Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка ассоциированной вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской болезни птиц

Р Г Б ОД

5 ? ОЕВ ДОЬ'

На правах рукописи

УДК 619:615.371/372:636.52/56

ЗУЕВ Юрий Владиславович

РАЗРАБОТКА АССОЦИИРОВАННОЙ ВИРУСВАЩИШ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО

ЛАРИНГОТРАХЕИТА И НЬШАСЯСКОЙ *

16.СО.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

БОЛЕЗНИ ПТИЦ

Автореферат

Покров - 1996

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательско институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук КУП1НИР АЛ

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор ХРИПУНОВ Е.М.

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук ДсШН .А.А. (ВШИЗВии!),

- кандидат.ветеринарных наук ГОРЕВА И.П. (ВГНКИ).

Ведущее учреждение - , ВНИИ защиты животных.

30

Защита состоится I марта 1996 г. в II часов на засе диссертационного совета Д—120.61.01 во Всероссийском научно-ис довательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологи по адресу: 601120, г.Покров,' Владимирской области, ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ. Автореферат разослан января 1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

Г.П.ФЁ

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Специфическая профилактика вирусных болезней занимает значительное место в условиях современного ведения птицеводства.

3 целях обеспечения ветеринарного благополучия птицеводческих хозяйств возникает необходимость профилактических прививок против двух, трех и более болезней. В этих условиях недостаточно обоснованные последовательность введения антигенов и интервалы мевду ними ведут к перегрузке иммунной системы птиц и не всегда обеспечивают надежную защиту птицепоголовья от инфекционных болезней, так как часто происходит несоответствие сроков формирования защиты и начала заболевания.

С целью сокращения графика прививок и снижения стрессового воздействия на птиц практикуется объединение вакцинных вирусов перед применением, ко в этом случае необходимо проводить расчеты по каждому из них для определения соответствующих рабочих разведений и достижения сбалансированности доз (К.Г.Аспанидзе, 1971; В.С.Дутко, 1977; Н.А.Изотова и соавт., 1988; Р.А.Каднмов, Ю.В.Сафаров, 1974; А.В.Качахидзе, 1965; А.Т.Кушнир, 1995; Р.Чо-лакова, I9S5; winterfield , 1984).

В производстве ассоциированных вакцин практикуется смешивание двух и более вирусов перед лиофилизацией (А.А.Шевченко,1995), но такая технология изготовления не снимает вопроса экономичного • использования биологических систем для культивирования вирусов.

Не вызывает сомнения целесообразность использования ассоциированных препаратов, применение которых сокращает количество прививок, уменьшает расход материалов и затраты труда, снижает потери живой кассы от стресс-факторов, связанных с иммунизацией (В.П.Рыженко, 1983).

Таким образом, разработка массовой иммунизации птиц ассо ированными вакцинами в сложной эпизоотической обстановке весь актуальна.

Птицу поражают многие инфекционные болезни, среди котори наиболее опасными являатся ньвкаслская болезнь (НБ) и инфекци кый ларинготрахеит (ИЛТ), которые могут привести к гибели вое поголовья.

Для специфической профилактики указанных болезней примен эмбриональные монозакцини, производство которых влечет сущест ные экономические затраты из-за использования куриных эмбрион энергоемких технологических процессов, расхода сопутствующих териалов для культивирования каждого вируса в отдельности и т

3 большинстве птицеводческих хозяйств проводится специйи ( кая профилактика ИЛТ и НБ птиц. В связи с этим больное значен придается применению ассоциированной вакцины, преимущество ко рой заклвчается в создании иммунитета сразу к двум болезням о, временно при экономии времени и трудозатрат.

Кроме этого, использование единой биологической системы льтизирования двух вирусов для получения ассоциированной вакц: против указанных болезней считаем актуальным и экономически 01 равданным.

Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явл: дась разработка ассоциированной вирусвакцины против инфекцион: го ларинготрахеита и ньвкаслской болезни птиц.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать режим совместного культивирования вирусов ИЛТ и НБ птиц в одном курином эмбрионе.

2. Оценить иммунобиологические свойства экспериментальны: образцов сухой ассоциированной вирусвакцины против ИЛТ и НБ п'.

3. Определить иммунологическую эффективность вирусов ИЛТ и НБ в составе ассоциированной вирусвакцины при различных методах применения.

Разработать нормативно-техническую документацию на ассоциированную вирусвакцину против ИЛТ и НБ птиц.

5. Провести комиссионные испытания ассоциированной вирус-вакцины против ИЛТ и НБ птиц в институте и на птицефабриках.

Научная новизна. Впервые разработан способ совместного культивирования вакцинных вирусов ИЛТ и НБ с заданным уровнем биологической активности обоих вирусов, обеспечивающий получение ассоциированных вакцин, предназначенных для аэрозольного, интраг назального и орального применения.

Получена ассоциированная вирусвакцина против ИЛТ и НБ птиц для аэрозольного метода применения. Определены минимальные и оптимальные иммунизирующие дозы вирусов ИЛТ и НБ птиц при аэрозольном применении ассоциированной вирусвакцины.

Получена ассоциированная вирусвакцина против ИЛТ и НБ птиц для интраназального и орального методов применения. Определены минимальные и оптимальные иммунизирующие дозы для указанных методов применения.

Ассоциированные вакцины стерильны, безвредны, ареактогенны и обладают высокой иммуногенной активностью.

Новизна полученных результатов подтверждена положительным решением ВНИИШЗ на выдачу патента по заявке & 93007931 "Способ получения ассоциированной вирусвакцины против инфекционного ла-ринготрахеита к ньюкаслской болезни птиц".

Практическая значимооть. В результате; выполненных исследо- . ; ваний разработаны ассоциированные вакцины против ИЛТ и НБ птиц для различных методов применения, которые могут успешно применяться в хозяйствах о различным направлением продуктивности птиц.

Вакцина получена в результате совместного культивирования зщ сов ИЛТ и НБ птиц в одном курином эмбрионе, что экономит кол: чество трудовых и материальных затрат по сравнению с изготов: нием моновакцин. Использование ассоциированной вакцина в усл< виях производства обеспечивает формирование, напряженного нищ тета сразу против двух болезней, дает возможность сократить » ло профилактических прививок и, тем самым, значительно снизив уровень неблагоприятного стрессового воздействия на организм птиц, которое ведет к снижению мясной и яичной продуктивное^

Ассоциированные вакцины прошли межведомственные комисож ныз испытания в птицехозяйствах Московской области.

Основный полоаения диссертационной работа, выдвигаемые у защиту:

1. Зпизоотологическое обоснование, целесообразности созде

!

и применения ассоциированной вирусвакцины против ИЛТ и НБ пту в современных условиях.

2. Технология изготовления ассоциированной вакцины проту ИЛТ и Ж птиц, основанная на культизировании указанных вирусе в одном курином эмбрионе.

3. Иммунологическая эффективность ассоциированной вакциь; против ИЛТ и НБ птиц при различных методах применения.

Апробация работы. Материалы диссертации долокены на науч конференции ВНИИВВиМ (г.Покров, 1992); заседаниях Государстве кой межведомственной комиооии по испытании ветеринарных биоло ческих препаратов в Российской Федерации; заседаниях ученого вета ВНИИВВиМ (1990-199*).-

При демонстрации в 199* году во Всероссийском Выставочно Центре ассоциированная вирусвакцина против ИЛТ и НБ птиц заня , X место, а её авторы награждены золотой медалью.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных р

бот; получено положительное решение на патент; утверждены Департаментом ветеринарии РФ' 2 нормативно-технических документа по контролю и применению ассоциированной вакцины против ИТ и НЕ птиц; утверждена директором ВНИИВВиМ инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины.

Внедрение. Успешно проведены межведомственные комиссионные испытания вирусвакцины против ИЛТ и НБ птиц ассоциированной сухой (приказ Департамента ветеринарии РФ $ 26 от I0.08.iH г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений, содержит 31 таблицу, 3 рисунка. Список использованной литературы включает 323 источника,

из них 208 отечественных я 115 зарубежных. Диссертация дополне—

?

на 12 приложениями, подтверждающими научную и практическую значимость отдельных этапов работы.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Вакцинные вирусы:

- ИЛТ, штамм "ЦНИИЛП", клон "НТ, получен в лаборатории ВНИИВВиМ в 1978 году путем клонирования методом предельных разведений и последующего пассирования на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона при температуре. 34°С. Биологическая активность в нативном состоянии 7,0 - 7,7 lg ЭИД^д^;

- НБ, штаммы "Ла-Сота" и "Бор-74 ВГНКИ", получены из ВГНКЙ ветпрепаратов с биологической активностью оба 9,25 le *

Вакцины:

- эмбрион-вирусзакцина против ИЛТ птиц из клона "НТ втамна "ЦНИИЛП", изготовленная во ВНИИВВиМ с биологической активностью

7,0 - 7,4 lg ЭИД50/смЗ;

- вирусвакцина сухая против НБ птиц из штамма "Ла-Сота" изготовленная во ВНИИВЗиМ, с биологической активностью 8,5 -

" • lg ^so/cM3:

- экспериментальные серии вирусвакцины против ИЛТ и НБ i

ассоциированной сухой, изготовленные во ВНИИВВиМ, с биологич< кой активностью по вирусу ИЛТ 7,0 - 7,4 le ЭИДдд/смЗ, по вир;

' 1 НБ для аэрозольного применения 7,2 - 7,7 з^ЭИД^^уЗ, а для других методов применения 9,25 lg ЗИД^д^р.

Эпизоотические штаммы:

- штамм "Богатицевский" вируса ИЛТ птиц с инфекционной г тивностью 4,0 - 4,6 lg ИД^д^З. Получен из проблемной лаборг тории вирусологии Московской ветеринарной академии в 1972 го;

- штамм "Т-53" вируса НБ с инфекционной активностью 7,5 ^50/0 2 см3* Получен из ВГНКИ ветпрепаратов 15.06.87 г.

Для культивирования вируса ИЛТ использовали первично-тру синизированные культуры клеток почки 19-дневного КЗ, печени I дневного КЗ, куриных фибробластов. Из перевиваемых культур кл ток использовали культуры клеток почки сайги (ПС), почки эмбр на лося (ПЗЛ), почки эмбриона котенка (ífe ), почки сибирского горного козерога (ПСПО, почки эмбриона свиньи (СПЗВ), почки нисвиньи (ПСМ), почки свиньи (ПКПС), почки поросенка (PK-I5). Первично-трипсинизированные культуры клеток готовили самостоя но, а перевиваемые культуры клеток получали в лаборатории "Ку туры клеток с музеем клеточных штаммов" ВНИИВВиМ.

Питательные среды - ИГЛА МЭМ, гидролизат лактальбумина н растворе Хенкса. Бактериологические среды - мясо-пептонный ar¡ (¡41A), мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный печеночный i льон (ШПБ) под вазелиновым маслом, агар и бульон Сабуро, cpe¿ Эдварда.

Физиологический раствор, 0,25^-ннй раствор трипсина, 1^-ний раствор трипановой сини,- йодированный спирт, дистиллированная вода.

■ Стабилизатор пептонно-лактозный фосфатный (СПЛФ).

Аппаратура и оборудование:

- прямоструйный зкекторный генератор аэрозолей ПЭГА-1;

- струйный аэрозольный генератор САГ-1;

- аэрозольная камера БОС-Ю объемом 1,05 м**;

- производственные помещения птицеводческих хозяйств объемом от 5,4 до 10 тыс. >Р;

- аспиратор Мигуноза с КПК—X;

- флуориметр;

- установка для лиофильной сушки.

Животные:

I I

- куриные эмбрионы 7-10-дневного возраста;

- цыплята и куры яичных и мясных пород в возрасте 12-100

дней;

- петух породы Леггорн, неиммунный к НБ.

При культивировании вируса ИЛТ на первично-трипскнизирован-ных или перевиваемых культурах клеток в первом пассаже вирусный материал вносили в разведении 1:10, предварительно слив из нат-расов старую ростовую среду.

В течение 24-144 ч после заражения культур клеток вели наблюдение за состоянием монослоя, формой клеток, образованием просветов и рН среды. Через 120-144 ч после заражения культур вирус-содержащую суспензию и клетки подвергали замораживанию и оттаиванию с целью увеличения выхода вируса из клеток.

При проведении последующих пассажей часть культуральной суспензии с вирусным материалом центрифугировали 15 мин при частоте 2500 об/мин и с полученным надосадком на поддерживающей среде

готовили разведение. 1:10 и вносили его на новые культуры клетс

При оценке, культуральных вируссодержащих материалов и И31 товлении вакцин биологическую активность производственных и зг зоотических штаммов определяли титрованием на КЗ с использовав ем общепринятого метода, описанного в методических указаниях г применении аэрозолей вакцин для иммунизации птицы против НБ, £ таюке. используя методические указания^ ОЧЬ-3 по определению с ологической активности вирусвакцина против ИЛТ птиц из клона "НГ штамма "ЦНИШП".

При разработке ассоциированной вакцины определяли иммунш рующуп дозу вирусов ИЛТ и НБ, последовательность заражения им1 КЗ, продолжительность и рении инкубации КЗ.

Приготовленные серии вакцины проверяли на контаминацию.бе териальной и грибной микрофлорой по ГОСТ 28085-89. Массовую дс влаги у лиофилизированнах серий ассоциированных вакцин опреде: ли по ГОСТ 2Ю61-89. Безвредность и остаточную вирулентность с тигенов выявляли в опытах на 25-30-дневных цыплятах, неиммунт к ИЛТ и НБ, путем внутримышечного введения препарата в объеме 1,0 см3 (на НБ) и интратрахеального введения препарата в объеь 0,5 см3 (на ИЛТ).

Растворимость лиофилизированной вакцины определяли раствс рением содержимого флакона при добавлении физиологического рас вора до исходного объема вируса, затем флакон встряхивали в те чение 2-3 минут.

Аэрозольную иммунизацию птиц в лабораторных условиях про! дили в статической камере., вакцину распыляли генераторами аэрс золей ПЭГА-1 из расчета I оР/мЗ объема камеры. Экспозиция им» низацин составляла 20 минут. Для определения концентрации прос аэрозоля отбирали пробоотборником КПК-1 в течение 5 минут с ос емной скоростью 5 л/мин. Концентрации аэрозолей вакцина опреде

/

ляли общепринятым флуориметрическим методом.

В производственных условиях ассоциированную вакцину распыляли генераторами аэрозолей САГ-1 или САГ-10 в помещёниях, где одновременно размещалось от 35 до 62 тыс. голов птиц, руководствуясь методическими рекомендациями по аэрозольной иммунизации птиц.

При интраназальном методе; иммунизации готовили разведение вакцины 1:50, ресуспгндируя содержимое одной ампулы или флакона соответственно в 2С0 или ЗСО см^ Физиологического растзора и вводили по 2 капли (0,2 ам^/голоэу) в каждое носовое отверстие.

Оральную иммунизацию цыплят проводили методом выпаивания с водой. С этой целью ассоциированную вакцину разводили 1:20, ре-суспендируя содержимое ампулы в 80 сьт5, а Флакона - в 120 см^ кипяченой воды к зыпаизали один раз в сутки два дня подряд из рас' чета 5 с:Р на одного цыпленка яйценоских пород до 25-дневного

3 <

возраста и 10 с!г на одного цыпленка мясных пород и взрослую птицу независимо от направления продуктивности-.

Иммунологическую эффективность ассоциированной вакцины оценивали по величине минимальной иммунизирующей дозы, сроку наступления и продолжительности иммунитета, уровню накопления вирус-нейтрализующих и гемагглютинирующих антител, а такхе по устойчивости цыплят к контрольному заражению.

Минимальную иммунизирующую дозу (МИД) вычисляли по методу Спирнена-Кербера.

Для определения срока наступления и продолжительности иммунитета группу цыплят прививали аэрозольным или другим методом оптимальной иммунизирующей дозой. Через различные срокк после однократной вакцинации (б, 10, 18 , 30 , 90. 180 и 2ОД дней) у цыплят брали кровь для серологических исследований и. не менее чем по 10-12 голов на каждый изучаемый срок подвергали контрольному заражению штаммом "Богатищевский" в доза 1000 5 см3 интра-

трахеально и штаммом "Т-53" в дозе 10000 ВД50/0Р внутримыше1

Титр гемагглютиниругащих антител у цыплят после прививки рзделяли в реакции задегаки гемагглитинации (РЗГА) по методш изложенной в методических указаниях по применении аэрозолей ] цик для иммунизации птиц против НБ.

Для определения вируснейтрализуюцих антител в крови приз тых цыплят ставили реакцию нейтрализации (РН) на 10-дневных ! используя постоянное количество сыворотки и прогрессивно нар; тающие 10-кратные раззедения вирус-антигена по методике", опш ной в стандарте С23 №3-79 "Методы лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц".

Контрольное заражение цыплят проводили через 18 дней пос одно- или двукратной закцинации эпизоотическими штаммами вир} ИЛТ и НБ в вышеуказанных дозах.

Реактогенность ассоциированной вакцины оценивали в тече! 10 суток после однократной иммунизации 25-30-дневных цыплят г наличию поствакцинальных осложнений.

Длительность хранения ассоциированной вакцины изучали ч« I, 3, б, 9 и 12 месяцев после изготовления при хранении вакщ в сухом месте при температуре 4-6°С и минус 45°С.

Статистическую обработку полученных результатов проводи! по общепринятой методике (И.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, 1962).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка способа совместного культивирования вирусов ИЛТ и НБ птиц

С цельв снижения материальных затрат на получение вирус« сырья нами проведены исследования по адаптации вируса ИЛТ, кл "НТ", к первично-трипсинизированным и перевиваемым культурам ток. Из первично-трипсинизированных использованы культуры кле куриных фибробластов, печени 12-1*-дневного КЗ и почки 19-дне

КЗ. Методика получения последней нами усовершенствована.

Наиболее обнадеживавшие результаты получены при культивировании вируса ИЛТ на культуре почки 19-дневного КЗ /в которой вирус сохранялся вплоть до 4-го пассажа. При аэрозольной вакцинации цыплят вируссодержащим материалом 1-го пассажа с титром 5,95 lg CM%0/ciP иммунитет вырабатывался у 25-40$ привитых. При культивировании вируса ИЛТ з других первично-трипсинизированных культурах вирус после 3-го пассажа не обнаруживали.

При исследованиях по адаптации вируса ИЛТ к перевиваемым культурам клеток установлено, что в культурах свиного происхождения (ПКПС, PK-I5, 0132. ПСМ) вирус ИЛТ сохранялся до 2-3-х пассажей, а б культурах ПЗЛ, ?е , ПС, ПСГК не обнаруживался уже после первого пассажа.

В дальнейшей работе каше внимание было уделено совместному культивирозаншо вирусов ИЛТ и НБ в развивающихся КЗ.

Известно, что оптимальными условиями для накопления вируса ИЛТ, клон "РГГ", в КЗ являются: инкубация зараженных в дозе 5-10 тыс. ЗВД50/0 2 0М3 КЗ в течение II0-I20 ч при температуре 34°С; для накопления вируса НБ - инкубация зараженных в дозе 10000 SH^q/qj СНЭ КЗ в течение 72-90 ч при температуре 37°С. Эти условия культивирования вирусов используются для наработки высокоактивного вируссодержаиего сырья при производстве моновакцин.

При изготовлении ассоциированной вакцины против ИЛТ и НБ птиц нами испытано несколько режимов совместного культивирования и влияние различных заражающих доз на репродукцию вирусов в КЗ.

Нами показано, что в наивысшем титре (до 7,7 lg ЭД^о/см^ клон "ИГ" накапливается при заражении КЗ в дозе 5000-10000 ЭИД 50/0,2 at? и инкубации при температуре 34°С в течение 120 часов. Дальнейшее повышение заражающей дозы вируса или увеличение сроков инкубации нецелесообразно, так как происходит гибель КЗ до 60-100#;

При различных заражающих дозах вируса НБ, штамм "Ла-Сотан в наибольшем титре накапливается в КЗ, инкубируемых при

При одновременном заражении КЭ вирусом НБ в дозе 316 ЭЙД/ и различными дозами вируса ИЛТ от 100 до 100000 ЗИДзд и их coi местном культивировании оказалось, что нет какого-либо заметш интерферирующего или экзальтирующего действия на репродукцию з руса ИЛТ со стороны вируса НБ по сравнению с монокультивирова!

При одновременном заражении КЭ вирусом ИЛТ в дозе 8000 31 50/0,2 cíP и различными дозами вируса НБ от 3,16 до 3160 ЭИД 50/0,1 oí? также не отмечено какого-либо подавляющего или уси ваюцего действия на репродукцию вируса НБ со стороны вируса И по сравнению с накоплением данных вирусов при монокультивиров.

Максимальное накопление вируса НБ, штамм "Ла-Сота", при накозых дозах заражения происходит при температуре 37°С. При ражаявдй дозе вируса НБ в пределах 100-400 3ИД50Д) j 0М3, шта "Ла-Сота" при инкубации КЭ в течение 120 ч при температуре 37 накапливался до 9,3 le ЭЩ^дд^.

В дальнейшем нами испытана возможность и эффективность с местного выращивания вирусов ИЛТ и НБ птиц при последовательн заражении КЗ указанными вирусами, с тем, чтобы получить вирус держащий материал для ассоциированной вакцины, предназначенно для аэрозольного метода применения.

В данном случае вирус ИЛТ должен иметь биологичеокую акт ность в пределах 7,0 - 7,7 lg ЭИД5о/смЗ, а вирус НБ - в преде 7,2-8,0 1бЭИД50/смЗ.

Используя полученные результаты мы выбрали оптимальную з лающую дозу вируса ИЛТ, сроки и режим инкубации КЗ, описанные ранее.

Заражение КЗ вирусом НБ проводили в разных дозах через ' 72 и 96 часов с момента заражения КЭ вирусом ИЛТ и инкубировг

вначале при температуре. 34°С с последующей инкубацией при 37°С.

Были проведены опыты по заражению КЗ вирусом ИЛТ, а через 48 часов вирусом НБ в дозах 316 ЭЙДзд/^ и выше. Первые 48 часов КЗ инкубировали при 34°С, остальные 72 часа при 37°С. Нам не удалось получить вирус НБ с требуемой активностью, титр его доходил до 9,0 lg ЗИД50//снЗ.

Необходимое накопление вируса НБ получено после заражения КЗ вирусом ИЛТ и инкубации при 34°Cj а через 72 часа заражение вирусом НБ в дозе 3,16-10 ЗЩЦдд) 0М3 и дальнейшей инкубации КЗ при температуре 37°С. Вирус НБ при такой схеме культивирования накапливался в титрах 7,2 - 8,0 lg ЗИД^ДуЗ.

При заракении КЗ вирусом НБ в дозе 3,16-10 ЗЦ50/0 I см3 через 96 часов посла заражения их вирусом ИЛТ накопление штамма

"Ла-Сота" не происходит.

<

Для получения ассоциированной вирусвакцины, предназначенной для орального и кнтраназального применения, необходимо было получить вируссодержаиее сырье с активностью по вирусу ИЛТ в пределах 7,0 - 7,7 lg 3HIgQ/CJ(3, а по вирусу НБ с активностью не ниже 9,0 lg ЭИД50/сМ3.

Материал с требуемой активностью удалось получить при одновременном заражении КЗ вирусом Ш1Т в дозе: 8000 ЭИД^/О 2 см3 и вирусом НБ в дозе 100-ВДО ЗИД5(у0 j- см3. Инкубирование, происходило 120 часов при 34°С и весь процесс совместного культивирования вирусов происходил без дополнительных технологических операций.

3.2. Разработка лабораторных образцов ассоциированной вируовакцины против ИЛТ и НБ птиц

Для наработки необходимого количества вируссодержащего сырья получена матровве распзодки вирусов ИЛТ и НБ соответственно с биологической активностью не ниже: 7,0 lg ЗИД^^З и с геиагглюти-нирующим титром не ниже 1:512. Имея даннае расплодкя вирусов при-

ступали к получению ассоциированной вакцины совместным культ! вированием вирусов в куриных эмбрионах.

При изготовлении ассоциированной вакцины для аэрозольно] применения КЗ заражали вирусом ИЛТ в дозе 5-15 тыс. ЭИД^д,^ и инкубировали при 34°0, Через 72 часа КЗ заражали вирусом И дозе 2-10 ЭИДздД) j сн3 и инкубировали далее при 37°С.

При получении ассоциированной вакцины для других методо! применения готовили общую вируссодержаиую смесь, содержащую i рус ИЛТ в дозе 5-15 тыс. ЗЩ^Д) 2 и вирус НБ в дозе 100-

вдо эид50/0Д омз.

Приготовленной суспензией КЗ заражали в аллантоисную по; и инкубировали при 34°С в течение 120 часов. Экстраэмбрионал! жидкость и пораженные ХАО от охлажденных КЗ отбирали от ка»Д1

20-30 КЗ в отдельные флаконы. Содержимое флаконов сливали в (

»

сосуд в соотношении 2/3 части ХАО и 1/3 часть аллантоисной ж5 сти и проводили размол на коллоидной мельнице. После размола руссодержащую суспензию центрифугировали 15 минут при частоте 2500 об/мин и в полученную надосадочную жидкость добавляли г 400 ЕД/см3 пенициллина и 400 мкг/см3 стрептомицина.

При расфасовке по пенициллиновым флаконам в вируссодержг суспензию после: размола добавляли стабилизатор в соотношении а при расфасовке по ампулам - в соотношении 3:1. При изготовл иоковакцик против ИЛТ и НБ используют сходные режимы суыки. Д получения ассоциированной вакцины за основу мы взяли режим су используемый при производстве вакцины против ИЛТ птиц.

В результате исследований получены окспериментальные сер ассоциированной вакцины с биологической активностью по вирусу 7.2 - 7,7 1вЭИДдо/о1р и по вируоу НБ 7,4 - 9,25 lg ЭИД50/см Данным способом изготовлено 7 экспериментальных серий ассоции ванной вакцины, из которых 3 использовали для дальнейших испы

3.3. Изучение биологических свойств опытных образцов ассоциированной вакцины против ИЛТ и НБ птиц

3.3.1. Определение биологической активности ассоциированной вирусзакцины

Одним из основных критериев биологических свойств вакцинных препаратов является изменение биологической активности вирусов во время лио^илизации и стабильность вакцины в процессе хранения.

3 опытах установлено, что активность гакцинных штаммов после лио^ильной сушки остается яа прежнем уровне: или снижается незначительно , что свидетельствует об оптимальных условиях сушки ассоциированной вакцины,

В процессе хранения при температуре 4-6°С через 10 месяцев биологическая активность вакцинных штаммов падает до предельно допустимого уровня, что и обусловило выбор срока годности готового препарата. При хранении вакцины в условиях низкой температуры при минус *5°С актизкость вирусов ИЛТ и НБ в течение года снижалась незначительно.

3.3.2. Определение иммуногенных свойств ассоциированной вирусвакцины при аэрозольном методе применения

При исследовании имкуногеннооти ассоциированной сухой вакцины определили, что 1Щ вируса ИЛТ при аэрозольной вакцинации составила 1,б6+р,3б ЗИД^, а оптимальная находится в пределах 3*2-510 ЭИДзд, что незначительно отличается от данных показателей при применении коммерческой вакцины против ИЛТ из клона "НГ (МИД составила 1,78+0,29 18 ЭИД^, а оптимальная *3*-540 ЭИД^).

Проведены опыты по двукратной аэрозольной вакцинации цыплят ассоциированной вакциной с определением уровня вируснейтрадизув-щих антител, сероконверсии и напряженности иммунитета по контрольному заражению через 16-18 дней после первой и через такой же пе-

риод после второй вакцинации. После, первой вакцинации в дозах 383-532 ЗИДзд антитела накапливались в титрах 1,6-2,2 1е и к 8 трольному заражению были устойчивы 70-90$ привитых цыплят. Пос второй аэрозольной вакцинации в дозах 528-876 ЭИД^д ур0вень а}

тител составил 1,8-2,75 , а напряженный иммунитет после ко} рольного заражения формируется у 80-100% цыплят.

У цыплят, аспирировавших дозы от 383 до 532 ЗИД^, напряг ный иммунитет против ИЛТ наступает к 18 дню, продолжается боле 90 днай и к 240 дню иммунными остаются Ц0% вакцинированных цыг лят. Имеет место зависимость уровня накопления антител с устой низостью цыплят к контрольному заражению штаммом "Богатищевскг В то :ге время с увеличением аспирируемой дозы у цыплят повншах ся титры антител. Уровень антител от 1,9 и выше свидетельса вузт( о наличии напряженного иммунитета к ИЛТ у 805 и более при витых цыплят.

МИД вируса НБ после аэрозольной вакцинации ассоциирование вакциной оостазила 2,13+0,32ЗИД^ Оптимальная доза, дающг защитный эффект после: одноразовой прививки не менее чем у 80$ цыплят, находится в пределах 770-872 ЭИДс^ МИД вируса НБ поел вакцинации коммерческой вакциной из штамма "Ла-Сота" составила 2,04+0,45 ЭИД50. а оптимальная находится в пределах 641 -950 ЭИД50.

После однократной иммунизации цыплят ассоциированной вакц ной в дозах 630-985 ЭИД^ по вирусу НБ напряженный иммунитет в рабатывался к 10 дню более чем у 80# привитых и сохранялся на таком уровне до 180 дней.

Цыплята, получившие в первув вакцинацию дозы вируса НБ 63 885 ЭИДэд, а во вторую - дозы в пределах 872-1206 ЭИД^, имели высокие серологические показатели и уотойчивый иммунитет.'

Так, после первой иммунизации гемагглютинирующие антитела

накапливались в титрах 3,42 - 4,68 , а после второй - в титрах 4,1 - 6,36 1ое2 , после контрольного заражения защита формировалась у 50-100$ привитых цыплят. Уровень накопления антител у цыплят коррелировал с устойчивостьи их к контрольному заражении. Антитела в титре более 3,0.1о£2 свидетельствовали о напряженном иммунитете к НБ не менее 80$ вакцинированной птицы. С увеличением аспирируемой дозы выработка антител наступает в более ранние сроки.

Изучение реактогенных свойств ассоциированной вакцины при аэрозольном применении проводили иммунизацией цыплят в дозах, в несколько раз превышающих оптимальные. Ассоциированная вакцина в дозе до 532 ЭЩЦд по вирусу ИЛТ не вызывала видимых клинических реакций у цыплят, на дозы 3200 и 4600 ЗИД^ соответственно реагировали 11$ и 20;? цыплят.

3.3.3. Определение иммуногенных свойств ассоциированной вирусвакцины при интраназальном методе применения

Опыты по интраназальной вакцинации цыплят ассоциированной вакциной показали, что иммунитет к ИЛТ формируется посла введения вакцинного вируса в дозах от 20 тыс. ЭЭДЦо и более;, обеспечи-зая защиту не менее 80$ привитых. МИД вируса ИЛТ составляет 3,51+ 0,42 ЭйДсд. Оптимальная иммунизирующая доза, определенная расчетным путем, находится в пределах 40-80 тыс. ЭИД^.

Для определения срока наступления и продолжительности иммунитета цыплята были привиты в дозе 40 тыс. ЭИД^. Иммунитет к вирусу ИЛТ после интраназальной прививки начинает формироваться с 10 дней и сохраняется до 240 дней после однократной прививки.Мак-симальный уровень иммунитета по серологическим исследованиям и контрольному заражению наблюдался у цыплят в период с 18 по 180 день посла иммунизации. Яспирируемые цыплятами дозы в пределах 40-640 тыс. ЭИДзд стимулируют образование вируснейтрализующих

антител в границах 2,0-2,5 lg .

МИД вируса НБ при интраназальком применении ассоциирован! вакцины находится в пределах 3,82+0,27 lg ЭИД^. Иммунизируют дозы 0T.I260C0 ЭЙД20 и более обеспечивают формирование иммуни1: та у всех привитых. Дозу 126000 ЗИД^ можно считать близкой к оптимальной.

Для определения срока наступления и продолжительности ит ните»а к НБ цыплята были привиты интраназ&льным методом ассоц! рованной Еакциной в дозе 400 тыс. ЗИД^. К 10-м суткам после t мунизации иммунитет формируется у 50%, к 18 суткам - у 100$ t сохраняет достаточную напряженность до 180 дней после однократ ной вакцинации. Наибольшее накопление гемагглвтинируюцих антит сохраняется через 18-30 суток после прививки. К 240 суткам тич постепенно снижаются с 6,4 log- до 2,9 log, .

* * I 1

3.3.4. Определение иммуногенных свойств ' ассоциированной вирусвакцины при оральном методе применения

МИД вакцинного вируса ИЛТ при оральном применении вакцинь составила 4,89+0,26 lg ЗИД^. Оптимальная иммунизирующая доза учетом 100-кратного запаса находится в пределах 5,94-9,58 млн ЗИДзд. Используя дозу около 870 тыс. ЭИД^, проведены эксперт ты по определению срока наступления и продолжительности иммуни та после однократной выпойки ассоциированной вакцины. К 18 сут после иммунизации иммунитет образуется более чем у 40$ цыплят, максимальный уровень его отмечается в период с 30 по 180 день еле прививки с уровнем вируонейтрализупщих антител в пределах 1,6 - 2,2 lg .

Возможность создания иммунитета к вирусу НБ путем орально вакцинации известна давно. МИД втамма "Ла-Сота" в составе ассо ированной вакцины 6,06+0,48 lg ЗИД50, что на 4 порядка больше.

чем при аэрозольной вакцинации.С учетом запаса оптимальная иммунизирующая доза колеблется в пределах от 40 млн до 356 млн ЭВД50. Используя оптимальную дозу в ез наименьшем значении определяли срок наступления и продолжительность иммунитета к НБ после однократной выпойки ассоциированной вакцины. Устойчивый иммунитет у цыплят по результатам контрольного заражения и серологических исследований формируется с 18 суток (5,7 log2 ) и сохраняется у части привитых до 2*0 суток.(1,9 log2 ). Нарастание актигэмагглаткниноз происходит несколько позже по сравнении с другими методами вакцинации.

Вакцинные вируса ИЛТ и НБ в составе ассоциированной вакцины сохранили свои иммунобиологические сзойстза, характерные 'для ник в составо ооотззтствуэЕих' моновакцин. На основании полученных результатов предлагается Использовать ассоциированную вакцину для профилактики ИТ и НБ птиц в хозяйствах яичного и мясного направлений продуктивности в оптимальных дозах и те же сроки, предусмотренные наставлениями по применению соответствующих моновакцин против ИЛТ и НБ птиц.

3.*. Комиссионные институтские и производственные испытания ассоциированной вирусвакцины против ИЛТ и КБ птиц

Комиссионные испытания по определении стерильности, биологической активности, безвредности и инмуиогеиности проведены о опытной серией й 2 ассоциированной вирусвакцины, изготовленной 16.02.95 г.

В результате проведенных испытаний показано, что вакцина не контаминирована бактериальной и грибной микрофлорой; биологическая активность по вирусу ИЛТ составила 7,0 lg Э^о/ом3, а П0 вирусу НБ - 7,* lg ЭВД50/смЗ.

Безвредность к иммуногенность вакцины проверяли на цыплятах

25-дневного возраста, восприимчивых к ИЛТ и НБ. Контроль безз ности вакцины в отношении вируса НБ проводили путем вкутримып ного введения разведения 1:50 в объеме 0,5 см3 (158 тыс. ЗИДС вируса НБ). Контроль безвредности вакцины в отношении вируса проводили интратрахеальным введением вируса ИЛТ з дозе 3000 ; 50/0,5 см3. В течение 10 суток наблюдения у цыплят отсутствоз изменения некротического характера на месте введения вакцины отклонения от физиологической нормы.

Через 18 дней после интраназальной иммунизации (доза ви] ИЛТ - 40 тис. ЭИД50> доза вируса НБ - 100 тыс. ЭИД50) 20 гол цыплят разделили на 2 группы и заразили одну интратрахеально штаммом "Богатищевский" в дозе 1000 ИД^, а цыплят другой гр; внутримышечно штаммом "Т-53" в дозе 10000 ДД^.

Уровень антиге«агглютининов у цыплят к НБ перед контрол заражением составил 5,5 log2 , а напряженный иммунитет у 90% цинированных цыплят. Против ИЛТ устойчивый иммунитет выработ у 80$ интраназально вакцинированных цыплят. Неимкунные цыпля при контрольном заражении переболели и пали.

Комиссионные испытания ассоциированной вирусвакцшш в у виях института и производства подтвердили результаты лаборат исследований и показали, что ассоциированная вакцина безвред иммуногенна для цыплят яичного и мясного направлений продукт ности и в оптимальных дозах не вызывает поствакцинальных pea и осложнений. Так, при испытаниях в условиях Томилинской пти фабрики на птице породы "Ломан-Браун" при первой иммунизации лята аспирировали 400 ЭИД^ вируса ИЛТ и 800 ЭИД^ вируса НЕ Через 18 дней после второй иммунизации, при которой цыплята чили 600 ЗВД50 вируса ИТ и 1200 ЭИД50 вируса НБ, вся привит птица имела напряженный иммунитет к обоим вирусам, выявленнь контрольном заражении и серодиагностике.

При испытаниях ассоциированной вакцины на Петелинской птицефабрике после однократной аэрозольной иммунизации бройлеры получили 400 ЭВД50 против ИЛТ и 800 ЭИД50 против НБ. Через 18 дней после вакцинации 90% цыплят имели напряженный, иммунитет к ИЛТ с титром преципитирупщих антител 3,2 log2 . Против НБ иммунитет вырабатывался у всех цыплят и титры антигемагглютининов составили 5,9 log2 .

Таким образом, ассоциированная вакцина по показателям безвредности, реактогенности и иммуногенности не уступает соответствующим ионовакцинам против ИЛТ и НБ птиц.

В производственных условиях при использовании ассоциированной вирусвакцины время проведения прививок сокращается в 2 раза, уменьшаются затраты труда на проведение вакцинации ветеринарными (специалистами (расчет вакцины идет лишь по вирусу ИЛТ, разводится одна вакцина вместо двух).

4. В Ы В О Д Ы

1. Впервые показана принципиальная возможность и эффективность совестного культивирования вирусов ИЛТ, клон "НЕ", и НБ, штамм "Ла-Сота", в одном курином эмбрионе, что позволило снизить материальные затраты на получение вируссодержащего сырья для изготовления ассоциированной вирусвакцины, предназначенной для аэрозольного, интраназального и орального методов применения.

2. Ассоциированная вирусвакцина безвредна и ареактогенна для цыплят с 15-20-дневного возраста в оптимальных дозах независимо от направления продуктивности.

3. Ассоциированная вирусвакцина наиболее эффективна при применении указанными методами по схеме: первая вакцинация цып-хят^-бройлеров в возрасте 15-20 дней, цыплят яичных пород - в возрасте; 25-27 дней и повторно через 16-18 дней с посдедувдей

ревакцинацией через каждые 6 месяцев.

Иммунологическая эффективность ассоциированной вирус вакцины не отличается от таковой при применении соответствую моновакцин против ИЛТ и НБ птиц.

5. Ассоциированная вирусвакцина при аэрозольном примене обеспечивает стабильную иммунологическую эффективность при б логической активности по вирусу ИЛТ не ниже 7,0 ЭИДздд^ а по вирусу НБ - в пределах 7,2 - 7,7 ЭИД^д,^. Минимал ная иммунизирующая доза вируса ИЛТ составляет 45,7 ЭИДзд, а руса НБ - 136,5 ЭЙД^д. Оптимальная иммунизирующая доза вирус ИЛТ составляет 400 - 600 ЭИД^, а вируса НБ - 800 - 1200 ЗЩ Напряженный иммунитет после однократной аэрозольной вакцинах в оптимальных дозах против НБ и ИЛТ Формируется на 12-15 сут и сохраняется не менее 6 месяцев.

6. Ассоциированная вирусвакцина при интраназальном прго нении обеспечивает получение стабильного иммунологического ; фекта при биологической активности по вирусу ИЛТ не ниже 7,( ЭИД50/СМ3, а по вирусу НБ - не ниже 9,0 1е ЭИД50//СМ3. Мини; ная иммунизирующая доза вируса ИЛТ составляет 3230 ЭИДзд, а руса НБ - 6600 ЭЩЦд. Оптимальная иммунизирующая доза вирус! ИЛТ составляет 60000 ЭИД50, а вируса НБ - 400000 ЭИД^. Нал; женный иммунитет после однократной интраназальной иммунизац] в оптимальных дозах формируется на 14-17 сутки и сохраняете; не менее 6 месяцев против обеих инфекций.

7. Ассоциированная вирусвакцина при оральном применени эффективна при биологической активности по вирусу ИЛТ не ни 7,0 ЭИД^^уЗ, а по вирусу НБ - не ниже 9,0 ЗЦедд, Минимальная иммунизирующая доза вируса ИЛТ составляет 77600 а вируса НБ - 1140000 ЭИД^. Оптимальная иммунизирующая до вируса ИЛТ составляет 7,76 млн ЭИД^, а вируса НБ - 198 млн

Напряженный иммунитет после однократной оральной вакцинации в оптимальных дозах формируется к 21-30 суткам против ИЛТ и сохраняется не менее трех месяцев, а к НБ - к 20-25 суткам и сохраняется закже не менее трех месяцев.

8. Ассоциированная вирусвакцина против HIT и НБ с положительным эффектом прошла комиссионные лабораторные и производственные испытания на поголовье около 2 млн птиц. Вакцина соответствует требованиям, предъявляемым к профилактическим препаратам подобного типа.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В результате проведенных исследований разработаны и Предложены к практическому применению:

- Временное наставление по применению вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской болезни птиц ассоциированной сухой (Утверждено Департаментом ветеринарии Р® 26.12.94 г.).

- Технические условия по контролю вакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской болезни птиц ассоциированной сухой (Утверждены Департаментом ветеринарии Рз 26.12.94 г.).

- Инструкция по изготовлению и контролю вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской болезни птиц ассоциированной сухой (Утверждена директором ВНИИВВиМ 27.12. 94 г.).

- Способ совместного культивирования вирусов ИЛТ и НБ для изготовления ассоциированной вирусвакцины. По заявке ft 93007931 от 09.02.93 г. получено положительное решение о выдаче патента от 14 марта 1995 года.

t

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зуев Ю.В., Дутко Ю.С., Кушнир А.Т. Получение однос: первично-трипсинизированной культуры клеток из почки курине эмбриона // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологт эпизоотологии: Тез. докл. научн. конф. ВНИИВВиМ. - г.Покро! 1992. - С. 294.

2. Подбор биологических систем для культивирования зщ инфекционного ларинготрахеита кур / Зуев Ю.В., Дутко B.C., ровская Н.К., Купнир А.Т. // Вопросы ветеринарной вирусолог микробиологии и эпизоотологии: Тез. докл. научн. конф. ВНИИ

- г.Покров, 1992. - С. 159-160.

3. Зуев Ю.В., Дутко Ю.С., Кушнир А.Т. Ассоциированная вакцина против инфекционного ларинготрахеита и ньикаслской ни птиц // Ветеринария. - 1995. - й 3. - С. 22-24.

4. ЗуеБ S.B. Иммунологическая эффективность ассоцииров вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньюкасл болезни птиц при аэрозольном применении // Вирусные болезни аивотных: Тез. докл. Всероссийской научно-практ. конф. - Вл мир, 1995. - С. 262.

5. Зуев Ю.В., Дутко Ю.С., Кушнир А.Т. Оценка иммукоген свойств ассоциированной вирусвакцины против инфекционного лi готрахеита и ньикаслской болезни птиц при различных методах менения // Вирусные болезни с.-х. животных: Тез..докл. Bcepi ской научно-практ. конф. - Владимир, 1995. - С. 263.

6. Зуев Ю.В., Дутко И .С., Кушнир А.Т. Принципы разрабо: ассоциированной вирусвакцины против инфекционного ларинготр< та и ньюкаолской болезни птиц // Актуальные вопросы ветерин; вирусологии.: Материалы научно-практ. конф. ВНИИВВиМ. - г.По} I9S5. - С. 165-166.

7. Зуев Ю.З. Оценка иммуногенных свойств ассоциированнс вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслс болезни птиц при аэрозольной вакцинации // Актуальные вопрос ветеринарной вирусологии: Материалы научно-практ. конф. ВНИК

- гЛокров, 1995. - C.I65.

8. Зуев В.В., Дутко B.C., Кушнир А.Т. Иммунологическая эффективность ассоциированной вирусвакцины против инфекционного ларинготрахеита и ньвкаслской болезни птиц при различных методах применения // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: Материалы научно-практ. конф. ВНИИВВиМ. - г.Покров, 1995. - С. 164165.

9. Дутко B.C., Зуев Ю.В., Кушнир А.Т. Способ совместного культивирования вирусов инфекционного ларинготрахеита и ньюкасл-ской болезни птиц в куриных эмбрионах // Заявка на патент

!г 93007931. Приоритет установлен 09.02.93 г. Положительное решение о выдаче патента принято 14.03.95 г.