Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Изучение иммунобиологических свойств вакцин против оспы овец и оспы коз

На правах рукописи □03057685

ГАРЬКИН Алексей Викторович

ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВАКЦИН ПРОТИВ ОСПЫ ОВЕЦ И ОСПЫ КОЗ

16.00.03 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой ст кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2007

003057885

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г. Владимир)

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник ДИБВ Вячеслав Иванович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии» (ГНУ ВИЭВ, г Москва)

заседании диссертационного совета Д 220 015 01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу 600901, г Владимир, мкр Юрьевец

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

УЗЮМОВ Василий Лаврентьевич

(ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г Владимир) доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник БАЛЫШЕВ Владимир Михайлович (ГНУ ВНИИВВиМ, г Покров)

Защита диссертации состоится

в

часов на

Автореферат разослан " ' апреля 2007 г

к

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Оспа мелких жвачных животных является особо опасной инфекцией Возбудителем оспы мелкого рогатого скота являются ДНК-содержащие эпителиотропные вирусы, относящиеся к семейству Роххтйае, роду Сарпрохпгиз В 1964 году на XII сессии Генерального Комитета МЭБ оспу овец внесли в список наиболее опасных болезней животных (список А), подлежащих декларации в случае возникновения Опасность болезни характеризуется высокой контагиозностью и летальностью, которая при доброкачественном течении составляет 5-10% и достигает 80-100% в случае осложнений при присоединении секундарных инфекций Экономический ущерб, наносимый инфекцией слагается из гибели и выбраковки заболевшего поголовья мелкого рогатого скота и больших материальных затрат по отрасли на проведение охранно-карантинных и других мероприятий по ликвидации эпизоотии. Заболевание характеризуется высокой степенью контагиозности, поэтому основным методом борьбы с инфекцией является профилактическая иммунизация восприимчивого поголовья животных

Оспа мелкого рогатого скота остается актуальным в мире заболеванием, (Китай, 2002-2003, Монголия, 2006, Греция, 2007) Появление очагов оспы среди коз в различных странах мира (Турция, 2001; Таджикистан, 2001, Вьетнам, 2005), в том числе в России в 2003 году, а также отдельные сообщения отечественных и зарубежных исследователей о недостаточной эффективности вирусвакцин против оспы овец при профилактике оспы коз свидетельствуют о том, что вирус оспы овец и вирус оспы коз являются самостоятельными таксономическими видами Поэтому наряду с вирусвакциной против оспы овец необходимо иметь и вирусвакцину против оспы коз для профилактики заболевания этого вида животных Создание ассоциированной вирусвакцины и ее стандартизация по качеству и сроку годности возможна при научно-обоснованном подборе штаммов вирусов оспы овец и оспы коз в составе препарата с сохранением его иммунобиологической активности в процессе хранения путем выбора оптимальной защитной среды При правильно подобранных антигенах в составе ассоциированной вирусвакцины организм животного способен отвечать дифференцированно и обеспечивать иммунологическую перестройку в отношении каждого антигена

1.2. Цели и задачи исследования. Целью настоящих исследований было изучение эпизоотологии оспы овец и оспы коз в Российской Федерации, а также разработка технологии изготовления и усовершенствование контроля культуральных моновалентных и ассоциированных вирусвакцин против оспы овец и оспы коз Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи

- провести анализ эпизоотической ситуации по оспе мелкого рогатого скота в Российской Федерации в 1993-2006 годах,

- адаптировать вирус оспы коз к перевиваемой культуре клеток гонады козы (СЬ-91),

- изучить культуральные свойства аттенуированного штамма вируса оспы коз,

отработать технологию изготовления лиофилизированных моновалентной против оспы коз и ассоциированной вирусвакцин против оспы овец и оспы коз,

- изучить иммунобиологические свойства вирусвакцины против оспы коз и ассоциированной против оспы овец и оспы коз,

- оптимизировать методы контроля вирусвакцин,

- изучить особенности формирования поствакцинального иммунитета при иммунизации животных в лабораторных условиях,

- разработать нормативную документацию на полученные биопрепараты

1.3. Научная новизна исследований:

- изучена эпизоотическая ситуация по оспе овец и оспе коз в Российской Федерации в 1993-2006 годах,

- впервые к перевиваемой культуре клеток гонады козы (СЬ-91) адаптирован вирус оспы коз,

разработан метод получения экспериментальных образцов культуральной вирусвакцины против оспы коз и ассоциированной против оспы овец и оспы коз,

- изучена эффективность гомологичной и перекрестной иммунизации овец и коз против оспы,

- оптимизирован метод контроля вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ»

1.4. Практическое значение работы:

- аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз и вирулентный штамм «Приморский 2003» вируса оспы коз депонированы во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (2006г ) Местом хранения указанных штаммов определена коллекция экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (2006г),

- разработаны и утверждены ТУ «Вирусвакцина против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» культуральная сухая» (2004г ),

- одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методические рекомендации

«Методические рекомендации по стационарному и роллерному культивированию атгенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз» (2006г),

«Методические рекомендации по оценке иммуногенной активности вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» и ассоциированной вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» и оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» (2006г ),

«Методические рекомендации по использованию защитной среды ВНИИЗЖ при изготовлении вирусвакцины против оспы коз и ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз» (2007г ),

- разработан и представлен на утверждение проект НД «Ассоциированная вирусвакцина против оспы овец и оспы коз» (2007г)

1.5. Основные положения, выносимые на защиту:

- эпизоотическая ситуация по оспе мелкого рогатого скота в Российской Федерации в 1993-2006 годах,

- патогенные свойства вирулентного штамма «Приморский 2003» вируса оспы коз,

- культуральные свойства аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз в перевиваемой культуре клеток гонады козы (Ch-91),

- эффективность гомологичной и перекрестной иммунизации овец и коз культуральными вирусвакцинами против оспы овец и оспы коз,

- иммунобиологические свойства вирусвакцины против оспы коз и ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз,

- иммунобиологические свойства вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» при длительном хранении

1.6. Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и опубликованы в материалах 2-й Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики» (г.Ставрополь, 2003г), Международной научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» (г Владимир, 2003г); Международной научно-методической конференции «Актуальные проблемы и перспективы развития АПК» (г Иваново, 2005г), Международного симпозиума «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» (г Казань, 2005г), Международного конгресса New Diagn Technol: Applications & Biologics Proc (Saint-Malo, France, 2005г) и на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2002-2006гг

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений, содержит 24 таблицы и 12 рисунков Список использованной литературы включает 250 наименований, из них 111 отечественных и 139 зарубежных. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы для исследований

2.1.1. Вирусы. В работе были использованы вирус оспы овец, вакцинный штамм «ВНИИЗЖ» с титром 5,0-6,0 lg ТЦД5о/см3, вирус оспы овец, вирулентный штамм «Афганский», тканевой, лиофилизированный с титром 5,33 lg ИД50/СМ3, вирус оспы коз, атгенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003», лиофилизированный с титром 5,5-6,5 lg ТЦД50/см3, вирус оспы коз, вирулентный штамм «Приморский 2003», тканевой, лиофилизированный с титром 7,01 lgHZWcM3

2.1.2. Культуры клеток. При выделении штамма вируса оспы коз была использована первично-трипсинизированная культура клеток тестакул козленка При адаптации к перевиваемым клеточным культурам использовали культуры клеток Ch-91, ВНК-21, MDBK, СПЭВ, Vero, RSK, Таурус-2 и Таурус-4.

2.13. Питательные среды и сыворотки. При изучении культуральных свойств вируса оспы коз использовали поддерживающие среды, приготовленные по стандартным прописям среды Игла-МЕМ по прописи ВНИИЗЖ, ПСП, РС-ЗМ, содержащие 1-2% фетальной сыворотки КРС Из других сред использовали ПСС для культуры клеток Vero, 0,4% ГЛА на Эрла для первично-трипсинизированной культуры клеток тестикул козленка

2.1.4. Животные. В работе использовали коз местных грубошерстных пород, а также беспородных 1-3-летнего возраста массой 10-30 кг и овец романовской породы, 1,5-3 летнего возраста массой 20-30 кг 22. Методы исследований

2.2.1. Определение инфекционной активности вируса оспы коз. Титр инфекционной активности вируса оспы коз определяли в 1-3-х сут монослое культуры клеток Ch-91, выращенной в пенициллиновых флаконах при использовании десятикратных разведений вируса с 10"1 до 10'8 на среде Игла, ПСП или РС-ЗМ Зараженные и неинфицированные контрольные культуры клеток термостатировали при 37±0,5°С Через 5-6 суток производили смену поддерживающей среды во флаконах Учет результатов титрования проводили ежедневно в течение 12 дней по наличию ЦПД в инфицированных флаконах и его отсутствию в контрольных Титр вируса определяли по методу Рида и Менча и выражали в lg ТЦД50/см3.

2.2.2. Изучение эвтектических свойств защитных сред. Определение эвтектической зоны стабилизированных и нестабилизированных

вируссодержащих вирусвакцинных суспензий проводили с использованием электрической цепи удельного сопротивления, смонтированной в щите управления сублимационного аппарата производства фирмы вМ] «ив^гок!» (Франция)

2.23. Лиофилизация экспериментальных образцов вирусвакцин. Для

составления вирусвакцины использовали вируссодержащий материал с титром биологической активности не менее 5,0 ^ ТЦД5о/см3 Лиофилизацию вирусвакцин производили в сублимационной установке Б М Д «иБ^гои!» (Франция) После окончания сушки камеру установки заполняли сухим стерильным воздухом и герметизировали флаконы по ОСТ 64-7-85-79 или др в зависимости от используемых флаконов при расфасовке вирусвакцины Флаконы проверяли визуально в проходящем свете на отсутствие трещин и на наличие вакуума при помощи аппарата Д'Арсонваль согласно ГОСТу 28083-89 Массовую долю влажности в высушенном материале определяли согласно ГОСТу 24061-89

2.2.4. Определение стерильности вирусвакцин. Определение стерильности вирусного материала и изготовленных вирусвакцинных препаратов проводили согласно ГОСТу 28085-89

2.2.5. Определение реактогенности и безвредности вирусвакцин. Для определения безвредности и реактогенности каждую серию вирусвакцины против оспы овец испытывали на 2-х овцах, а вирусвакцину против оспы коз — на козах. Вирусвакцину вводили овцам и козам по 5,0 см3 в дозе 500000 ТЦЦ50 подкожно в область бесшерстного участка внутренней поверхности передней конечности

2.2.6. Определение антигенной активности вирусвакцин. Антигенную активность вирусвакцин против оспы овец, оспы коз и ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз проверяли через 7, 14 и 21 дней после иммунизации животных. В культуре клеток СЬ-91 определяли уровень вируснейтрализующих антител Титр антител выражали в логарифмах с основанием 2 (1о&)

2.2.7. Определение иммуногенной активности вирусвакцин. Иммуногенную активность вирусвакцин против оспы овец и против оспы коз определяли через 21 день после вакцинации в различных дозах методом контрольного заражения животных вирулентными штаммами Иммуногенную

активность ассоциированной вирусвакцины проверяли на иммунизированных овцах и козах В качестве контролен служили животные, не подвергавшиеся вакцинации против оспы Для заражения коз использовали вирулентный штамм «Приморский 2003» вируса оспы коз, а для заражения овец - вирулентный штамм «Афганский» вируса оспы овец

2.2.8. Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью компьютерной программы Statistica Basic Statistics and Tables, а также методов, приведенных в руководствах Ашмарина И П, Гланца С., Джупины С И, Еременко В П, Сосова РФ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Иучение эпизоотической ситуации по оспе овец и оспе коз в Российской Федерации в 1993-2006гг.

Российская Федерация до 1993 года в течение длительного времени оставалась благополучной по оспе овец и оспе коз Во время возникшей в 1993 году на юге России (Ставропольский край и Дагестан) в 5 очагах оспы овец заболело 1413 овец, из которых пало 528 голов животных (летальность 37,4%) В дальнейшем в России отмечалось увеличение количества очагов заболевания и до 1999г оспа мелкого рогатого скота в России проявлялась ежегодно В 2000-2006гг оспа мелких жвачных на территории России имела значительно меньшее распространение, чем в 1993-1999гг В 2001, 20042006гг оспу овец и коз на территории России не регистрировали. В 20002003 гг. отмечалось 18 очагов оспы среди овец и коз с общим количеством заболевших 1096, из которых пало 589 животных. За указанный период летальность составила 53,7% Всего в 1993-2006гг. зарегистрировано 108 очагов оспы среди овец и коз с общим количеством заболевших 19804, из которых пало 11890 (летальность 60%) Случаи заболевания коз оспой отмечались в 1997 и в 2002 годах во время вспышек оспы овец В 2003 году оспа коз возникла в Еврейской АО как самостоятельное заболевание.

3.2. Анализ вспышки оспы овец и коз в Еврейской АО и Приморском

крае в 2002 году

Возникшие в 2002 году в двух регионах Дальнего Востока очаги оспы овец были локализованы, в основном, в частном секторе и ликвидированы путем

убоя больных животных, осуществления карантинных мер и проведения вынужденной вакцинации всего поголовья восприимчивых животных в неблагополучных и угрожаемых пунктах В большинстве случаев у овец отмечалось течение болезни без сливных и геморрагических поражений Вследствие того, что заболевание возникало в основном в частных дворах, возбудитель не прошел длительных пассажей на чувствительных животных и не приобрел для них высокой патогенности Первые случаи заболевания овец оспой были зарегистрированы в августе-сентябре 2002 года в Ленинском районе ЕАО, граничащем с Китаем. В дальнейшем оспа овец была зарегистрирована в 4-х районах ЕАО - Смидовичском, Октябрьском, Облученском и Биробиджанском Распространение инфекции было более значительным на территории ЕАО, где заболевание было зарегистрировано в 5 районах области Из 1264 овец заболели 374, из числа которых 58 пали, летальность составила 6, 45% Убито 341 животное Во время вспышки оспы овец в Ленинском районе Еврейской АО отмечались единичные случаи заболевания коз

В Приморском крае первый случай оспы выявлен среди овец, принадлежащих СПХК "Луговое" и жителям Хорольского района В последующем единичные очаги оспы были обнаружены в Спасском, Ханкайском, Анучинском, Шкотовском, Михайловском и Уссурийском районах Всего в Приморском крае в 7 неблагополучных пунктах было выявлено 152 овцы, больных оспой, из которых 12 пали (летальность 12,7%) Было вынужденно убито 128 овец

Диагностика болезни проводилась на основании характерных клинических признаков, патологоанатомических изменений и результатов лабораторных исследований, проведенных Еврейской областной, Приморской краевой ветлабораториями и ФГУ «ВНИИЗЖ» В качестве патологического материала были исследованы пробы сыворотки крови и кожные поражения в виде папул В сыворотках крови овец, ранее не подвергавшихся вакцинации против оспы, установлено наличие высокого уровня антител к вирусу оспы овец В ИФА титр антител составил 1.1000, в РДСК-1 80-1:160, в РДП-1:4-1 16 Активность суспензии из проб кожи в ИФА составляла 1 256-1 1024, в РДСК-1*32-1-64, в РДП-1 2 Методом заражения культуры клеток СЬ-91 произведено выделение возбудителя При дальнейшем исследовании материала в ПЦР подтверждена принадлежность изолята к вирусу оспы овец

В октябре-ноябре 2003 года в частном секторе двух населенных пунктов Ленинского района Еврейской АО (с Ленинское и с.Калинино) было зарегистрировано заболевание коз с подозрением на оспу. До возникновения болезни иммунизация против оспы среди животных не проводилась. У заболевших коз отмечались высокая температура тела и характерные для оспы поражения кожи в области вымени, бесшерстных и малошерстных участков туловища и головы Поражения у молодняка в возрасте до года локализовались в области губ и на слизистой ротовой полости Всего было зафиксировано 14 случаев заболевания животных. При лабораторном исследовании патологического материала на восприимчивых животных (козы) и в культуре клеток был изолирован вирусный агент, идентифицированный как вирус оспы коз, который в дальнейшем был использован в качестве контрольного при изучении напряженности поствакцинального иммунитета

3.3. Изучение биологических свойств вирулентного штамма «Приморский 2003» вируса оспы коз 3.3.1. Выделение вируса и определение титра инфекционной активности

Выделение возбудителя из патологического материала козы, поступившего из ЕАО, осуществляли прямым заражением местных беспородных коз 1-2 летнего возраста Для заражения использовали 20% тканевую вируссодержащую суспензию патологического материала, которую вводили внутрикожно в ряд точек на освобожденной от шерсти боковой поверхности туловища На 5 сутки после заражения была установлена генерализация оспенного процесса, преимущественно на стадии папул, наблюдавшихся в большом количестве в месте введения вирусной суспензии, в области вымени, внутренней поверхности грудных и тазовых конечностей и подхвостовой складки На 7 сутки после заражения животное было подвергнуто вынужденному убою Из пораженных участков кожи был отобран вируссодержащий материал, который в виде 20% тканевой суспензии был использован для получения расплодки при проведении 2-го пассажа на животном Получение расплодки вирулентного штамма осуществляли внутрикожной инокуляцией тканевого вируссодержащего материала в 100 точек по боковой поверхности туловища, освобожденной от шерстного покрова На 7-й день после заражения при выраженных признаках генерализации, животное было обескровлено В дальнейшем полученный

вируссодержащий материал был лиофилизирован в виде тканевой суспензии и исследован на инфекционную активность При титровании вирус вводили козе в разведениях от 10'2 до 10'7 на выбритые боковые поверхности туловища, инъецируя каждое разведение внутрикожно в 4 точки в объеме по 0,5 см3 на каждое введение Учет результатов проводили по образованию инфильтратов в местах инокуляции вируса Титр инфекционной активности вируса соответствовал 7,01 1§ИД5о/0,5 см3 3.3.2. Изучение клинических признаков заболевания и оценка патогенных свойств вируса оспы коз на восприимчивых животных Патогенность возбудителя в зависимости от введенной заражающей дозы оценивали по продолжительности инкубационного периода, проявлению, тяжести течения болезни и ее исхода Данные о проявлении клинических признаков оспы коз отражены в таблице 1

Таблица 1

Клинические признаки и исход заболевания коз оспой при заражении различными дозами вирулентного штамма вируса оспы коз

п=10

№ п/п Исследуемые показатели Количество инфекционных доз (ИД5о/0,5см3)

100 500 1000

1 Количество животных в опыте 1 2 7

2 Инкубационный период, дни 3 4 3-6

3 Начальное проявление местной реакции, дни 4 4 3-4

4 Начало лихорадочного периода, дни 4 7 3-7

5 Длительность лихорадочного периода, дни 10 2-3 2-6

6 Время наступления генерализации, дни 10 6-7 5-8

7 Инфекционная экзантема розеолы 1/1 2/2 7/7

8 папулы 1/1 2/2 7/7

9 Ринит и кератоконьюнктивит 1/1 2/2 7/7

10 Бронхопневмония 1/1 2/2 6/7

11 Артрит 1/1 2/2 6/7

12 Мастит и агалактия 1/1 2/2 5/7

13 количество голов 1/1 2/2 7/7

дни 14 10-11 4-12

14 Выраженность паталогоанатомических изменений 1/1 2/2 5/7

Примечание в числителе — количество реагирующих животных, в знаменателе - количество животных в опыте.

Из данных таблицы 1 видно, что независимо от дозы введенного козам вируса, заболевание всегда заканчивалось летально. Инкубационный период составлял 3-6 дней, лихорадочный период начинался с 3-7 дня, и продолжался от 2 до 10 дней. Оспенная экзантема у коз характеризовалась розеолезно-папулезной стадиями. Формирования везикул и пустул не наблюдалось ни в одном из случаев заражения. В последующем данный вирулентный штамм вируса оспы коз был обозначен как «Приморский 2003» и депонирован во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов». Местом хранения штамма вируса определена коллекция экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (2006г.),

3.3.3. Адаптация вируса оспы коз к первичным и перевиваемым культурам клеток и изучение культуралышх свойств Выделение и начальные пассажи вируса оспы коз осуществляли в первично-трипсинизированной культуре клеток тестикул козленка, в которой с увеличением количества пассажей и времени культивирования вируса оспы коз, титр биологической активности вируса постепенно возрастал. Биологическая активность вируса в процессе пассирования при его адаптации к культуре клеток СИ-91 отражена на рис, 1.

м

3; о

а ¿г

о, Э"

£ л1

— ■■■

у/

г- :„;- -■.

. и. ■-■.-■

■

. , ■ -.....■.. .г ' -: ■"- ' ■

1 3 5 7 Э 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 количество пассажей

Рис. I. Биологическая активность вируса оспы коз при культивировании в

продолжение 35 пассажей в культуре клеток СИ-91 Из данных, представленных на рис.1 следует, что вирулентный штамм вируса оспы коз был адаптирован к культуре клеток СЬ-91 и пассирован в ней на протяжении 35 пассажей, в продолжение которых вирус характеризовался высоким потенциалом репродукции, стабильностью

культуральных свойств и морфологических признаков, сходных с таковыми у вируса оспы овец (рис.2 и 3).

Рис.2 Рис. 3

Рис.2. Морфология в ири о нов кул ыпурального вируса оспы коз в концентрированном препарате. Различная степень контраста свидетельствует о гетерогенности вирусной популяции, выявляемой в условиях негативного контрастирования, х 76000. (Пономарев А.П.)

Рис. 3. Морфология варионое культурального вакцинного штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец в концентрированном препарате. Негативное контрастирование, х 110000. (Пономарев А.П.)

Выраженное ЦПД, характерное для вируса оспы, отмечалось с 3-го пассажа. В дальнейшем вирус оспы коз был лиофилизирован и использован для продолжения исследований. Из числа исследованных перевиваемых культур клеток слабая чувствительность к вирусу оспы коз отмечалась у культур Таурус-2 и 4, КСТ и более выраженная у RSK. Культуры ВНК-21, MDBK, Vero и СПЭВ оказались не чувствительными к вирусу оспы коз.

3.4. Изучение культуральиых свойств аттенуироваиного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз

Аттеиуированный штамм вируса оспы коз был получен из вирулентного штамма «Приморский 2003» при проведении 35 пассажей в культуре клеток Ch-91. В опыте на восприимчивых животных (козы) было установлено отсутствие патогенности и реверсибелыюсти полученного штамма. В

последующем атгенуированный штамм вируса оспы коз был обозначен как «ВНИИЗЖ 2003» и депонирован во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» Местом хранения штамма вируса определена коллекция экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (2006г) При дальнейшем изучении кулыуральных свойств аттенуированного штамма в культуре клеток СЬ-91 использовали лиофилизированный вирус с активностью 5,0 ТЦД50/см3 и выше Культивирование вируса проводили до наступления полной специфической деструкции монослоя клеток. В зависимости от дозы заражения, составлявшей 0,01-1 ТЦЦ5о/кл, вирус накапливался в титрах не ниже 5,0 ТЦД50/см3 (таблица 2)

Таблица 2

Влияние дозы заражения на репродукцию вируса оспы коз в культуре клеток СЬ-91

Доза (ТЦЦ50/кл) Период культивирования (сут) Площадь поражения монослоя клеток (%) Титр вируса (1ё ТЦД5о/см3)

0,01 6-7 80-90 7,17±0,10

0,05 5-6 80-90 6,67±0,08

0,1 5-6 60-70 6,17±0,72

1 (концентрат) 4-5 50-60 5,33±0,17

Из таблицы 2 видно, что при заражении культуры клеток в дозе 0,01-1 ТЦД50/кл, накопление аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз в культуре клеток СЬ-91 обеспечивалось на уровне 5,33-7,17 ^ ТЦД50/см3 за 4-7 суток при поражении клеточного монослоя, составляющем 50-90% Оптимальной инфицирующей дозой вируса оказалась 0,01-0,05 ТЦД50/кл, вызывавшая при стационарном культивировании в течение 5-7 суток накопление вируса в титре от 6,67±0,08 до 7,17±0,10 ^ ТЦЦ50/см при 80-90% поражении клеточного монослоя Характер наблюдавшегося проявления ЦПД аттенуированного штамма вируса оспы коз в монослое культуры клеток СЬ-91 при стационарном культивировании представлен на рисунках 4-7

Рис.4 Рис. 5

Рис. 4. Монослой 3-х суточной незаряженной культуры клеток СИ-91. Хорошо выражена компактность клеток веретенообразной формы. Х/(У. Рис. 5. Неинфицированчые клетки 3-х суточной культуры С11-91. *40.

Рис■ 6 Рис. 7

Рис. 6. Монослой культуры клеток СИ-91 па 5-е сутки после заражения вирусом оспы коз с характерной картиной ЦПД: отмечаются множественные гроздьевидные скопления округлившихся светопреломляющих клеток. х10.

Рис. 7. Клетки монослоя культуры СИ-91, зараженные вирусом оспы коз на 5-е сутки после инфицирования. *40.

Стабильность культурапьных свойств атгенуированного штамма вируса оспы коз при определении степени его накопления в течение 25 пассажей в культуре клеток С К-91 при заражающей дозе 0,01-0,05 ТЦДм/кл. представлена на рис, 8,

о 5

>, г

а. ""г

| §

X О!

5В»—■

_«

■ ■ .....—-—

. ■ ■■ - .и Д Ж Ч. ■:.::■

. - ■■ - ' у- :4г •' . . -... - - ...

' -.'г > ' '* .-'

Э 11 13 15 17 номер пассажа

19 21 23 25

¡'ис.8. Биологическая активность штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз при дозе заражения 0,01-0,05 ТЦДц/кл. культуры клеток С/1-91 Из данных, представленных на рис. 8 видно, что в процессе пассирования в условиях стационарного культивирования вируса оспы коз с дозой заражения 0,01-0,05 ТЦД;(/кл., его биологическая активность на уровне 6,007,50 1ц ТЦДзц/см3 отмечалась в течение первых 13 пассажей. При увеличении количества пассажей биологическая активность вируса постепенно снижалась. При сравнительном аналнзе стационарного и роллерного способов культивирования атгенуированного штамма вируса оспы коз, была установлена возможность наработки высокоактивного вирусного материала посредством использования роллерной технологии. Результаты исследования представлены в таблице 3.

Таблица 3

Зависимость титра аттенуироваиного штамма вируса оспы ко:) от времени и способа культивирования в культуре клетокСЬ-91

Параметры Титр вируса ТЩЬ»'см3)

культивирования Стационарный Роллсриый'

Время Пассаж вируса

(сут.) 8 14 8 [4

3 с сывороткий 4,00±0,20 2,76±0,25 4,76±0,4б 3,66±0,15

без сыворотки 3,0 8 ±0,23 1,20±0,25 4,2 5 ±0,43 2,03*0,28

5 с сывороткой 5,25±0,13 4,25±0,43 5,33±0,27 5,00±0,21

без сыворотки 4,00*0,21 2,02±0,30 4,60±0,28 3,50±0,13

7 с сывороткой 6,5 5 ±0,3 4 5,55±0,34 7,33±0,29 6,00±0,35

без сыворотки 5,26±0,20 3,30±0,14 6,33±0,26 4,51±0,17

Примечание: * - доза заражения культуры клеток - 0,01-0,05 ТЦДи/кл; содержание сыворотки 1%.

Из данных таблицы 3 видно, что в зависимости от пассажа вируса от исходного, при одинаковых параметрах заражения культуры клеток, использования поддерживающей среды с 1% содержанием в ее составе сыворотки крови КРС и общей продолжительности культивирования вируса, установлена возможность получения активного вирусного материала роллерным способом. Культивирование вируса оспы коз в культуре клеток Ch-91 без сыворотки крови КРС с увеличением числа пассажей сопровождалось снижением интенсивности его репродукции. В условиях роллерного культивирования при дозе заражения 0,01-0,05 ТЦЦ50/кл для репродукции атгенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз оптимальной является 1% концентрация сыворотки крови КРС в составе поддерживающей среды Увеличение содержания сыворотки крови КРС до 5% приводило к ингибированию вирусной активности как при стационарном, так и при роллерном способе культивирования

3.5. Оценка свойств различных защитных сред при изготовлении сухой

культуральной вирусвакцины против оспы коз

Проведенные исследования по определению эвтектических зон и температуры полного замораживания, биологической активности вирусвакцины против оспы коз в условиях воздействия положительных температур и влияния компонентного состава ГЛА-сахарозо-желатозного стабилизатора на уровень остаточной влажности, при лиофилизации вирусвакцины против оспы коз показали лучшие результаты при конечной концентрации ГЛА от 2,5 до 5,0%, сахарозы от 2,0 до 3,0% и желатозы от 0,5 до 1,0% в составе вирусвакцины. Из других защитных сред может быть рекомендовано к применению обезжиренное молоко

3.6. Изучение иммунобиологических свойств вирусвакцин против оспы овец и оспы коз при гомологичной и перекрестной иммунизации 3.6.1. Исследование реактогеппости и безвредности вирусвакцины

против оспы коз

Определение безвредности и реактогенности экспериментальных серий вирусвакцины против оспы коз проводили на козах местных пород 1-3-летнего возраста Препарат вводили животным по 5,0 см3 в дозе 500000 ТЦД5о подкожно в область бесшерстного участка внутренней поверхности передней

конечности За животными вели наблюдение в течение 21 дня Вирусвакцину считали безвредной, если она не вызывала заболевания и гибели коз В единичных случаях у животных на месте введения вирусвакцины отмечалось образование на 4-6 сутки воспалительного отека в виде небольшого тяжа размером от 1 до 3 см2, который исчезал на 3-14 сутки и никак не отражался на клиническом состоянии животных На протяжении всего срока наблюдения температура тела коз оставалась в пределах физиологической нормы Это позволило заключить, что вирусвакцина против оспы коз из атгенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз является безвредным и ареактогенным препаратом

3 62. Оценка эффективности вирусвакцин с использованием метода контрольного заражения животных Гомологичная иммунизация. Иммуногенную активность вирусвакцины против оспы коз проверяли на 21-й день после иммунизации коз в дозах 500000, 4000, 1000, 100 и 10 ТЦЦ50 контрольным заражением иммунных и неиммунных контрольных коз вирулентным штаммом «Приморский 2003» вируса оспы коз внутрикожно в область подхвостовой складки в дозе 1000 ИД50/0,5 см3 За исключением животных, на которых производился контроль безвредности препарата (500000 ТЦД50), всем остальным животным вирусвакцину вводили в объеме 1 см3 подкожно После заражения животных наблюдали 14 дней с ежедневной термометрией и осмотром Контрольные животные погибали с характерными признаками оспы В период иммунизации и после контрольного заражения температура тела коз, иммунизированных различными дозами вирусвакцины против оспы коз, оставалась на уровне физиологической нормы

Перекрестная иммунизация. Изучение эффективности перекрестной иммунизации коз проводили, используя вирусвакцину против оспы овец в дозе 4000 ТЦЦ5о, а для овец в аналогичной дозе использовали вирусвакцину против оспы коз Всех вакцинированных и двух неиммунных контрольных животных через 21 день заразили вирулентным штаммом «Приморский 2003» вируса оспы коз внутрикожно в область подхвостовой складки по 1000 ИД5О/0,5 см3 За животными вели наблюдение в течение 14 дней Результаты контрольного заражения гомологично и перекрестно иммунизированных коз, представлены в таблице 4

Таблица 4

Результаты заражения коз, иммунизированных различными вирусвакцинами, вирулентным штаммом «Приморский 2003» вируса

оспы коз

Иммунизация вирусвакциной Доза вирусвакцины, ТЦЦ50 Результаты заражения

наличие повышенной температуры тела местная реакция генерализация гибель

против оспы коз 500000 0/4 0/4 0/4 0/4

4000 0/7 0/7 0/7 0/7

1000 0/3 0/3 0/3 0/3

100 0/2 0/2 0/2 0/2

10 0/3 0/3 0/3 0/3

против оспы овец 4000 3/4 3/4 0/4 0/4

контроль 2/2 2/2 2/2 2/2

Примечание в числителе - количество положительно реагирующих,

в знаменателе — число животных в опыте

Из таблицы 4 видно, что все козы при гомологичной иммунизации вирусвакциной против оспы коз независимо от прививной дозы были предохранены от заболевания оспой, тогда как у иммунизированных вирусвакциной против оспы овец у 3-х из 4-х животных отмечено повышение температуры тела и наличие местной реакции в области введения вирулентного вируса, которая возникала на 3-4-е сутки и выражалась гиперемией и болезненным отеком, достигавшим размеров 5 см2 и более, сохранявшимся на протяжении всего срока наблюдения. Контрольные животные реагировали на заражение повышением температуры тела до 41,0°С, образованием отека в области введения вируса, наличием генерализации оспенного процесса и гибелью.

В дальнейшем проведены исследования по изучению эффективности гомологичной иммунизации овец вирусвакциной против оспы овец и перекрестной иммунизации овец вирусвакциной против оспы коз Результаты контрольного заражения гомологично и перекрестно иммунизированных овец представлены в таблице 5

Таблица 5

Результаты заражения овец, привитых различными вирусвакцинами, вирулентным штаммом «Афганский» вируса оспы овец

Иммунизация вирусвакциной Доза вирусвакцины, тцд» Результаты заражения

наличие повышенной температуры тела местная реакция генерализация гибель

против оспы овец 500000 0/4 0/4 0/4 0/4

4000 0/6 0/6 0/6 0/6

40 0/2 0/2 0/2 0/2

против оспы коз 4000 4/4 2/4 0/4 0/4

контроль 2/2 2/2 2/2 2/2

Примечание в числителе - количество положительно реагирующих,

в знаменателе - число животных в опыте Из таблицы 5 видно, что все овцы, привитые вирусвакциной против оспы

овец (гомологичная иммунизация) независимо от дозы вирусвакцины были

устойчивы к экспериментальному заражению. При перекрестной

иммунизации - введении овцам вирусвакцины против оспы коз в прививной

дозе — после заражения вирулентным штаммом «Афганский» вируса оспы

овец у всех животных отмечено повышение температуры тела до 40,5°С, а у

2-х из 4-х овец - образование болезненного отека в месте введения вируса

размером до 6 см2 и наличие гиперемии в паховой области, которые

сохранялись в течение всего срока наблюдения. Таким образом, перекрестная

иммунизация овец вирусвакциной против оспы коз при заражении животных

вирулентным штаммом вируса оспы овец не предохраняла их от

переболевания, сопровождавшегося повышением температуры тела и

выраженной местной реакцией на вирус Контрольные овцы болели оспой в

генерализованной форме и погибали в течение 9-10 дней

3.6.3. Исследование поствакцинального гуморального иммунитета у овец

и коз

Как было указано выше, перекрестно иммунизированные овцы и козы реагировали на заражение повышением температуры тела до 40,5°С и образованием отека размером до 5 см2 в месте инокуляции возбудителя, что свидетельствовало о заболевании животных оспой, тогда как после

вакцинации гомологичными препаратами овец - вирусвакциной против оспы овец и коз — вирусвакциной против оспы коз, и заражения вирулентными штаммами, все животные были здоровы, а на месте введения вирулентных штаммов наличия гиперемии и отека не установлено Уровень антител в крови иммунизированных животных зависел от дозы введенной вирусвакцины и сроков вакцинации. Во всех случаях наличие максимального уровня антител установлено на 21-й день после иммунизации животных Несмотря на различную специфическую активность сыворотки крови животных, привитых различными дозами вирусвакцины, все козы были предохранены от заболевания оспой при экспериментальном заражении вирулентным штаммом «Приморский 2003» вируса оспы коз

3.7. Изучение иммунобиологических свойств ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз Антигенную активность ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз определяли на 7, 14 и 21-й день после вакцинации Результаты исследования антигенной и иммуногенной активности ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз, представлены в таблице 5

Таблица 6

Антигенная и иммуногенная активность ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз

Разведение вирусвакцины Дни после Титр антител (1о;>2)

в Овцы Козы

акцинации к вирусу Результаты к вирусу Результаты

оспы овец заражения оспы коз заражения

7 1,47±0,25 - 1,20±0,22 -

1 25 14 1,74±0,30 - 1,83±0,31 -

21 2,04±0,22 0/6 2,25±0,25 0/6

7 - - 0,41±0,10 -

1 1000 14 - - 0,90±0,11 -

21 - - 1,51±0,35 0/2

7 - - 0,25±0,02 -

1 10000 14 - - 0,57±0,11 -

21 - - 1,11 ±0,25 0/2

Контроль 0 2/2 0 2/2

Примечание- в числителе — количество заболевших животных, в знаменателе — количество животных в опыте, «-»- исследований не проводили.

Из таблицы 6 видно, что максимальный уровень антител в крови животных выявлен на 21-й день после вакцинации, который у овец и коз, вакцинированных в прививной дозе 1 см3, разведенной 1.25 вирусвакцины, был примерно одинаковым и соответствовал 2,04±0,22 и 2,25±0,25 1о§2 Независимо от степени разведения вирусвакцины все привитые ассоциированной вирусвакциной козы были устойчивы к заражению вирулентным штаммом вируса оспы коз, их состояние было в пределах физиологической нормы, повышения температуры тела не отмечалось Контрольные овцы и козы болели оспой в генерализованной форме с наличием специфической экзантемы по всему телу и погибали на 7-11 сутки после заражения

3.8. Биологическая активность вирусвакцины против оспы овец из

штамма «ВНИИЗЖ» в условиях длительного хранения С целью определения биологической активности вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» в процессе длительного хранения при температуре 2-8°С, методом титрования в перевиваемой культуре клеток СЬ-91 было исследовано 6 серий препарата При этом было выявлено, что специфическая активность вируса в вирусвакцине после ее изготовления была в пределах 5,00-5,50 ^ ТЦЦ50/СМ3, а массовая доля влаги - 3,0-4,7% При длительном хранении вирусвакцины ее активность снижалась в пределах на 0,17-1,12 ТЦД50/см3 Более выраженное снижение

специфической активности на 0,84-1,12 ^ ТЦД50/см3 проявлялось при повышенном содержании массовой доли влаги - 3,8-4,7%

Исследование антигенной и иммуногенной активности вирусвакцины, хранившейся в течение 6-24 месяцев со дня изготовления показало, что титр антител в крови привитых животных зависел от дозы вирусвакцины, а также от сроков после вакцинации Через 21 день после иммунизации овец заражали вирулентным штаммом «Афганский» вируса оспы овец по 1000 ИД50/0,5 см3 внутрикожно в область подхвостовой складки При контрольном заражении все овцы, привитые вирусвакциной, хранившейся в течение 6-24 месяцев, были предохранены от заболевания оспой, тогда как контрольные животные заболели и пали в течение 8-13 дней с характерными для оспы клиническими признаками Полученные результаты послужили основанием для продления срока годности вирусвакцины против оспы овец до 2-х лет и

изменения метода контроля ее иммуногенной активности по величине титра антител без контрольного заражения животных

4. ВЫВОДЫ

1. Обобщены и проанализированы сведения по эпизоотической ситуации по оспе овец и оспе коз в Российской Федерации в 1993-2006 годах Установлено, что наиболее неблагополучная эпизоотическая ситуация по оспе овец отмечалась в 1995-1997 годах. Как самостоятельное заболевание оспа коз зарегистрирована в России в 2003 году в Еврейской АО

2 Выявлены особенности клинического проявления оспы коз и изучены патогенные свойства вирулентного штамма «Приморский 2003» вируса оспы коз, вызывающего 100% летальность при внутрикожном введении животным. Наряду с высокой патогенностью установлено наличие у штамма «Приморский 2003» вируса оспы коз выраженных антигенных свойств, индуцирующих выработку специфических вируснейтрализующих антител

3 Изучены культуральные свойства аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз и разработаны методы его культивирования при использовании перевиваемой культуры клеток гонады козы (СЬ-91), показана возможность использования культурального вируса для производства моновалентной против оспы коз и ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз

4 Отработаны параметры использования стабилизатора на основе гидролизата лактоальбумина, сахарозы и желатозы при лиофилизации вирусвакцины против оспы коз, изучена ее термостабильность в условиях хранения при различных температурных режимах Проведенные исследования биологической активности вирусвакцины показали лучшие результаты при конечной концентрации ГЛА 2,5-5,0%, сахарозы 2,0-3,0% и желатозы 0,5-1,0% в ее составе

5 Разработана технология изготовления и контроля сухой культуральной вирусвакцины против оспы коз из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз и изучены ее иммунобиологические свойства в лабораторных условиях на козах. Установлено, что при контрольном заражении вакцинированных животных вирулентным вирусом в летальной дозе, все животные были защищены от заболевания

6 Разработана технология изготовления и контроля сухой ассоциированной культуральной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз и изучены ее иммунобиологические свойства в лабораторных условиях Показано, что при контрольном заражении вакцинированных овец и коз вирулентными штаммами вирусвакцина обеспечивает защиту от заражения в разведениях 1 25 для овец и 1 25-1 10000 для коз

7 Установлено, что вирусвакцина против оспы коз и ассоциированная вирусвакцина против оспы овец и оспы коз являются ареактогенными препаратами с высокой антигенной и иммуногенной активностью

8 Показано, что перекрестная иммунизация коз вирусвакциной против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец и иммунизация овец сухой культуральной вирусвакциной против оспы коз из атгенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз в прививной дозе 4000 ТЦЦ5о не предохраняет всех животных от проявления клинических признаков при контрольном заражении вирулентными штаммами вирусов в летальных дозах.

9 Оптимизирован метод контроля вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» по динамике накопления специфических вируснейтрализующих антител без контрольного заражения животных вирулентным вирусом Показано, что при титре вируснейтрализующих антител 2,0 1о§2 и выше животные устойчивы к контрольному заражению

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Атгенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз и вирулентный штамм «Приморский 2003» вируса оспы коз депонированы во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (2006г ). Местом хранения указанных штаммов определена коллекция экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (2006г.).

2. Разработаны и утверждены ТУ «Вирусвакцина против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» культуральная сухая» (2004г)

3. Одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методические рекомендации

- «Методические рекомендации по стационарному и роллерному культивированию атгенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз» (2006г),

- «Методические рекомендации по оценке иммуногенной активности вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» и ассоциированной вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» и оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» (2006г);

- «Методические рекомендации по использованию защитной среды ВНИИЗЖ при изготовлении вирусвакцины против оспы коз и ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз» (2007г)

4 Разработан и представлен на утверждение проект НД «Ассоциированная вирусвакцина против оспы овец и оспы коз» (2007г.)

6. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Гарькин, A.B., Вспышка оспы овец и коз на Дальнем Востоке России в 2002 году / A.B. Гарькин, В И. Диев // Актуал вопросы зоотехнич науки и практики- матер 2-й Междунар науч -практич конф - Ставрополь, 2003 -С 295-296.

2 Усовершенствование методов контроля вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» / М С Зиновьева, A.B. Гарькин, Д К Басова, Ф П. Курченко, В И Диев, В М Захаров // Актуал вопросы зоотехнич науки и практики матер 2-й Междунар. науч -практич конф - Ставрополь, 2003 -С 317-320

3. Исследование кинетики термоинактивации вирусвакцин против оспы мелких жвачных / A.B. Гарькин, В И. Диев, P.M. Онищенко, Д К. Басова // Актуал пробл. инфекц. патологии жив -х: матер. Междунар науч конф, посвящен. 45-летию ФГУ ВНИИЗЖ - Владимир, 2003. - C.4I2-415.

4. Влияние длительного хранения лиофилизированной вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» на

специфическую активность / Д К Басова, A.B. Гарькин, М С Кукушкина, В И Диев, Ф П Курченко // Актуал пробл инфекц патологии жив -х матер Междунар науч конф, посвящен 45-летию ФГУ ВНИИЗЖ - Владимир, 2003 -С.451-452

5 Влияние остаточной влажности вирусвакцин против оспы мелких жвачных на сохранение качества биопрепаратов в условиях повышенных темеператур / A.B. Гарькин, Р М Онищенко, В М. Захаров, В И Диев // Актуал пробл и перспективы развития АПК матер Междунар науч.-методич конф, посвящен 60-летию победы в ВОВ и 75-летию ИГСХА -Иваново, 2003 - Т 2 - С 38-39.

6 Изучение эвтектических свойств на этапе стабилизации вирусвакцин против оспы мелкого рогатого скота / A.B. Гарькин, Р М Онищенко, В М Захаров, В И. Диев // Актуал. пробл и перспективы развития АПК. матер Междунар науч -методич конф, посвящен 60-летию победы в ВОВ и 75-летию ИГСХА - Иваново, 2003 - Т 2 - С 113-114.

7 Эвтектические зоны альтернативной группы стабилизаторов, использованных в процессе изготовления моновирусвакцин против оспы овец и оспы коз / A.B. Гарькин, Р М. Онищенко, В И Диев, В М Захаров // Науч основы обеспечения защиты жив -х от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекц заболеваний, матер Междунар симпозиума - Казань, 2005. - Ч 2 - С 96-100

8 Гарькин A.B., Иммуногематологический статус при оспе коз // A.B. Гарькин / Ветеринарная патология. - 2006. - №4(19) С 84-86

9 Clinical signs of goat pox following experimental infection / VI Diev, A.V. Gar'kin, D К Basova, V M Zakharov // New Diagn Technol Applications & Biologies Proc - Saint - Malo, France, 2005. -Pill.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «ВНИИЗЖ», 90 экз апрель 2007

Актуальность темы. Оспа мелких жвачных животных является особо опасной инфекцией. Возбудителем оспы мелкого рогатого скота являются ДНК-содержащие эпителиотропные вирусы, относящиеся к семейству Poxviridae, роду Capripoxvirus. Опасность болезни характеризуется высокой контагиозностью и летальностью, которая при доброкачественном течении составляет 5-10% и достигает 80-100% в случае осложнений при присоединении секундарных инфекций. Экономический ущерб, наносимый инфекцией слагается из гибели и выбраковки заболевшего поголовья мелкого рогатого скота и больших материальных затрат по отрасли на проведение охранно-карантинных и других мероприятий по ликвидации эпизоотии.

Оспа мелкого рогатого скота остается актуальным в мире заболеванием, (Китай, 2002-2003; Монголия, 2006; Греция, 2007). Появление очагов оспы среди коз в различных странах мира (Турция, 2001; Таджикистан, 2001; Вьетнам, 2005), в том числе в России в 2003 году, а также отдельные сообщения отечественных и зарубежных исследователей о недостаточной эффективности вирусвакцин против оспы овец при профилактике оспы коз свидетельствуют о том, что вирус оспы овец и вирус оспы коз являются самостоятельными таксономическими видами. Поэтому наряду с вирусвакциной против оспы овец необходимо иметь и вирусвакцину против оспы коз для профилактики заболевания этого вида животных. Создание ассоциированной вирусвакцины и ее стандартизация по качеству и сроку годности возможна при научно-обоснованном подборе штаммов вирусов оспы овец и оспы коз в составе препарата с сохранением его иммунобиологической активности в процессе хранения. При правильно подобранных антигенах в составе ассоциированной вирусвакцины организм животного способен отвечать дифференцированно и обеспечивать иммунологическую перестройку в отношении каждого антигена.

Цели и задачи исследования. Целью настоящих исследований было изучение эпизоотологии оспы овец и оспы коз в Российской Федерации, а также разработка технологии изготовления и усовершенствование контроля культуральных моновалентных и ассоциированных вирусвакцин против оспы овец и оспы коз. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- провести анализ эпизоотической ситуации по оспе мелкого рогатого скота в Российской Федерации в 1993-2006 годах;

- адаптировать вирус оспы коз к перевиваемой культуре клеток гонады козы (Ch-91);

- изучить культуральные свойства аттенуированного штамма вируса оспы коз; отработать технологию изготовления лиофилизированных моновалентной против оспы коз и ассоциированной вирусвакцин против оспы овец и оспы коз;

- изучить иммунобиологические свойства вирусвакцины против оспы коз и ассоциированной против оспы овец и оспы коз;

- оптимизировать методы контроля вирусвакцин;

- изучить особенности формирования поствакцинального иммунитета при иммунизации животных в лабораторных условиях; разработать нормативную документацию на полученные биопрепараты.

Научная новизна исследований:

- изучена эпизоотическая ситуация по оспе овец и оспе коз в Российской Федерации в 1993-2006 годах;

- впервые к перевиваемой культуре клеток гонады козы (Ch-91) адаптирован вирус оспы коз; разработан метод получения экспериментальных образцов культуральной вирусвакцины против оспы коз и ассоциированной против оспы овец и оспы коз;

- изучена эффективность гомологичной и перекрестной иммунизации овец и коз против оспы;

- оптимизирован метод контроля вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ».

Практическое значение работы:

- аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз и вирулентный штамм «Приморский 2003» вируса оспы коз депонированы во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (2006г.). Местом хранения указанных штаммов определена коллекция экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (2006г.);

- разработаны и утверждены ТУ «Вирусвакцина против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» культуральная сухая» (2004г.);

- одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методические рекомендации:

Методические рекомендации по стационарному и роллерному культивированию аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз» (2006г.);

Методические рекомендации по оценке иммуногенной активности вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» и ассоциированной вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» и оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» (2006г.);

Методические рекомендации по использованию защитной среды ВНИИЗЖ при изготовлении вирусвакцины против оспы коз и ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз» (2007г.); разработан и представлен на утверждение проект НД «Ассоциированная вирусвакцина против оспы овец и оспы коз» (2007г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

- эпизоотическая ситуация по оспе мелкого рогатого скота в Российской Федерации в 1993-2006 годах;

- патогенные свойства вирулентного штамма «Приморский 2003» вируса оспы коз;.

- культуральные свойства аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз в перевиваемой культуре клеток гонады козы (Ch-91);

- эффективность гомологичной и перекрестной иммунизации овец и коз культуральными вирусвакцинами против оспы овец и оспы коз;

- иммунобиологические свойства вирусвакцины против оспы коз и ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз;

- иммунобиологические свойства вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» при длительном хранении.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации опубликованы в трудах и материалах 2-й Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики», г. Ставрополь, 2003г; Международной научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных», г. Владимир, 2003г.; Международной научно-методической конференции «Актуальные проблемы и перспективы развития АПК», г. Иваново, 2005г.; Международного симпозиума «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний», г. Казань, 2005г.; Международного конгресса New Diagn. Technol.: Applications & Biologies: Proc., Saint-Malo, France, 2005г; в журнале «Ветеринарная патология», №4(19), 2006г., а также были доложены на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2002-2006гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 139 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений, содержит 24 таблицы и 12 рисунков. Список использованной литературы включает 250 наименований, из них 111 отечественных и 139 зарубежных. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

5. ВЫВОДЫ

1. Обобщены и проанализированы сведения по эпизоотической ситуации по оспе овец и оспе коз в Российской Федерации в 1993-2006 годах. Установлено, что наиболее неблагополучная эпизоотическая ситуация по оспе овец отмечалась в 1995-1997 годах. Как самостоятельное заболевание оспа коз зарегистрирована в России в 2003 году в Еврейской АО.

2. Выявлены особенности клинического проявления оспы коз и изучены патогенные свойства вирулентного штамма «Приморский 2003» вируса оспы коз, вызывающего 100% летальность при внутрикожном введении животным. Наряду с высокой патогенностью установлено наличие у штамма «Приморский 2003» вируса оспы коз выраженных антигенных свойств, индуцирующих выработку специфических вируснейтрализующих антител.

3. Изучены культуральные свойства аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз и разработаны методы его культивирования при использовании перевиваемой культуры клеток гонады козы (Ch-91), показана возможность использования культурального вируса для производства моновалентной против оспы коз и ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз.

4. Отработаны параметры использования стабилизатора на основе гидролизата лактоальбумина, сахарозы и желатозы при лиофилизации вирусвакцины против оспы коз, изучена ее термостабильность в условиях хранения при различных температурных режимах. Проведенные исследования биологической активности вирусвакцины показали лучшие результаты при конечной концентрации ГЛА 2,5-5,0%, сахарозы 2,0-3,0% и желатозы 0,5-1,0% в ее составе.

5. Разработана технология изготовления и контроля сухой культуральной вирусвакцины против оспы коз из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз и изучены ее иммунобиологические свойства в лабораторных условиях на козах. Установлено, что при контрольном заражении вакцинированных животных вирулентным вирусом в летальной дозе, все животные были защищены от заболевания.

6. Разработана технология изготовления и контроля сухой ассоциированной культуральной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз и изучены ее иммунобиологические свойства в лабораторных условиях. Показано, что при контрольном заражении вакцинированных овец и коз вирулентными штаммами вирусвакцина обеспечивает защиту от заражения в разведениях 1:25 для овец и 1:25-1:10000 для коз.

7. Установлено, что вирусвакцина против оспы коз и ассоциированная вирусвакцина против оспы овец и оспы коз являются ареактогенными препаратами с высокой антигенной и иммуногенной активностью.

8. Показано, что перекрестная иммунизация коз вирусвакциной против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» вируса оспы овец и иммунизация овец сухой культуральной вирусвакциной против оспы коз из аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз в прививной дозе 4000 ТЦД5оне предохраняет всех животных от проявления клинических признаков при контрольном заражении вирулентными штаммами вирусов в летальных дозах.

9. Оптимизирован метод контроля вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» по динамике накопления специфических вируснейтрализующих антител без контрольного заражения животных вирулентным вирусом. Показано, что при титре вируснейтрализующих антител 2,0 log2 и выше животные устойчивы к контрольному заражению.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Аттенуированный штамм «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз и вирулентный штамм «Приморский 2003» вируса оспы коз депонированы во Всероссийской государственной коллекции культур микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (2006г.). Местом хранения указанных штаммов определена коллекция экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (2006г.).

2. Разработаны и утверждены ТУ «Вирусвакцина против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» культуральная сухая» (2004г.).

3. Одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» следующие методические рекомендации:

- «Методические рекомендации по стационарному и роллерному культивированию аттенуированного штамма «ВНИИЗЖ 2003» вируса оспы коз» (2006г.);

- «Методические рекомендации по оценке иммуногенной активности вирусвакцины против оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» и ассоциированной вирусвакцины против оспы овец из штамма «ВНИИЗЖ» и оспы коз из штамма «ВНИИЗЖ 2003» (2006г.);

- «Методические рекомендации по использованию защитной среды ВНИИЗЖ при изготовлении вирусвакцины против оспы коз и ассоциированной вирусвакцины против оспы овец и оспы коз» (2007г.).

4. Разработан и представлен на утверждение проект НД «Ассоциированная вирусвакцина против оспы овец и оспы коз» (2007г.).