Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Усовершенствование технологии изготовления и контроля инактивированной вакуины против классической чумы свиней

РГБ ОД

3 - МАЙ 1899

На правах рукописи

¿)0

УДК $19:616.98:578.833.31:615.371

ФЕДОРОВ ДМИТРИЙ ГЕННАДЬЕВИЧ

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И КОНТРОЛЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

16.00.03,- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации т соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ПОКРОВ 1999 г.

Работа выполнена во Всероссийской научно-исследовательском институте

ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской,-^.акадеййн"

л

сельскохозяйственных яаук: ^

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор Жестерев В.И,

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

- доктор ветеринарных наук, профессор Дудников А.И. (ВНИЙЗЖ),

- кандидат ветеринарных наук Витин Б.Г (ВНИИВВиМ)

Ведущее учреждение - Всероссийский Государственный НИИ контроля,

стандартизации и сертификация ветеринарных препаратов

Защита состоится 23 апреля 1999 года в 11 часов 30 минут на заседании специализированного совета Д 120.61.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии в микробиологии по адресу: 601120, г. Покров, Владимирской области, ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан «23 » нарта 1999 года

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Савукова В.Я.

пш.ш з&г^ д

1. Общая характеристика работы

Актуальность выбранной темы

Классическая чума свиней (КЧС) - вирусная болезнь, характеризующаяся быстрым распространением, высокой контагиозностью и смертностью среди заболевших свиней. Она наносит большой экономический ущерб, особенно в условиях промышленного свиноводства. Борьба с КЧС базируется на быстрой и точной диагностике, специфической профилактике и ветеринар-но-санитарных мероприятиях.

До настоящего времени в России и странах СНГ для специфической профилактики КЧС широко применяются три вирусвакцины из штамма "К": "АСВ", "ВГНКИ", "ЛК-ВНИИВВиМ" (Н. К. Мищенко, Н. В. Лихачев 1968 г.; В. А. Сергеев и др. 1969г.; И. Ю. Хухоров, В. В. Куриннов, И. Ф. Вишняков и др. 1992 г.). Массированное применение этих вакцин в течение 70-х начале 80-х годов, с одной стороны, позволило стабилизировать эпизоотическую ситуацию по КЧС, значительно снизить заболеваемость и потери от КЧС, с другой стороны, делает невозможным серологический мониторинг, выделение и идентификацию изолятов вируса.

Использование вирусвакцин небезопасно с точки зрения возможной реверсии (непредсказуемой селекции штамма в сторону усиления вирулентных свойств), контаминации материала другими биоагентами в процессе приготовления вирусного сырья, длительности вирусоносительства у вакцинированных животных и тератогенного действия, сопровождающегося высокой перинатальной смертностью, что значительно осложняет применение вирус-вакцин в репродуктивных хозяйствах для иммунизации супоросных свиноматок.

Инактивированные тканевые препараты против КЧС, используемые в прошлом, не нашли широкого применения ввиду нетехнологичности и экологической опасности производственного процесса, несовершенства методов

контроля вакцин, слабого иммунологического эффекта и дороговизны получаемого препарата. Тем не менее, необходимость надежной и безопасной инактивированной вакцины против КЧС очевидна.

Во ВНИИВВиМ разработана культуральная инактивированная вакцина против КЧС, технология изготовления которой основана на использовании вирулентного вирусного штамма "Ши-Мынь" и перевиваемой культуры клеток линии РК-15 (авторы Жестерев В.И., Балышева В.И., Устаров Р.Д., Чур-банова Г.Н. 1995 г.).

Последние два обстоятельства (использование в производстве вирулентного штамма, невысокая технологичность культуры клеток) создают определенную эпизоотическую угрозу при обработке вирусного сырья и значительно усложняют (технологически и экономически) производство биопрепарата при его масштабировании. Цель и задачи исследований В связи с вышеизложенным целью данной работы явилось усовершенствование технологии изготовления и методов контроля инактивированной вакцины против КЧС и тактики ее применения.

Исходя из вышеперечисленного были поставлены следующие задачи:

1. Оценить существующие средства и методы процесса изготовления инактивированного препарата и выбрать технологически перспективную схему производства.

2. Усовершенствовать технологию изготовления инактивированной вакцины против КЧС для промышленного производства.

3. Усовершенствовать методы технологического контроля инактивированной вакцины против КЧС,

4. Оценить иммунобиологическую эффективность инактивированной вакцины против КЧС и разработать схему ее применения

5. Разработать научно-техническую документацию на инактивированный препарат против КЧС.

Научная новизна результатов

Научная новизна работы, заключается в том, что:

•В результате проведенных исследований экспериментально обоснована и практически апробирована технология изготовления эффективной инакти-вированной вакцины против классической чумы свиней из вакцинного штамма без предварительного концентрирования вируса.

•Изучена генетическая стабильность вакцинного штамма "ЛК-К" вируса КЧС, используемого для изготовления инактивированной вакцины, на разных уровнях пассажей;

•Впервые показано, что сернокислая медь в качестве инакгиванта способствует разрушению вирионной РНК до низкомолекулярных фрагментов нуклеотидов;

•Впервые разработан и предложен способ оценки полноты инактивации вируса КЧС сернокислой медью, заключающийся в определении целостности вирионной РНК амплификацией различных участков генома вируса КЧС;

•Разработана технология изготовления ВКПВ КЧС и изучены его иммунобиологические свойства в процессе длительного хранения и в составе инактивированной вакцины против КЧС;

•Впервые проведены исследования иммунореактивности трансгенных по гену соматотропного гормона свиней при вакцинации инактивированной вакциной против классической чумы свиней. Практическая значимость результатов

•Разработана безвредная, экологически безопасная и высокоэффективная инактивированная вакцина против КЧС из вакцинного штамма "ЛК-К" вируса КЧС, позволяющая рекомендовать ее для применения в племенных и репродуктивных свиноводческих хозяйствах;

•Разработана к практическому применению НТД на инактивированную вакцину, утвержденная Департаментом ветеринарии МСХиП 28 декабря 1998г.;

•Разработана технология изготовления ВКПВ КЧС для длительного хранения и экспресс изготовления из него инактивированной вакцины;

•Экспериментально разработан и предложен экспресс-метод оценки полноты инактивации вируса с использованием метода ПЦР, позволяющий в 8-10 раз снизить время контроля остаточной инфекционности готового препарата;

•Изучены иммунобиологические свойства инактивированной вакцины против КЧС и предложена схема ее применения. Апробация работы и публикация результатов исследований Результаты исследований доложены на заседании ученого совета ВНИИВВиМ в апреле 1998г., научной конференции ВНИИВВиМ г. Покров, декабрь 1998г.

По результатам исследований опубликовано 11 печатных работ. Основные положения диссертационной работы выдвигаемые на защиту

1.Экспериментальное обоснование перспективности использования вакцинного штамма для производства инактивированной вакцины против КЧС.

2.Технологические процессы изготовления инактивированной вакцины против КЧС и методы контроля биопрепарата.

З.Обоснование перспективности использования метода ПЦР для оценки полноты инактивации вируса КЧС.

4.Технология получения ВКПВ КЧС для длительного хранения и перспективы его использования в производстве инактивированной вакцины.

5.Схема применения инактивированной вакцины против КЧС и ее эпизо-отологическая эффективность.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений, иллюстрирована 24 таблицами, и 9 рисунками. Список использованной литературы включает 158 наименований из них 92 отечественных и 66 зарубежных.

2. Собственные исследования

2.1 .Материалы и методы

Вирусы

В работе использовали: вакцинный штамм «ЛК-К» (10-37пассажей), выращенный в перевиваемой культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК), с активностью 5,0-6,5 1g ККИД50/см3; вакцинный штамм «Ж-ВНИИВВиМ» ( 37-87 пассажей), выращенный в культуре клеток тестикул ягнят (ТЯ), с активностью 4,5-5,0 lgKKHflso/cM3; эпизоотический штамм «Ши-Мынь» - вируссодержащая кровь 4-го пассажа на подсвинках с активностью 4,5 lg ККИДго/см3'

Культуры клеток

Перевиваемые культуры клеток: почки сибирского горного козерога (ПСПС-60 и ПСГК-С85), почки поросенка (РК-15 и SK-6), эмбриона кролика (ПЭкр)

Среды

0,25% ФГМ-суспензионная; Игла (MEM) и 0,25% ФГМ на растворе Эрла; 0,1 ГЛА на растворе Хенкса.

Сыворотки крови овец, телят, лошади, коз, КРС.

Животные

Поросята крупной белой породы 2-3-х месячного возраста, массой 25-45 кг. Поросята трансгенные по гену соматотропного гормона 45-50-дневного возраста.

Кролики массой 0,6-1,0 кг. и 2,5-3,5 кг.

Выращивание вируса КЧС в культуре клеток

При выращивании вируса КЧС, сформировавшийся монослой в роллер-ных или стационарных сосудах заражали вирусом в разведении 1:50-1:100 к исходному объему культуральной среды . Сосуды с зараженной культурой инкубировали при 37°С в течение 2 часов, затем добавляли среду ИГЛА с 2% сыворотки КРС и продолжали инкубировать при 37 ±0,5°С в течение 3-5 суток.

При суспензионном выращивании вируса в культуре клеток ПСГК-С85 бутыли с инфицированной суспензией клеток вращали со скоростью 200±10 см/мин и выдерживалиЗ-5 суток (37 ±0,5°С).

Инфекционную активность вируса оценивали в прямом МФА (по методике Куриннова В.В.и соавт., 1984г) и выражали в культуральных клеточных инфекционных дозах (ККЩЬо/см3).

Концентрирование вируса

Вирусный материал концентрировали с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) (м.м.6000), добавляя его к вирусу до конечной концентрации 7%. После тщательного шутгелирования (20-30 минут) смесь выдерживали при 4-8°С 17-18 часов и центрифугировали (2500 оборотов/мин - 30 минут). Надо-садочную фракцию декантировали, осадки объединяли и вновь повторяли процедуру до получения осадка необходимой степени концентрации (1:2501:1000) вируссодержащей суспензии.

Инактивация вируса КЧС

К вирусному сырью добавляли постепенно, при постоянном перемешивании, 0,5 М раствор Си804 до 1, 3 и 5 шМ конечной концентрации и выдерживали при 37°С периодически перемешивая. Через определенные промежутки времени, отбирали пробы и оценивали остаточную инфекционность

в них титрованием в культуре клеток РК-15 прямым МФА. Константу инактивации (К) вычисляли по формуле и определяли кинетику инактивации ви-

IgCo-lgCt „, руса: К = ———х2,3 ,где

lg Со - исходный титр вируса;

lg Ct - титр вируса через определенный промежуток времени;

t - время инактивации вируса;

2,3 - коэффициент перевода натуральных логарифмов в десятичные.

Константу скорости инактивации (К) выражали в час'1 (потеря вируса за единицу времени, т.е. за час).

Определение полноты инактивации вируса

Определение полноты инактивации вируса проводили в стационарном монослое клеток РК-15 (ПСГК-60) путем трех последовательных пассажей инактивированного вируса.

DUE

ПЦР проводили в объеме 25 мкл, содержащего 2,5 мкл Юхбуфер (10 мМ Tris-HCl, 1.5 mM MgCl, 50 mM КС1, рН 8.3), по 2 мкл каждого праймера (1 микроМ), по 2 мкл каждого dNTP, 2 мкл кДНК, 2 мкл Taq-поли-меразы (Promega), 30 мкл минерального масла (Sigma). Режим амплификации 35 циклов: 95°С-1 мин, 50°С-1 мин, 72° С-1 мин (thermocycler Hybaid). В качестве контролей использовали РЫК выделенную как из зараженной, так и из незараженной культуры клеток ПСГК-60.

Рестрикционный анализ.

Отбирали по 15 ми продукта ПЦР разрезали в объеме 50 мкл с 8-10 ед рест-риктазы Aval и Bgll. Электрофорез проводили в 5-8% ПААГ.

Приготовление инактивированной вакцины

К инактивированному вирусному сырью после инактивации добавляли 10-20% ГОА (0,6% конечной концентрации сухого остатка в вакцине) или 10-25 % аэросила (0,4 % конечной концентрации соответственно) и тщательно шуттелировали.

Оценка иммуногенности вакцин

Для оценки вакцины на иммуногенность использовали неиммунных се-ронегативных к вирусу КЧС подсвинков массой 25-70кг, которых прививали внутримышечно двукратно в объеме 2 см3 с интервалом 14 суток.

За животными в течение всего периода опытов вели клинические наблюдения с термометрией, определением количества вируснейтрализующих антител, а также исследования крови и органов на вирусвыделение после контрольного заражения.

Через 14 суток после повторной инокуляции проводили контрольное заражение вирулентным вирусом классической чумы свиней в дозе Ю3'°ЛДзо (штамм "Ши-Мынь).

Наблюдение за зараженными животными вели в течение 14 суток, проводя ежедневную термометрию.

Статистическая обработка результатов исследований

Все опыты ставили с числом повторностей (>3), обеспечивающих получение достоверных результатов. Цифровые данные подвергали статистической обработке средних величин и их ошибок . Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разносному методу Стьюдента-Фишера.

2.2.Результаты исследования

2.2.1.Усовершенствование технологии получения вирусного сырья 2.2.1.1. Выбор клеточной системы и штамма вируса КЧС

Для оценки уровня накопления вируса КЧС было исследовано 5 перевиваемых клеточных культур (РК-15, БК-6, ПЭКр, ПСГК-60, ПСГК-С85). Полученные результаты показали, что исследуемые культуры обладают различной чувствительностью к вирусу КЧС. Наименьшей репродуктивной активностью обладает культура клеток ПЭКр (0,5-2,0 ^ ККИД50/см3). Культуры клеток РК-15, БК-б, ПСГК-60 и ПСГК-С85 репродуцировали вирус КЧС в более высоких титрах (3,5-6,

Репродуктивная активность клеточных культур зависела от используемых штаммов вируса КЧС. Так вирус штамма "ЛК-ВНИИВВиМ" накапливался в более высоких титрах в культурах клеток РК-15 и БК-6 (4,5-5,0 ^ ККИД50/см3)

и в меньшей степени в культурах ПСГК 60 и ПСГК-С85. Штамм "ЛК-К" наоборот проявил наибольшую активность в культурах клеток ПСГК 60 и ПСГК-С85 (6,0-6,17 1ц ККИД50/см3).

Штамм "ЛК-К" накапливался в более высоких титрах во всех исследуемых культурах, чем штамм "ЛК-ВНИИВВиМ". Как правило, разница в накоплении вируса составляла 1,0-2,01§ ККИД50/СМ3. Поэтому в дальнейших исследованиях был использован вирус КЧС штамма "ЛК-К", а также культуры клеток ПСГК-60 и ПСГК-С85, высокий индекс пересева которых (1:60 и 1:10 соответственно) позволяет получать большее количество культуры клеток за один пассаж и, тем самым, масштабировать производство вирусного сырья.

2.2.1.2.Условия выращивания вируса.

Наши дальнейшие исследования были посвящены разработке крупномасштабной технологии выращивания вакцинного штамма "Ж-К" вируса КЧС. Однако в процессе этих работ необходимо было изучить в экспериментальных условиях ряд технологических вопросов по определению оптимальных параметров культивирования, обеспечивающих максимальный урожай вируса.

Нами были изучены основные факторы, влияющие на накопление вируса в культурах клеток ПСГК-60 и ПСГК-С85, а так же время культивирования,

использование сывороток различных видов животных н метод культивирования. На основании проведенных исследований по изучению н оптимизация параметров выращивания аэтенунровзнного штамма "ЛК-К" вируса КЧС в экспериментальных и опытно-промышленных условиях нами была предложена следующая усовершенствованная технология получения вирусного сырья:

♦ Использование высокоактивного ахтенунрованного штамма "Ж-К" вируса КЧС;

♦ Использование перевиваемых культур клеток ПСГК-бО н ПСПС-С85;

♦ Условия культивирования:

-поддерживающая среда: ЙГЛА-МЕМ для субстрат зависимого варианта клеток н 0,25% ФГМ-суспензтанная дда суспензионной культуры с 2-5% сыворотки КРС, обработанной ПЭГ, рН среды - 6,9-7,2; -объем заполнения сосудов - 0,1 - 0,15; -множественность заражения 0,6-0,06 ККЦД50/КЩ -1,5-2 часовой контакт вируса с культурой при температуре 37°С; -длительность культивнровання - 4-5 суток в роллеркых н суспензионных условиях прн температуре 37°С. 2.2.1.3.Генетич£ская стабильность штамма вируса Сравнительный анализ генома вируса (10, 20 н 30 пассаж), полученного по данной технологии, амплификацией 5'-концевой не транслируемой области генома, основного структурного бежа %р55 н неструктурного белка р80 не выявил изменений генома, что подтверждается данными полученными прн оценке нммуногенноста вакцинных препаратов, приготовленных из этого штамма вируса КЧС на разных уровнях пассажей. Проведенные в этом плане исследования показали, что вакцинный пламм "ЛК-К" вируса КЧС, выращенный в культуре клеток ПСГК-60, в течение 30 пассажей не снижал своих исходных

нммуногенных сводов. Через две недели после двукратной иммунизации животных с интервалом 14 суток средние тигры ВН- антител были на уровне 1:161:32,

2.2.2.Усовершенствованне технологии изготовления инактивированной вакцины против КЧС

2.2.2.1.Применение ВКПВ для изготовления инзктивнрованиого вакцинного препарата.

Высококощентрнрованный полуфабрикат вируса (ВКПВ) КЧС получатга с помощью ПЭГ (м.м. 6000), который добавляли к вирусной суспензии в конечной концентрации 7%. После шуттелировання смесь центрифугировали до получения необходимой концентрации (1:250-1:1000) н хранили при -40°С в течение 18-30 месяцев. Инакпгвироваиные препараты, изготовленные кз концентратов, хранившихся при -40°С в течение 18 месяцев индуцировали образование в организме прнвшых евшей ВН-аншгел в титрах 1:12-1:16 и все они остались живы после контрольного заражения вирулентным штаммом "Ши-Мынь" в дозе 104'0ЛД5о.

Некощентрлрованный вирус (контроль), хранившийся при тон же температуре енкзнл активность на 2,0через 18 месяцев и на 3,0через 30 месяцев (срок наблюдения).

Полученные данные свидетельствуют о том, что концентрирование вируса КЧС (1:250-1:1000) позволяет сохранить его исходные иммунобиологические свойства. После дательного хранения концентраты вирусного сырья являются пригодными дая изготовления ннаюнвярованных препаратов против КЧС

2.2.2-2.Кннетика инактивации вируса

Проведенные нами исследования показали, что сернокислая медь является простым в изготовлении и надежным инактивантом. Штамм "ЛК-К" инак-тивировался сернокислой медью в концентрациях 1, 3 и 5 шМ за при температуре 37°С 18,5, 14,5 и 12,5 часов соответственно и за 30,5, 21 и 16 часов при температуре 24°С. Штамм ЛК-ВНИИВВиМ в этих же условиях полностью инактивировался за 12, 9, 8 при температуре 37°С и 20, 16 и 12 часов при температуре 24°С. Увеличение концентрации сернокислой меди вызывало ускорение инактивации вируса. Так, при концентрации инакткванта 5 тМ и температуре 37°С константа инактивации достигала наивысших значений ( 0,873 час' штамм "Ж-К"; 1,054 час"1 штамм "Ж ВНИИВВиМ"), а при 3 тМ и 1 тМ соответственно 0,95 и 0,746 час"1 для штамма "Ж-К" и 1,265 и 0,973 час'1 для штамма "Ж ВНИИВВиМ". Та же закономерность наблюдалась и при температуре 24°С.

Таким образом, наиболее оптимальным режимом инактивации вируса КЧС является применение сернокислой меди 5 тМ концентрации при температуре 37°С в течение 12 часов. Для большей безопасности (полной инактивации оставшегося вируса, инфекционная активность которого ниже 1 ККИД и не всегда может быть обнаружена при титровании) экспозиция воздействия инактиванта была увеличена до 3-х суток

2.2.2.3.Выбор адъюванта

В процессе конструирования инактивированной вакцины были испытаны рекомендованные для практики адъюванты: гидрат окиси алюминия (ГОА), аэросил марки А-300, сапонин и минеральные масла.

С целью выбора наиболее оптимального сорбирующего адъюванта были проведены опыты по сравнительному изучению адъювантных свойств ГОА и аэросила. В ходе проведенных экспериментов было установлено, что аэросил обладал большей сорбционной активностью и осаждал на себе 94-95%, а ГОА - 84-90 % вируса. Комбинированная суспензия из аэросила и ГОА обладал той же активностью, что и аэросил. Увеличение процентного содержания

аэросила не влияло на уровень сорбции вируса. Было установлено, что препараты против КЧС обладали одинаковой антигенной активностью - титры ВНА в сыворотках крови подсвинков достигали уровня 1:16 через 14 дней после повторной вакцинации.

Таким образом, инактивированные вакцинные препараты против КЧС с аэросилом, а также аэросила с сапонином, в качестве адъюванта, не обладали выраженными иммуногенными преимуществами перед препаратами содержащими ГОА

Проведенные нами исследования с вакцинным штаммом "JIK-K" вируса КЧС и масляным адъювантом показали, что эмульгированная инактивиро-ванная вакцина против КЧС из штамма "ЛК-К" обеспечивала слабую защиту от инфекции (50%). Учитывая низкую иммуногенность эмульгированного препарата, была предпринята попытка его изготовления из концентрированного вируссодержащего сырья. Предварительная 3-х кратная концентрация инактивированного вирусного антигена, с последующим добавлением масляного адъюванта в соотношении 1:3, позволила создать инактивированный сорбированно-эмульгированный препарат против КЧС, обеспечивающий 100% защиту привитых животных от контрольного заражения при незначительной гипертермии до 40,5°С в течение 2-4 дней.

В связи с тем, что технология изготовления сорбированных препаратов не требует дополнительных затрат на предварительное концентрирование вируссодержащего антигена и меньшую себестоимость ГОА, по сравнению с масляными адъювантами, мы остановили свой выбор на сорбированной форме инактивированной вакцины против КЧС, с ГОА в качестве адъюванта.

2.2.3.Усовершенствование методов иммунобиологического контроля

2.2.3Л.Разработка экспресс-метода определения полноты инактивации вирусного сырья

Учитывая, что для контроля авирулентнос-ти антигена с использованием культуры клеток требуется 3-4 недели нами был разработан в соавторстве с

сотрудниками лаборатории "Биофизики" экспресс-метод оценки полноты инактивации вакцинного штамма "ЛК-К" вируса КЧС с использованием ~ электрофоретического анализа продуктов ПЦР, комплементарных последовательностям 5-концевой области, гликопротеина §р55 и белка р80 вирусного генома КЧС в геле агарозы. Данный метод основан на использовании ионов сернокислой меди, способствующих разрушению нуклеиновой кислоты (РНК) вируса КЧС штамм "ЛК-К" до низкомолекулярных фрагментов, не обладающих инфекционностью. Были проведены исследования, по разработанной нами методике, с использованием для инактивации вируса различных концентраций сернокислой меди и времени инкубации.

Опыты показали, что при испытании различных концентраций инакти-ватора воздействием сернокислой меди (1-5 шМ) происходило полное разрушение РБК вируса. Отсутствие продуктов ПЦР по сравнению с контролями позволяет судить о разрушении нуклеиновой кислоты в инактивирован-ных препаратах, об отсутствии живого вируса и его полной инактивации в биоматериале. Этот феномен был использован в качестве теста технологического контроля авирулентности вируса после обработки сернокислой медью при изготовлении инактивированной вакцины против КЧС.

В результате проведенных исследований был разработан экспресс-метод оценки полноты инактивации вируса КЧС "штамм "Ж-К" с целью технологического контроля антигена на авирулентность в процессе производства вакцины. Применение данного способа позволяет дать оценку авирулентности антигена через 2 суток, что в 8-10 раз сокращает время контроля по этому показателю.

2.2.3.2.0ценка иммуногенности вакцины

При разработке метода контроля иммуногенности вакцины исследовали устойчивость привитых животных к контрольному заражению вирулентным вирусом КЧС штамма "Ши-Мынь" (1000 ЛД).

Исследования показали, что как при двукратном (в объеме 2,0 см3), так и при однократном (5,0 см3) введении вакцина обладала одинаковой иммуно-генностью и обеспечивала защиту от инфекции 100% привитых животных. Все подопытные животные оставались клинически здоровы весь период наблюдения (31 день). Эти данные, результаты полученные при изучении дозы и кратности применения вакцины и тот факт, что для проведения контроля вакцины на безвредность подопытным животным вводят 5 см3 вакцины, позволили нам предложить использовать для оценки ее иммуногенности поросят, на которых проводилось испытание на безвредность, что значительно сокращает количество животных и время, необходимые для контроля качества вакцины.

2.2.4.Разработка условий применения инактивнрованной вакцины

2.2.4.1 .Изучение иммуногенных свойств.

Иммуногенные свойства вакцины определяли по сероконверсии ВН-Ат и устойчивости привитых животных к контрольному заражению.

Исследования проведенные по определению дозы и кратности применения вакцины показали, что двукратное внутримышечное введение вакцины в объеме 2,0 см3 с интервалом в 10-14 дней поросятам 1,5 месячного возраста не уступает по своей эффективности однократному введению вакцины в объеме 4,0 см3

Результаты по определению сроков наступления иммунитета у животных показали, что через 14 суток после однократного внутримышечного введения свиньям инактивнрованной вакцины в дозе 2,0 см3 титр ВН-антител достигал значений 1:8-1:16. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что формирование иммунитета у животных наступает на 14 сутки после прививки указанной вакцины (минимальный защитный уровень для свиней 1:8).

Применение бустер инъекции в дозе 2,0 см3 через 14 суток после первой прививки приводило к значительному повышению уровня ВН-Ат (1:16-1:32).

Наивысший уровень (1:32) ВН-Аг наблюдали с 6 по 20 неделю после первичной иммунизации, после чего он снизился до 1:16.

Применение однократной ревакцинации подсвинков внутримышечно в объеме 2,0 см3 через 3 месяца после первой прививки вызывает повышение уровня ВН-Ат до 1 :б4 через 8 недель после однократной ревакцинации, который не снижался в течение 9 недель, после чего постепенно достиг уровня 1:32 и сохранялся до 1 года (срок наблюдения) после первичной иммунизации.

Исследования влияния колостральных ВН-Ат на поствакцинальный иммунитет показали, что двукратная прививка 30-45 дневных поросят в объеме 2,0 см3 с интервалом в 14 дней позволяет преодолеть ВН-действие колостральных антител и обеспечить надежную защиту вакцинированных животных.

Таким образом, схема применения инактивированной вакцины против КЧС из штамма "ЛК-К" включает в себя, двукратную иммунизации 1,5 месячных поросят в объеме 2,0 см3 с последующей однократной ревакцинацией через 3 месяца после первой прививки, далее один раз в 9 месяцев.

2.2.4.2.Иммунологическая реактивность животных на введение антигена

Иммунореактивностъ трансгенных животных

При проведении исследований иммунореактивности трансгенных по гену соматотропного гормона свиней при вакцинации инактивированной вакциной против классической чумы свиней (КЧС) в сравнении с обычными свиньями и свиньями получившими дозу экзогенного соматотропина одновременно с первой вакцинацией было установлено, что иммунореактивность трансгенных животных находится на уровне, во-первых, достаточном для формирования полноценного иммунитета против КЧС и, во-вторых, статистически более высоком (51о§2)по сравнению с обычными животными, которым вводили экзогенный соматотропин (3,71og2), и контрольными свиньями (4,71о§г). У трансгенных животных отмечалась большая стабильность значе-

и

ний содержания лимфоцитов и нейтрофилов по сравнению с обоими контрольными группами. Животные, получавшие экзогенный соматотропин, проявляют меньшую по сравнению с трансгенными и обычными животными иммунореактивность в отношении инактивированной вакцины против КЧС, что, очевидно, вызвано незначительным иммунодепрессирующим действием введенного соматотропина. Следует отметить, что иммунный ответ трансгенных животных, в отличие от обычных жизотных, был более однородным и стабильным, показатели титров ВН-Ат находились на одном уровне. Этот факт позволяет сделать вывод о влиянии на иммунореактивность животных не только экзогенных факторов (условия содержания, кормления, обработка лечебными препаратами), но и генотипа животных.

Влияние других факторов на поствакцинальный иммунитет

В ходе производственных испытаний в ТОО "Карповский" Волгоградской области было отмечено, что у поросят подвергшихся обработке препаратами тилана и привитых через месяц после лечения, отмечается низкая иммунореактивность на введение как живой - вирусвакцины Ж-ВНИИВВиМ, так и инактивированной вакцины из штамма "Ж-К". Титры ВН-антител через 1-2 месяца после прививки были в пределах 1:6 и 1:4 соответственно. Данным экспериментом было показано, что во время переболе-вания наступает временный резкий спад активности иммуно-компетентной системы, очевидно, в связи с переболеванием отечной болезнью и применением ртутьсодержащих препаратов, так как повторное применение указанных вакцин вызвало повышение уровня ВН-Ат до 1:32.

2.2.5.Производствеиные испытания инактивированной вакцины против КЧС

По разрешению Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ были проведены испытания опытных серий инактивированной культуральной вакцины против КЧС из штамма "Ж-К", изготовленной по нашей технологии во ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, в хозяйствах

различного направления Владимирской, Самарской и Волгоградской областей

В ходе исследований было привито 210 супоросных свиноматок, 185 холостых свиноматок, 580 поросят 2-8 месячного возраста. Наблюдение за животными вели в течение 3-14 месяцев после прививки. Исследования показали, что инактивированная вакцина безвредна и иммуногенна. От момента прививки и по срок наблюдения (7-12 месяцев) среди поросят, привитых в возрасте 45 дней, а также супоросных и холостых свиноматок и хряков видимых клинических отклонений от нормы не отмечено. Свиноматки приносили полноценное и жизнеспособное потомство. Колостральные ВН-антитела у таких поросят к 38-40 дню после рождения были в пределах 1:81:56 (в среднем 1:49). Вакцинация поросят в этом возрасте (42-50 дней) сопровождалась индукцией поствакцинальных антител. Средние титры ВН-Ат через 1-3 месяца были в пределах 1:30-1:32. Ревакцинация молодняка через 3 месяца однократным введением препарата (2см3) сопровождалась повышением уровня ВН-АТ (>1:64), который сохранялся до 6 месяцев после первоначальной прививки, после чего постепенно снизился до >1:32 и сохранился на этом уровне до конца наблюдений (1 год после прививки).

Вакцинация взрослого поголовья свиней (8-9 месячного возраста) сопровождалась более интенсивным иммуногенезом (>1:32 через 3-5 месяцев), чем это наблюдалось у молодняка.

Таким образом, проведенные исследования и полученные результаты свидетельствуют о том, что вакцина, изготовленная из штамма JIK-K, инактивированная сернокислой медью и сорбированная на ГОА, при двукратной иммунизации в объеме 2,0 см3 с последующей ревакцинацией через 3 месяца после первой прививки, вызывает синтез ВН-антител в количестве, обеспечивающем защиту привитых животных. Вакцина безвредна и ареактогенна. Она сохраняет свои иммуногенные свойства в течение года, при температуре хранения 4-8°С. Вакцина может быть рекомендована для применения в ре-

продуктивных свиноводческих хозяйствах в угрожаемой и благополучных зонах.

З.Выводы

1.Усовершенствована технология изготовления инактивированной ГОА вакцины против КЧС, включающая в себя использование высокоактивного (6,0-6,5 ^ ККИДзо/см3) атгенуированного штамма "ЛК-К" вируса КЧС, перевиваемых культур клеток ПСГК-60 и ПСГК-С85, сернокислой меди в качестве инактиванта и адъюванта - гидрата окиси алюминия.

2.Усовершенствована технология получения вируса КЧС штамма "ЛК-К", которая позволяет получать высокоактивное (6,0-6,5 ^ ККИД5о/см3) вирусное сырье с сохранением его генетических и иммуногенных свойств на протяжении не менее 30 пассажей.

3.Предложена технология концентрирования вируса КЧС в 250-1000 раз, позволяющая сохранять его исходные иммунобиологические свойства в течение более 30 месяцев при температуре минус 40°С и использовать длительно хранившиеся концентраты вируссодержащего сырья для экспресс-изготовления инактивированного препарата против КЧС.

4.Разработан экспресс-метод и схема контроля полноты инактивации вируса КЧС сернокислой медью с использованием электрофоретического анализа продуктов ПЦР. Сернокислая медь в конечной концентрации 5 тМ при температуре 37°С в течение 12 часов разрушает РНК вируса КЧС штамма "ЛК-К" до низкомолекулярных фрагментов не обладающих инфекционно-стью. Отсутствие продуктов ПЦР по сравнению с контролями позволяет судить о разрушении нуклеиновой кислоты в инактивированных препаратах, об отсутствии живого вируса и его полной инактивации в биоматериале. Это позволяет с помощью указанного метода в течение 2 суток определить полноту инактивации вакцины против КЧС и может служить тест-системой технологического контроля качества вакцинных препаратов по этому показателю.

5.Усовершенствован метод контроля иммуногенности инактивированной вакцины против КЧС, позволяющий сократить количество необходимых животных и время проведения иммунобиологического контроля.

6.Разработаны условия применения вакцины, включающие в себя двукратное внутримышечное введение препарата животным, с 1,5 месячного возраста, в дозе 2,0 см3 с интервалом в 14 дней, с последующей однократной ревакцинацией через 3 месяца, что обеспечивает надежную защиту животных в течение 12 месяцев (срок наблюдения) после вакцинации.

7.При проведении производственных испытаний 2-х опытно-промышленных партий (1,5 и 3,0 тыс. доз, соответственно), изготовленных по предлагаемой технологии во ВНИИВВиМ, в хозяйствах Владимирской, Самарской и Волгоградской областей на 900 свиньях разных возрастов, вакцина зарекомендовала себя как безвредный и высокоиммуногенный препарат, рекомендованный для применения в репродуктивных хозяйствах в угрожаемой и благополучных зонах по КЧС.

4.Практические предложения

Разработана и предложена безвредная, экологически безопасная и высокоэффективная инактивированная вакцина против КЧС из аттенуированного штамма "JIK-K" вируса КЧС, инактивированного сернокислой медью и сорбированного на ГОА, для применения в племенных и репродуктивных свиноводческих хозяйствах.

Разработана и предложена НТД (ТУ №9384-009-00495549-98, Наставление по применению) на инактивированную вакцину, утвержденная Департаментом ветеринарии МСХиП 28 декабря 1998 г..

Разработана технология изготовления инактивированной вакцины из ВКПВ КЧС после его длительного хранения.

Экспериментально разработан и предложен экспресс-метод оценки полноты инактивации вируса с использованием метода ПЦР, позволяющий в 810 раз снизить время контроля авирулентности антигена.

Экспериментально обоснована и предложена схема применения инакти-вированной вакцины против КЧС.

Список опубликованных работ по материалам диссертации

1.В.ИБалышева., В.И. Жестерев, Г.Н. Чурбанова, Д.Г. Федоров, В.М. Балышев Оценка штамма "ЛК-К" на безвредность, реверсию и контактную передачу // Проблемы инфекционной патологии животных. Тез. докл. конф., посвященной 100-летию открытия вируса ящура,Владимир, 1997, с. 127

2.Федоров Д.Г., Жестерев В.И., Горшкова Т.Ф., Закутский Н.И., Калан-таенко Ю.Ф. Сравнительное изучение адъювантных свойств гидрата окиси алюминия и аэросила// Проблемы инфекционной патологии животных. Тез. докл. конф., посвященной 100-летию открытия вируса ящура, Владимир, 1997, с.221-222

3.Мищанин В.А., Федоров Д.Г., Жестерев В.И., Куриннов В.В., Юрков С.Г. Высококонценгрированный полуфабрикат вируса (ВКПВ) в технологии изготовления вакцинных препаратов против классической чумы свиней// Ветеринария, И, 1998, с.22-24

4. Балышева В.И. Жестерев В.И., Чурбанова Г.Н., Вишняков И.Ф., Хрипунов Е. М., Федоров Д. Г. Вакцины против КЧС из штамма " ЛК-К"// Материалы научно-произв. Конф., посвящ. 190-летию Высшего вет. обр. в России и 100-летию вет.науки.Тез.докл.,1998, с.ЗО

5. Рудобельский Э.В., Дмитренко В.В., Жестерев В.И., Федоров Д.Г., Неверовский А.И., Юрков С.Г. Оценка вирусвакцин против КЧС, изготовленных из аттенуированного штамма, размноженного в перевиваемых клетках линии Б К-б // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особоопас-

ными и экзотическими болезнями животных. Материалы междунар. науч. практ. конф., посвященной 40-летию ВНИИВВиМ, Покров, 1998, с.203-204

6. Рудобельский Э.В., Дмитренко В.В., Федоров Д.Г., Чермашенцев В.И. Специфическая профилактивность поросят полученных от вакцинированных против КЧС свиноматок II Диагностика, профилактика и меры борьбы с особоопасными и экзотическими болезнями животных. Материалы междунар. науч. практ. конф., посвященной 40-летию ВНИИВВиМ, Покров, 1998, с.206

7. Рудобельский Э.В., Чермашенцев В.И., Жестерев В.И., Дмитренко

B.В., Коломыцев A.A., Федоров Д.Г. Сохранение возбудителя КЧС у инфицированных свиней на фоне специфического иммунитета // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особоопасными и экзотическими болезнями животных. Материалы междунар. науч. практ. конф., посвященной 40-летию ВНИИВВиМ, Покров, 1998, с.205

8. Федоров Д.Г., Чурбанова Г.Н., Балышева В.И., Жестерев В.И. Производственные испытания инактивированной вакцины против классической чумы свиней./ // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особоопасными и экзотическими болезнями животных. Материалы междунар. науч. практ. конф., посвященной 40-летаю ВНИИВВиМ, Покров, 1998, с.197

9. Федоров'Д.Г., Мищанин В.А., Жестерев В.И., Куринов В.В., Юрков

C.Г. Усовершенствование технологии изготовления вакцины против классической чумы свиней // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо-опасными и экзотическими болезнями животных. Материалы междунар. науч. практ. конф., посвященной 40-летию ВНИИВВиМ, Покров, 1998, с.198-199

10.Новиков Б.В., Балышева В.И., Дмитренко В.В., Чурбанова Г.Н., Федоров Д.Г., Жестерев В.И., Вишняков И.Ф., Полтавцева P.A., Эрнст JI.K. Им-мунореактивность свиней, трансгенных по гену соматотропного гормона// Диагностика, профилактика и меры борьбы с особоопасными и экзотиче-

скими болезнями животных. Материалы междунар. науч. практ. конф., посвященной 40-летию ВНИИВВиМ, Покров, 1998, с.190

11.Балышева В.И., Чурбанова Г.Н., Жестерев В.И., Селянинов Ю.О., Топская P.A., Федоров Д.Г. Культивирование вируса КЧС, штамм "Ж-К" в суспензии// Диагностика, профилактика и меры борьбы с особоопасными и экзотическими болезнями животных. Материалы междунар. науч. практ. конф., посвященной 40-летию ВНИИВВиМ, Покров, 1998, с.207-208