Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммунобиологические свойства вакцинного штамма КС вируса классической чумы свиней

На правах рукописи

КОРИЦКАЯ МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВАКЦИННОГО ШТАММА КС ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2005 г.

Работа выполнена в лаборатории средств специфической профилактики вирусных болезней ЗАО «Научно-производственное объединение НАРВАК».

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки РСФСР Сергеев ВА.

доктор биологических наук Непоклонов Е.А.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук

Мищенко Н.К. (ФГУ ВГНКИ); доктор ветеринарных наук, профессор Куриннов В.В. (ВНИИВВиМ РАСХН)

Ведущая организация: ФГУ Федеральный центр охраны здоровья животных (ФГУ ВНИИЗЖ).

Защита диссертации состоится

Ж 6^2005 г. в Л'

■г>*>

часов

на заседании диссертационного совета Д 220.011.01 при ФГУ Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов по адресу: г. Москва, Звенигородское ш., д.5, ФГУ ВГНКИ.

1.0бшая характеристика работы

1.1-Актуальность темы

Классическая чума свиней (КЧС) является наиболее опасной вирусной болезнью свиней, причиняющей серьезный экономический ущерб многим странам с развитым свиноводством. КЧС, в зависимости от штамма вируса, протекает в острой, хронической и инапаратной формах, характеризуется высокой контагиозностью и летальностью до 100% (Edwards S. et. AL, 2000; Сергеев ВА., Непоклонов ЕА., Алипер Т.И., 2001; Van Oirschot, 2003; Пруцников СИ. и др., 2003). По данным Международного Эпизоотического Бюро (МЭБ, 2000) КЧС относится к группе особо опасных болезней животных.

Вирус КЧС вместе с вирусом диареи (ВД) крупного рогатого скота и вирусом пограничной болезни овец (ПБО) образуют род пестивирусов в семействе флавивирусов. Кроме структурно-морфологического сходства эти вирусы имеют тесное антигенное родство между собой (Collet M., et al., 1988; Moenning V., 1990).

Вирус КЧС способен размножаться в клеточных культурах различных видов млекопитающих (Pirtle E., KniazeffA. 1968), однако он накапливается в высоком титре главным образом в культурах клеток свиного происхождения. Отличительной особенностью вируса КЧС является способность размножения, как правило, без цитопатического эффекта (ЦПЭ), даже в клеточных культурах естественного хозяина (Moenning, 1990).

Имеются отдельные сообщения (Gillespie J., et al., 1962, Laude, H., 1978) о слабовыраженном ЦПЭ отдельных штаммов вируса КЧС. Размножение вируса КЧС с отчетливо выраженным ЦПЭ наблюдали лишь в культуре клеток стромы костного мозга поросят недельного возраста (Shimizu Y., et al., 1995) и в линии CPK-NS клеток почки свиньи, полученной и выращиваемой в среде без сыворотки (Sakoda Y., et al., 1998).

Специфическая профилактика КЧС основывается на применении живых безопасных и высокоиммуногенных вакцин. В мировой практике используют живые вакцины, различающиеся между собой главным образом способом размножения вакцинного штамма вируса и его накоплением. Вакцинные штаммы вируса КЧС размножают или на кроликах или в культуре клеток (Vandeputte Y., Chappuis G., 1999). В обоих случаях наиболее широко используют китайский штамм (С-штамм) (Van Oirschot, 2003), аттенуированный длительным пассированием на кроликах (более 800 пассажей) (Oleksiewicz M., et al., 2003).

В 1967 г. в СССР впервые были созданы две культуральные вакцины против КЧС: ВГНКИ (Лихачев Н.В., Мищенко Н.К.) и ЛК-ВНИИВВиМ (Сергеев ВА, Попов ВИ). Вторая принципиально отличалась тем, что вакцинный штамм ЛК размножали в культуре клеток не свиного происхождения (в субкультуре клеток тестикулярной ткани ягнят). Эти вакцины существенно не отличались от аналогичных вакцин, применяемых в других странах. Положительный опыт борьбы с КЧС с помощью вакцинации накоплен во многих странах (Kutter D., 1999). Однако, опыт борьбы с КЧС в странах ЕС привел к выводу, что существующие в мире живые вакцины против КЧС и традиционные схемы их применения «способны защитить свиней от заболевания и гибели, но не от инфицирования» (Edwards S., 1998). Стратегия ликвидации КЧС путем тотального убоя свиней в неблагополучных хозяйствах, принятая странами ЕС, не приемлема для России по экономическим причинам. Единственным безальтернативным способом ликвидации КЧС без тотального убоя свиней является стратегия гипервакцинации (Сергеев ВА, Непоклонов ЕА., Алипер Т.И.), для реализации которой требовалось создание новой живой вакцины с повышенной активностью. Решению этой актуальной задачи посвящена наша работа.

1.2.Цель и задачи исследований

Усовершенствование средств специфической профилактики классической чумы свиней на основе вакцинного штамма ЛК-КС с целью повышения активности сухой вакцины.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить иммунобиологические свойства вакцинного штамма ЛК-КС вируса КЧС;

- освоить и внедрить в исследовательскую практику изготовление и контроль вакцины методы количественного определения вакцинного вируса (PLA) и специфических антител (NPLA);

- провести ревизию и оптимизацию основных технологических этапов изготовления живой вакцины;

- усовершенствовать нормативную документацию на вакцину КС;

- наладить серийное производство вакцины КС в соответствии с потребностями ветеринарной практики.

1.3.Научная новизна исследований

Показано, что вакцинный штамм КС (ЛК-КС) генетически и фенотипически отличается от китайского вакцинного штамма ^ вируса КЧС. Штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, в 1996г. и в GenBank(CШA) за N^AF099102 (2003 г.) . Установлена прямая корреляция между концентрацией вакцинного вируса и иммуногенностью сухой вакцины КС для свиней. Определена возможность длительного хранения клеток ТЯ в жидком азоте без потери ростовых свойств и репродукции вакцинного штамма вируса КЧС Изучена длительность персистенции вакцинного штамма в организме привитых свиней, что облегчает дифференциацию носительства вакцинного и полевых штаммов вируса КЧС.

Обратная зависимость уровня сероконверсии у вакцинированных свиней от дозы вакцины при ее титровании указывает на необходимость увеличения интервала времени между вакцинацией и определением титра ВНА (NPLA).

Рекомбинантный химерный вирус КЧС-ВД сохранил свойства обоих родителей: иммуногенные свойства вакцинного штамма вируса КЧС и цитопатогенность вируса ВД КРС.

1.4.Практическая значимость исследований

Разработаны и предложены для практического применения:

- вакцина КС против классической чумы свиней живая культуральная сухая. Извещение №1 об изменении ТУ 9384-018-000080-64-98, утверждено Генеральным директором «НПО НАРВАК» 20 марта 2003г. и согласовано с Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 20 марта 2003 г.

- наставление по применению вакцины КС против классической чумы свиней живой культуральной сухой. Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 20 марта 2003г.

В результате оптимизации условий размножения, хранения и лиофилизации вируса, активность вакцины КС повышена в 10 раз по сравнению с базовым вариантом -вакциной Ж ВНИИВВиМ.

1.5.Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета НПО НАРВАК (2000-2004гг), а также на научной международной конференции в г.Феодосия (2003 г.).

1.6.Публикации

По теме диссертации опубликованы 6 научных работ.

1.7.Основные положения диссертационной работы, выносимые на

защиту:

-иммунобиологические свойства вакцинного штамма КС вируса КЧС;

-условия массового размножения и лиофилизации вакцинного штамма КС с целью изготовления сухой вакцины для практического применения;

-биологическая активность вакцинного штамма КС in vivo и in vitro;

-свойства рекомбинантного (химерного) штамма КЧС-ВД вируса КЧС.

1.8.Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения. Список литературы включает 174 источника, в том числе 31 отечественных и 143 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 2 рисунками и 32 таблицами.

За проведение совместных исследований и помощь в работе приносим искреннюю благодарность сотрудникам НПО НАРВАК :Т.И.Алиперу, ММ.Демкиной, М.И.Мусиенко, Т.В.Гребенниковой, А.Н.Власовой, А.Д.Забережному, С.Н.Корженкову.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Материалы и методы

2.1.1.Вирусные штаммы. В исследованиях использовали, в основном, два производственных штамма вируса КЧС: аттенуированный (вакцинный) штамм КС и высоковирулентный штамм Ши-Мынь. Первый поддерживали размножением в культуре клеток ТЯ, второй - размножением в организме свиней, серонегативных к вирусу КЧС. Для длительного хранения их лиофилизировали или помещали на -70°С. Химерный вирус КЧС-ВД получен на основе инфекционного клона вакцинного штамма КС вируса КЧС (А.Д. Забережный и др., 2003). Последовательность гена поверхностного гликопротеина Е2 вируса КЧС была замещена на аналогичную последовательность цитопатогенного штамма NADL вируса диареи КРС. Трансфекция чувствительных клеток инфекционной

РНК химерного вируса сопровождалась серийным размножением вируса в культуре клеток РК-15, SK-6 и ТЯ.

2.1.2.Питательные среды, сыворотки, растворы. В работе использовали питательные среды: 0,5%ГЛА на растворе Хенкса (производства ИПиВЭ); MEM, ДМЕМ, раствор Хенкса, 0,25% раствор трипсина, 0,02% раствор версена (производства НПО Нарвак). В питательные среды и растворы вносили антибиотики в обычно принятой концентрации.

Для выращивания культур клеток использовали сыворотку крови новорожденных телят («Gibco»), а также сыворотку крови плодов крупного рогатого скота (фетальную).

2.1.3.Культуры клеток. Первичные культуры, субкультуры клеток и культуры перевиваемых линий клеток готовили общепринятым способом, используя питательную 0,5% ГЛА на растворе Хенкса с 7-10% сыворотки крови свободной от антител к вирусу диареи КРС.

2.1.4.Определение инфекционной активности вируса в культуре клеток. Вирусный антиген выявляли методом PLA (peroxidase-linked-assay). Суспензию клеток РК-15 вносили в 96-луночные плашки (Nunc). Десятикратные разведения вируса делали в 96-луночных плашках (180мкл среды + 20 мкл вируса) или в 24-луночных плашках (900мкл среды +100 мкл вируса) и вносили их в плашки с культурой клеток. После внесения разведений вируса в суспензию клеток, плашки инкубировали в СОг-инкубаторе 3-4 суток.

По истечении срока инкубации из плашек удаляли ростовую среду, монослой промывали PBS и в лунки вносили фиксирующий раствор. Плашки помещали в холодильник на +4°С на 1 час.

После удаления фиксирующего раствора монослой клеток высушивали использовали для выявления вирусного антигена в клетках, инфицированных разными разведениями вируса. В лунки вносили по 0,05 мл специфической кроличьей антисыворотки в рабочем разведении, выдерживали 60 мин при 37°С. Лунки планшета промывали буфером (PBST), вносили по 0,05 мл антикроличьих антител, меченных пероксидазой хрена, инкубировали 1 час при 37°С. Лунки планшета вновь промывали буфером (PBST) и вносили раствор хромогена диэтилкарбазола. Планшеты просматривали под световым микроскопом. Окрашивание клеток в темно-красный цвет свидетельствовало о наличии антигена вируса КЧС.

2.1.5.Выявление вирусного антигена методом иммунофлуоресцентного анализа (МФА). Для постановки реакции иммунофлуоресценции использовали 96-луночные плашки с культурой клеток РК-15, зараженной десятикратными разведениями вируса

(титрование по описанной ранее методике). Через 96 часов инкубации монослой промывали PBS и фиксировали в спирт-ацетоне. После фиксации плашки сушили и затем монослой инкубировали с прямым анти-КЧС конъюгатом (меченным FITC) в течение 1 часа при 37°С, промывали (3 раза PBS, 3 раза - водой). Затем монослой обрабатывали контрастирующим агентом Evans Blue (Sigma) и учитывали результат под флюоресцентным микроскопом.

За титр инфекционности вируса принимали максимальное разведение, вызывающее инфицирование клеток в 50% лунок и выражали в дозах инфицирующих культуру клеток (lg ТКИДбо/мл). Вирус, нейтрализованный специфической антисывороткой, не выявлялся методами PLA и МФА.

2.1.6.Выявление антител в реакции нейтрализации (NPLA). Для постановки реакции делали двукратные разведения исследуемых сывороток в 96-луночных планшетах в 0,1 мл на ростовой среде, содержащей 100-500 ТКИД50 вируса КЧС (штамм КС) и инкубировали 1 час при 37°С.

Суспензию клеток РК-15 разливали по 0,1 мл в 96-луночные плашки и добавляли по 0,1 мл каждого разведения сыворотки.

Плашки с культурой клеток помещали в СОг-инкубатор на 3-4 суток. По окончании срока инкубации содержимое лунок удаляли и фиксировали монослой по описанной ранее методике. После удаления фиксирующего раствора монослой клеток высушивали и использовали для постановки реакции (PLA).

Вируснейтрализующий титр сыворотки выражали как максимальное ее разведение, ингибирующее репродукцию вируса в 50% лунок с зараженной культурой клеток.

2.1.7.Выявление антител методом ИФА Антитела к вирусу КЧС кроме реакции нейтрализации выявляли методом ИФА с помощью «Набора реагентов для определения антител к вирусу КЧС иммуноферментным методом «КЧС-серотест» (ТУ 9388-08200008064-98).

2.1.8.Полимеразная цепная реакция. Вакцинный штамм вируса КЧС выявляли методом обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Контаминацию клеточных культур вирусом ВД определяли методом ПЦР.

2.1.9.Лиофилизация вакцины КС. Вакцинный вирус лиофилизировали в присутствии криозащитной среды. Готовили 7 криозащитных сред, в состав которых входили сахароза, желатоза, ГЛА, глютамат Na, сухое молоко, сыворотки крови. Компоненты защитных сред стерилизовали автоклавированием, фильтрованием или гамма лучами (2 млн. рад). Стерильные компоненты объединяли в различных

соотношениях с вируссодержащей жидкостью, помещали по 1 мл в 3 мл флаконы и лиофилизировали.

Процесс лиофилизации включал три этапа: замораживание, сублимацию и досушивание. Смесь культурального вируса со средой высушивания (по 1мл в 3 мл флаконах) замораживали (6-8 часов) до полного замораживания материала (-45°С).

Сублимацию проводили при вакууме около 0,160 мбар. При этом температура в материале поддерживалась в зоне эвтектики в температурном диапазоне между нижней (-38°С) и верхней (-31°С) эвтектическими температурами не менее 50 часов.

После удаления из материала около 90% влаги проводили досушивание в течение 15 часов при температуре в материале 25°С.

2.1.10.Ускоренное «старение» вакцины. 6 флаконов с сухой вакциной каждой серии выдерживали в течение 7 суток при 37°С. По истечении этого срока пробы титровали в культуре клеток РК-15 и определяли инфекционную активность методом PLA.

Активность вакцины после ускоренного старения не должна снижаться более чем на 2,01 ^ТКИД50/мл.

2.2.Результаты собственных исследований

2.2.1.Чувствительность культур клеток к вирусу. Изучали чувствительность 6 линий клеток к вакцинному штамму вируса КЧС. С этой целью использовали линии клеток ткани почек: свиньи (РК-15, РК-1, СПЭВ), сайгака (ПСК), горного козерога (ПСГК) и зеленой мартышки (Vero). В качестве положительного стандарта использовали субкультуру клеток ТЯ, в которой вакцинный штамм ЛК-КС вируса КЧС хорошо размножался.

Инфицированные культуры инкубировали при 37°С в течение 3-4 дней. Наличие вируса в культурах различных линий клеток определяли после 5, 6 и 7-го пассажей методом ОТ-ПЦР.

Учитывая данные литературы о возможной контаминации клеточных культур вирусом диареи крупного рогатого скота, источником которого является сыворотка данного вида животных, нами проведены соответствующие исследования. Контаминацию культур клеток ТЯ и 6 линий клеток вирусом ВД определяли методом ПЦР.

Исследовали неразведенную культуральную жидкость после однократного замораживания инфицированной культуры. Полученные результаты показали, что свободными от контаминации вирусом ВД при повторных исследованиях оказались культуры клеток ТЯ.СПЭВ и РК-15. Из 6 линий клеток к вакцинному штамму вируса КЧС

чувствительной оказалась только линия клеток РК-15. Все пробы вируса в этих культурах клеток после 5-7 пассажей были отрицательными в ПЦР.

2.2.2.Методы титрования вируса. Первоначально сравнивали чувствительность различных культур клеток свиного происхождения: субкультуры (1-й пассаж) клеток почки поросенка (ПП) и тестикул поросенка (ПТ), а также линии клеток почки поросят (РК-15) и тестикул поросят (ПТП). Стандартом чувствительности к вакцинному штамму служила субкультура клеток ТЯ (1-5 пассажей). Наиболее высокой чувствительностью обладали субкультура клеток ТЯ и линия клеток РК-15 (титр 6 проб вируса был в пределах 6,8-7,2 ^ ТКИД/МЛ). Субкультуры ПП и ПТ обнаружили незначительно меньшую чувствительность (6,5-6,7 ^ ТКИД/МЛ). Перевиваемая линия клеток ПТП оказалась слабо чувствительной (4,2-5,0 ^ ТКИД^/МЛ). В дальнейшем сравнивали 3 варианта титрования 7 образцов вируса в культуре клеток ТЯ в полистироловых 96-луночных планшетах.

1-й вариант. В лунки с однослойной культурой вносили по 180 мкл среды и по 20 мкл вируса каждого разведения. 2-й вариант. В лунки вносили по 180 мкл суспензии клеток и по 20 мкл вируса каждого разведения. 3-й вариант клеток с одновременным разведением вируса. Во все лунки вносили по 180мкл суспензии клеток; в первый ряд лунок добавляли по 20 мкл исходного вируса, в последующие ряды лунок вносили по 20 мкл смеси клеток с вирусом предыдущего разведения.

При титровании по вариантам 1 и 2 10-кратные разведения вируса готовили в пенициллиновых флаконах, а затем вносили в лунки с клетками. При титровании по варианту 3 внесение вируса сочеталось с его разведением.

Чувствительность 3-х вариантов титрования вируса оказалась сходной. Наиболее простым является титрование в суспензии клеток, с одновременным разведением вируса, так как при этом методе сокращается время получения результата с 7-8 до 4 дней (с учетом времени необходимого для выращивания культуры клеток). Этот метод в дальнейшем использовали при титровании вируса.

2.2.3.Продолжительность субкультивирования клеток ТЯ и накопление вируса. Клетки ТЯ способны к росту не более 9-10 пассажей (в отдельных случаях в течение 12 пассажей). До 7-го пассажа клетки, как правило, обладают выраженной ростовой способностью и при коэффициенте пересева 1:2-1:3 формируют монослой на 2-5 сутки, затем рост клеток замедляется, монослой формируется на 6-10 сутки, морфология клеток изменяется.

Субкультивирование клеток ТЯ на протяжении 6-7 пассажей в роллерных сосудах объемом 1 и 3 л обеспечивало высокое накопление вируса (6,7-7,5 ^ ТКИД50/МЛ). С

увеличением продолжительности субкультивирования клеток ТЯ накопление вируса снижалось. В дальнейших опытах для выращивания вируса, как правило, использовали клетки ТЯ, выращенные в течение 3-6 пассажей.

2.2.4.Накопление вируса в роллерной и статической культуре. Субкультуры клеток ТЯ выращивали в матрасах 1,5-2 л, в пластиковых многополочных "фабриках" фирмы Nunc (Голландия) и роллерных флаконах 1 и 3 л. Однослойную культуру клеток ТЯ 1-6 пассажей заражали вирусом по стандартной методике и инкубировали 4 дня. В каждом опыте концентрацию вируса определяли в пробах, взятых из 2-3 аналогичных сосудов после окончания периода культивирования вируса.

В роллерной культуре (табл.1) накопление вируса было более интенсивным. Это, вероятно, в основном связано с относительно большим числом клеток ТЯ на единицу объема поддерживающей среды, а также с особенностями условий роллерного культивирования.

Таблица 1

Накопление вируса в культуре клеток ТЯ при разных способах культивирования

Культуральные сосуды Кол-во клеток/мл Кол-во опытов Титр вируса (lg ТКИД50/МЛ) в различных опытах

Матрасы 1,5 л 70000 13 6,5-7,5л7,2)

Матрасы 2 л 85000 12 7,0-7,5 (7,3)

«Фабрики» Nunc 70000 3 6,7-7,3 (7,0)

Роллерные флаконы 1л и Зл 250000400000 16 6,7-8,0 (7,5)

В скобках указан средний титр вируса.

2.2.5.Накопление вируса в клетках ТЯ и среде в процессе культивирования. Клетки ТЯ (1-3 субкультура) выращивали в 1л роллерных флаконах и заражали внесением вируса (Юмл-7,0 ^ ТКИД50) в поддерживающую среду (100 мл). Инфицированную культуру инкубировали 1-5 дней при 37°С. Изучали накопление вируса в культуральной жидкости (КЖ) и в клетках, для чего ежедневно брали по 3 сосуда с инфицированной культурой и определяли содержание вируса в КЖ до замораживания и в цельной культуре (ЦК) после замораживания с целью освобождения вируса из инфицированных клеток. Ежедневно брали объединенную пробу из 3 аналогичных сосудов с инфицированной культурой.

Из данных, приведенных на рис. 1. видно, что вирус максимально накапливался через 3-4 дня. Через 5 дней титр вируса оставался на прежнем уровне или незначительно снижался. Через 2-5 дней культивирования основная масса вируса (около 90%) оставалась

связанной с клетками культуры, которая внешне не отличалась от аналогичной неинфицированной культуры клеток ТЯ Однократное замораживание инфицированной культуры позволяет освободить основную массу внутриклеточного вируса и увеличить его выход в КЖ примерно в 5 раз (с 7,0 до 7,7 ^ ТКИД/МЛ)

Рис 1 Накопление вируса в роллерной культуре в процессе культивирования.

Содержание вируса в культуральной жидкости до разрушения клеток (1) и после разрушения клеток замораживанием (2)

2 2 6 Способ заражения культуры клеток. Роллерную культуру клеток заражали с адсорбцией и без адсорбции вируса на клетках

Вирус вносили в культуральные сосуды после удаления ростовой среды перед или одновременно с внесением поддерживающей среды и инкубировали 3-4 суток Накопление вируса при обоих способах заражения культуры было практически одинаковым (7,4 и 7,5 ^ ТКИД50/МЛ) Адсорбция вируса на клетках перед внесением поддерживающей среды не влияет на его накопление, а лишь усложняет технологический процесс получение вируса В другом варианте опытов сравнивали накопление вируса при заражении выросшей монослойной культуры и клеток ТЯ при посеве

В последнем случае поддерживающая среда содержала от 5 до 8% сыворотки плода КРС В обоих случаях использовали разные заражающие дозы вируса, а культивирование длилось 4 суток

Установлено, что накопление вируса (6 7-7,5 ^ ТКИД50/МЛ) не зависит от способа заражения культуры (на монослой или в суспензию клеток) Заражение в суспензию упрощает и ускоряет процесс накопления вируса, но в этом случае необходимо

использовать клетки ТЯ с высокой ростовой потенцией и сыворотку без антител к вирусу

вд.

2.2.7.3аражагощая доза вируса. Роллерную культуру клеток ТЯ заражали с различной множественностью: 0,1; 1,0; 10 ^ ТКИДя/мл на 1 клетку. Каждой дозой вируса заражали по 3 роллерных культуры. Инфицированные культуры инкубировали 4 сут. Для титрования брали среднюю пробу вируса из 3 аналогичных культур. Опыты повторяли 3 раза.

Полученные результаты (табл. 2) показали, что накопление вируса находится в зависимости от дозы заражения. Для получения вируса в максимальной концентрации (7,5-7,7 ^ ТЦЦ5(/мл) роллерную культуру клеток ТЯ следует заражать вирусом в соотношении ~1 ТКИД50 на 1 клетку и культивировать 4 дня при 37°С.

Таблица 2

Влияние дозы заражения на накопление вируса в культуре клеток ТЯ

Число пассажей клеток ТЯ Возраст культуры клеток, дни Заражающая доза вируса (1ВТКИД5о на клетку) Накопление вируса (^ТКИДо/мл) через 96 часов

№ опыта средние данные

1 2 3

2-3 2-3 0,1 6,7 6,7 6,2 6,5

2-3 2-3 1 7,5 7,3 7,7 7,5

2-3 2-3 10 7,2 7,5 7,2 7,3

2.2.8.3амораживание клеток ТЯ. В связи с сезонностью рождения ягнят и получения тестикулярной ткани изучали возможность хранения клеток ТЯ в жидком азоте. Клетки первичной культуры ресуспевдировали в криозащитной среде, помещали в ампулы и хранили в жидком азоте до приготовления культуры. При восстановлении культуры замороженную суспензию клеток вносили в культуральный сосуд (1,5 л матрасы) и добавляли ростовую среду. Через 24 ч проводили смену среды. Отмечена корреляция жизнеспособности клеток ТЯ до и после хранения в жидком азоте.

Чувствительность к вирусу клеток ТЯ (3-7 субкультура) до и после замораживания сравнивали путем титрования нескольких образцов вируса. Условия выращивания клеток и титрования вируса в обоих случаях были одинаковыми. Титр вируса в обеих культурах оказался практически одинаковым (7,5 и 7,3 ^ ТКИДо/мл). В других опытах изучали размножение вируса в роллерной культуре клеток ТЯ до и после хранения в жидком азоте (111

1,5 г.). Незамороженные и замороженные клетки обладали хорошей ростовой способностью и были использованы для репродукции вируса на уровне 1-7 субкультур. Роллерные культуры заражали с высокой множественностью (7,0 ^ ТЩЦо/мл), инкубировали 4 дня, после чего клетки разрушали кратковременным замораживанием ( от -20° до -60°С, 30 мин -1 час) и определяли титр вируса..

Установлено, что клетки ТЯ, хранившиеся в жидком азоте 6-18 месяцев, сохранили выраженную способность к росту в культуре и репродукции вируса КЧС (табл. 3). В роллерной культуре, приготовленной из клеток, подвергшихся и не подвергшихся замораживанию, вирус накапливался в высоком титре (6,5-7,7 ^ ТЩП^/мл). Таким образом, установлена возможность использования в производстве вакцины КС клеток ТЯ хранившихся в жидком азоте не менее 1-1,5 лет.

Таблица 3

Влияние замораживания клеток ТЯ на размножение вируса

Продолжительность Накопление вируса ТКИД5(/мл) в крьтуре Средний титр

хранения клеток в клеток различных пассажей вируса

жидком азоте, мес 1 2 3 4-5 67 (^ТСИДя/мл)

6-8 Н.и. 6,2 6,7 6,2 6,7 6,7

Н.и. 6,7 7Д 6,7 7,2

12 6,7 6,7 6,2 5,2 6,7 7,0

7,7 7,2 7,0 6,7 7,2

Н.И. 7,7 7,7 7,2 7,7

18 7,2 7,7 6,7 7,7 7,2 7,4

7,7 7,0 7,7 Н.И. 7,0

Клетки до 6,5 6,7 7,0 6,7 6,7 7,2

замораживания 6,7 7,5 7,2 7,7 7,2

(контроль) 7,7 77 7,7 ни 7,7

н.и.-не исследовано

2.2.9.Наличие антител к вирусу ВД в ростовой среде. Наличие антигенной связи

между ВД и КЧС, а также частое присутствие антител к ВД в сыворотке крови КРС, хорошо известно. Учитывая эти обстоятельства, исследовали размножение штамма КС вируса КЧС в культуре клеток ТЯ, выращенной с сывороткой КРС (эмбриональной или телячьей), содержащей нейтрализующие антитела (ВНА) к ВД в титре 1:16. Определяли влияние антител на накопление вируса в клеточной культуре и на чувствительность клеток ТЯ при титровании вируса. Клетки ТЯ выращивали в среде 0,5% ГЛА с 7% сыворотки, содержащей или не содержащей ВНА к ВД. В опытах по изучению влияния

антител на накопление вируса ростовую среду заменяли на поддерживающую среду без сыворотки и вносили вирус (107 ТКИД50/МЛ). В ряде опытов клеточный монослой перед заражением промывали 2-3 раза поддерживающей средой для удаления остатков сыворотки, присутствовавшей в ростовой среде. Инфицированные культуры клеток ТЯ инкубировали при 37°С 3-4 дня и титровали в культуре клеток ТЯ, выращенной в отсутствии антител к ВД.

Выращивание клеток ТЯ в среде с сывороткой, содержащей нейтрализующие антитела к вирусу диареи КРС в титре 1:16, не влияет на накопление штамма КС в роллерной культуре (7,0-7,5 ^ ТКВД50/МЛ), если при заражении использовать среду без сыворотки.

При титровании вируса необходимо выращивать клетки в отсутствии антител с самого начала, или перед отделением клеток от стекла промывать монослой 2-3 раза, суспензию клеток готовить в среде с сывороткой без антител к ВЦ или перед титрованием клетки выращивать в течение 1-2 пассажей с сывороткой без антител к ВЦ.

Таблица 4 Влияние антител к вирусу ВЦ на размножение вакцинного штамма КС в культтое клеток

Накопление вируса

Характеристика культуры перед заражением ЖИД/мл

4-7 пассажей в присутствии сыворотки с ВНА к ВД (1:16) перед заражением смена среды на бессывороточную 7,0-7,5

То же + отмывание монослоя 2-3 раза перед заражением 7,0-7,5

То же + 1 пассаж клеток с сывороткой без антител 7,0-7,5

4-7 пассажей с сывороткой без антител (контроль) 7,0-7,5

2.2.10.Персистенция вакцинного штамма КС у привитых свиней по данным ПЦР.

Длительность присутствия вакцинного штамма КС вируса КЧС в организме привитых свиней определяли с целью возможной дифференциации вакцинированных и невакцинированных животных. В первом опыте 4-х свиней 80-90-дневного возраста, серонегативных к вирусу КЧС, прививали вакциной КС однократно внутримышечно в дозе, рекомендованной наставлением для благополучных по КЧС хозяйств (1000 ИмДбо). Наличие вируса КЧС в крови привитых свиней определяли методом ПЦР. Кровь для исследования брали на 2, 3, 4, 7, 14, 21 дни после вакцинации. В каждый из указанных периодов исследовали кровь от 4 животных. Кроме наличия вируса КЧС в крови определяли вируснейтрализующие антитела (ВНА) методом МР1А.

Таблица 5

Наличие вакцинного штамма КС и нейтрализующих антител в крови поросят через

различн ые периоды после вакцинации (1000 ИмД„

Время после вакцинации Наличие вируса (ПЦР) Наличие ВНА

(дни) (ОТЬД)

2 4/4

3 4/4

4 4/4

7 2/4 +

14 0/4 +

21 0/4 +

числитель-количество положительных проб;

знаменатель-количество исследованных проб.

Приведенные в таблице данные показывают, что вакцинный вирус обнаруживается в крови у 50% поросят в течение 7 дней после вакцинации. Через 14 дней и позже после прививки вакцинный вирус в крови поросят не обнаруживался. Таким образом, вакцинный штамм КС вируса КЧС персистирует в крови свиней, иммунизированных в дозе 1000 ИмД50, в течение 7 дней и исчезает между 7-14 днями после вакцинации. Специфические ВНА удавалось обнаружить в крови свиней через 7 дней после вакцинации.

В другом опыте исследовали персистенцию вакцинного штамма в зависимости от дозы вакцины. Вакциной в дозе 10000 и 100000 ИмД50 прививали внутримышечно по 4 серонегативных свиньи 80-90-дневного возраста. Кровь для определения вируса брали периодически в течение 20 дней после вакцинации. Через 20 дней после вакцинации по 2 свиньи из каждой группы были убиты и взяты пробы органов (селезенка, лим. узлы) для исследования на наличие вируса.

Таблица 6

Обнаружение вакцинного штамма КС в крови и органах поросят при введении __разных доз вакцины_

Доза вакцины (ИмДя) Дни после вакцинации

2 4 6 7 11 13 15 20

10000 4/4 4/4 4/4 2/4 1/4 0/4 0/4 0/4(0/2)

100000 4/4 4/4 4/4 3/4 1/4 0/4 0/4 0/4(0/2)

числитель- количество положительных проб; знаменатель- число исследованных проб;

в скобках указаны результаты обнаружения вируса в органах убитых свиней. Результаты этих опытов показали, что вакцинный штамм КС быстро элиминирует из организма свиней, привитых в дозах Через 15-20 дней его не удавалось

обнаружить в крови и органах свиней, привитых разными дозами вакцины. Таким образом, установлено, что вакцинный вирус исчезает из организма не позже, чем через 15 дней после прививки.

2.2.11.Реактогенность штамма КС для кроликов. Одним из фенотипических свойств вакцинного штамма СЬ, размноженного в организме кроликов или адаптированного и размноженного в культуре клеток, является способность размножаться и вызывать термическую реакцию у привитых кроликов. Представлял интерес сравнить штаммы КС и СЬ по этому признаку.

3 кролика массой 1,5-2,0 кг прививали штаммом КС внутривенно в дозе 6,0 ^ ТКИД50 (2мл). 3 кролика привили лапинизированным штаммом СЬ, размноженным на кроликах (дефибринированная кровь), внутривенно в дозе 3,0 ^ ИД50 (для кроликов). 2 кролика оставлены непривитыми в качестве контроля. До и после введения вируса в течение 4 дней утром и вечером измеряли температуру тела, по которой судили о реакции на введение двух вакцинных штаммов вируса.

Результаты этого опыта показали, что штамм КС в отличие от штамма СЬ не вызывал гипертермию у кроликов при внутривенном введении. Неспособность штамма КС вызывать гипертермию у кроликов может служить фенотипическим маркером, отличающим его от штамма СЬ. Полученные данные согласуются с результатами генотипирования этих штаммов (А.Д. Забережный и др., 2000).

2.2.12.Антигенная и иммуногенная активность трех коммерческих живых вакцин против КЧС. Опыты проводили на свиньях крупной белой породы в возрасте 80-90 дней, серонегативных в отношении вируса КЧС. Для иммунизации животных использовали производственные серии трех сухих вакцин: РЦуас из штамма ЬС, размноженного на кроликах (фирма «РЦуа» (Хорватия); ЛК-ВНИИВВиМ из штамма ЛК, адаптированного и размноженного в субкультуре клеток тестикулярной ткани ягнят (Покровский завод биопрепаратов, Россия); КС из штамма КС, адаптированного и размноженного в субкультуре клеток тестикулярной ткани ягнят (НПО НАРВАК, Россия).

Каждой серией вакцины прививали по 5 свиней однократно внутримышечно в объеме 2 мл в соответствии с наставлением по их применению. Две свиньи оставляли не вакцинированными (контроль).

Инфекционную активность вакцины «РЦуас» оценивали на кроликах, двух других -в культуре клеток РК-15 (РЬА). Титр вируса в указанных вакцинах составлял соответственно 4,0 ^ ИД50/МЛ; 5,5 и 6,5ТКИД50/МЛ.

Через 21 день после вакцинации всех животных заражали подкожно вирулентным штаммом Ши-Мынь вируса КЧС в дозе 105 ЛД50, после чего в течение 14 дней проводили клинические наблюдения и измеряли температуру тела.

У всех свиней на 14, 21 и 35-е сутки после вакцинации брали кровь для определения титра нейтрализующих антител методом МРЬА. Кроме того, наличие

вирусспецифических антител в сыворотке крови вакцинированных свиней выявляли конкурентным методом ИФА при использовании коммерческого набора "СЬекй-С8Р-8ЕЯО" (Швейцария). По интенсивности торможения реакции антиген- антитело рассчитывали коэффициент ингибирования.

Главным критерием иммуногенности вакцин является защита свиней от заболевания и гибели после заражения вирулентным штаммом вируса КЧС. Уровень специфических антител к вирусу КЧС до и после контрольного заражения принимали во внимание в качестве дополнительного критерия иммуногенности и антигенности вакцины.

У вакцинированных животных нейтрализующие антитела были обнаружены во все периоды исследований. Титр антител на 21-е сутки был выше, чем на 14-е сутки после вакцинации. Максимальный титр антител выявлен через 2 нед. после заражения вирулентным штаммом вируса (35-е сут.). Во все периоды после вакцинации титр нейтрализующих антител был выше у свиней, привитых вакциной КС.

Определение специфических антител конкурентным методом ИФА показало, что по мере увеличения периода после вакцинации их активность в сыворотке крови возрастала и достигла максимального значения через 14 сут. после контрольного заражения (35-е сутки после вакцинации). После заражения их активность возросла в 2-3 раза.

Таблица 7

Титр вируснейтрализующих антител (МРЬЛ) в сыворотке крови свиней в различные

периоды после

вакттинаттии разными препаратами Рог?)

№

животного

До вакцинации

После вакцинации, сут.

21

35

Вакцина РЦуас

<1,5 <1,5 <1,5 <1,5 2,0

2,5 2,5 3,0 3,5 3,0

6,0 4,5 4,0 4,5 4,0

7,5 7,5 10,0 9,0 8,0

Вакцина «КС»

6

7

8

9

10

<1,5 <1,5 <1,5 <1,5 <1,5

4,5 3,5 4,0 4,0 4,0

7,0 5,5 4,5 8,0 7,5

7,0 8,0 7,5

8,5 8,0

Вакцина «ЛК-ВНИИВВиМ»

11 12

13

14

15

<1,5 <1,5 <1,5 <1.5 <1,5

3,5 3,0 3,5 3,5 3,0

6,0 6,0 4,5 5,0 5,0

7,5 8,0 7,5 7,5 8,0

Не выявлено принципиальных различий в иммуногенности и антигенности межу лапинизированной вакциной из штамма ЬС (РНуас) и культуральными вакцинами ЛК-ВНИИВВиМ и КС.

Эти вакцины являются безвредными, ареактогенными для свиней, обладают выраженной иммуногенностью и обеспечивают защиту животных от заболевания и гибели при заражении вирулентным штаммом вируса КЧС. Вакцина КС характеризуется более высокой инфекционной активностью по сравнению с двумя другими вакцинами. После заражения вирулентным штаммом вируса КЧС у вакцинированных животных наблюдали повышение титра специфических антител примерно в 4 - 8 раз (бустерный эффект), что, вероятно, свидетельствует о приживляемости вирулентного вируса в организме свиней, несмотря на их устойчивость к заболеванию при заражении летальной дозой вирулентного вируса.

2.2.13. Иммунобиологические свойства химерного вируса КЧС-ВД КРС.

Стабильность репликации химерного штамма изучали параллельно в течение 10 последовательных пассажей в культурах клеток РК-15 и ТЯ. В отличие от исходного вакцинного штамма КС химерный вирус размножался с цитопатическим эффектом (ЦПЭ), который усиливался по мере инкубирования при 37°С и приводил практически к полному разрушению монослоя клеток через 120 часов после заражения.

Накопление вируса при серийном пассировании было стабильным и практически одинаковым в обеих культурах клеток. Вирус накапливался в титре 6,5-7,0 ^ ТЦИЦ50/МЛ. Активность вируса по ЦПЭ была значительно ниже (на 3,0-4,0 чем в РЬА.

Таблица 8

Накопление химерного вируса в двух культурах при оптимальном режиме __культивирования_

Культура клеток Количество Титр вируса (^ ТКИД50/мл)

пассажей вируса РЬА ЦПЭ

7 6,5 3,5

РК-15 8 7,0 3,8

10 7,2 4,0

7 6,8 4,0

ТЯ 8 6,5 3,5

10 6,8 4,0

Экспериментальную серию сухой живой вакцины готовили из химерного штамма вируса КЧС 10-го пассажа в культуре клеток ТЯ.

Иммуногенность этой серии вакцины проверяли на 4-х серонегативных в отношении вируса КЧС свиньях в возрасте 80-90 дней. В качестве положительного контроля служили две свиньи, вакцинированные сухой живой вакциной КС. В качестве отрицательного контроля служили две не вакцинированные свиньи.

Свиней вакцинировали однократно внутримышечно в дозе 10000 ТКИД50- Всех свиней заражали интраназально вирулентным вирусом КЧС (штамм Ши-Мынь) в дозе 105 LD50 на 25-й день после вакцинации. За животными вели клиническое наблюдение в течение 30 дней после заражения.

Все вакцинированные свиньи обнаружили выраженную сероконверсию и не заболели после заражения.

Обе контрольные (не вакцинированные) свиньи заболели на 3-й день и погибли на б-й и 9-й дни после заражения с признаками геморрагического диатеза, характерного для КЧС.

Полученные данные показали, что химерный вакцинный штамм КС-ВД отличается от исходного штамма КС способностью размножаться в культуре клеток с ЦП действием и аналогичен ему по уровню накопления в клеточной культуре ТЯ, иммуногенным и антигенным свойствам.

2.2.14.Корреляция биологической активности сухой вакцины КС при титровании в культуре клеток РК-15 и на свиньях. При изготовлении культуральной живой вакцины против КЧС определенные трудности доставляет контроль биологической активности (иммуногенности) вакцины. Эти трудности возрастают при проведении различных исследований на основе количественной оценки биологической активности аттенуированных штаммов и вакцин.

С этой целью изучена корреляция биологической активности 3 серий сухой вакцины КС при определении in vivo и in vitro. Биологическую активность каждой серии вакцины определяли в культуре клеток РК-15 в 3 повторностях. Биологическую активность тех же серий вакцины проверяли на серонегативных свиньях 60-70-дневного возраста. 10-кратными разведениями вакцины с учетом ее активности в культуре прививали внутримышечно по 2-3 свиньи, серонегативных к вирусу КЧС. Спустя 30 дней вакцинированных и контрольных свиней (2 головы) заражали вирулентным штаммом Ши-Мынь (5,0 lg ЛД50)- Иммуногенность вакцины определяли по защите свиней от заболевания и гибели через 15 дней после заражения и выражали в ИмД50/мл. Другой способ оценки биологической активности тех же серий вакцины заключался в следующем.

От свиней, привитых различными разведениями вакцины, перед контрольным заражением (30 дней после вакцинации) брали сыворотку крови и определяли серопозитивность в МРЬА. Появление серопозитивности у вакцинированных свиней считали проявлением биологической (иммуногенной) активности вакцины (титр ВНА >1:4).

Таблица 9

Результаты сравнительного титрования биологической активности трех серий сухой

вакцины КС в культуре клеток и на свиньях

Серии вакцины Биологическая активность вакцины

в культуре клеток РК-15 (1ёТКИД5о/мл) на свиньях ИмДзо/мл)

№1 6,3; 6,5; 6,7; 6,0 (6,3)

№2 6,5; 6,7; 6,7; 6,3; (6,5)

№3 6,7; 6,8; 6,0 6,0 (6,2)

в скобках указана активность вакцины по данным сероконверсии

Результаты этих исследований показали практическую равноценность двух методов титрования биологической активности вакцинного вируса Активность 3 серий вакцины в среднем составляла: в культуре клеток РК-15 (Р1А) 6,3 ^ ТКИД50/МЛ; по защите свиней при контрольном заражении - 6,1 ^ ИМД50/МЛ и по сероконверсии у свиней - 6,3 ^ ИцДго/мл. Эти данные учитывали при определении иммуногенности сухой вакцины в дальнейших исследованиях.

При определении иммуногенной активности вакцины на свиньях методом контрольного заражения установлена прямая зависимость между дозой вакцинного вируса и титром специфических антител в реакции нейтрализации (ОТ1А) через 35 дней после вакцинации. Однако разница в титре антител в РН в этот период не влияла на устойчивость вакцинированных свиней к заражению вирулентным штаммом вируса КЧС.

С целью повышения точности оценки титра вируса в вакцине по сероконверсии у свиней, привитых минимальными дозами вакцины, кровь для исследования (ОТЬА) следует брать через > 35 дней после вакцинации.

2.2.15.Изготовление и контроль сухой вакцины КС. Вакцинный штамм КС размножали в роллерной культуре клеток ТЯ при оптимальных условиях. В течение 19972004 гг. бьто произведено более 1500 литров вируса с активностью 6,0-7,7 % ТКИД50/МЛ, который использовали для изготовления сухой вакцины КС. Культуральный вирус проверяли на отсутствие вирусной и бактериальной контаминации и на инфекционную активность. До использования в вакцину его хранили при -60-70°С. При изготовлении вакцины культуральный вирус смешивали с криозащитной средой, разливали по 1 мл в 3 мл флаконы и подвергали высушиванию. При изготовлении экспериментальных серий

сухой вакцины использовали лабораторные установки для лиофилизации вместимостью 300-1000 флаконов (Змл). Для производственных целей использовали промышленные лиофилизаторы «Виртис» и «Мартин-Христ» вместимостью соответственно 7000 и 18000 флаконов. При выборе оптимального режима высушивания определяли эффективность использования 7 криозащитных сред. Качество промышленных серий сухой вакцины КС оценивали согласно ТУ: наличие вакуума во флаконах, макровид сухого препарата, растворимость, массовая доля влаги, инфекционная активность, безвредность и иммуногенность. Иммуногенность сухой вакцины определяли на серонегативных поросятах массой 3040 кг. Вакциной в дозе 50 и 500 ТКИД50/мл прививали внутримышечно по 2 свиньи. Через 15 дней 4 вакцинированных и 1 контрольную свинью заражали вирулентным штаммом Ши-Мынь и наблюдали еще 15 дней. Все серии сухой вакцины, проверенные этим способом, оказались безопасными и иммуногенными. Кроме того, определяли снижение титра инфекционности при ускоренном старении вакцины и в процессе продолжительного ее хранения при 2-8°С. Для практического применения выпускали те серии вакцины, которые полностью отвечали требованиям ТУ. Некоторые характеристики 10 серий сухой вакцины КС приведены в таблице.

Таблица 10

Некоторые параметры 10 серий сухой вакцины КС

№ серии

Наличие вакуума

Массовая

Доля влаги

%

Титр вируса в сухой вакцине ТКИДо/мл) после хранения при 2-8 С (мес.) 0 3 6 9 12

Титр(1е ТКИД50/мл)вак цины при ускоренном старении (37°С, 7 дней)

6,2

6,2

6,2

5,7

6,0

4,2

6,7

6,0

6,0

5,7

5,7

4,0

3

4

5

6

7

8

9

10

6,0

6,2

6,0

6,0

5,7

4,3

1,3

6,0

6,0

6,0

6,0

5,5

4,2

0,9

6,5

6,7

6,2

6,2

5,7

5,0

0,8

6,2

6,7

6,2

6,2

5,6

4,7

3,9

6,2

6,23

6,23

5,23

5,23

5,5

2,6

6,3

6,23

6,0

6,0

5,33

4,2

2,6

6,0

6,0

6,0

5,0

5,0

4,7

3,0

6,2

6,23

6,2

5,76

5,23

5,0

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

№№ 1-6 - стабилизатор - М (сухое молоко) №№ 7-10- стабилизатор - ГЖС

Результаты этих опытов показали, что через 6 месяцев хранения при минус 2 -

минус 8 С все 10 серий сухой вакцины сохранили исходную инфекционную

активность. Через 9 и 12 месяцев соответственно некоторые серии вакцины снизили

инфекционность на 1,0-1,7 *ТКИД50/мл. В процессе ускоренного старения инфекционная активность вакцины снижалась на 0,7-2,7*ТКИД50/мл.

З.ВЫВОДЫ

Определены условия массового размножения вакцинного штамма КС в субкультуре клеток тестикулярной ткани ягнят (ТЯ), обеспечивающие получение вируса с титром 6,5-7,5 % ТКИД5(/мл.

Клетки первичной культуры ТЯ могут длительно храниться в жидком азоте без потери способности к субкультивированию и репродукции штамма КС.

Выращивание клеток ТЯ в среде с сывороткой, содержащей нейтрализующие антитела к вирусу диареи КРС в титре 1:16, не влияет на накопление штамма КС в роллерной культуре клеток.

Установлена корреляция биологической активности сухой вакцины КС при титровании в культуре клеток РК-15 (ТКИД5о) И на свиньях (ИмД50). Иммуногенная активность вакцины для свиней практически равна инфекционной активности в культуре клеток

По длительности виремии, антигенным и иммуногенным свойствам для свиней штамм КС не отличался от двух широко известных вакцинных штаммов СЬ и ЛК вируса КЧС, однако в отличие от лапинизированного штамма СЬ он не обладал реактогенностью для кроликов.

Определены режим изготовления и методы контроля сухой вакцины КС, обеспечивающие гарантированную активность при хранении и эффективность применения в практических условиях.

Рекомбинантный химерный вирус КЧС-ВД сохранил антигенные и иммуногенные свойства исходного вакцинного штамма КС и приобрел способность вызывать ЦПД в культуре клеток ТЯ и РК-15. Титр вируса по ЦПД составлял 0,1% по сравнению с титром вируса в РЬА.

В результате оптимизации условий размножения, хранения и лиофилизации вируса активность сухой вакцины КС повышена в 10 раз по сравнению с базовым вариантом - вакциной ЛК.

4.Практические предложения

На основании проведенных исследований и оптимизации режима культивирования вакцинного штамма КС вируса КЧС разработаны и предложены для практического применения:

- вакцина КС против классической чумы свиней живая культуральная сухая. Извещение №1 об изменении ТУ 9384-018-000080-64-98, утверждено Генеральным директором «НПО НАРВАК» 20 марта 2003г. и согласовано с Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 20 марта 2003г.

- наставление по применению вакцины КС против классической чумы свиней живой культуральной сухой. Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 20 марта 2003 г.

5. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сергеев ВА, Непоклонов ЕА, Алипер Т.Н., Котельников А.П., Корицкая МА, Демкина М.М. Гипервакцинация - новая стратегия ликвидации классической чумы свиней (КЧС) в хозяйствах промышленного типа.// Науковий висник национального аграрного университета, Киев-2001, стр.83-89.

2. Сергеев ВА, Корицкая МА., Непоклонов ЕА., Алипер Т.Н. Сравнительная оценка антигенной и иммуногенной активности коммерческих живых вакцин против классической чумы свиней.// Сельскохозяйственная биология, 2003, №4,стр.96-98.

3. Корицкая МА., Демкина М.М., Мусиенко М.И., Сергеев ВА. Корреляция биологической активности сухой вакцины КС против классической чумы свиней при титровании в культуре клеток РК-15 и на свиньях.// Ветеринарная медицина 82, Сб.научных работ, Харьков 2003, стр.728

4. Власова А.Н., Грабовецкий В.В., Корицкая МА, Демкина М.М., Воркунова Т.К., Мусиенко М.И., Гребенникова Т.В., Алипер Т.И., Непоклонов ЕА., Забережный А.Д. Создание химерного вируса классической чумы свиней, содержащего ген Е2 вируса диареи КРС.// «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных», Владимир, октябрь 2003,стр.159-164.

5. Корицкая М.А., Демкина М.М., Сергеев В.А. Культивирование вакцинного штамма вируса классической чумы свиней.// Вопросы вирусологии, № 1,2005, стр.42-46.

6. Корицкая МА, Демкина М.М., Власова А.Н. Чувствительность методов титрования вируса КЧС. // Вопросы вирусологии, №2,2005, стр.46-48.

Подписано в печать 23.05.2005 г. Формат издания 60x88/16 Бум. тип. Усл. печ.л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ №

Отпечатано в ФГУП «ЭКСПЛОР» 107139, Москва, Орликов пер., д.З, тел. 207-80-52

V X.

"»>

-V,

607

Классическая чума свиней (КЧС) является наиболее опасной вирусной болезнью домашних и диких свиней, причиняющей серьезный экономический ущерб многим странам с развитым свиноводством.

КЧС высококонтагиозная мультисистемная геморррагическая вирусная болезнь свиней, которая может иметь острую, подострую, хроническую (длительно текущую) форму, а также может протекать латентно. Летальность колеблется в широких пределах (до 100%).

По классификации МЭБ КЧС относится к группе А болезней животных. Она регистрируется в Европе, Центральной и Южной Америке и Азии, отсутствует в Австралии, Новой Зеландии, Северной Америке и Африканском континенте. В настоящее время многие страны (кроме ЕС) с целью контроля или ликвидации КЧС используют традиционные живые вакцины.

Характерной особенностью эпизоотии КЧС в Европе в конце прошлого века является легкая и хроническая форма заболевания с нарушениями функции воспроизводства (Harkness, 1985; Куриннов и др., 1992; Вишняков и др., 1998; Коломыцев, и др., 1998, 2000). Причиной такого течения болезни является широкая циркуляция низковирулентных штаммов вируса, вызывающих слабоманифестированную хроническую инфекцию (Baker, Sheff, 1960; Liss, 1984, Donaldson, 1987). Наличие латентных форм, возможность длительного вирусоносительства, сходство с другими болезнями, затруднительная клиническая и лабораторная диагностика осложняют своевременное выявление КЧС и способствуют ее распространению. Этому также в значительной степени способствуют оживленные экономические связи между хозяйствами, регионами и странами.

Быстрая и точная диагностика КЧС - один из решающих факторов эффективной борьбы с болезнью и снижения экономических потерь. Диагноз на КЧС ставится на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических и лабораторных методов исследования. Совершенствование диагностики КЧС остается актуальной задачей современной ветеринарной вирусологии.

Лабораторная диагностика КЧС основывается на выявлении вирусного антигена, специфических антител, обнаружении вирусного генома и выделении вируса. Она может осложняться наличием ложноположительных реакций из-за антигенного родства с другими пестивирусами, латентно инфицирующими свиней (Wensvoort et al., 1986, 1989). Выделение вируса в культуре клеток PK-15 - наиболее чувствительный и традиционный метод диагностики КЧС, поскольку он позволяет выявить присутствие небольшого количества вирулентного вируса (Mengeling, 1970; Вишняков и др., 1986). Дифференциация вакцинированных и инфицированных свиней при этом методе облегчается тем, что вакцинный вирус не выявляется через 2 недели после иммунизации (Carbrey, 1988). Наличие вируса в культуре клеток выявляют и идентифицируют с использованием меченых антисывороток и моноклональных антител (МФА, PLA) (Edwards et al., 1991; Van Oirschot, Terpstra, 1989). Кроме PLA, для обнаружения вируса КЧС в культуре клеток японские исследователи предложили метод «экзальтации» вируса болезни Ньюкасла (Kumagi et al., 1961) и метод обратной интерференции вируса везикулярного стоматита (Thuchiya et al., 1993). Однако эти методы не получили практического применения.

Для обнаружения вирусного антигена в патологическом материале используют МФА. Исследуют мазки-отпечатки миндалин и других органов павших и убитых животных, а также криосрезы тканей (Stair et al., 1963,

Mengeling, Pirtle, 1963, Кулеско, 1972, Carbrey et al., 1970, Попов 1984, Вишняков, 1984). Этот метод оказался быстрым и надежным для выявления вирусного антигена и используется во многих странах. С его помощью была ликвидирована КЧС в США.

Другим современным методом, применяемым для обнаружения вируса КЧС, является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). С помощью этой реакции вирус КЧС может быть обнаружен в инфицированных культурах клеток и в материалах от больных и павших животных (Liu et al., 1991, Harding et al., 1994; Непоклонов 1998, 1999). Кроме того, этим методом удалось различать вакцинные штаммы (13 штаммов) от полевых Европейских изолятов (23 изолята) с помощью рестриктазного анализа ГЩР-продуктов. ДНК-амплификаты 5'-некодирующей области генома вируса КЧС расщепляли эндонуклеазой (Vilceketa., 1998).

Серологические методы диагностики КЧС играют важную роль, однако, их значение различно и зависит от стратегии борьбы с этим заболеванием. В странах Западной Европы и других странах в отсутствии вакцинации обнаружение вирусспецифических антител служит основанием для постановки диагноза на КЧС.

В России и ряде других стран, где проводится широкомасштабная вакцинация свиней против КЧС, определение уровня специфических антител может иметь значение при оценке иммунного статуса животных и проведении соответствующих мероприятий по специфической профилактике (Малярец и др., 1995; Вишняков и др., 1985).

Значительный прогресс при разработке высокоспецифичных тест-систем для обнаружения антител к вирусу КЧС был достигнут при применении технологии рекомбинантных белков (Rumenapf et al., 1991; van Ziji, Wensvoort, de Kluyver, 1991; Hulst et al., 1993; Nepoklonov et al., 1997).

Специфическая профилактика с давних пор занимала важное место в борьбе с КЧС, особенно в странах с высокоразвитым свиноводством. С разработкой живых вакцин против КЧС открылась новая эра в специфической профилактике этой болезни. Исследования начатые полвека тому назад в США (Koprowski et al., 1946, Baker, 1960) завершились в итоге на Тайване созданием первого безопасного лапинизированного штамма С (CL) вируса КЧС и одноименной вакцины (Lin, Lee, 1981). Вакцина из штамма С после тщательной проверки (Bognar, Meszazos, 1963, Лихачев, Агеева, 1964, Florent et al., 1969) на безопасность и иммуногенность получила всеобщее признание и широкое применение в разных странах, неблагополучных по КЧС, в том числе в странах Западной Европы. Например, только в Голландии в 1982-1986 гг. для профилактики КЧС использовали 38 млн. доз лапинизированной вакцины С (Terpstra С. et.al. 1990). Эту вакцину наиболее широко применяли в различных странах Европы, Азии и Южной Америки. Исследования по дальнейшему совершенствованию средств специфической профилактики КЧС были продолжены в ряде стран. В результате были предложены новые технологические решения, в частности, размножение вакцинного штамма С в культуре клеток вместо организма кролика и разработаны новые культуральные вакцины на основе других безопасных высоко иммунногенных аттенуированных штаммов вируса КЧС. Кроме престижа, эти разработки имели коммерческую направленность, а именно на снижение затрат при изготовление вакцины путем повышения урожая вируса. Например, в 1 мл культуральной вакцины содержалось в 10-100 раз больше вакцинного вируса, чем в лапинизированной вакцине.

Таким образом, в результате серии работ с 60-х годов прошлого века специфическая профилактика КЧС стала осуществляться с помощью живых вакцин на основе аттенуированных штаммов вируса, размноженных в организме кроликов или в культуре клеток. Имея небольшие различия между собой, все они характеризуются общностью иммунобиологических свойств, в том числе, полной безопасностью и высокой иммуногенностью.

Кроме создания живых вакцин, во многих высокоразвитых странах проведены обширные исследования по изучению эффективности их применения в зависимости от различных условий. С самого начала с применением живых вакцин против КЧС связывали надежды сокращения экономических потерь и возможность ликвидации болезни в масштабах целых стран. Стратегия борьбы с КЧС в разных странах была и остается различной. Одни страны полностью исключают вакцинацию, другие прибегают к ней в случае крайней необходимости, как к вынужденной и временной мере, третьи - используют ее как основную меру борьбы и профилактики КЧС. Меры борьбы с КЧС часто определяются эпизоотологической ситуацией и социально-экономическими факторами. Положительный опыт борьбы с КЧС с помощью вакцинации накоплен во многих странах, в том числе в РФ.

1.2. Современные живые вакцины против КЧС

Вирус КЧС является типичным представителем рода Pestivirus, в который кроме него входит еще 6 антигенных групп: 2 группы вируса диареи КРС (BVDV-1 и BVDV-2), 3 группы вируса пограничной болезни овец (BDV-1, BDV-2, BDV-3) и одну антигенную группу представляет штамм HI38 , выделенный от жирафа в Кении 30 лет тому назад (Becher Р., et al., 2003). Пестивирусы представляют собой частицы диаметром 40-60 нм округлой формы, покрытые рыхлой оболочкой, в состав которой входят 3 белка El, Е2 и Ems, ответственные за антигенные и иммуногенные свойства. Иммунодоминантным белком вируса КЧС считается гликопротеин Е2 (Van Oirschot, 1999).

Вирус КЧС способен размножаться в клеточных культурах различных видов млекопитающих (Pirtle and Kniazeff, 1968, Roche and Edwards, 1994). Однако наиболее чувствительными и продуктивными в отношении вируса КЧС являются культуры клеток, полученные из тканей свиней.

Одной из отличительных особенностей вируса КЧС является его способность размножаться in vitro, как правило, без цитопатического эффекта (Van Oirschot, 1999, Moenning, 1990). В некоторых ранних работах имелись единичные сообщения о размножении некоторых штаммов вируса КЧС с вяловыраженным ЦПЭ (Gillespie et al., 1960, Van Beckum, Barterling, 1970, De Castro, 1973, Laude, 1978). Отчетливо выраженный ЦПЭ отмечен при размножении слабовирулентного штамма ALD вируса КЧС в культуре клеток стромы костного мозга новорожденных поросят (Shimizu et al., 1995). Следует отметить, что данный штамм вируса размножается в традиционных клеточных культурах без ЦПЭ. За цитопатогенность трех изолятов вируса КЧС ответственными оказались дефектные интерферирующие частицы (ДИЧ-частицы), присутствующие в вирусной популяции наряду с полногеномными вирусными частицами (Meyers, Thiel, 1995). 2 новых цитопатогенных изолята вируса КЧС (cpMVPl и cpBWl) выделены от естественно инфицированных свиней. Оба они содержали дефектные (делеционные) частицы (Kosmidou et al., 1998).

Получены 2 линии клеток почки свиньи (FS-L3 и CPK-NS) в которых вакцинный штамм GPE" вызывает ЦПЭ. Эти линии клеток пригодны для выявления ВНА к вирусу КЧС на основе подавления цитопатогеннного действия вируса GPE" (Sakoda et al., 1998).

Оказалось возможным титровать вирус GPE" в культуре клеток на основе интерференции с обычными цитопатогенными вирусами по «отрицательным бляшкам» (Fukusho et al., 1976).

Стабильную линию клеток почки поросят CPK-NS выращивали в среде без сыворотки. Штаммы вируса КЧС, не вызывающие экзальтацию вируса Ньюкаслской болезни, размножались в клетках CPK-NS с выраженным ЦПЭ. Титр вируса по ЦПЭ коррелировал с титром в PLA (Sakoda et al., 1998).

Все современные культуральные вакцинные штаммы, используемые для промышленного изготовления традиционных живых вакцин, размножаются в клеточных культурах без ЦПЭ.

Важная роль в контроле КЧС принадлежит специфической профилактике. Создание эффективных вакцин против КЧС всегда вызывало особый интерес. Так как инактивированные вакцины оказались малоэффективными (Koenen et al., 1988), особое внимание было уделено разработке живых вакцин. Новая эра в специфической профилактике КЧС связана с получением трех аттенуированных вакцинных штаммов: китайского лапинизированного штамма С (синонимы LC, LPC) и двух культуральных штаммов - японского (GPE") и французского (Тиверваль).

Многолетние исследования этих штаммов, проведенные в разных странах в лабораторных и полевых условиях не выявили принципиальных различий между ними. Все они характеризуются безопасностью для свиней различного возраста и физиологического состояния и выраженной иммуногенностью, которая отчетливо проявляется устойчивостью вакцинированных свиней к экспериментальному заражению вирулентным штаммом вируса КЧС (Van Oirschot, 2003).

С целью усовершенствования технологии изготовления живой вакцины из китайского штамма С его адаптировали к размножению в различных культурах клеток. В результате на основе китайского штамма С в разных странах создана серия культуральных вакцин, получивших фирменные названия: ВГНКИ (Россия); Suvac (Венгрия); Cellpest (Польша); Pestiffa (Merial, Франция); TVM (Чехия); Egermann (Riems, Германия); Norden; Minnesota Anchor; Colvasan Sanocon Porcivac (Мексика) (Vilcek and Belak, 1998).

Несмотря на различие способов аттенуации трех наиболее известных основных вакцинных штаммов (С, GPE* и Тиверваль) и различные модификации размножения в клеточных культурах, при анализе их основных свойств просматривается прототипность с лапинизированным китайским штаммом С. Примером может служить опыт применения различных живых вакцин в Мексике, где с начала 90-х годов использовали вакцины: PAV-1, Minnesota, GPE, PAV-20 и С. Когда иммуногенность указанных вакцин сравнили стандартным методом контрольного заражения различия в эффективности не обнаружили. Однако во всех случаях эффективность вакцинации свиней в хозяйствах оказалась менее выраженной, чем в лабораторных условиях. Из 44 выборочного зараженных свиней только 28 (64%) имели полную 100% защиту без каких-либо клинических признаков инфицирования (Morilla-Gonzalez, 2002).

Другие примеры сравнительного изучения различных вакцинных штаммов вируса КЧС так же свидетельствуют об их тождестве или идентичности по основным свойствам. Однако существует мнение, что одни вакцинные штаммы способны преодолевать материнский иммунитет более эффективно, чем другие (Ogawa et al., 1973).

В настоящее время для профилактики КЧС применяют живые вакцины из нереактогенных безопасных вирусных штаммов, аттенуированных длительным пассированием в организме кроликов или в культуре клеток. К наиболее хорошо изученным и широко применяемым относятся, прежде всего, лапинизированный китайский штамм (С, LC или LPC), а также культуральные штаммы, японский (GPE*), французский (Tiverval). Для изготовления живой вакцины против КЧС в странах Европы, Азии и Южной Америки, в основном, применяли китайский лапинизированный штамм С в оригинальном виде или его культуральные варианты. В странах бывшего СССР с 1968 г. применяли в основном культуральную вакцину из штамма ЛК -КС (Сергеев, Непоклонов, Алипер, 2001).

Штамм С получен на Тайване из лапинизированного штамма Ровак ч (Koprowski et al., 1946) путем дальнейшего пассирования в организме кроликов более чем 800 внутривенных пассажей) (Лин и Ли, 1981). В результате был получен безопасный, ареактогенный и высокоиммуногенный вакцинный штамм С (Van Oirschot, 1999).

По-видимому, существуют различные варианты китайского штамма, аттенуированные длительным серийным пассированием на кроликах, которые используют в производстве вакцины (Van Oirschot, 2003). Изучение генетической основы аттенуации показало, что в З'-некодирующей области генома С-штамма имеется непрерывная вставка из 13 богатых урацилом нуклеотидов, чего нет в вирулентном (Moormann 1996, Wong et al, 2001) или родительском штаммах (Wu et al, 2001). Однако до конца не ясна ее роль в аттенуации штамма С (Van Oirschot, 2003).

Свойства штамма С впервые были описаны Богнаром и Месарошем (1963). По их данным вакцина из этого штамма вызывала иммунитет к экспериментальному заражению у 95-100% свиней через 4-5 дней после однократной вакцинации, который длился не менее 2-3 лет. Вакцинация не только защищала от болезни, но и подавляла репродукцию вирулентного штамма вируса КЧС после экспериментального заражения (Biron et al., 1987) и, кроме того, предотвращала передачу его от привитых свиней неиммунным свиньям, находящимся в контакте (Terpstra, Wensvoort, 1987). Хотя отдельные случаи горизонтальной передачи штамма С от привитых к не привитым свиньям имели место (Bognar, Meszaros, 1963, Biron et al., 1987, Terpstra, Tielen, 1976), он сохранял свойства аттенуации даже после 20-30 экспериментальных серийных пассажей на восприимчивых свиньях (Van Oirschot, 1999). Более того, штамм оставался безопасным для иммуносупрессированных свиней (Florent, Thomas, Leunen, 1969, Kamijyo et al., 1976). Фенотипически аттенуация С штамма вируса КЧС проявляется в ограничении его размножения в организме свиней, главным образом, в лимфоидных тканях и, в первую очередь, в клетках миндалин (Terpstra, 1978), которые являются основными входными воротами инфекции в естественных условиях. Следует отметить, что вирусный антиген у вакцинированных свиней изредка обнаруживали в других органах (Terpstra,

1978). Штамм С может преодолевать плацентарный барьер супоросных свиней, однако при этом не вызывает каких-либо нарушений развития инфицированных плодов (Tesmer et al., 1973) и не причиняет вреда свиноматкам и новорожденным поросятам (Dingeldein et al., 1976; Marks, 1977; Van Oirschot, 2003).

Безопасность и высокая эпизоотологическая эффективность вакцинного штамма С была подтверждена в результате широкого применения в ряде стран (Bekaert, Leunen, 1969, Terpstra, Robijns, 1977, Van Oirschot, 2003). Производство оригинальной живой вакцины из штамма С основывается обычно на использовании крови, селезенки, лимфоузлов зараженных кроликов. Сухая кроличья вакцина по содержанию вакцинного вируса в 10-100 и более раз уступает культуральным вакцинам.

Стремясь усовершенствовать технологию массового производства и стандартизацию вакцины, многие исследователи пошли по пути изыскания чувствительных культуральных клеточных систем для размножения штамма С. Таким образом, в разработке и производстве живых вакцин против КЧС наметилось 3 независимых пути: 1) оригинальная вакцина из штамма С, размноженного в организме кроликов; 2) модифицированные вакцины из штамма С, адаптированного и размноженного в различных культурах клеток; 3) оригинальные вакцины, полученные из других штаммов: Тиверваль (Aynaud et al., 1976) и GFE (Shimizu, 1980), с самого начала аттенуированных и размноженных в различных культурах клеток при пониженной температуре. Все указанные вакцинные штаммы соответствовали требованиям OIE (2000).

Первые практически наиболее значимые исследования по получению и размножению вакцинных штаммов вируса КЧС в клеточных культурах с целью изготовления вакцины проведены в СССР и были завершены в 1967 году. С тех пор было налажено серийное промышленное изготовление двух живых вакцин с использованием для массового размножения двух клеточных систем: 1) культуры клеток тестикулярной ткани ягнят - вакцина JIK

ВНИИВВиМ (Сергеев и др. 1971, 1980) и вакцина КС (Сергеев, Непоклонов, Алипер, 2001); 2) первичной культуры клеток почки эмбрионов свиньи -вакцина ВГНКИ (Мищенко, 1972, Лихачев, Мищенко, 1974).

Вакцинный штамм JTK получен длительным пассированием вируса КЧС в первичной культуре и субкультуре клеток тестикулярной ткани ягнят (ТЯ). Эти культуры также использовали для массового выращивания вируса при изготовлении сухой вакцины. Многочисленные лабораторные и полевые испытания показали, что ЛК-вакцина по безопасности и иммуногенности подобна вакцине из штамма С. Фенотипически штамм ЛК отличался от штамма С отсутствием способности вызывать гипертермическую реакцию у кроликов при внутривенном введении. На основе филогенетического анализа и в соответствии с Европейской Классификацией (Lowings, Ibata, Patón, 1996) штамм С отнесен к подгруппе 1.1. (референтный штамм Alfort), а штамм ЛК-КС к подгруппе 1.2. (референтный штамм Breshia) (Гребенникова и др., 1999).

За последние 30 лет на Покровском заводе биопрепаратов, в основном для свиноводческих хозяйств СССР и России, были изготовлены сотни серий вакцины в количестве более миллиарда доз. С 1997 года аналогичную вакцину (КС) готовит НПО НАРВАК. Вакцина КС из клонированного штамма Ж отличается от вакцины ЛК лишь более высоким накоплением вакцинного штамма ( 107-107'5 ТЦЦбо/мл) в роллерной культуре клеток ТЯ.

Вакцина ВГНКИ из штамма С, адаптированного и размноженного в первичной культуре клеток почки эмбрионов свиньи уступала вакцине ЛК по содержанию вируса в 10 и более раз. Кроме того, этот метод размножения вакцинного вируса не исключал возможности эндогенной контаминации вакцины латентными вирусами свиней, в том числе, полевым вирулентным штаммом вируса КЧС. Следует отметить, что размножение вакцинных штаммов вируса КЧС в культурах клеток «свиного происхождения» противоречит требованиям OIE (2000 г.).

Много лет спустя, в Германии штамм С так же выращивали в первичной культуре клеток почки эмбрионов свиньи (Dahle, Liess, 1995). Свиньи, привитые такой вакциной внутримышечно в дозе >100 ИмДго за 1, 2, 3 и 4 недели до интраназального заражения вирулентным штаммом вируса КЧС (1000 ТКИД5о) приобрели выраженный иммунитет. На 3-7 дни после заражения вирус в крови не обнаружен. Титр ВНА возрастал и достигал максимума >1:2000 к 4 неделям после вакцинации. Он практически не увеличивался, если заражение проводили через 4 недели после вакцинации. При заражении в более ранние сроки отмечали выраженный бустерный эффект. У невакцинированных животных и погибших после заражения вирус постоянно обнаруживали в крови и органах.

Лапинизированный штамм С был адаптирован к первичной культуре клеток почки ягнят (Goret et al., 1971). Этот штамм накапливался в титре не более 105 ИмДбо/мл и оказался безопасным для супоросных свиноматок, новорожденных поросят и откормочных свиней. Иммунитет наступал в течение недели после вакцинации и сохранялся более года. Вакцинированные свиноматки передавали антитела потомству с молозивом. Лиофилизированная вакцина сохраняла активность в течение года при 4°С. (Precaustra, 1975, 1983).

Лапинизированный китайский штамм сохранял исходные свойства после адаптации и размножения в культуре тестикулярных клеток телят (Zheng-Zi Cai et al., 1997). Аналогичные результаты получены при размножении штамма С в культуре клеток почек ягнят (Barnaure et al., 1977). В указанной культуре вирус накапливался в тире 5х104/мл (ИД50 для кроликов). Из этого вируса было приготовлено 76 серий лиофилизированной вакцины, которой привито более 8 млн. свиней. Такая вакцина обладала выраженной иммуногенностью и сохраняла активность в течение года при -10°-15°С или в течение 9,5 месяцев при4°С.

Минимальная прививная доза вакцины равная 100 ИМД50, в основном считалась достаточной для контроля циркуляции вируса в хозяйстве (В iron et al., 1987), хотя в ряде случаев ее повышали в 5 и более раз (Vandeputte et al., 2001, Zheng-Zi Cai et al., 1997).). Вакцина Pestiffa производится фирмой Мериал с использованием линии клеток почки ягнят (IR04 kindly) (Vandeputte, Chappuis 1999, Ghenut et al, 1999).

Исходя из ведущей роли гуморального иммунитета при КЧС, изучали корреляцию между титром вакцинальных антител (NPLA) и иммунитетом (штамм С, вакцина Pestiffa). Определяли размножение, экскрецию и горизонтальную передачу вирулентного вируса, а также защиту от заболевания и гибели свиней при интраназальном заражении (100 ИД50). Свиньи с титром ВНА 1:12,5-<1:50 проявляли все атрибуты инфицирования, кроме гибели. При титре 1:50-1:300 вирус размножался (бустерный эффект), но не экскретировался и не распространялся горизонтально, что представляет особый интерес с эпизоотологической точки зрения (Terpstra, Wenswoort, 1988). ч Штамм С, адаптированный к первичной культуре клеток почки кролика, получил название штамма CPA (C-Porto-Alegre), а вакцина из этого штамма PAV-250. Вакцинный штамм CPA сохранил свойства родительского штамма и оставался активным при 4°С 12 месяцев (Vidor, Martins, 1991, Correa et al., 1992). В институте Ф.Лефлера (о. Риме, Германия) в качестве эффективного субстрата для промышленного размножения использовали культуру клеток эмбриона кролика (Glaner, Tesmer, 1985, Kaden, Lange, 2001).

Вакцина из штамма С, адаптированного к культуре клеток почки свиньи линия SK-6 (Kasza et al., 1972) получила название Cidepest. 1 ТКИД50 вакцины соответствовала 1 дозе, защищающей 50% вакцинированных свиней (1SwPD50). В практических условиях рекомендовано вакцину применять в дозе 400-600 ТКИД50 Прочный иммунитет у привитых 6-8-недельных серонегативных поросят наступал на 7 день и длился более 6 месяцев (срок наблюдения). Титр ВНА у таких поросят через 6, 12 и 26 недель после вакцинации был в пределах 1:16-1:256. Все вакцинированные свиньи после заражения вирулентным вирусом были защищены от заболевания и гибели, однако через 2 недели после заражения титр ВНА увеличился в несколько раз (1:200-1:1000), что свидетельствовало об ограниченном размножении вирулентного вируса в вакцинированном организме, клинически полностью устойчивом к экспериментальному заражению. В дальнейшем линия клеток БК-6 была адаптирована к росту в суспензии (Тегрэ^а, е1 а1., 1990).

В культуре клеток РК-15 штамм С накапливался в более высоком титре, чем в первичных культурах клеток почек и тестикул поросят. В роллерной культуре и в суспензионной культуре на микроносителе Цитодекс-3 через 96 ч вирус накапливался в титре 8,0 ^ ТКИД50/мл. Вакцина СеПреБ!, приготовленная из этого вируса, по безопасности и иммуногенности была аналогична вакцине из исходного лапинизированного штамма С (Сау е1а1., 1989).

Штамм С был адаптирован к культуре клеток почки минисвиньи (линия МРК), чего не удалось сделать при использовании линии клеток почки кролика ЯК-13. Указанный успех позволил провести целую серию исследований с вакцинным штаммом вируса КЧС, размноженным в культуре клеток МРК. При адаптации вируса использовали суспензию клеток о селезенки кролика (10 кл/мл), инфицированного штаммом С, и клетки МРК (5х106кл/мл). Размножение вируса контролировали на кроликах и выявляли в селезенке инфицированных кроликов методом флюоресцирующих антител. После 20-25 пассажей в культуре клеток МРК вирус максимально накапливался в титре 8,0 ^ ТКИД5(/мл и вызывал температурную реакцию у кроликов в разведении 1:7240. Двухмесячные поросята, привитые этим вирусом (1:20-1:1280) оказались иммунными в течение 11 месяцев (срок наблюдения). Через 30 дней после вакцинации титр ВНА у поросят был в пределах 1:32-1:256, а через 30 дней после контрольного заражения титр ВНА повысился до 1:1024-1:4096. Заражение вакцинированных поросят не сопровождалось выделением вируса с секретами и экскретами. У всех вакцинированных животных, убитых через 8 дней после заражения, в крови и тканях вирус не обнаружен (4 пассажа в МРК), в отличие от контрольных свиней (Rivero et al., 1988, 1990, Gualandi et al., 1991).

Через 30 дней после вакцинации свиней в полевых условиях титр ВН-антител был в пределах 1:32-1:128 (Rivero et al., 1988, Ferrari, 1992). Результаты этих опытов показали, что живые культуральные вакцины на основе С-штамма по безопасности и иммуногенности были подобны оригинальной лапинизированной вакцине и отличались от нее более совершенной технологией и большей производительностью (Ferrari, 1992, Terzic et al., 1998).

Японский GPE" вакцинный штамм получен пассированием слабовирулентного полевого штамма ALD в различных клеточных культурах при 30°С. Он прошел 142 пассажа в культуре клеток тестикулярной ткани свиней и клонирован методом предельных разведений; 36 пассажей в культуре клеток тестикулярной ткани КРС, вновь клонирован тем же методом, а затем прошел 41 пассаж в культуре клеток почки морской свинки и получил название штамм GPE". Вакцинный штамм GPE" в отличие от исходного вирулентного хорошо размножался в культуре клеток морской свинки (G-маркер) при 30°С и плохо при 40°С (Т-маркер). Испытание этого штамма на поросятах подтвердило его безопасность и высокую иммуногенную активность. У привитых поросят ВНА образовывались в титре 1:32-1:256 (Sasahara, 1980). Геном штамма GPE" отличался от генома родительского штамма по 225 нуклеотидам (Ishikawa et al, 1995). Вакцина на основе штамма GPE' получила название GPE-вакцина. Систематическое применение этой вакцины и других мер контроля позволило ликвидировать КЧС в Японии (Edwards et al., 2000).

Штамм Тиверваль получен из вирулентного штамма Альфор после более чем 170 серийных пассажей в культуре клеток при 29-3 0°С и мог быть идентифицирован несколькими маркерами in vitro (Launais et al, 1972; Aynaud, 1988). По безопасности и иммуногенности он был подобен другим вакцинным штаммам.

Вакцинный вирус присутствует в организме привитых свиней не более 10-15 дней (СгеЬепшкоуа е1 а1., 1996., Ьогепа е1 а1., 2001). Вакцинные штаммы можно различать от полевых изолятов вируса КЧС с помощью рестриктазного анализа ПЦР-продукта. ДНК-амплификаты 5л-некодирующей области генома вируса КЧС расщепляли эндонуклеазой ^аЬегегИпу е1 а1., 1999). Однако такая возможность не решала одну из важных задач серодиагностики. Главный недостаток приведенных выше живых вакцин, состоит в том, что индуцируемые ими антитела не отличаются от антител, которые образуются после инфицирования вирусом КЧС, что делает невозможным различить инфицированных животных от вакцинированных. Эта проблема решалась путем создания маркированных вакцин.

4. ВЫВОДЫ

1. Определены условия массового размножения вакцинного штамма КС в субкультуре клеток тестикулярной ткани ягнят (ТЯ), обеспечивающие получение вируса с титром 6,5-7,5 ПСИД^о/мл.

2. Клетки первичной культуры ТЯ могут длительно храниться в жидком азоте (>2 лет) без потери способности к субкультивированию и репродукции штамма КС.

3. Выращивание клеток ТЯ в среде с сывороткой, содержащей нейтрализующие антитела к вирусу диареи КРС в титре 1:16, не влияет на накопление штамма КС в роллерной культуре клеток ТЯ.

4. Установлена корреляция биологической активности сухой вакцины КС при титровании в культуре клеток РК-15 (ТКИД5о) и на свиньях (ИмД50). Иммуногенная активность вакцины для свиней практически равна инфекционной активности в культуре клеток (ИмД5о=ТКИД5о).

5. По длительности виремии, антигенным и иммуногенным свойствам для свиней штамм КС не отличался от двух широко известных вакцинных штаммов СЬ и ЛК вируса КЧС. Однако, в отличие от лапинизированного штамма СЬ он не обладал реактогенностью для кроликов.

6. Определены режим изготовления и методы контроля сухой вакцины КС, обеспечивающие гарантированную активность при хранении и эффективность применения в практических условиях.

7. Рекомбинантный химерный вирус КЧС-ВД сохранил антигенные и иммуногенные свойства исходного вакцинного штамма КС и приобрел способность вызывать ЦПД в культуре клеток ТЯ и РК-15. Титр вируса по ЦПД составлял 0,1% по сравнению с титром вируса в РЬА.

8. В результате оптимизации условий размножения, хранения и лиофилизации вируса активность сухой вакцины КС повышена в 10 раз по сравнению с базовым вариантом - вакциной ЛК.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований разработаны и предложены для практического применения: вакцина КС против классической чумы свиней живая культуральная сухая. Извещение №1 об изменении ТУ 9384-018-000080-64-98, утверждено Генеральным директором «НПО НАРВАК» 20 марта 2003г. и согласовано с Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 20 марта 2003г. наставление по применению вакцины КС против классической чумы свиней живой культуральной сухой. Утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ 20 марта 2003г.