Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Культивирование, антигенные и иммуногенные свойства вируса энцефаломиокардита свиней

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ им. Я. Р. КОВАЛЕНКО

Р Г 5 ОД

На правах рукописи

1 Л йП? 1955

МАЛЬЦЕВ Дмитрий Владимирович

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, АНТИГЕННЫЕ И ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ЭНЦЕФАЛОМИОКАРДИТА СВИНЕЙ

16.00.03—ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва— 1995

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко.

доктор ветеринарных наук, профессор Б. Г. Орлянкин

доктор ветеринарных наук С. А. Жидков (ВИЭВ) кандидат ветеринарных наук В. М. Балышев (ВНИИВВиМ)

Ведущая организация: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К. И. Скрябина

Защита диссертации состоится Л/'^л-р 1995 Г-

в -"-часов на заседании Специализированного совета К 020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я- Р. Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ. Автореферат разослан « 1995 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. Терешков

I. СБЩЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди вирусных агентов, вызывающих патологию репродукции свиней и гибель поросят, важная роль принадлежит вирусу энцефаломиокардита. Впервые энцефаломиокардит свиней был зарегистрирован в Панаме в 1958 году ( Т. Murnane, 1960 ).В настоящее время заболевание широко распространено во многих странах мира с развитым свиноводством и причиняет значительный экономический ущерб ( j.vansickle, 1990 ).

Заражение животных чаще происходит при поедании грызунов, которые являются резервуаром вируса энцефаломиокардита свиней, либо через инфицированную ими воду и корм. Недавно была доказана возможность передачи вируса при контакте от инфицированных поросят здоровым( ü.Foni, 1993 ).

Заболевание у свиноматок и хряков протекает, как правило, в субклинической форме, иногда отмечается гриппоподобное состояние. У хряков-производителей заболевание влияет на качество семени - количество сперматозоидов и их подвижность. У супоросных свиноматок наблюдается нарушение репродуктивной функции. Вирус проходит через плаценту и вызывает гибель эмбрионов и плодов. Эмбрионы после гибели резорбируются, а плоды мумифицируются. У поросят заболевание часто протекает в острой форме с высокой летальностью ( W. Christiansen, 1992 ).

Для специфической профилактики энцефаломиокардита свиней в США и Южной Африке предложено несколько вакцин. Широкое применение вакцины, полученной в Оксфордской лаборатории,в свиноводческих хозяйствах США и Канады показало её удовлетворительную эффективность в предотвращении заболевания.

Недавно установлена циркуляция вируса энцефаломиокардита в ряде свиноводческих хозяйств России (H.A. Ермолина, Б.Г. Ор-

лянкин, 1993).

Цель и задачи исследований. Цель работы - отработать оптимальные условия накопления вируса энцефаломиокардита свнней в перевиваемых культурах клеток и изучить антигенные и иммуноген-ные свойства инактивированных препаратов вируса на лабораторных животных.

В соответствии с этим в задачи исследований входило:

- изыскать наиболее чувствительную клеточную систему для культивирования вируса энцефаломиокардита свиней;

- оптимизировать условия накопления вируса в чувствительной клеточной системе;

- определить патогенность вируса энцефаломиокардита свиней для морских свинок;

- отработать оптимальные условия инактивации вируса энцефаломиокардита свиней с целью получения безопасных и антигенно активных препаратов;

- изучить на лабораторных животных антигенную и иммуноген-ную активность инактивированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней.

Научная новизна. Изыскана эффективная клеточная система для выращивания вируса энцефаломиокардита свиней и определены оптимальные условия его накопления. Изучена патогенность вируса энцефаломиокардита для морских свинок. Отработаны режимы инактивации вируса формалином и димером этиленимина. Определена янтигенкая и иммутюгенная активность инактивированных сорбированных и эмульгированных препаратов вируса на морских свинках. 1!зучено влияние хранения на антигенную и иммуногенную активность инактивированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней.

Практическая ценность работы. Получены безопасные инакти-

вированные сорбированные и эмульгированные препараты вируса энцефаломиокардита свиней с высокой антигенной и иммуногенной активностью. Разработан метод оценки активности инактивированных препаратов вируса на морских свинках.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсувдены на научной конференции (г.Покров, 1994г), заседании Учёного(совета ВИЭВ (1994 г.) и межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (1995 г.).

Публикация результатов исследований. Основные материалы диссертации опубликованы в 3 научных работах.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и список литературы. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 9 рисунками. Список использованной литературы включает 153 источника, из них 14 отечественных и 139 зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ШСЛВДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 1992-1994 гг. в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики болезней свиней ВИЭВ.

Вирус. В опытах использовали культуральный штамм 1029 вируса энцефаломиокардита свиней, полученный из Кубинского национального института ветеринарии. Гемагглютинирущая активность

7 О

вируса составляла 1:128-1:1024, титр инфекционности - 10 ' -Ю7»5 ТЦ^о/мл.

Культуры клеток и среды. Для выявления спектра чувствительных к вирусу энцефаломиокардита клеточных систем использовали

перевиваемые культуры клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), тес-тикул поросят (БТ) и щитовидной железы свиньи (ЩС). Перевиваемые культуры клеток получали из лаборатории экспериментальной технологии культур клеток, питательных сред и клеточной биотехнологии.

Культуру клеток С11ЭВ выращивали в смеси питательных сред 199 (70 %) и Игла (30 %)\ зт - в среде ФШС; ЩС - в смеси равных объёмов сред 199 и ГСБМ. В ростовую среду добавляли 7-10 % стерильной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики: пенициллин 100 ВД/мл, стрептомицин и канамицин по 100 мкг/мл. Клетки выращивали в стационарных и роллерных условиях.

Взращивание вируса оицефаломиокардита свиней в культуре клеток. Вируссодержащую жидкость вносили на клеточный монослой в соотношении 1:10. Инфицированную культуру инкубировали при 37°С в течение 18-24 часов до появления выраженного цитопатичес-кого эффекта (ЦПЭ). Для освобождения вируса из клеток их разрушали путём двукратного замораживания и оттаивания.

Титр вируса определяли в реакции гемагглютинации (РГА), которую ставили микрометодом в лунках полистироловых пластин с использованием 0,5 % суспензии эритроцитов морской свинки. Результаты реакции учитывали после полного оседания эритроцитов в контроле. За титр вируса принимали наибольшее его разведение, вызывающее полную агглютинацию эритроцитов.

Титрование вируса энцефаломиокардита свиней в культуре клеток. Инфекционную активность вируса определяли титрованием по цитопатическому действию (ЦПД) в однослойной гомологичной культуре клеток по общепринятой методике. Расчёт титра инфекци-онности вируса проводили по методу Рида и Менча и выражали в тканевых цитопатических дозах (ТЦД^о/мл).

Инактивация вируса энцефаломиокардита свиной, Bipyc инакти-вировали формалином, содержит/м но менее 30 % формальдегида,и димером этиленимина (ДЭИ). Инактивацию проводили при 37°С в течение 72 часов. Полноту инактивации вируса энцефаломиокардита свиней определяли путём серийного пассирования инактивированно-го вируса (3 пассажа) в культуре клеток С11ЭВ. Наличие вируса контролировали по ЦПЭ и в РГА. Отсутствие ЦПЭ свидетельствует о полной инактивации вируса.

Адъюванты. В качестве адъювантов использовали масляные адъюЕанты ЕНШИ 3310, 3404, Фрейнда (полный и неполный) и гидроокись алюминия (ГОА).

Для приготовления эмульгированных препаратов антиген смешивали с масляным адъювантом в соотношении 1:1; при изготовлении сорбированных препаратов использовали ГОА в конечной концентрации 10 мг/мл.

Определение титра антител к вирусу энцефаломиокардита свиней в сыворотках крови животных. Наличие специфических антител в сыворотках крови опытных животных выявляли в реакции торможения гемагглютинации (РГГА). Реакция основана на способности специфических антител подавлять гемагглютинируюсцую активность вируса. РТГА ставили микрометодом в лунках полистироловых пластин с использованием 0,5 % суспензии эритроцитов морской свинки и рабочего разведения вируса (8 гемагглютинирующих единиц). Перед постановкой реакции сыворотки крови освобождали от термолабильных и термостабильных ингибиторов гемагглютинации и гетеро-агглютининов. За титр антител принимали предельное разведение сыворотки, полностью подавляющее гемагглютинирупцую активность вируса (H.A. Ермолина, Б.Г. Орлянкин, 1993).

Экспериментальные животные. Оценку антигенной активности

- б -

инактивированных препаратов вируса энцефаломиокардита проводили на морских свинках массой 350-400 г и белых мышах массой 1820 г.

Иммунизация животных. Животных иммунизировали двукратно подкожно в области лопатки в дозах: морских свинок - 1,0 мл, белых мышей - 0,5 мл.

Оценка иммуногенной активности инактивированных препаратов. Иммуногенную активность инактивированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней определяли путём интраназалъного (по 0,5 мл в кавдый носовой ход) и интраперитонеального (1,0 мл) заражения вакцинированных морских свинок. Белым мышам вирулентный вирус вводили интраперитонеально в дозе 0,5 мл через 14 дней после второй иммунизации.

Статистическую обработку результатов исследований проводили, используя учебное пособие "Биометрия" Г.Ф. Лакина (1990).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Культивирование вируса энцефаломиокардита свиней.

С целью выявления клеточной системы, обеспечивающей наибольшее накопление вируса энцефаломиокардита, исследовали перевиваемые культуры клеток почек эмбриона свиньи (СОЭВ), тестикул поросят (зт) и щитовидной железы свиньи (1ДС). Сформировавшийся ыонослой заражали при смене ростовой среды в соотношении 1:10. Инфицированную культуру инкубировали при 37°С в течение 18-24 часов до появления выраженного ЦПЭ. Накопление вируса энцефаломиокардита свиней в культуральной жидкости определяли в РГА и титрованием. Предварительно клетки разрушали двумя циклами замораживания и оттаивания. Результаты исследований представлены в таблице I.

Накопление вируса энцефаломиокардита свиней в различных клеточных системах

(X ± т , а - 3)

Культура клеток

Титр гемагглютининов Титр вируса

(обратные величины) ( ¿'д ТЦП^/мл)

СГ1ЭВ ЦС

¿т

683 ± 174,6 75 ± 32,7 85 ± 21,8

7.8 ± 0,2

6.9 ± 0,1 7,1 ± 0,3

Как видно из результатов, представленных в таблице I, все испытанные клеточные системы оказались чувствительными к вирусу энцефаломиокардита свиней, причём максимальное накопление его отмечали в культуре клеток СПЭБ (р<0,05). В связи с этим для дальнейшей работы была выбрана перевиваемая культура клеток СПЭВ.

Увеличение выхода вируса может зависеть от "возраста" культуры, способа выращивания, физиологического состояния клеток и других факторов. Заметное влияние на накопление вирусов оказывает "возраст" культуры.

Максимальное накопление вируса энцефаломиокардита свиней в культуре клеток СПЭВ происходило при заражении её через 24 и 48 часов после посева. Вирус хорошо размножался в клетках, инфицированных спустя 72 часа после посева, однако, титр гемагглютининов и инфекционная активность были ниже (в 4-5 раз).

Наибольшее накопление вируса энцефаломиокардита свиней в культуре клеток СПЭВ наблюдали через 20-24 часа после зараже-' ния. Культивирование вируса в течение последующих 24 часов приводило к достоверному снижению его гемагглютиниругацей и инфекционной активности (р<0,05).

Накопление вируса в культуре клеток зависит от множественн-

ости заражения. При заражении культуры клеток СПЭВ вируссодер-жащей суспензией в соотношении 1:10 отмечали максимальный выход вируса энцефаломиокардита свиней. При заражении культуры клеток в соотношении 1:1000 вирус накапливался в меньшем количестве.

Широкое применение в вирусологической практике получили однослойные стационарные и роллерные культуры. Роллерный метод культивирования имеет ряд преимуществ, так кск при меньших затратах сырья позволяет получить большее количество вируса. Инфекционная активность вируса энцефаломиокардита свиней, накопленного в роллерных условиях была в 8 раз выше, чем в стационарных (р<0,05). Наблюдалось некоторое увеличение гемагглютиниру-ющей активности вируса при роллерном культивировании (с 1:683^ 174,6 до 1:1365^351,3).

2.2.2. Патогенность вируса энцефаломиокардита свиней для морских свинок.

Вирус энцефаломиокардита свиней патогенен для некоторых видов лабораторных животных, в том числе для морских свинок и белых мышей. Заражение морских свинок любых возрастов вирулентным вирусом приводит к развитию миокардита. Инфицирование белых мышей всех возрастов сопровождается развитием энцефали-; та л миокардита.

Нами было изунено клиническое проявление энцефаломиокардита, патологоанатомические и гистологические изменения внутренних органов и тканей у морских свинок, заражённых интрапе-ритонеально и интраназально культуральным вирусом с инфекционной активностью Ю5,0 (I группа), Ю6'0 (2 группа), Ю7'0 (3 группа) и 10® >° (4 группа; ТЦД^/мл. В каждую группу входило

по 4 животных. Клинические признаки заболевания развивались на

2-4-е сутки после заражения животных 3-4 групп, на 4-5-е сутки - 1-2 групп. Заболевание сопровождалось анорексией, взъерошен-ностью волосяного покрова, парезами тазовых конечностей.

В результате заражения вирулентным вирусом энцефаломиокар-дита свиней все морские свинки 3 и 4 опытных групп погибли. Во 2 группе выжило одно, а в I группе - два животных.

Всех павших морских свинок вскрывали. Основные патологоана-томические изменения локализовались в печени, почках, селезенке и лёгких. Видимые изменения в сердце обнаруживали у животных

3-4 групп в виде серых очаговых уплотнений диаметром до I мм.

При вскрытии морских свинок видимых изменений в головном и спинном мозге не регистрировали.

Гистологические исследования проводили совместно с профессором В.А. Шубиным. Отмечали расстройство гемодинамики в лёгких, головном и спинном мозге, печени и почках, а также дист-рофическо-некротические процессы в печени, селезёнке и почках. Интенсивность поражений спинного мозга зависела от инфекционной активности вируса при заражении и от длительности течения болезни. Если у животных 1-3 групп, погибших в течение 3-5 суток, спинной мозг был в пределах нормы, то у морских свинок 4 группы и 1-3 групп, павших через 7-11 суток после заражения, регистрировали пролифераты из лимфоидных клеток, периваскулиты лимфоцитарного типа, очаговые скопления глиальных клеток и увеличение количества астроцитов. В головном мозге наблюдали развитие негнойного менингоэнцефалита.

Изменения в сердце у морских свинок 1-3 групп были слабо выражены. У животных 4 группы отмечали обширные очаги зернисто-глыбчатого распада миоцитов со скоплениями лимфоидных клеток и

гистиоцитов по периферии некрозов, а также в участках миокарда не связанных с ними.

Из вышеизложенного следует, что заражение морских свинок вирулентным вирусом энцефаломиокардита свиней приводит к развитию инфекционного процесса.

2.2.3. Инактивация вируса энцефаломиокардита свиней

Для профилактики вирусных заболеваний широко применяют ина-ктивированные вакцины. Важным условием эффективности вакцин является выбор инактиванта и оптимальных условий инактивации, позволяющих лишить вирус икфзкциоиности при максимальном сохранении его антигенной активности.

Для определения оптимальных условий инактивации вируса эн-цефаломиокврдита свиней применяли инактиванты в различных концентрациях. Инактивацию проводили при 37^С в течение 72 часов. Формалин нейтрализовали добавлением 1,6 М раствора бисульфита натрия к вируссодеряащей суспензии в соотношении 1:10. Инакти-вирущее действие ДЭЙ прекращали добавлением 20 % раствора тиосульфата натрия в соотношении 1:10.

Полноту инактивации вируса энцефаломиокардита свиней определяли по отсутствию размножения вируса в культуре клеток СЛЭВ в течение 3 пассажей. Ечияние инактивантов на гемагглгатинирую-цую активность вируса оценивали по титру гемагглютининов до и после инактивации.-Результаты исследований представлены в таблице 2.

Формалин полностью инактивировал вирус энцефаломиокардита свиней в концентрациях 0,2 и 0,3 %. Гемагглютинирукхцая активность вируса снижалась в 32 и 64 раза соответственно. ДЭИ в концентрациях 5 и 10 ыМ обеспечивал полную инактивацию вируса. В стличии от формалина, ДЭИ практически не снижал гемагглютиниру-

Инактивация вируса энцефаломиокардита свиней формалином и ДЭИ

Инактивант Концентрация инактиванта Титры гемагглютининов _( об]эатные_величины 2 до инакти- после инак-вации тивации Остаточная инфекцион-ность

0,05 % 512 64 +

Формалин 0,10 % 0,20 % 512 512 32 16 +

0,30 % 512 8 -

I мМ 512 256 +

ДЭИ 5 мМ 512 256 -

10 Ш 512 128 -

щую активность вируса.

В дальнейшей работе для инактивации вируса энцефаломиокардита свиней использовали формалин в концентрации 0,2 % и ДЭИ -5 I.iL

Для исключения бактериального и грибкового роста в качестве консерванта к инактивированному вирусу энцефаломиокардита свиней добавляли мертиолат в конечной концентрации 1:20 ООО, который не влиял на его гемагглютинирухщую активность.

2.2.4. Изготовление инактивированных препаратов вируса энцефаломиокардита евшей.

Из инактивированного вируса энцефаломиокардита свиней готовили сорбированные и эмульгированные препараты. При изготовлении сорбированных препаратов использовали ГОА Щёлковского биокомбината. Оптимальную концентрацию ГОА, полностью сорбирующей вирус, определяли по отсутствию гемагглютининов в пробах, содер-

жащих ГОА от I до 40 мг/мл.

Вирус энцефаломиокардита свиней полностью сорбировался ГОА в концентрации 10 мг/мл. В дальнейших исследованиях для изготовления сорбированных препаратов вируса использовали ГОА в конечной концентрации 10 мг/мл (вирус смешивали с 2 % ГОА в соотношении 1:1).

Для приготовления эмульгированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней использовали масляные адъюванты ЕНШИ 3310, 3404 и Фрейнда (полный и неполный). Полученные из ШШИ адъюванты 3310 и 3404 стерилизовали при 120°С в течение 90 минут и смешивали с вируссодержащей суспензией в соотношении 1:1. Готовые препараты хранили во флаконах при 4°С до использования. Приготовленные эмульгированные препараты представляли собой эмульсию белого цвета, вязкой консистенции. Стабильность эмульсии проверяли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 минут. Допускалось отслоение не более 5-7 % масляной фазы.

2.2.5. Определение антигенной и иммуногенной активности

инактивированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней.

Антигенную и иммуногенмую активность инактивированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней определяли на морских свинках и белых мышах.

Для изучения влияния инактивантов на антигенную и иммуно-генную активность вируса энцефаломиокардита свиней готовили эмульгированные препараты из вируса, инактивированного формалином и ДЭИ. До инактивации гемагглютинирующая активность вируса составляла 1:512. Каждый препарат вводили пяти морским свинкам под-коино в дозе 1,0 мл двукратно с интервалом 21 день. Двукратно

вакцинированных животных заражали вирулентным вирусом, инфекционная активность которого составляла ТЦП^о/мл. Еируссодер-жащую суспензию вводили интраперитонеально в дозе 1,0 мл и инт-раназально - по 0,5 мл в каждую ноздрю. Сыворотки крови на наличие специфических антител исследовали перед иммунизацией, через 3 недели после первой и через 2 недели после второй иммунизации, а также через 2 недели после заражения. Результаты исследований представлены э таблице 3.

Таблица 3

Антигенная активность эмульгированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней в зависимости от вида инактиванта

_( х*д, п=5 )_

Инактивант ' __Тит£ы_антигемагглютининов_(об£атные_величины)

!ч/з 3 недели по!ч/з 2 недели по!ч/з 2 недели после I иммуниза- еле 2 иммуниза- еле заражения _!ции_!ции_!_

Формалин 102 ¿43,1 230 ± 86,1 461 ± 147,7 ДЭИ 128 ± 36,9 407 ± 49,2 1024 ± 296,1

Примечание: до иммунизации специфических антител в сы-Еоротках крови морских свинок не обнаружено.

Эмульгированные препараты, приготовленные из инактивирован-ного различными инактивантами вируса энцефаломиокардита свиней, обладали антигенной активностью и индуцировали у морских свинок образование антигемаггдотининов в титрах от 1:32 до 1:512. Повторная иммунизация эмульгироваткми препаратам! приводила гс нарастанию титров антител в сыворотках крови опытных животных.

Степень иммуногенности эмульгированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней, инактивированного различными инактивантами, оценивали по количеству погибших и вьшивашх животных.

Препараты вируса энцефаломиокардита, инактивированного формалином, обеспечивали защиту всего поголовья иммунизированных морских свинок при заражении. Несмотря на высокий уровень специфических антител в сыворотках крови опытных животных, двукратно вакцинированных препаратом, приготовленным из вируса, инактивированного ДЭИ, введение вирулентного вируса вызывало гибель 20 % морских свинок. Заражение неиммунизированных животных сопровождалось гибелью всего поголовья.

На антигенные и иммуногенные свойства вакцин большое влияние оказывает вид адъюванта. В связи с этим готовили эмульгированные и сорбированные препараты из вируса энцефаломиокардита свиней, инактивированного формалином. Оценку антигенной и имму-ногенной активности препаратов вируса проводили на морских свинках, вакцинацию которых осуществляли подкожно в область лопатки в дозе 1,0 мл двукратно с интервалом 3 недели.

Антигенную активность эмульгированных и сорбированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней сравнивали с активностью инактивированного вируса без адъюванта. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Инактивированный вирус энцефаломиокардита свиней без адъюванта обладал низкой антигенной активностью и индуцировал образование специфических антител в титрах не превышающих 1:32. Как эмульгированные, так и сорбированные препараты обладали антигенной активностью и индуцировали образование антител к вирусу энцефаломиокардита у опытных животных. Причём, уровень специфических антител в сыворотках крови морских свинок, иммунизированных инактивированным препаратом с адъювантом Фрейнда, был выше в 5,5-7,0 раз, чем у животных других опытных групп.

Двукратная иммунизация морских свинок эмульгированными пре-

Антигенная активность инактивированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней в зависимости от вида адьюванта

____( х*и, п=з )__

!_ _Тит£ы_антигемагглютининов_(обратнке_величины)

!ч/з 3 недели по-!ч/з 2 недели по-!ч/з 2 недели по-адъюванта еле I иммуниза- еле 2 иммуниза- еле заражения ! ции

Фрейнда 149 + 65,5 341 + 87,3 597 ± 262,0

ЕНИЯИ 3310 27 + 5,4 91 + 38,2 392 ± 163,7

ШИЯИ 3404 24 + 8,2 53 + 10,9 213 ± 43,7

ГОА 21 + 5,4 75 + 32,7 235 ± 152,8

Контроль II + 2,7 27 + 5,4 гибель

Примечание: до иммунппацил специфических антител в сыворотках крови морских свинок ке обнаружено.

паратеми вируса энцефаломиокардита, инактивировашого формалином, предохраняла их от гибели после заражения вирулентным вирусом. В результате заражения животных, вакцинированных сорбированным препаратом, отмечали гибель 12,5 % поголовья. Заражение морских свинок, иммунизированных инактивированным препаратом вируса без адьюванта, сопровождалось их гибелью.

Для оценки антигенной и иммуногенной активности сорбированного и эмультированного препаратов вируса энцефаломиокардита в зависимости от способа введения, морских свинок иммунизировали подкожно и внутримышечно в дозе 1,0 мл двукратно. Сыворотки крови на наличие специфических антител исследовали до иммунизации, через 2 недели после второй иммунизации и через 2 недели после заражения вирулентным вирусом. Перед иммунизацией у животных антител к вирусу энцефаломиокардита не обнаружено. Результаты исследований представлены в таблице. 5.

Антигенная активность сорбированного и эмульгированного препаратов вируса энцефаломиокардита свиней в зависимости от способа введения

( Х*ш, п=3 )

Ддъювант ! Способ 1 ^ введения ! Титры антигемагглютининов (обрат-_ные_величины)__________ !ч/з 2 недели по-!ч/з 2 недели пос-сле 2 иммуниза- ле заражения !ции !

ГОА внутримышечно 43 ± 10,9 53 ± 10,9

ГОА подкожно 53 ± 10,9 85 ± 21,7

ВНИЯИ 3404 внутримышечно 85 ± 21,7 107 ± 21,7

ШИЯИ 3404 подкожно 107 ± 21,7 213 ± 43,7

В ходь проведённых исследований установлено, что морские свинки обладают иммунологической реактивностью к препаратам вируса энцефаломиокардита при иммунизации их внутримышечным и подкожным способами.

Иммунизация морских свинок сорбированным и эмульгированным препаратами вируса энцефаломиокардита как подкожным, так и внутримышечным способами, обеспечивала полную защиту животных при заражении их вирулентным вирусом.

В следующей серии опытов изучали антигенную и иммуногенную активность инактивированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней в зависимости от кратности введения. Морских свинок иммунизировали подкожно в дозе 1,0 мл однократно и двукратно. До вакцинации специфических антител в сыворотках крови опытных животных не обнаружено. Результаты исследований представлены в таблице 6.

Повторная иммунизация морских свинок инактивированными сорбированным препаратом приводила к увеличению уровня специфических антител в 4,7 раза, а эмульгированным - в 3,4 раза.

Антигенная активность инактивированных препаратов вируса энцефэломиокардита свиней в виси.мости от кратности введения

( х±я, п=з )

Адъюван? Кратность введения ¡Титры антигемагглютининов (обратные величины) !ч/з 3 недели!ч/з 2 недели!ч/з 2 неделя после I имму- после 2 имму- после зара-!низации 'ниэации !хения

ГОА однократно 21 ± 5,4 _ 149 ±65,5

ГОА двукратно 16 ± 0 ^ ± 22,7 213 ± 152,8

ШШИ 3310 однократно 24 ± 8,2 - 139 ± 76,4

ШИЯИ 3310 двукратно 27 ± 5,4 91 ± 8,2 352 ± 163,7

Двукратная иммунизация эмульгированным и сорбированным препаратами вируса энцефаломиокардита свиней обеспечивала полную защиту опытных животных при заражении их вирулентным вирусом.

Для определения антигенной и иммуногенной активности сорбированных и эмульгированных препаратов вируса энцефаломиокардита в зависимости от количества антигена, проводили двукратную иммунизацию морских свинок. Инфекционная активность вируса,

7 5

накопленного в стационарных условиях, составляла 10 ' ТЦД^д/мл, в роллерных - 10®'^ ТЦД^о/мл. Перед иммунизацией морских свинок специфических антител в сыворотках крови не обнаружено. Результаты исследований представлены в таблице 7.

Инактивированные препараты, содержащие различное количество вируса, обладали выраженной антигенной активностью. Двукратное введение инактивированных эмульгированных и сорбированных препаратов, приготовленных из вируса с инфекционной активность» Ю8,5 ТЦД^о/мл, индуцировало образование антител к вирусу энцефаломиокардита в больших титрах, чем иммунизация эмульгированными и сорбированными препаратами, приготовленными из вируса с

Антигенная активность инактивированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней в зависимости от количества вируса

_( Х*т, п=3 )_

!Титры антигемагглютининов ^обратные величиньО _

Препарат !ч/з 3 недели по-!ч/з 2 недели по-!ч/э 2 недели после I иммуниза- еле 2 иммуниза- еле заражения _!ции_1ции_|_

Стационарный ШШИ 3310

Стационарный ГОА

Роллерный ШШИ-3310

Роллерный ГОА

27 ± 5,4 16 ± О 27 ± 5,4 21 ± 5,4

96 ± 32,7 43 ± 10,9 171 ±43,7 85 ± 21,7

341 ± 87,3 224 ± 131,0 341 ± 87,3 171 ± 43,7

инфекционной активностью Ю7'^ ТДД^о/мл.

Эмульгированные и сорбированные препараты, приготовленные из вируса энцефаломиокардита, полученного в роллерных условиях, обеспечивали полную защиту опытных животных при заражении их вирулентным вирусом. Сорбированные препараты, приготовленные из вируса энцефаломиокардита,полученного в стационарных условиях, обеспечивали защиту 87,5 % морских свинок при заражении.

Иммуногенные свойства инактивированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней изучали также на белых мышах. Животных иммунизировали двукратно с интервалом 21 день подкожно в область лопатки в дозе 0,5 мл. Вакцинированных белых мышей заражали вирулентным вирусом, инфекционная активность которого составляла ТЦЦ§о/мл, через 14 дней после ревакцинации.

Заражение животных проводили интраперитонеально в дозе 0,5 мл.

За белыми мытами наблюдали в течение 14 дней. В качестве контрольных использовали невакцинированных животных. Степень имму-ногенности препаратов оценивали по количеству погибших и оставшихся в живых белых мышей. Результаты исследований представлены в таблице 8.

Таблица 8

Кммуногенность инактивированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней на белых мышах

Адъювант !--------- Результаты_заражения------

_!заражено,гол!погибло,гол!еыжило.гол\% летальности

ВНИЯИ 3310 40 5 35 12,5

ГОА 40 18 22 45,0

Контроль 20 20 0 100,0

Иммунизация белых мышей инактивированными препаратами вируса энцефаломиокардита свиней не обеспечивала полной защиты животных при заражении их вирулентным вирусом. Однако, процент летальности в группе животных, вакцинированных эмульгированным препаратом, был в 3,6 раза ниже, чем при иммунизации сорбированным препаратом.

2.2.6. Влияние хранения инактивированных. препаратов вируса энцефаломиокардита свиней на их антигенную и иммуногенную активность

Антигенную и иммуногенную активность эмульгированного и сорбированного препаратов вируса энцефаломиокардита-, инактивирован-ного формалином, определяли через 6 месяцев их хранения при 4°С. На каждый препарат использовали по 3 морских свинки. Сорбированный и эмульгированный препараты вводили подкожно в области лопатки в дозе 1,0 №1 двукратно с интервалом 21 день (таблица 9),

Таблица 9

Антигенные свойства инактивированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней через б месяцев после изготовления

( А г т. , п. = 3 )

! Титры антигемагглютининов (обратные величиньО __

Адъювант ,Ч//3 ^ недели после 2 им-!ч/з 2 недели после зара-_!мунизации_!жения_

ГОА 43 ± 10,9 277 ± 152,8

ШИЯИ 3310 Ъ ± 32,7 256 ± 131,0

Примечание: специфических антител в сыворотках крови

морских свинок до иммунизации не обнаружено

Сорбированные и эмульгированные препараты, приготовленные из вируса энцефаломиокардита, инактивированного формалином, сохраняли свои антигенные и иммуногенные свойства при хранении их при температуре 4°С в течение 6 месяцев (срок наблюдения ), обеспечивая полную защиту вакцинированных морских свинок при-заражении вирулентным вирусом.

ВЫВОДЫ

1. Определена чувствительность перевиваемых культур клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ), тестикул поросят ,(5Т) и щитовидной железы свиньи (ЩС) к вирусу энцефаломиокардита свиней. Наибольшее накопление вируса отмечено в культуре клеток СПЭВ.

2. Установлены оптимальные условия выращивания вируса эн-цефаломиокардит а свиней в перевиваемой культуре клеток СПЭВ. Максимальное накопление вируса энцефаломиокардита происходит при заражении клеток СПЭВ вирусом в разведении 1:10 и культивировании в течение 18-24 часов при 37°С в роллерных условиях.

3. Выбрана лабораторная модель для изучения патогенных сво-

Пств вируса энцефаломиокардита свиней. Заражение морских свинок сопровождается развитием заболевания. Введение вирулентного вируса в дозе 2-Ю7,0- 2-Ю8,0 ТЦД^ вызывает гибель 100 %, 2.Ю6,0- То %, а в дозе 2-105,0 ТЦ%0- 50 % животных.

4. Патоморфологические изменения у морских свкнок, заражённых вирусом энцефаломиокардита свиней, характеризуются расстройством гемодинамики в лёгких, головном и спинном мозге, сердце, печени и почках; негнойнкм менингоэнцефаломиелитом, миокардитом и дистрофическо-некротическими процессами в печени, селезёнке и почках.

5. Определены условия инактивации вируса энцефаломиокардита свиней с целью получения безопасных и антигенно активных препаратов. Формалин и димер этиленимина полностью инактивиру-ют вирус в концентрации 0,2 % и 5 соответственно в течение 72 часов при температуре

6. Инактивированные препараты вируса энцефаломиокардита свиней обладвют выраженными антигенными и иммуногенннми свойствами. Двукратная подкожная иммунизация морских свинок индуцирует выработку специфических антител в высоких титрах и защищает ■ животных от заражения.

7. Инактивированные препараты вируса энцефаломиокардита свиней сохраняют антигенные и иммуногенные свойства при хранении их при температуре 4°С в течение 6 месяцев (срок наблюдения).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты проведённых исследований использованы при разработке лабораторного регламента на изготовление набора для выявления антител к вирусу энцефаломиокардита свиней в реакции торможения гемагглютинации (утверждён директором ВЮЗ 28 ноября 1994 г.).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Мальцев Д.В. Определение оптимальных условий культивирования вируса энцефаломиокардита в перевиваемой культуре клеток почек эмбриона свиньи// Материалы научной конференции "Актуальные проблемы ветеринарии, животноводства и подготовки кадров на Южном Урале". - Челябинск. - 1993. - С. 32-34.

2. Мальцев Д.В., Орлянкин Б.Г. Антигенная активность инак-тивированных препаратов вируса энцефаломиокардита свиней// С-х биология. - 1993. - # 6. - С. 125-126.

3. Мальцев Д.В., Орлянкин Б.Г., Савич О.М. Культивирование, антигенные и иммуногенные свойства вируса энцефаломиокардита свиней// Материалы научной конференции "Классическая чума свиней". - Покров. - 1994 (в печати).