эффектом прошла комиссионные лабораторные и производственные испытания на поголовье около 2 млн птиц. Вакцина соответствует требованиям, предъявляемым к профилактическим препаратам подобного типа.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В результате проведенных исследований разработаны и Предложена к практическому применению:

- Временное наставление по применению вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской болезни птиц ассоциированной сухой (Утверждено Департаментом ветеринарии Pas 26.12.94 г.).

- Технические условия по контролю вакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской болезни птиц ассоциированной сухой (Утверждены Департаментом ветеринарии Р* 26.12.94 г.).

- Инструкция по изготовлению и контролю вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской болезни птиц ассоциированной сухой (Утверждена директором ВНИИВВиМ 27.12. 94 г.).

- Способ совместного культивирования вирусов ИЛТ и НБ для изготовления ассоциированной вирусвакцины. По заявке » 93007931 от 09.02.93 г. получено положительное решение о выдаче патента от 14 марта 1995 года.

б. СПИСОК РАБОТ, СЛУШКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зуев Ю.В., Дутко Ю.С., Кушнир А.Т. Получение односло] первично-трипсинизированной культуры клеток из почки куриног эмбриона // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии эпизоотологии: Тез. докл. научн. конф. ВНИИВВиМ. - г.Покров, 1992. - С. 294.

2. Подбор биологических систем для культивирования виру инфекционного ларинготрахеита кур / Зуев Ю.В., Дутко Ю.С., Б ровская Н.К., Купнир А.Т. // Вопросы ветеринарной вирусологи микробиологии и эпизоотологии: Тез. докл. научн. конф. ВНИИВ

- г.Покров, 1992. - С. 159-160.

3. Зуев Ю.В., Дутко Ю.С., Куинир А.Т. Ассоциированная в вакцина против инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской б ни птиц // Ветеринария. - 1295. - £ 3. - С. 22-24.

4. Зуев й.В. Иммунологическая эффективность ассоциирова вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслс болезни птиц при аэрозольном применении // Вирусные болезни животных: Тез. докл. Всероссийской научно-практ. конф, - Вла мир, 1995. - С. 262.

5. Зуев Ю.В., Дутко Ю.С., Кушнир А.Т. Оценка иммуногенн свойств ассоциированной вирусвакцины против инфекционного ла готрахеита и ньикаолской болезни птиц при различных методах менения // Вирусные болезни с.-х. животных: Тез.-докл. Всеро ской научно-практ. конф. - Владимир, 1995. - С. 263.

6. Зуев Ю.В., Дутко W.C., Кушнир А.Т. Принципы разрабог ассоциированной вирусвакцины против инфекционного ларинготре та и ньюкаслской болезни птиц // Актуальные вопросы ветерине вирусологии: Материалы научно-практ. конф. ВНИИВВиМ. - г.Пок 1995. - С. 165-166.

7. Зуев D.B. Оценка иммуногенных свойств ассоциирование вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслс болезни птиц при аэрозольной вакцинации // Актуальные вопрос ветеринарной вирусологии: Материалы научно-практ. конф. ВНИК

- гЛокров, 1995. - С. 165.

8. Зуев D.B., Дутко Ю.С., Кушнир А.Т. Иммунологическая эффективность ассоциированной вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньокаслской болезни птиц при различных методах применения // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: Материалы научно-практ. конф. ВНЖВВиМ. - г .Покров, 1995. - С. 164165.

9. Дутко B.C., Зуев Ю.В., Кушнир А.Т. Chocoö совместного культивирования вирусов инфекционного ларинготрахеита и ньюкасл-ской болезни птиц в куриных эмбрионах // Заявка на патент

ß 93007931. Приоритет установлен 09.02.93 г. Положительное решение о выдаче патента принято 14.03.95 г.