Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Усовершенствование средств диагностики бешенства и сравнительный анализ антирабической активности противовирусных препаратов в эксперименте
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 16.00.03
Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Усовершенствование средств диагностики бешенства и сравнительный анализ антирабической активности противовирусных препаратов в эксперименте
На правах рукописи
м
МИРОНОВ Александр Николаевич
003463942
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ АНТИРАБИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
12иАР2£39
Казань-2009
003463942
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный Центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»)
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор
Хисматуллина Наиля Анваровна Научный консультант: доктор биологических наук
Филимонова Мария Николаевна Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор
Фаизов Тагир Хадиевич доктор биологических наук Коксин Владимир Петрович
Ведущая организация: ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».
Защита состоится « 3?» ииЯу/Ш^ии 2009 г. в часов на заседании
/
диссертационного совета Д—220.012.01 при ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») (420075, г. Казань, Научный городок - 2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (г. Казань).
Автореферат разослан «-¿¿Г » ^С^ССШЛ 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук,
ст. научный сотрудник г-^/^ ^ В.И. Степанов
1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1 Актуальность проблемы. Бешенство - зооноз, поражающий центральную нервную систему, приводящий к летальному исходу. Учитывая широкое распространение бешенства и экономический ущерб, наносимый данным заболеванием, разработка и усовершенствование антирабических препаратов остаётся актуальной проблемой.
В ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань) разработана технология получения антирабической сыворотки крови овец, используемая в изготовлении иммуноферментных и иммунофлуоресцентных препаратов для диагностики бешенства (Бусыгин К.Ф., Юсупов Р.Х, 1983; Хисматуллина Н.А., Юсупов Р.Х., 1995, 1998, 2000), которые обеспечивают в целом своевременную и точную постановку диагноза. Тем не менее, на современном этапе в связи с неблагополучной ситуацией по этому зоонозу, необходимо дальнейшее усовершенствование диагностических препаратов в плане повышения их активности и чувствительности методов.
В то же время, в центре внимания медицинской и ветеринарной службы России остаются вопросы постэкспозиционной антирабической лечебно-профилактической вакцинации людей, основанной на комбинированном применении антирабического иммуноглобулина (АИГ) и антирабической вакцины.
Как известно, основная функция АИГ, гомологичного или гетер'ологичного, состоит в создании пассивного иммунитета с целью предупреждения развития болезни с коротким инкубационным периодом (Селимов М.А., 1978, 1987, 1998). Однако гетерологичный АИГ может вызывать аллергические реакции, а гомологичный - является дорогостоящим. В этой связи, необходим поиск альтернативных специфических и неспецифических препаратов для экстренной постэкспозиционной защиты от бешенства до развития клинических признаков.
Научно-практический интерес представляют работы C.B. Грибенча и
соавт. (1993, 2006), в которых показана эффективность РНКазы Bacillus intermedius в качестве антирабического препарата при экспериментальном заражении бешенством. В этом отношении определенную ценность представляет изучение эндонуклеазы бактерий Serratia marcescens, ингибирующей размножение ряда РНК- и ДНК-содержащих вирусов и применяемой на практике для лечения и профилактики вирусного паралича пчел (Панфилова З.И., Салганик Р.И., 1983; Аликин Ю.С. и др., 1998).
Большой интерес в качестве фактора противовирусного иммунитета представляет интерферон, ингибирующий транскрипцию вирусного генома и трансляцию вирусной мРНК, что препятствует накоплению вируса в клетке-мишени. В связи с этим практический интерес представляет индуктор интерферона - циклоферон, эффективность которого установлена в отношении хламидиоза и ряда вирусных инфекций (Ершов Ф.И. и др., 1998).
В связи с вышеизложенным, перспективным направлением исследований является усовершенствование средств лабораторной диагностики бешенства, анализ антирабической активности существующих и разработка новых противовирусных препаратов различной природы для экстренной постэкспозиционной защиты от возможного развития рабической инфекции.
1.2 Цель и задачи исследований. Целью работы явилось усовершенствование средств диагностики бешенства и сравнительный анализ антирабической активности противовирусных препаратов в эксперименте.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
1. Усовершенствовать способ получения антирабической сыворотки крови при иммунизации овец.
2. Изучить эффективность иммуноферментных и иммунофлуоресцентных конъюгатов, изготовленных на основе усовершенствованного антирабического глобулина сыворотки крови овец.
3. Получить препарат эндонуклеазы Serratia marcescens.
4. Изучить эффективность и провести сравнительный анализ
применения антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», эндонуклеазы Serratia marcescens и циклоферона для экстренной постэкспозиционной защиты от бешенства в эксперименте.
1.3 Научная новизна. Усовершенствован способ получения антирабической сыворотки при иммунизации овец, заключающийся в применении полиэтилсилоксана в составе масляного адьюванта вместо неполного адьюванта Фрейнда, позволяющий повысить ее вируснейтрализующую и комплементсвязывающую активность в 4 раза. Впервые установлен защитный эффект антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в экспериментах на белых мышах через 2 ч после заражения эпизоотическим штаммом вируса бешенства (ВБ), составляющий 57%. Впервые установлена антирабическая активность эндонуклеазы S.marcescens в комбинации с MgS04 и препаратом «Д» из группы дезинтоксикантов и разработан на их основе препарат «ЭМД», обеспечивающий 31%-ную защиту лабораторных животных при экспериментальном бешенстве. Установлена антирабическая активность циклоферона при внутримышечном трёхкратном введении в дозе 10 мг/кг через 2-, 24- и 48 ч после заражения белых мышей, обеспечивающая 45%-ную защиту.
1.4 Практическая ценность. Антирабическая сыворотка крови овец, полученная по усовершенствованному способу иммунизации, повышает эффективность диагностических исследований.
Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные и внедренные в практику нормативные документы: Инструкцию по применению флуоресцирующего антирабического глобулина, утв. Россельхознадзором 03.03.2008 г.; Инструкцию по применению набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА), утв. Россельхознадзором 03.03.2008 г. Указанные диагностические препараты зарегистрированы в РФ за № ПВР-1-4.9/00196 и № ПВР-1-1.9/00261 от 3
марта 2008 г., соответственно, а также сертифицированы ВГНКИ № РОСС 1Ш.ФВ01.В18715 и РОСС Ш.ФВ01.В18714, соответственно.
Использование диагностикумов позволяет осуществлять точную и своевременную постановку диагноза и выдачу практических рекомендаций по эффективной ликвидации бешенства.
Установленная антирабическая активность композиции эндонуклеазы S.marcescens с MgSO,» и препаратом «Д», антирабического глобулина производства ФГУ «Ф ЦТ Р Б - В НИВ И», а также циклоферона при экспериментальном бешенстве свидетельствует о перспективности их применения в качестве дополнительных средств к антирабической вакцине для экстренной постэкспозиционной защиты от бешенства с целью предупреждения развития заболевания.
1.5 Основные положения диссертации, выдвигаемые на защиту:
-Усовершенствованный способ получения антирабической сыворотки
крови при иммунизации овец.
-Эффективность наборов препаратов для диагностики бешенства, разработанных на основе антирабического глобулина сыворотки крови овец, полученной по усовершенствованному способу иммунизации.
- Сравнительный анализ антирабической активности циклоферона, антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», эндонуклеазы Serratia marcescens и РНКазы Bacillus intermedius,-использованной в качестве стандарта, при экспериментальном бешенстве.
1.6 Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: ежегодных отчетных научных сессиях ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» по итогам НИР за 2005 - 2008 гг.; научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии» (Казань, 2007); научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Достижения молодых учёных - в производство», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Х.Х. Абдуллина (Казань, 2008); международной научно-практической конференции «Проблемы профилактики и борьбы с
особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных», посвященной 50-летию института (Покров, 2008).
1.7 Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе одна - в рекомендованном ВАК РФ издании («Учёные записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана»),
1.8. Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 147 страницах и включает: общую характеристику работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 297 источников, в том числе 109 иностранных и 1 ссылка на сайт internet) и приложение. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 13 рисунками.
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы исследований
Работа выполнена в 2005 - 2008 гг. в лаборатории иммунологии ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» МСХ РФ и кафедре микробиологии Казанского государственного университета (КГУ) им. В.И. Ульянова-Ленина (№№ госрегистрации 01200202602 и 01200202604). Отдельные фрагменты работы были выполнены с участием с.н.с., к.в.н. Гумерова В.Г. и м.н.с. Яруллиной Г.М.
2.1.1 Материалы исследований
В опытах применяли 2 штамма вируса бешенства (ВБ): производственный фиксированный - «Овечий» ГНКИ (линия штамма Pasteur) и стандартный - CVS.
В работе использовали: 5 овец, 40-50 кг; 100 морских свинок, 0,3-0,35 кг; 50 белых крыс, 250-300 г; 1200 белых мышей беспородных, 6-10 г и 2000 - линии BALB/c, 14-16 г, а также перевиваемую культуру клеток невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1).
ГТри иммунизации овец применяли неполный адъювант Фрейнда (НПО «Реакомплекс», г.Чита), кремнеорганическую жидкость- полиэтилсилоксан (ОАО «Силан», г. Липецк ) в составе масляного адъгованта, а также декстран-сульфат, м.м.500000 у.е. («АррИСЬет», Германия).
В опытах по изучению антирабического действия препаратов использовали антирабический глобулин сыворотки крови овец (ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань), коммерческий антирабический иммуноглобулин (ЗАО «Биолек», г. Харьков) с активностью 205 МЕ/мл, отраслевой стандартный образец антирабической сыворотки ВГНКИ с активностью 20 МЕ/мл, (ВГНКИ, г. Москва), эндонуклеазу З.шагсезсепэ (изоформа 8ш1), любезно предоставленную д.б.н. Филимоновой М.Н. и циклоферон в ампулах («Полисан», г. Санкт-Петербург), а также фармацевтический препарат «Д» из группы дезинтоксикантов (ОАО «Биосинтез», г. Пенза). В качестве контрольных препаратов применяли РНКазу ВдгПегтесНиз (экспериментальный завод Института органического синтеза, Латвия) и культуральную антирабическую вакцину «Рабикан» из штамма «ГЦелково-51» (Щелковский биокомбинат).
В исследованиях использовали 106 проб патологического материала (головной мозг), из них: 6 - от сельскохозяйственных, 7 - от домашних, 33 - от диких животных и 60 - от мышевидных грызунов, поступивших в различные годы из неблагополучных по бешенству районов Республики Татарстан (РТ). В опытах исследовали также 370 образцов сывороток крови овец, иммунизированных антигеном возбудителя бешенства, штамм «Овечий» ГНКИ.
Контролем в опытах служили суспензии и отпечатки головного мозга интактных белых мышей (контрольный отрицательный антиген), а также иммуноглобулины сывороток крови неиммунизированных животных. В качестве контрольного положительного антигена использовали мозг белых мышей, зараженных ВБ, штамм «Овечий» ГНКИ, в качестве гетерологичного антигена - мозг мышей, зараженных вирусом болезни
Ауески, штамм ВГНКИ, а также контрольный флуоресцирующий глобулин.
Образцы готовили в виде 10%-ной суспензии мозга на 0,85%-ном растворе NaCl с добавлением пенициллина и стрептомицина. Антигены предварительно осветляли центрифугированием при 800 g в течение 15 мин, инактивировали при 56°С в течение 30 минут.
В работе использовали диагностические наборы, разработанные в ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г.Казань: «Флуоресцирующий антирабический глобулин» (ТУ 9388-027-00492374-2007) и «Набор препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)» (ТУ 9388 - 025 - 00492374 - 2007).
В экспериментах применяли диагностические антитела против иммуноглобулинов барана и лошади, меченные пероксидазой и флуоресцеинизотиоционатом (НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва).
2.1.2 Методы исследований
Метод иммунофлуоресценции (ИФ) проводили в прямом варианте на предметных стеклах по ГОСТу 26075-84 с использованием флуоресцирующего антирабического глобулина, разработанного в ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», г. Казань.
Реакцию нейтрализации (РН) проводили по Е.А. Fitzgerald (1985), реакцию длительного связывания комплемента (РДСК) - по Е. Kuwert (1975), биологическую пробу - по ГОСТу 26075 - 84. Заражение культуры клеток НГУК-1 с последующим окрашиванием флуоресцирующим антирабическим глобулином проводили согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике бешенства», утв. Депветеринарии МСХиП РФ 14.05.1997 г.
Для определения антигенов ВБ применяли сэндвич-вариант ИФА согласно нормативной документации (Хисматуллина H.A., Юсупов Р.Х., 1998), утв. Депветеринарии МСХиП РФ 11.12.1998 г., для обнаружения антител в сыворотках крови иммунизированных животных - непрямой вариант ИФА. Результаты оценивали на спектрофотометре «BIO-RAD
model 680», при длине волны 490 нм. Иммунизацию овец и получение препаратов иммуноглобулинов проводили согласно нормативной документации к «Флуоресцирующему антирабическому глобулину», разработанной в ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (Хисматуллина Н.А., Юсупов Р.Х., Курбанова И.А., 2000), утв. Депветсринарии МСХиП РФ 21.01.2000 г.
Электрофорез препарата эндонукдеазы в отсутствии или присутствии додецилсульфата натрия - ДСН (нативные или денатурирующие условия, соответственно) проводили в 15% полиакриламидном геле (ПААГ), используя в качестве электродного буфера Трис-глициновый -, рН 8,3, концентрирующего - Трис-HCl-, рН 6,7, разделяющего - Трис-HCl буфер, рН 8,7. В качестве маркерных белков применяли смесь изоформ Sml и Sm2 эндонукдеазы, ДНКазу 1 и бычий сывороточный альбумин («Реанал», Венгрия), молекулярная масса которых составляла 27, 29 и 67 кДа, соответственно.
Гельфильтрацию эндонукдеазы S. marcescens проводили через колонку с сефадексом G-25 («Pharmaceae», Швеция), взяв за основу метод, описанный М.Н, Филимоновой и соавт. (1997); определение активности эндонукдеазы -методом кислоторастворимых фракций согласно рекомендациям М. Nestle, W. Roberts (1969) и И.Б. Лещинской и соавт. (1974).
Антирабическую активность противовирусных препаратов изучали на белых мышах и морских свинках при различных сроках и способах введения.. При интрацеребральном способе препарат вводили по 0,03 -, подкожном -0,05 -, внутримышечном, внутрибрюшинном и внутривенном - по 0,1 мл. Вирус вводили внутримышечно в заднюю конечность белых мышей - по 0,1 мл, морских свинок - по 0,5 мл, в дозе, вызывающей 60-90% смертность. Срок наблюдения за подопытными животными составлял не менее 2 месяцев.
Цифровой материал обрабатывали методами вариационной статистики с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel 2007. Все опыты ставили с числом повторностей (не менее трех), обеспечивающих получение достоверных результатов.
3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Усовершенствование способа получения антирабичсской сыворотки крови овец и анализ сс диагностической ценности при изготовлении иммунохимических препаратов. В качестве иммунизирующего антигена использовали очищенный и концентрированный антиген ВБ, штамм «Овечий» ГНКИ, в виде суспензии мозга зараженных овец.
Иммунизирующий антиген ВБ соединяли с масляным адъювантом, в состав которого входила кремнеорганическая жидкость - полиэтилсилоксан (ПЭС-3). Прототипом ПЭС-3 служил неполный адъювант Фрейнда (НАФ), используемый в настоящее время для получения антирабической сыворотки, аналогом - 2%-ный раствор декстран-сульфата (м.м.500000 у.е.).
Уровень специфических антител определяли в РН, ИФА и РДСК. Титры антител сохранялись в течение 5-10 месяцев (срок наблюдения).
Как видно из таблицы 1, наиболее выраженная стимуляция антителогенеза происходит при иммунизации овец ВБ в сочетании с масляным адъювантом и ПЭС-3. При этом уровень комплементсвязывающих и вируснейтрализующих антител в 4 раза превосходит таковой при иммунизации овец ВБ в сочетании с НАФ и в 2 раза - по сравнению с декстран-сульфатом.
Таблица 1 - Активность антирабической сыворотки крови овец, иммунизированных вирусом бешенства в сочетании с различными иммуномодуляторами_ .____________
Наименование иммуномодуляторов Активность антирабической сыворотки в:
РДСК ИФА РН
Масляный адъювант с ПЭС-3 1:640 1:12800 1:800
НАФ 1:160 1:3200 1:200
Декстран-сульфат 1:320 1:6400 1:400
Из активной антирабической сыворотки крови овец выделяли глобулиновую фракцию путем двукратного осаждения 50%-ным раствором сульфата аммония, согласно НД к «Флуоресцирующему антирабическому глобулину», утвержденной ДВ МСХиП РФ 21.01.2000 г. При определении вируснейтрализующей активности антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» использовали отраслевой стандартный образец антирабической сыворотки ВГНКИ (ВГНКИ, г. Москва). Активность антирабического глобулина сыворотки крови овец составила в РДСК 1:640, в непрямом ИФА - 1:12800 и в РН - 420 МЕ/мл.
Для сравнительного анализа диагностической ценности антирабических глобулинов из сывороток крови овец, иммунизированных с применением различных иммуномодуляторов, были приготовлены соответствующие препараты флуоресцирующего антирабического глобулина (ФАГ) и антирабического пероксидазного конъюгата.
Установлена прямая зависимость красящего титра ФАГ от титра комплементсвязывающих антител в исходных антирабических глобулинах, чем выше активность антирабического глобулина, тем выше красящий титр ФАГ. Максимальный красящий титр был характерен для конъюгата, изготовленного на основе сыворотки крови овец, полученной при иммунизации с использованием масляного адъюванта с ПЭС-3 и составил 1:16... 1:64, а минимальный - с использованием НАФ - 1:8... 1:16, что повышало чувствительность метода ИФ. При окрашивании положительных контрольных препаратов самым активным конъюгатом отмечена более выраженная флуоресценция (++++) с характерным, ярким, сверкающим жёлто-зелёным свечением антигена вируса бешенства по сравнению с ФАГ, активность которых была ниже и составила соответственно 1:8... 1:16 и 1:8... 1:32 (+++), при отсутствии свечения в отрицательных контролях.
На следующем этапе из антирабических глобулинов с различной активностью были приготовлены пероксидазные конъюгаты (ПХ КГ) с последующим определением их активности. В результате была установлена
прямая зависимость активности конъюгатов от комплементсвязывающей активности антирабического глобулина. Так, активность ПХ КГ, изготовленного на основе антирабического глобулина с активностью в РДСК 1:160 составила 1:200, а с активностью 1:640 - 1:800. Эффективность антирабических ПХ КГ оценивали при идентификации 18 эпизоотических изолятов вируса бешенства, положительных по биопробе. В результате исследований установлена прямая зависимость уровня титров антигена ВБ от активности ПХ КГ. Так, титры антигена ВБ в ИФА, с использованием ПХ КГ, активность которого составляла 1:800 в 4 раза превышали таковые при использовании ПХ КГ, активность которого составляла 1:200, что свидетельствует о повышении чувствительности метода ИФА.
В последующих экспериментах провели сравнительную оценку вируснейтрализующей активности антирабического глобулина сыворотки крови овец («ФЦГРБ-ВНИВИ», г. Казань) и коммерческого антирабического иммуноглобулина сыворотки крови лошади с активностью 205 МЕ/мл (ЗАО «Биолек», г. Харьков), применяемого в медицинской практике РФ. Для нейтрализации антирабического глобулина использовали стандартный вирус бешенства CVS в дозе 300 LD50. В результате исследований установлено преимущество антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г.Казань) перед коммерческим антирабическим иммуноглобулином, заключающееся в двукратном превышении вируснейтрализующей активности, составляющей 420 МЕ/мл. При этом титры в ИФА составили 1:12800 и 1:6400, соответственно.
В следующей серии экспериментов определили чувствительность методов ИФА и ИФ с применением ФАГ и ПХ КГ, определяя титр вируса в динамике инфекционного процесса. Эксперименты показали, что порог чувствительности метода ИФА и ИФ с применением конъюгатов на основе масляного адъюванта и ПЭС-3 повысился с 3,4 lg 1Л)50/мл до 3,3 lg LDjo/imi и с 3,9 lg LDso/мл до 3,8 lg LDso/мл, соответственно.
Следовательно, антирабическая сыворотка крови овец, полученная по
усовершенствованному способу иммунизации повышает эффективность диагностических исследований при бешенстве.
По итогам исследований разработаны Инструкции по применению флуоресцирующего антирабического глобулина и набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА), утв. Россельхознадзором 03.03.2008 г.
Диагностические наборы препаратов нашли широкое применение в ветеринарных лабораториях и профильных институтах субъектов России.
3.2 Изучение патогенных свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства. Исследованием 106 проб патологического материала от различных видов животных бешенство установлено в 18, в т.ч. 6 - от лисиц, 6- от КРС, 3 - от кошек, 2 - от собак и 1 - от рыси Экспериментальным заражением 18 изолятами ВБ была установлена их патогенность для лабораторных животных - белых мышей и морских свинок. Показано различие эпизоотических изолятов ВБ по степени патогенности для лабораторных животных: индекс инвазивности варьировал от 1,6 до 2,2, инкубационный период составил в среднем от 9 до 19 суток.
В дальнейших исследованиях на примере эпизоотического изолята вируса бешенства, выделенного от собаки Лениногорского района РТ, экспертиза 2580, установлена степень накопления вируса в различных отделах головного мозга методами ИФА и ИФ. Максимальное содержание антигена ВБ отмечено в аммоновом роге, минимальное - продолговатом мозге с титром в ИФА 1:40 (Ксп=2,3) и 1:20 (Ксп=2,2), соответственно. В дальнейших исследованиях были установлены ярко выраженные преципитирующие и комплементфиксирующие свойства изучаемого эпизоотического изолята ВБ с активностью в РДП и РДСК 1:4 - 1:8. Изучаемый эпизоотический изолят ВБ размножался в культуре клеток НГУК-1 без проявления цитопатического действия. Инфекционная активность вируса на белых мышах была не ниже 4 lg LD50/0,03 мл; антигенная специфичность (индекс нейтрализации антирабической референс-
сывороткой) - не ниже 3 1Л}50/0,03 мл. На данный изолят составлен Паспорт, характеризующий его биологические и серологические свойства. Изолят получил название штамм «Соб-2580» и был использован в дальнейших исследованиях при оценке антирабической активности препаратов в качестве эпизоотического штамма ВБ.
3.3 Изучение эффективности антирабического глобулина из сыворотки крови овец производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» при экспериментальном бешенстве. Изучение противовирусной активности антирабического глобулина проводили на белых мышах с использованием эпизоотического ВБ, штамм «Соб-2580».
Активность антирабического глобулина сыворотки крови овец составила в РДСК 1:640, в непрямом ИФА -1:12800 и в РН - 420 МЕ/мл.
В результате исследований по изучению защитного эффекта антирабического глобулина при различных способах введения через 2 ч после заражения установлен максимальный защитный эффект при введении препарата в место заражения (57%), меньший защитный эффект - при внутрибрюшинном - (25%), внутривенном - (22%) и внутримышечном введении в неинфицированную конечность (20%) (рис.1).
60
50
40
£
я 30
н
3 20
10
22 25 ■ ■ I
■^инфицированная
конечность
вена брюшная инфицированная
полость конечность Место введения антирабнческого глобулина ФГУ "ФЦТРБ-ВНШЩ"
Рис.1. Защитный эффект антирабического глобулина при различных способах введения после заражения ВБ, шт. «Соб-2580».
J
В дальнейших исследованиях установлена зависимость защитного эффекта от вируснейтрализующей активности препарата, чем выше активность, тем выше процент зашиты. Так, минимальная защита - 10% -отмечена при использовании препарата с вируснейтрализующей активностью 1:100, больший процент защиты - 25% - при активности 1:400, максимальная защита - 57% наблюдалась при активности препарата 1:800. В идентичных исследованиях при введении препарата через 24 ч - защита составляла 28%.
Таким образом, установлена эффективность применения антирабического глобулина в дозе 80 МЕ/кг (1,2 ME/мышь) при однократном внутримышечном введении в место инфицирования через 2 - и 24 ч после заражения эпизоотическим штаммом ВБ, составляющая 57%- и 28%-ную защиту, соответственно.
3.4 Получение препарата эндонуклеазы и определение его антирабического эффекта. Для исследования антирабического эффекта эндонуклеазы S.marcescens была выбрана изоформа Sml в связи с более щелочным значением ее изоэлектрической точки по сравнению с изоформой Sm2. Гомогенность исходного препарата эндонуклеазы по молекулярной массе и заряду белковой компоненты была подтверждена электрофорезом в ПААГ, в результате которого была обнаружена одна белковая полоса, локализованная на уровне изоформы Sml в отсутствии ДСН и ДНКазы 1 - в его присутствии.
Для освобождения исходного препарата от возможных низкомолекулярных примесей и одновременного перевода фермента в раствор 0,85%-ного NaCl провели гельфильтрацию через колонку с сефадексом G-25. Распределение белка по фракциям в результате гельфильтрации (рис.2) подтверждало отсутствие белковых примесей: элюция белка проходила одним пиком, совпадающим с пиком активности.
Удельная активность эндонуклеазы во фракциях максимального содержания фермента (фракции 4 и 5), а также фракциях, полученных аналогичным образом далее, соответствовала активности гомогенного белка.
Эти фракции использовали для исследования антирабической активности.
Антирабический эффект эндонуклеазы в физиологическом растворе анализировали, предварительно инфицируя животных внутримышечно ВБ, штамм «Соб-2580» и производственным ВБ, штамм «Овечий» ГНКИ, в дозах 41Х)5о/0,1 мл и 61ЛЭ50/0,1 мл, соответственно.
600000
500000
я £
1 <
^Номер*фракц?ц| -Содержание белка Активность
Рис.2. Распределение белка по фракциям при гельфильтрации.
Эндонуклеазу вводили внутримышечно в место инфицирования через 2 часа В выбранных условиях фермент не проявил защитного действия. Смертность животных до и после применения эндонуклеазы была на одном и том же уровне независимо от штамма вируса.
Поскольку известно, что эндонуклеаза - это фермент, активируемый катионами магния (Лещинская И.Б. и соавт., 1974), для последующего анализа к раствору эндонуклеазы добавили Mg2+ в виде соли MgS04, а также препарат «Д», один из компонентов которого способствует прохождению веществ через цитоплазматические мембраны (Robinson B.V., 1990). Концентрации растворов MgS04 и препарата «Д», не вызывающие изменения жизнеспособности мышей, подобрали заранее в предварительном эксперименте. Эти концентрации составили 1- и 45%, соответственно. Полученный таким образом комбинированный препарат, условно названный «ЭМД», оказал 28%-ную защиту через 2 ч после заражения ВБ, штамм «Соб-
2580».
При исследовании зависимости антирабического эффекта комбинированного препарата «ЭМД» от активности и дозы эндонуклеазы было показано, что увеличение ферментативной активности от 99,2 х 103 до 248 х 103 Ед/мл сопровождалось изменением защитного эффекта от 5 до 31%. При этом наибольшее повышение антирабической активности - на 15% -наблюдали при изменении активности от 99,2 х 103 до 124,0 х 103 Ед/мл. Максимальная доза эндонуклеазы в комбинированном препарате не превышала 0,8 мг/кг веса животного.
При исследовании зависимости защитного эффекта препарата «ЭМД» от способа его введения защитное действие было установлено лишь при его введении в место заражения. При других способах введения защитный эффекта препарата «ЭМД» не отмечен.
В последующих экспериментах нами установлено отсутствие ингибирующего действия комбинированного препарата «ЭМД» на уровень напряженности вакцинального . иммунитета и на значения индекса нейтрализации 2 вирусов бешенства, штаммы CVS и «Овечий» ГНКИ, антителами иммунизированных животных.
Таким образом, установлен защитный эффект эндонуклеазы с активностью не менее 248 х 103 Ед/мл (доза 0,8 мг/кг) в комбинации с катионами магния и препаратом «Д» (2:1:1), на основе которых разработан препарат «ЭМД», составляющий 31% при однократном введении в место инфицирования через 2 ч после заражения белых мышей эпизоотическим штаммом ВБ.
3.5 Изучение антирабической активности циклоферона.
Исследование антирабической активности циклоферона проводили на белых мышах, зараженных производственным и эпизоотическим штаммами ВБ. Циклоферон вводили в дозе 5,0- и 10,0 мг/кг внутримышечно в место инфицирования, однократно - через 2 ч и трехкратно - через 2-, 24- и 48 ч после заражения ВБ.
Как видно из таблицы 2, однократное введение циклоферона в дозе 5 мг/кг обеспечивает 30- и 35%-ную защиту при заражении мышей производственным и эпизоотическим штаммами ВБ, соответственно. Трехкратное введение циклоферона в дозе 5 мг/кг увеличивало процент защиты по сравнению с его однократным введением на соответственно 10- и 6%.
Таблица 2 - Защитное действие циклоферона при однократном и трёхкратном введении после внутримышечного заражения белых мышей производственным и эпизоотическим штаммами вируса бешенства_
Штамм вируса бешенства Доза циклоферона мг/кг Введение циклоферона
Однократное Трехкратное
Смертность,% Защита, % Смерт-ность,% Защита, %
Производственный «Овечий» ГНКИ 5 40 30,0±2,1** 35 40,0±2,7*
Эпизоотический «Соб-2580» 25 35,0±2,2* 19. 41,0±2,6*
Производственный «Овечий» ГНКИ 10,0 35 35,0±2,6** 32 43,0±2,7*
Эпизоотический «Соб-2580» 20 40,0±3,1** 15 45,0±3,1**
Контроль эпизоотический «Соб-2580» 0 60 0 60 0
Контроль Производственный «Овечий» ГНКИ 0 70 0 75 0
Примечание: * - Р<0,01; **-Р<0,05.
• Увеличение дозы в 2 раза приводило к дальнейшему возрастанию защитного эффекта, соответственно на 8- и 5%. Наибольший защитный эффект - 50% отмечен при внутримозговом введении циклоферона в дозе 10 мг/кг через 2 ч после заражения производственным ВБ, штамм «Овечий» ГНКИ.
Таким образом, установлена антирабическая активность циклоферона в дозе 10 мг/кг при однократном внутримозговом введении через 2 ч и трехкратном внутримышечном введении в место инфицирования через 2-,
24- и 48 ч после заражения белых мышей эпизоотическим штаммом ВБ, обеспечивающая 50- и 45%-ную защиту, соответственно.
3.6 Сравнительный анализ антирабической активности противовирусных препаратов при экспериментальном бешенстве.
При проведении сравнительного анализа эффективности применения антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», эндонуклеазы S.marcescens и циклоферона в качестве антирабических препаратов использовали также РНКазу B.intermedius, подтвердив в эксперименте на лабораторных животных ее защитный эффект, установленный ранее C.B. Грибенча и соавт. (2004, 2006) и др.
Сравнительная оценка антирабической активности препарата эндонуклеазы S.marcescens («ЭМД»), антирабического глобулина, циклоферона и РНКазы B.intermedius при их внутримышечном введении через 2 ч после заражения показала, что наилучшее защитное действие - 60% - оказывала РНКаза, несколько меньший эффект - 57% - наблюдали при введении антирабического глобулина, 40% - при введении циклоферона и наименьший эффект - 31% - при использовании препарата «ЭМД» (рис. 3).
PHKasa антнрабипескнй цпклоферон "ЭМД"
глобулин ФГУ " ФЦТРБ-ВНШШ"
Рис.3. Сравнительная оценка антирабической активности противовирусных препаратов.
Учитывая то, что сравниваемые препараты относятся не только к разным классам соединений, но и различаются по их механизму действия в
отношении рабической инфекции, представляло интерес исследование их комбинированного действия.
В результате исследований было установлено, что при комбинированном применении циклоферона и антирабического глобулина через 2 ч после внутримышечного заражения ВБ защитный эффект составлял 66%, что превышало их защитное действие при использовании по отдельности на 25- и 9%, соответственно. Вместе с тем, при однократном комбинированном применении этих препаратов через 24 ч после заражения защитный эффект составил 36%, а последующее двукратное введение циклоферона через 48- и 72 ч после заражения повышало защитный эффект до 46%.
При комбинированном применении антирабического глобулина (в инфицированную конечность) и антирабической вакцины «Рабикан» (в неинфицированную конечность) через 2 ч после заражения защитный эффект составил 100%. Применение этих препаратов в комбинации через 24 ч после заражения приводило к снижению защитного эффекта на 49%, что по-видимому, связано с интерференцией вакцины антирабическим глобулином.
Сравнительный анализ антирабической активности исследуемых препаратов показал, что в преобладающем большинстве случаев максимальный защитный эффект наблюдается при введении их в место заражения, что, вероятно, обусловлено блокированием инфекции у «входных воррт». Установленный нами факт эффективности внутримозгового введения циклоферона при внутримышечном заражении (50%), связан также с местной продукцией интерферона и защитой клеток-мишеней. Следовательно, экстренная защита бешенства возможна на двух уровнях: на уровне ворот инфекции и на уровне ЦНС.
Необходимо отметить, что удлинение инкубационного периода при использовании антирабического глобулина и циклоферона на 1-2 сут позволяет повысить эффективность гуморального иммунитета в ответ на введение антирабической вакцины.
РНКаза и эндонуклеаза проявляют, по-видимому, однотипный механизм действия на рабический вирус у ворот инфекции, нарушая этапы его репродукции. В тоже время, установленное нами различие в антирабической активности этих препаратов, примерно в 2 раза, вероятно, обусловлено их различием по ферментативной активности, составляющей 442200 ЕД/мл для РНКазы и 248000 ЕД/мл для эндонуклеазы. Возможно, дальнейшее увеличение ферментативной активности препарата «ЭМД» приведет к более выраженному антирабическому эффекту.
Таким образом, в результате проведенных исследований в экспериментах на лабораторных животных установлена возможность применения антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», циклоферона и препарата «ЭМД», созданного на основе эндонуклеазы З.тагсезсепэ, в качестве дополнительных средств к антирабической вакцине, что является перспективным для экстренной постэкспозиционной защиты от развития возможной рабической инфекции при укусах опасной локализации с высоким риском заболевания. В связи с этим необходимы дальнейшие исследования по испытанию предложенных противовирусных препаратов на более крупных животных.
4 ВЫВОДЫ
1. Усовершенствован способ получения антирабической сыворотки при иммунизации овец, заключающийся в использовании иммуномодулятора • полютилсилоксана в составе масляного адъюванта вместо неполного адъюванта Фрейнда, позволяющий повысить её вируснейтрализующую и комплементсвязывающую активность в 4 раза.
2. Показано, что применение иммуноферментных и иммунофлуоресцентных конъюгатов, изготовленных на основе усовершенствованного антирабического глобулина сыворотки крови овец, повышает чувствительность методов ИФА и ИФ.
3. Установлена эффективность применения антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в экспериментах на белых мышах в
дозе 80 МЕ/кг через 2 - и 24 ч после заражения эпизоотическим штаммом ВБ, составляющая 57%- и 28%-ную защиту, соответственно.
4. Установлена антирабическая активность циклоферона в дозе 10 мг/кг при однократном внутримозговом введении через 2 ч и трехкратном внутримышечном введении в место инфицирования через 2-, 24- и 48 ч после заражения белых мышей эпизоотическим штаммом вируса бешенства, обеспечивающая 50% - и 45%-ную защиту, соответственно.
5. Впервые установлена антирабическая активность эндонуклеазы в комбинации с катионами магния и препаратом «Д», на основе которых разработан препарат «ЭМД», обеспечивающий 31%-ную защиту через 2 ч после заражения белых мышей эпизоотическим штаммом вируса бешенства.
6. Комбинированное применение антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в дозе 80 МЕ/кг с циклофероном в дозе 10 мг/кг обеспечивает 66%-ную защиту при однократном внутримышечном введении в место инфицирования, а с антирабической вакциной «Рабикан» - 100%-ную защиту при однократном внутримышечном введении в инфицированную и неинфицированную конечность, соответсвенно, через 2 ч после заражения белых мышей эпизоотическим штаммом вируса бешенства.
5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Использование диагностикумов, разработанных на основе антирабического глобулина, полученного по усовершенствованному способу иммунизации овец, повышает эффективность диагностических исследований и способствует своевременной выдаче практических рекомендаций по эффективной ликвидации бешенства.
2. Результаты исследований вошли в:
-Инструкцию по применению флуоресцирующего антирабического глобулина, утв. Россельхознадзором 03.03.2008 г.;
-Инструкцию по применению набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа
(ИФА), утв. Россельхознадзором 03.03.2008 г.
-СТО 00492374-003-2008 на производственный фиксированный штамм «Овечий» ГНКИ вируса бешенства, утв. директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 8.12.2008 г.
3. Для проведения постэкспозиционной экстренной профилактики бешенства перспективно применение антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в качестве дополнительного средства к антирабической вакцине в дозе 80 ME/кг внутримышечно в место инфицирования в течение первых 24 ч после контакта.
6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Миронов, А.Н. Выделение и изучение патогенных свойств эпизоотического изолята вируса бешенства / А.Н. Миронов // Материалы научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии». - Казань, 2007. - С. 121-123.
2. Миронов, А.Н. Получение и изучение противовирусной активности антирабического глобулина при экспериментальном заражении белых мышей уличным вирусом бешенства / А.Н. Миронов, H.A. Хисматуллина, А.Н. Чернов, Р.Х. Юсупов // Труды Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИВВиМ «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных». - Покров, 2008. -Т.1. -С.169-171.
3. Миронов, А.Н. Изучение противовирусной активности циклоферона при экспериментальном бешенстве / А.Н. Миронов // Научно-практическая конференция молодых учёных и специалистов «Достижения молодых учёных - в производство», посвященной 100-летию со дня рождения профессора Х.Х. Абдуллина. - Казань, 2008. - С. 161-164.
4. МироновА-Н. Изучение противовирусной активности антирабического глобулина и РНКазы Bacillus intermedius при экспериментальном заражении бешенством / Н.А.Хисматуллина, А.Н.Миронов, А.Н.Чернов, Р.Х. Юсупов // Учёные записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана. -Казань, 2008. -Т. 191. -С. 140-147.
Подписано в печать 20.02.09 г. Сдано в набор 24.02.09 г. Заказ 74
Формат 60x84/16. Гарнитура Times New Roman Усл. печ. л.1,5. Бумага офсетная
Тираж 100 экз. Отпечатано с оригинал-макета в типографии ФГУ "ФЦТРБ-ВНИВИ" 420075, г. Казань - 75, Научный городок - 2
Оглавление диссертации Миронов, Александр Николаевич :: 2009 :: Казань
Общая характеристика работы.
1 Обзор литературы.
1.1. Биологические свойства возбудителя бешенства.
1.2. Методы лабораторной диагностики бешенства.
1.3. Иммунитет при бешенстве и методы его оценки.
1.4. Лечебно-профилактические средства от бешенства.
1.5.Интерферон, индукторы интерферона и другие противовирусные препараты.
2 Собственные исследования.
2.1. Материалы и методы исследований.
2.1.1. Материалы исследований.
2.1.2. Методы исследований.~.
3 Результаты собственных исследований.
3.1. Усовершенствование способа получения антирабической сыворотки крови овец и анализ её диагностической ценности при изготовлении иммунохимических препаратов.
3.2. Изучение патогенных свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства.
3.3. Изучение эффективности антирабического глобулина из сыворотки крови овец производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» при экспериментальном бешенстве.
3.4. Получение препарата эндонуклеазы и определение его антирабического эффекта.
3.5. Изучение антирабической активности циклоферона.
3.6. Сравнительный анализ антирабической активности противовирусных препаратов при экспериментальном бешенстве.
Обсуждение результатов собственных исследований.
Выводы.
Практические предложения.
Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Миронов, Александр Николаевич, автореферат
Актуальность проблемы. Бешенство — зооноз, поражающий центральную нервную систему, приводящий к летальному исходу. Учитывая широкое распространение бешенства и экономический ущерб, наносимый данным заболеванием, разработка и усовершенствование антирабических препаратов остаётся актуальной проблемой.
В ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань) разработана технология получения антирабической сыворотки крови овец, используемая в изготовлении иммуноферментных и иммунофлуоресцентных препаратов для диагностики бешенства (Бусыгин К.Ф., Юсупов Р.Х, 1983; Хисматуллина Н.А., Юсупов Р.Х., 1995, 1998, 2000), которые обеспечивают в целом своевременную и точную постановку диагноза. Тем не менее, на современном этапе в связи с неблагополучной ситуацией по этому зоонозу, необходимо дальнейшее усовершенствование диагностических препаратов в плане повышения их активности и чувствительности методов.
В то же время в центре внимания медицинской и ветеринарной службы России остаются вопросы постэкспозиционной антирабической лечебно-профилактической вакцинации людей, основанной на комбинированном применении антирабического иммуноглобулина (АИГ) и антирабической вакцины.
Как известно, основная функция АИГ, гомологичного или гетерологичного, состоит в создании пассивного иммунитета с целью предупреждения развития болезни с коротким инкубационным периодом (Селимов М.А., 1978, 1987, 1998). Однако гетерологичный АИГ может вызывать аллергические реакции, а гомологичный - является дорогостоящим. В этой связи, необходим поиск альтернативных специфических и неспецифических препаратов для экстренной постэкспозиционной защиты от бешенства до развития клинических признаков.
Научно-практический интерес представляют работы С.В. Грибенча и соавт. (1993, 2006), в которых показана эффективность РНКазы Bacillus intermedius в качестве антирабического препарата при экспериментальном заражении бешенством. В этом отношении определенную ценность представляет также изучение эндонуклеазы бактерий Serratia marcescens, ингибирующей размножение ряда РНК- и ДНК-содержащих вирусов и применяемой на практике для лечения и профилактики вирусного паралича пчел (Панфилова З.И., Салганик Р.И., 1983; Аликин Ю.С. и др., 1998).
Большой интерес в качестве фактора противовирусного иммунитета представляет интерферон, ингибирующий транскрипцию вирусного генома и трансляцию вирусной мРНК, что препятствует накоплению вируса в клетке-мишени. В связи с этим практический интерес представляет индуктор интерферона - циклоферон, эффективность которого установлена в отношении хламидиоза и ряда вирусных инфекций (Ершов Ф.И. и др., 1998).
В связи с вышеизложенным, перспективным направлением исследований является усовершенствование средств лабораторной диагностики бешенства, анализ антирабической активности существующих и разработка новых противовирусных препаратов различной природы для экстренной постэкспозиционной защиты от возможного развития рабической инфекции.
Цель и задачи исследований. Целью работы явилось усовершенствование средств диагностики бешенства и сравнительный анализ антирабической активности противовирусных препаратов в эксперименте.
Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:
1. Усовершенствовать способ получения антирабической сыворотки крови при иммунизации овец.
2. Изучить эффективность иммуноферментных и иммунофлуоресцентных конъюгатов, изготовленных на основе усовершенствованного антирабического глобулина сыворотки крови овец.
3. Получить препарат эндонуклеазы Serratia marcescens.
4. Изучить эффективность и провести сравнительный анализ применения антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», эндонуклеазы Serratia marcescens и циклоферона для экстренной постэкспозиционной защиты от бешенства в эксперименте.
Научная новизна. Усовершенствован способ получения антирабической сыворотки крови при иммунизации овец, заключающийся в применении полиэтилсилоксана в составе масляного адьюванта вместо неполного адьюванта Фрейнда, позволяющий повысить ее вируснейтрализующую и комплементфиксирующую активность в 4 раза. Впервые установлен защитный эффект антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в экспериментах на белых мышах через 2 ч после заражения эпизоотическим штаммом вируса бешенства (ВБ), составляющий 57%. Впервые установлена антирабическая активность эндонуклеазы S.marcescens в комбинации с MgS04 и препаратом «Д» из группы дезинтоксикантов и разработан на их основе препарат «ЭМД», обеспечивающий 31%-ную защиту лабораторных животных при экспериментальном бешенстве. Установлена антирабическая активность циклоферона при внутримышечном трёхкратном введении в дозе 10 мг/кг через 2-, 24- и 48 ч после заражения белых мышей, обеспечивающая 45%-ную защиту.
Практическая ценность. Антирабическая сыворотка крови овец, полученная по усовершенствованному способу иммунизации, повышает эффективность диагностических исследований.
Результаты проведенных исследований вошли в следующие разработанные и внедренные в практику нормативные документы: Инструкцию по применению флуоресцирующего антирабического глобулина, утверждённую Россельхознадзором 03.03.2008 г.; Инструкцию по применению набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА), утверждённую Россельхознадзором 03.03.2008 г. Указанные диагностические препараты зарегистрированы в РФ за № ПВР-1-4.9/00196 и № ПВР-1-1.9/00261 от 3 марта 2008 г., соответственно, а также сертифицированы ВГНКИ № РОСС БШ.ФВ01.В18715 и РОСС БШ.ФВ01.В 18714, соответственно.
Использование диагностикумов позволяет осуществлять точную и своевременную постановку диагноза и выдачу практических рекомендаций по эффективной ликвидации бешенства.
Установленная антирабическая активность композиции эндонуклеазы S.marcescens с MgSC>4 и препаратом «Д», антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», а также циклоферона при экспериментальном бешенстве свидетельствуют о перспективности их применения в качестве дополнительных средств к антирабической вакцине для экстренной постэкспозиционной защиты от бешенства с целью предупреждения развития заболевания.
Основные положения диссертации, выдвигаемые на защиту:
-Усовершенствованный способ получения антирабической сыворотки крови при иммунизации овец.
-Эффективность наборов препаратов для диагностики бешенства, разработанных на основе антирабического глобулина сыворотки крови овец, полученной по усовершенствованному способу иммунизации.
-Сравнительный анализ антирабической активности циклоферона, антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», эндонуклеазы Serratia marcescens и РНК азы Bacillus intermedins, использованной в качестве стандарта, при экспериментальном бешенстве.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: ежегодных отчетных научных сессиях ФГУ «ФЦТРБ - ВНИВИ» по итогам НИР за 2005 - 2008 гг.; научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии» (Казань, 2007); научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Достижения молодых учёных - в производство», посвящённой 100-летию со дня рождения профессора Х.Х. Абдуллина (Казань, 2008); международной научно-практической конференции «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных», посвященной 50-летию института (Покров, 2008).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе одна - в рекомендованном ВАК РФ издании («Учёные записки КГАВМ им. Н.Э. Баумана»).
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 147 страницах и включает: общую характеристику работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 297 источников, в том числе 109 иностранных и 1 ссылка на сайт internet) и приложение. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 13 рисунками.
Заключение диссертационного исследования на тему "Усовершенствование средств диагностики бешенства и сравнительный анализ антирабической активности противовирусных препаратов в эксперименте"
выводы
1. Усовершенствован способ получения антирабической сыворотки при иммунизации овец, заключающийся в использовании в качестве иммуномодулятора полиэтилсилоксана в составе масляного адъюванта вместо неполного адъюванта Фрейнда, ' позволяющий повысить её вируснейтрализующую и комплементсвязывающую активность в 4 раза.
2. Показано, что применение иммуноферментных и иммунофлуоресцентных конъюгатов, изготовленных на основе усовершенствованного антирабического глобулина сыворотки крови овец повышает чувствительность методов ИФА и ИФ.
3. Установлена эффективность применения антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в экспериментах на белых мышах в дозе 80 МЕ/кг через 2 - и 24 ч после заражения эпизоотическим штаммом вируса бешенства, составляющая 57%- и 28%-ную защиту, соответственно.
4. Установлена антирабическая активность циклоферона в дозе 10 мг/кг при однократном внутримозговом введении через 2 ч и трехкратном внутримышечном введении в место инфицирования через 2-, 24- и 48 ч после заражения белых мышей эпизоотическим штаммом вируса бешенства, обеспечивающая 50% - и 45%-ную защиту, соответственно.
5. Впервые установлена антирабическая активность эндонуклеазы в комбинации с катионами магния и препаратом «Д, на основе которых разработан препарат «ЭМД», обеспечивающий 31%-ную защиту через 2 ч после заражения белых мышей эпизоотическим штаммом вируса бешенства.
6. Комбинированное применение антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в дозе 80 МЕ/кг с циклофероном в дозе 10 мг/кг обеспечивает 66%-ную защиту при однократном внутримышечном введении в место инфицирования, а с антирабической вакциной «Рабикан» - 100%-ную защиту при однократном внутримышечном введении в инфицированную и неинфицированную конечность, соответственно, через 2 ч после заражения белых мышей эпизоотическим штаммом вируса бешенства.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Использование диагностикумов, разработанных на основе антирабического глобулина, полученного по усовершенствованному способу иммунизации овец, повышает эффективность диагностических исследований и способствует своевременной выдаче практических рекомендаций по эффективной ликвидации бешенства.
2. Результаты исследований вошли в:
-Инструкцию по применению флуоресцирующего антирабического глобулина, утв. Россельхознадзором 03.03.2008 г.;
-Инструкцию по применению набора препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА), утв. Россельхознадзором 03.03.2008 г.
-СТО 00492374-003-2008 на производственный фиксированный штамм «Овечий» ГНКИ вируса бешенства, утв. директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 8.12.2008 г.
3. Для проведения постэкспозиционной экстренной профилактики бешенства перспективно применение антирабического глобулина производства ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» в качестве дополнительного средства к антирабической вакцине в дозе 80 МЕ/кг внутримышечно в место инфицирования в течение первых 24 ч после контакта.
Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2009 года, Миронов, Александр Николаевич
1. Авилов, В.М. Эпизоотическое состояние и эффективность проводимых мероприятий против бешенства животных в России / В.М. Авилов, А. А. Гусев, А.В. Савин // Ветеринария. 2002 -№6-С.З-6.
2. Авилов, B.C. Актуальные проблемы профилактики особо опасных инфекций животных / B.C. Авилов, В.А. Седов // Ветеринария. -1994-№ 6-С. 3-6.
3. Аликин, Ю.С. Развитие технологии получения и перспективы использования эндонуклеазы Serratia marcescens / Ю.С. Аликин, Л.П. Сенженко, В.П. Клименко // Ферменты микроорганизмов: Сб. Докладов XI Всероссийской конференции. Казань, 1998. - С. 152-163.
4. Аликин, Ю.С. Эндоглюкин, препарат против вирусных заболеваний / Ю.С. Аликин, В.И. Масычева, В.П. Клименко // Пчеловодство. 1985.-№5.-С. 42-44.
5. Анина-Радченко, Н.Д. К вопросу о применении реакции связывания комплемента для диагностики бешенства /Н.Д.Анина-Радченко// Симпозиум по бешенству. Тез. докл. ин-та полиомиелита и вирус, энцефалитов АМН СССР. М., 1972- С. 123-124.
6. Анина-Радченко, Н.Д. Бешенство и борьба с ним /Н.Д.Анина-Радченко// Кишинев: Штиинца -1979 - С. 98.
7. Барановская, С.А. Экспериментальное бешенство белых мышей /С.А.Барановская, Н.М.Балаева//Архив биологических наук -1936. В. 41. -№ 1.-С. 157-163.
8. Баринский, И.Ф. Влияние некоторых иммуностимуляторов на напряженность вакцинального антирабического иммунитета / И.Ф. Баринский, С.В. Грибенча, Г.М. Игнатьев, Н.Н. Амитина и др. // Вопросы вирусологии, 1985. № 2. - С. 183-185.
9. Беер, Д.М. Противовирусная активность ряда индукторов интерферона на модели вируса бешенства / Д.М. Беер, С.А Мур, Д.Г.
10. Шеддок и др. // Бюллетень ВОЗ. — 1979. — Т. 57, № 5. - С. 535—541.
11. Белоусов, В.И. О совершенствовании диагностической работы в ветеринарных лабораториях России /В.И. Белоусов// Матер, междунар. научно-практич. конф., посвященной 40-летию ВНИИВВиМ. Покров, 1998-С. 13-14.
12. Бойко, А.А. Создание иммуноферментных препаратов /А.А. Бойко// В кн.: Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. Тез. докл. третьей Всесоюз. конф. -М., 1987 С.201-202.
13. Ботвинкин, А.Д. Обнаружение антител к вирусу бешенства в сыворотке крови людей с помощью иммуноферментного метода /А.Д.Ботвинкин, М.А.Селимов, Т.Н. Згурская // Вопросы вирусологии. -1986 Т. 31. - № 3. - С.333-334.
14. Ботвинкин, А.Д. Обнаружение вируса бешенства в головном мозге и слюнных железах животных с помощью иммуноферментного метода /А.Д.Ботвинкин, С.М.Чернов, Л.Я. Грибанова// Вопросы вирусологии. 1987 - № 6- С. 747-750.
15. Ботвинкин, А.Д. Природные очаги бешенства в Российской Федерации / А.Д. Ботвинкин, Г.Н. Сидоров // Иркутск, 1992. - С. 182.
16. Ботвинкин, А.Д. Антигенные варианты вируса бешенства, связанные с заболеваниями людей в России и странах ближнего зарубежья / А.Д. Ботвинкин, М.А. Селимов, М.А. Штыкова, В.В. Хозинский // В кн. Современные проблемы рабиологии. М., 1998. - С. 34.
17. Ботвинкин, А.Д. Итоги изучения антигенного разнообразия вируса бешенства на территории бывшего СССР /А.Д.Ботвинкин, И.В.Кузьмин, Н.А.Хисматуллина// Ветеринарная патология 2004 - №3 - С. 117-126
18. Бусыгин, К.Ф. Применение метода диффузионной реакции преципитации в агаре-геле для изучения специфичности иммунных сывороток /К.Ф. Бусыгин// Ученые записки КГВИ 1964 - Т. 90 - С.144-149.
19. Бусыгин, К.Ф. Диагностика бешенства методом флуоресцирующих антител / К.Ф. Бусыгин //Тез. докл. Всесоюз. конф. -Казань, 1983 -С. 136.
20. Бусыгин, К.Ф. Люминесцентная диагностика инфекционных болезней животных /К.Ф.Бусыгин// М.: Колос - 1975 - С. 160.
21. Бусыгин, К.Ф. Флуоресцирующие иммуглобулины из иммуноасцитической жидкости белых крыс для диагностики бешенства /К.Ф.Бусыгин, Р.Х.Юсупов// Сб. науч. тр. КВИ.- Казань, 1984 — С. 79-81.
22. Бусыгин, К.Ф. Способ получения препарата для люминисцентной диагностики бешенства животных / К.Ф. Бусыгин, Р.Х. Юсупов // А.с. № 184328 от 1.03.83 г.
23. Бучнев, К.Н. Диагностика бешенства с применением реакциипреципитации в агаровом геле /К.Н. Бучнев, М.М. Шахматов, B.JI. Титов, Л.Ф.Меньшикова, О.П.Кривенко, В.И.Вовк, М.М.Лагишева, Г.В.Полубоярова//Ветеринария. -1963 № 3 - С. 66-70.
24. Бучнев, К.Н. Специфичность и чувствительность реакции преципитации в агаровом геле при диагностике бешенства /К.Н.Бучнев, А.А.Росляков, Э.В. Ивановский// Труды научно-контрольного института ветеринарных препаратов М., 1968 - Т. 15 - С.30-35.
25. Вагабов, A.M. Вирусы группы бешенства / A.M. Вагабов, И.Ф. Баринский // Вопросы вирусологии. 1979. - № 5. - С. 451-457.
26. Валеев, А.Р. Определение оптимальных условий концентрирования нуклеазы Serratia marcescens в приготовлении препаратов для электрофоретических исследований. Курсовая работа студента IV курса кафедры микробиологии КГУ / А. Р. Валеев. Казань, 2007.
27. Ведерников, В.А. Бешенство животных /В.А.Ведерников, В.А. Седов, Э.В.Ивановский// М.: Колос. - 1974 - С.112.
28. Ведерников, В.А. Эпизоотологические основы совершенствования мероприятий по профилактике бешенства / В.А. Ведерников, В.А. Седов // Львов, 1988. С. 71 - 72.
29. Воллер, А. Иммуноферментные реакции в диагностической медицине. Теория и практика /А.Воллер, Д.Бидуэлл, Анн. Бартлет// Бюллетень ВОЗ. 1977 - Т. 53 - № 1 - С. 38 - 43.
30. Вотяков, В.И., Мишакова Н.П., Самойлова Т.И. А.с. СССР 1678369 (1991); Бюл. изобрет., 35, 24 (1991).
31. Габдуллина, Т.К. Действие нуклеазы Serratia marcescens на клетки и рост асцитной опухоли Эрлиха : автореф. дис.канд. биол. наук : 14.00.14 / Габдуллина Гашира Карамовна. Киев, 1980. - 20 с.
32. Галиуллин, А.К. Оценка противосибиреязвенного иммунитета в иммуноферментном и радиоиммунном анализе /А.К.Галиуллин, В.П.Коксин, К.М.Салмаков// Тез. докл. Республ. научно-производств. конф. Казань,1992-С. 20.
33. Галицкая, Н.Н. Материалы по экспериментальной химиотерапии вирусных инфекций / Н.Н. Галицкая, В.И. Вотяков, А.С. Шашенько // -Минск, 1979.-С. 50-52.
34. Горбачев, Е.Н. Влияние физикохимических факторов на чувствительность и специфичность иммуноферментного анализа /Горбачев Е.Н., Вербов В.Н., Артюхов А.И.// Твердофазный иммуноферментный анализ. Л., 1988 - Т. 64 - С. 76 - 80.
35. Грабко, В.И. Рекомбинантный вирус осповакцины, экспрессирующий протективный антиген G рабического вируса / В.И. Грабко, М.А. Селимов, И.И. Фодор и др. // Тез. докл. научн. конф. Современные проблемы рабиологии. М., 1998. - С.33-34.
36. Грибенча, С.В. Профилактическая и лечебная активность индуктора интерферона у мышей, зараженных в мозг уличным вирусом / С.В. Грибенча, Н.Н. Носик, Ф.И. Ершов, И.Ф. Баринский // Вопросы вирусологии, 1983. № 1. - С. 71-73.
37. Грибенча, С.В. Сравнительное изучение клеточного и гуморального иммунитета, а также резистентности к вирусу бешенства при антирабической вакцинации / С.В. Грибенча, Г.М. Игнатьев, А.Ф. Киркин, И.Ф. Баринский // Вопросы вирусологии. 1985. - С. 357-361.
38. Грибенча, С.В. В кн.: Индукторы интерферона. — М.: 1982. — С. 140—146.
39. Грибенча, С.В., Игнатьев Г. М., Баринский И. Ф. // Актуальные проблемы медицинской вирусологии. — М.:1985. — С. 163—164.
40. Грибенча, С.В. Влияние некоторых иммуномодуляторов на гуморальный антирабический иммунитет / С.В. Грибенча, Г.М. Игнатьев, Н.Н. Амитина, Э.Б. Тазулахова, Ф.И. Ершов, И.Ф. Баринский // Вопр. вирусол. — 1985. -№ 2. — С. 198—200.
41. Грибенча, С.В. Лечебная активность комбинированного применения индуктора интерферона и вакцины при экспериментальном бешенстве. / С.В. Грибенча, Н.Н. Носик, Ф.И. Ершов, И.Ф. Баринский // Вопр. вирусол. — 1983. № 5. — С. 590—594.
42. Грибенча, С.В. Современные аспекты биологии и профилактики лиссавирусных инфекций: дис. . д-ра мед. наук / С.В. Грибенча. М , 1993. -76 с.
43. Грибенча, С.В. Принципы альтернативного метода профилактики бешенства / С.В Грибенча, И.Ф Баринский // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Международный симпозиум посвящ. году Пастера. — СПб, 1995. —С. 127.
44. Грибенча, С.В. Влияние индуктора интерферона двуспиральной РНК на развитие вакцинального антирабического иммунитета / С. В. Грибенча, Н. Н. Носик, Ф. И. Ершов, И. Ф. Баринский // Вопр. вирусол. — 1984. -№ 2. —С. 223—227.
45. Грибенча, С.В., Селимов М. А. // Симпозиум по бешенству. —1. М., 1969. —С. 44—51.
46. Грибенча, С.В. Изучение биологических вариантов популяции ряда штаммов уличного вируса бешенства / С. В. Грибенча, К.А. Ванаг, И.Ф. Баринский / Вопросы вирусологии, 1982. № 6. - С. 98-102.
47. Грибенча, С.В. Эффективность дсРНК как индуктора интерферона при внутримышечном заражении мышей уличным вирусом бешенства / С.В. Грибенча, Н.Н. Носик, Ф.И. Ершов и др. // Вопросы вирусологии. 1983. - № 2. - С. 232-235.
48. Грибенча, С.В. Противовирусная активность пептидного иммуномодулятора «Гепон» в экспериментах на модели уличного вируса бешенства / С.В. Грибенча, Р.Д. Холмс, Ф.И. Ершов, И.Ф. Баринский // Вопросы вирусологии. 2003. - № 4. - С. 40-44.
49. Грибенча, С.В. Противовирусная активность РНКазы Bacillus intermedins у морских свинок и кроликов, зараженных уличным вирусом бешенства / С.В. Грибенча, JI.A. Поцелуева, И.Ф. Баринский и др. // Вопросы вирусологии, 2006. № 5. - С. 41-43.
50. Гришок, А.П. Оральная иммунизация лисиц против бешенства живой культуральной вакциной из штамма «Внуково-32» / А.П. Гришок, М.А. Селимов Т.А. Аксенова // В сб.: Актуальные проблемы медицинскойвирусологии. М., 1985. - С. 170-172.
51. Гришок, А.П. Эпизоотологический надзор при оральной иммунизации лисиц / А.П. Гришок // Матер. Всесоюз. конф. Львов, 1988. -С. 74-75.
52. Даниленко, Г.И. Синтез и защитное действие производных фенил ад амантана в отношении вируса бешенства / Г.И. Даниленко, Е.А. Шабловская, Л.А. Антонова и др. // Химико-фармацевтический журнал. -1998. № 2. - Т. 32. - С. 28-30.
53. Джупина, С.И. Эпизоотология бешенства животных в Западной Сибири / С.И. Джупина, С.А. Юрик // Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с болезнями животных. Новосибирск, 1997. -С. 41-^12.
54. Егоров, A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа /А.М.Егоров, А.П.Осипов, Б.Б.Дзантиев, Е.М. Гаврилова// М.: Высшая школа.-1991-С.351 .
55. Елаков, А.Л. Стандартизация контроля антирабических вакцин / А.Л. Елаков, В.И. Уласов, B.C. Иванов // Матер, межд. конф. «Актуальные проблемы здоровья скота, завозимого в Россию в рамках нацпроекта
56. Развитие агропромышленного комплекса», 28-30 ноября 2007 г. Казань, 2008. - С. 54-57.
57. Ершов, Ф.И. Интерфероны / Ф.И. Ершов // Вопросы вирусологии. 1998. - № 6. - С. 247-252.
58. Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики бешенства: ГОСТ 26075-84. М.: Издательство стандартов, 1984.-9 с.
59. Жуков, И.В. Результаты изучения антигенной принадлежности штаммов уличного вируса бешенства с использованием моноклональных антител / И.В. Жуков // Бюл. ВНРШ экспериментальной ветеринарии. 1988 -В.65. - С.54-55.
60. Зибицкер, Д. Е., Ковалев Н. А. Бешенство его профилактика. — Минск, 1968.
61. Зубович И.К. Защитное действие рифампицина при экспериментальной рабической инфекции белых мышей / И.К. Зубович, В.И. Вотяков, Н.П. Мишаева и др. // Антибиотики и химиотерапия. 1989. - Т. 34.-№2.-С. 123-125.
62. Ивановский, Э.В. Разработка и усовершенствование вакцин дляспецифической профилактики бешенства животных: дисс. в форме докл. докт. мед. наук / Э.В. Ивановский. М., 1991. - С. 11-12.
63. Инструкция по применению вакцины антирабической культуральной концентрированной очищенной инактивированной сухой и антирабического иммуноглобулина от 12.03.03 г.
64. Ильясова, Г.Х. Применение иммуноферментного анализа для диагностики инфекционных заболеваний животных /Г.Х.Ильясова, Г.П.Новошинов, Р.Х.Юсупов// Сб. трудов КГВИ Казань, 1983 - С. 15-20
65. Каплан, М.М. Методы лабораторных исследований по бешенству /М.М.Каплан// ВОЗ. Женева, 1995- С. 13-26.
66. Клюева, Е.В. Иммунофлуоресцентный метод индикации антигена вируса бешенства, выращиваемого in vitro и in vitro /Е.В. Клюева// Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1967. - 17 с.
67. Клюева, Е.В. Индикация вируса бешенства с помощью метода флуоресцирующих антител /Е.В.Клюева, Е.В.Семенова// В кн.: Актуальные проблемы вирусных инфекций. - М., 1965 - С. 359-361.
68. Клюева, Е.В. О диагностической ценности метода флуоресцирующих антител при бешенстве /Е.В.Клюева, Е.В.Семенова, М.А. Селимов// Вопросы вирусологии. -1966 -№ 3 -С. 278-282.
69. Клюева, Е.В. Ускоренная диагностика бешенства с помощью флуоресцирующих антител /Е.В.Клюева, Е.В.Семенова, М.А.Селимов// В кн.: Вопросы борьбы с бешенством. - М.,1963 -С. 16-17.
70. Коваклова, JI. Твердофазный вариант иммуноферментного анализа к вирусу бешенства в сыворотках людей / Л. Коваклова, М. Ешкенази, Т. Ганчева, В. Вачева // Acta vitol. - 1984. - № 28. - С. 422-427.
71. Ковалев, Н.А. Выделение вируса бешенства / Ковалев Н.А. // В кн.: Новые методы диагностики зоонозных инфекций Минск, 1982 - С. 4769.
72. Ковалев, Н.А. Иммунофлуоресцентное исследование отпечатков роговицы при бешенстве /Н.А.Ковалев, А.С. Шашенько// Ветеринария — 1970 -№ 9 С. 44 - 46.
73. Ковалев, Н.А. Радиоиммунологический метод определения напряженности антирабического иммунитета /Н.А.Ковалев// Рекомендации МСХ СССР по внедрению достижений науки и передового опыта в. производстве. М., 1980 -№ 1 - С. 73-74.
74. Ковалёв, Н.Н. Новые подходы к профилактике бешенства /Н.Н. Ковалёв, М.М. Усеня// Биол.-экол.пробл.зараз.болезней диких животных и их роль в патологии с.-х. животных и людей. Покров, 2002. С. 124-127.
75. Коломакин, Г.А. О постановке, учете и специфичности реакции преципитации в агаровом геле при диагностике бешенства /Г.А.Коломакин, Г.А.Бельченко, М.М. Смирнова// Лаб. дело. -1970. № 6 - С. 370-372.
76. Коломакин, Г.А. К вопросу серологической диагностики бешенства. /Г.А.Коломакин, М.С. Тимонина// Ветеринария. 1972 - № 5 -С. 105-106.
77. Комитет экспертов ВОЗ по бешенству 8-й доклад: Серия технических докладов 864. Женева, 1994.
78. Кравченко, А.Т. Эффективность специфического лечения бешенства / А.Т. Кравченко, М.К. Каракуюмча, А.И. Усенко // Ж. микробиол., 1976. №4. - С. 72—80.
79. Кузьмин, И.В. Лиссавирус с необычной антигенной структурой, выделенный от летучий мыши на юге Кыргызстана / И.В. Кузьмин, А.Д.
80. Ботвинкин, С.Н. Рыбин, А.В. Баялиев // Вопр. вирусологии. 1992. - № 5-6. - С. 256-259.
81. Кузьмин, И.В. Р^41 положительный штамм рабического вируса выделен от человека на Севере Красноярского края /И.В.Кузьмин, З.С. Лукашенко// Тез. докл. науч. конф.: Современные проблемы рабиологии. -М., 1998-С. 6-7.
82. Куриненко, Б.М. Противоопухолевое действие нуклеазы Serratia marcescens, ковалентно связанной с растворимыми декстранами / Б.М. Куриненко, М.Н. Беляева, И.Е. Черепнева, З.А. Вестуре // Вопросы онкологии. 1977. - Т. 23. - С. 94 - 98.
83. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин // М.: Высшая школа, 1990. -С. 122-128.
84. Лещинская, И.Б. Метод выделения и очистки щелочной рибонуклеазы Bacillius intermedins / И.Б Лещинская, Г.И Клейнер, Т.И. Волкова и др. // Приклад, биохим. и микробиол. — 1981. Т. 17. - № 2. - С. 241-246.
85. Лещинская, И.Б. Получение и характеристика высокоочищенного препарата нуклеазы Serratia marcescens / И.Б. Лещинская, Н.П. Балабан, Г.С. Егорова, В.И. Таняшин, Т.М. Третьяк // Биохимия. 1974. - Т. 39. - С. 116122.
86. Маналов, А. Д. Твердофазные радиоиммунные и иммуноферментные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии /А.Д.Маналов // ЖМЭИ. 1985- № 4 - С. 100 - 107.
87. Машковский, М.Д. Лекарственные средства / М.Д. Машковский // М.: Новая волна, 2008. Издание 15-е. - С. 340-341.
88. Мовсесянц, А.А. Бешенство людей в Российской Федерации / А.А Мовсесянц, О.С. Хадарцев // Журнал микробиологии. 2003. № 5 - С. 112-116.
89. Мовсесянц, А.А. Современные проблемы лечения гидрофобии антирабическими препаратами: дис. д-ра мед. наук / А.А. Мовсесянц. М., 1993.-475 с.
90. Мовсесянц, А.А. Медицинские иммунобиопрепараты для специфической профилактики бешенства /А.А. Мовсесянц, Г.Б. Агеенко// Ветеринарная патология. 2002. - № 1. - С. 48-51.
91. Могилёвский, Б.Ю. Практическая рабиология / Б.Ю. Могилёвский / Херсон, Приднепровье. - 1997. - 143 с.
92. Недосеков, В.В. Разработка и усовершенствование средств и методов оценки эффективности вакцин против бешенства /В.В.Недосеков// Автореф. дис. канд. вет. наук. Покров, 1998. - С.26.
93. Павловский, В.В. Специфическая профилактика бешенства /В.В. Павловский, Л.П. Семенова, Э.В. Ивановский // В кн.: Тр. Всесоюз. госуд. научно-контрольного института вет. препаратов. М., 1975. - С. 35-40.
94. Пантелеев, О. А. Непрямой твердофазный методиммуноферментного анализа, его точность и источники погрешностей /О.А.Пантелеев, Л.И. Ванеев// ЖМЭИ 1986 - №3. - С. 95-99.
95. Пантюшенко, М.С. Использование полимеразной цепной реакции для выявления полевых изолятов вируса бешенства /М.С.Пантюшенко, М.А.Наумкина, В.В .Недосеков, И.Ф.Вишняков., С.Ж.Цыбанов,
96. B.В.Куриннов, У.Н.Романова// Тез. докл. науч. конф.: Современные проблемы рабиологии. -М., 1998 С. 26-27.
97. Панфилова, З.И. Получение мутантов Serratia marcescens суперпродуцентов эндонуклеазы путем воздействия нитрозометилмочевиной на синхронизированную культуру / З.И. Панфилова, Р.И Салганик // Микробиология. 1983. - Т. 52. - С. 974-978.
98. Папуниди, К.Х. Иммуноферментный метод для серологической диагностики ботулизма /К.Х. Папуниди, Г.Л. Адгамова// Рациональные методы профилактики, диагностики и терапии незаразных болезней животных: сб. науч. тр. КВИ. Казань, 1993. - С. 94-95.
99. Педерсен, Ю. Характеристика изоформ нуклеазы Serratia marcescens электроспрей масс-спектрометрией / Ю. Педерсен, М. Филимонова, П. Роепсторф, К. Бидерманн // Биохимия. 1995. - Т.60, №3.1. C. 462-469.
100. Петров, В.А. Индукторы интерферонов в лечении и профилактике вирусных инфекций / В.А. Петров, Г.А. Заболотняя // Новые лекарства и новости фармакотерапии. 2000. - № 8. - С. 7-12.
101. Пилле, Э.Р. Лиссавирусы / Э.Р. Пилле // Вопросы вирусологии. -1996. -№ 1.-С.2-6.
102. Полюшкина, Г.С / Г.С. Полюшкина, JI.H. Романова, Л.Г. Карпович и др. // Актуальные проблемы медицинской вирусологии. — М., -1985.
103. Равилов, А.З. Эпизоотическая ситуация и меры борьбы с бешенством в Республике Татарстан / А.З. Равилов, Н.А. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов и др. // Ветеринарный врач. Казань, 2000. - № 2. - С. 33-36.
104. Савицкая, Т.А. Изучение иммунобиологических свойств изолятов рабического вируса и совершенствование эпизоотолого-эпидемиологического надзора за бешенством в Республике Татарстан: автореф. дисс. канд. биол. Наук / Т.А. Савицкая. Казань, 2007. - 24 с.
105. Самойлова, Т.И. Особо опасные и медленные инфекции / Т.И. Самойлова, Н.П. Мишаева, А.А. Згировская // Химиотерапия и химиопрофилактика вирусных инфекций. Минск, 1985. - С. 75.
106. Сафаров, Р.К. Размножение фиксированного вируса бешенства в культуре ткани и индикация его иммунофлуоресцентным методом. /Р.К.Сафаров, Е.В.Клюева// В кн.: Актуальные вопросы ветеринарной вирусологической конференции М., 1966 - Ч. 2. - С.29-30.
107. Седов, В.А. Семинар Всемирной организации здравоохраненияпо борьбе с бешенством диких животных / В.А. Седов, Г.Ф. Коромыслов, А.В. Куликовский // Вестник с.-х. наук. -1991. -№ 4 С. 172-173.
108. Селимов, М.А. Применение реакции связывания комплемента (РСК) для индикации вируса бешенства в культуре ткани /М.А.Селимов, Л.И.Калинина, Т.А.Аксенова и др.// В кн.: Вопросы борьбы с бешенством- Т. 9. -М., 1967. -С.70-79.
109. Селимов, М.А. Использование реакции связывания комплемента для индикации вируса бешенства в культуре ткани /М.А. Селимов, Л.И.Калинина, Т.А.Аксенова, В.И.Кубанова // В кн.: Вопросы борьбы с бешенством. М., 1963. - С. 14-15.
110. Селимов, М.А. Современная эпизоотическая ситуация и перспективы ликвидации бешенства / М.А. Селимов // Вопросы вирусологии. 1998.-№5.-С. 196-198.
111. Селимов, М.А. Современные методы лабораторной диагностики * бешенства / М.А.Селимов, Е.В.Клюева, Е.В.Семенова // М.: Медицина. -1964.-С.58.
112. Селимов, М. А. Бешенство. М.: Медицина, 1978. - 336 с.
113. Селимов, М.А. Новые данные о распространении Р-41 положительных штаммов рабического вируса в арктическом и внеарктическом регионах./М.А.Селимов, А.Д.Ботвинкин, В.В. Хозинский, Л.Я. Грибанова// ЖМЭИ. 1994. - № 2. - С. 53-56.
114. Селимов, М.А. Современные достижения в области рабиологии. Обзорная информация. М.: ВНИМИ, 1987. - Вып. 4. - 69 с.
115. Селимов, М.А. К проблеме генно-инженерной антирабической вакцины / М.А. Селимов, И.И. Фодор, В.И. Грабко // Генно-инженерные и синтетические вакцины. Пущино, 1990. - С. 64- 70.
116. Селимов, М.А. Идентификация штаммов сильватического и арктического бешенства с помощью моноклональных антител / М.А. Селимов, А.Д. Ботвинкин, А.Г. Татаров // Вопросы вирусологии. 1983. - № 2. - С. 243 - 244.
117. Смирнова, М.М. Сравнительная эффективность методов диагностики бешенства /М.М.Смирнова// Автореф. дис. канд. вет. наук. -Фрунзе, 1975.-С.19.
118. Сологуб, Т.В. Выявление антител к вирусу бешенства методом ингибирования твердофазного ИФА /Т.В.Сологуб, В.Н.Никитин, Н.Ф.Вишняков// Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Покров, 1992. - Ч. 2 - С. 261 - 262.
119. Субботина, Л.С. Результаты использования метода ELISA при изучении клещевого энцефалита и бешенства / JI.C. Субботина, О.В. Новолохин, А.Д. Ботвинкин, Л.В. Матюхина // ЖМЭИ. 1985. - №1.- С. 7377.
120. Сюрин, В. Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А .Я. Самуйленко, Б.В. Соловьёв, Н.В. Фомина. М., ВНИТИБП. -1998. - С. 303.
121. Таршис, М.Г. Бешенство животных / М.Г. Таршис, Н.А. Ковалев, П.П. Кузнецов // Минск.: Ураджай. - 1990. - С. 100 - 104.
122. Татаров, А.Г. Экспресс-диагностика бешенства в линии клеток невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1) /А.Г.Татаров, М.А.Селимов,
123. B.Я.Кармышева, Н.А. Хисматуллина// Тез. докл. Всесоюзн.конф. М., 19851. C. 172-173.
124. Татаров, А.Г. Выделение рабического вируса и экспресс-диагностика бешенства в культуре перевиваемых клеток невриномы Гассерова узла крысы /А.Г.Татаров, Н.А.Хисматуллина, М.А.Селимов, В.Я.Кармышева// Вопросы вирусологии. 1987. - № 6. - С. 619 - 621.
125. Твёрдофазный вариант иммуноферментного анализа к вирусубешенства / JI. Коваклова, М. Ешкенази, Т. Ганчева, В. Вачева // Acta virol. -1984. -№28.-С. 422-427.
126. Топленннова, К.А. Применение непрямого метода флуоресцирующих антител для обнаружения вируса бешенства /К.А.Топленинова// Вопросы вирусологии. 1961. - № 2. - С. 174.
127. Трубина, Л.М. К вопросу о быстрой лабораторной диагностике бешенства /Л.М.Трубина// Лабораторное дело. 1956. - № 2. - С. 21 - 23.
128. Тукшаитов, Р.Х. Основы динамической метрологии и анализа результатов статистической обработки / Р.Х. Тукшаитов // Казань, 2001. -С. 228-230.
129. Филимонова, М.Н. Усовершенствованный лабораторный метод очистки нуклеазы Serratia marcescens и некоторые свойства фермента / М.Н. Филимонова, И.Б. Лещинская, Н.П. Балабан //- Деп. в ВИНИТИ 30. 01. 79; № 32079. Казань, 1979.
130. Филимонова, М.Н. Получение нуклеазы Serratia marcescens в гомогенном состоянии и изучение физико-химических свойств фермента / М.Н. Филимонова, Н.П. Балабан, Ф.Р. Шарипова, И.Б. Лещинская // Биохимия. 1980. - Т. 45. Вып. 11. - С. 2096-2102.
131. Филимонова, М.Н. Эндонуклеаза Serratia marcescens. Характеристика фермента / М.Н. Филимонова, Л.А. Баратова, Н.Д. Воспельникова, А. О. Желтова, И. Б. Лещинская // Биохимия. 1981. - Т. 46. -вып.-9.-С. 1660-1665
132. Филимонова, М.Н. Выделение и характеристика изоформ внеклеточной нуклеазы Serratia marcescens / М.Н. Филимонова, А.А. Дементьева, И.Б. Лещинская, Г.Ю. Бакулина, С.В. Шляпников // Биохимия. -1991. Т. 56, вып. 3. - С. 508-520.
133. Филимонова, М.Н. Изоформы нуклеазы Serratia marcescens. Сравнительный анализ субстратной специфичности / М.Н. Филимонова, А.В. Гарусов, Т.А. Сметанина, М.А. Андреева, Л.М.Богомольная, И.Б. Лещинская
134. Биохимия. 1996 - Т. 61, вып. 10. - С. 1800-1806.
135. Филимонова, М.Н. Антимикробный препарат / М.Н. Филимонова, Е.В. Ершова, Ю.И. Сафин и др. // Патент РФ от 25.03.2008.
136. Филимонова, М.Н. Эндонуклеаза бактерий Serratia marcescens в эволюционном ряду родственных нуклеодеполимераз: автореф. дисс. докт. биол. наук / М.Н. Филимонова. Казань, 1999. - 45 с.
137. Фоменко, М.В. Порядок и оценка результатов лабораторных исследований при диагностике бешенства / М.В. Фоменко, И.К. Тутов // Вестник ветеринарии. 1997. - № 6. - С. 47 - 50.
138. Хамадеев, Р.Х. Хламидиозы рогатого скота и свиней (эпизоотология, диагностика, специфическая профилактика и меры борьбы): автореф. дисс. докт. вет. наук / Р.Х. Хамадеев. Казань, 1991. - 40 с.
139. Хисамутдинов, Ф.Ф. Новый метод борьбы с природным бешенством / Ф.Ф. Хисамутдинов, Н.А. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов, Э.Г. Бурганов // Тез. докл. Респуб. научно-производ. конф. Казань, 1996. -С.52.
140. Хисматуллина, Н.А. Разработка и усовершенствование лабораторных методов диагностики бешенства: автореф. дис. . канд. биол. наук / Н.А. Хисматуллина. Казань, 1989. - С. 21.
141. Хисматуллина, Н.А. Разработка непрямых вариантов иммуноферментного анализа для определения антигена вируса бешенства и специфических антител /Н.А. Хисматуллина, Р.Х.Юсупов// Матер. Всесоюзн. конф. Львов, 1988. - С. 98.
142. Хисматуллина, Н.А. Производство наборов препаратов для лабораторной диагностики бешенства /Н.А.Хисматуллина, Р.Х.Юсупов,
143. И.А.Курбанова// Тез. докл. Всерос. науч.- практич. конф.: Вирус, болезни с/х. животных Владимир, 1995.- С. 67.
144. Хисматуллина, Н.А. Серологический контроль при антирабической вакцинации животных /Н.А. Хисматуллина// Тез. докл. науч. конф.: Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе. М., 1999. - С. 95-96.
145. Хисматуллина, Н.А. / Н.А.Хисматуллина, Р.Х.Юсупов. Нормативная документация к "Набору препаратов для лабораторной диагностики бешенства животных методом иммуноферментного анализа (ИФА)", утв. ДВ МСХ и ПРФ 11.12.1998 г.
146. Хисматуллина, Н.А. /Н.А.Хисматуллина, Р.Х.Юсупов, И.А.Курбанова// Нормативная документация к "Флуоресцирующему антирабическому глобулину", утв. ДВ МСХ и П РФ 21.01.2000 г.
147. Хисматуллина, Н.А. Прижизненная диагностика гидрофобии /Н.А. Хисматуллина, Т.А.Савицкая, Р.В.Тимиргалеев, Р.Х. Юсупов, А.З. Равилов, Д.К. Баширова// Труды международн. научно-практич. конф., посвящ. 45-летию
148. ВНИВИ, 24-26 сент.2003г, «Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов» Покров, 2003 - 41.- С. 157-161.
149. Хисматуллина, Н.А. Идентификация и изучение биологических свойств эпизоотических изолятов вируса бешенства / Н.А. Хисматуллина, М.М. Каримов, Т.А. Савицкая, А.Н. Чернов, Р.Х. Юсупов, А.З. Равилов // Ученые записки КГАВМ, 2004. Т. 178. - С. 156-162.
150. Хисматуллина, Н.А. Разработка средств и методов иммунологического мониторинга и мер борьбы при бешенстве и лихорадке Ку животных: автореф. дисс. докт. биол. наук / Н.А. Хисматуллина. Казань, 2000. - 45 с.
151. Хисматуллина, Н.А. Эпизоотическая ситуация и профилактика бешенства лисиц на территории Татарстана / Н.А. Хисматуллина, А.Н. Чернов, Р.Х. Юсупов, А.З. Равилов, А.В Иванов, М.Ш. Зайдуллин // Ветеринарный врач, 2005. -№1.- С. 53-57.
152. Хузин, Д.А. Иммуноферментный метод определения антител к возбудителю некробактериоза /Д.А.Хузин, Е.К.Акимов, Н.А.Хисматуллина, В.В.Сабирова// Матер, международ, конф., посвящ. 125- летию академии. -Казань, 1998. 4.1. - С. 111-112.
153. Цвиль, Л.А. Состояние антирабической помощи и организация эпиднадзора за бешенством на территории г. Москвы / Л.А Цвиль, Л.В. Родина, И.Р. Лебедева // Тез. докл. научн. конф.: Современные проблемы рабиологии-М., 1998.-С. 15-16.
154. Цетлин, Е.М Отработка оптимальной схемы учета результатов при применении иммуно ферментной тест-системы для определения антигенной активности культуральной антирабической вакцины /Е.М.Цетлин, Р.А. Волкова//Вопросы вирусологии 1996-№ 1.-С. 21-24.
155. Чард, Т. Радиоиммунологические методы /Т.Чард// М.: Мир. -1981.-С. 247.
156. Черкасский, Б.Л. Эпидемиология и профилактика бешенства. М., Медицина. - 1985. - 228 с.
157. Чернов, А.Н. Изучение биологических свойств изолятов вируса бешенства, циркулирующих в эпизоотических очагах Республики Татарстан /
158. A.Н. Чернов, Н.А. Хисматуллина, Р.Х. Юсупов // Матер. Междунар. науч.-практич.конф. посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ, 9-10 декабря 1998 г. Покров. -1998. - С. 78-79.
159. Чернов, А.Н. Эпизоотический, иммунологический мониторинг энзоотий бешенства в Республике Татарстан и совершенствование мер борьбы с ним: автореф. дисс. канд. вет. наук / А.Н. Чернов. Казань, 1999. —21 с.
160. Чернов, С.М. Анализ эффективности твердофазного иммуноферментного метода для ускоренной диагностики бешенства В сб.: Природноочаговые болезни человека ■ /С.М.Чернов, А.Д.Ботвинкин, Л.Д.Грибанова, А.С.Чиж//- Омск, 1989. - С. 90.
161. Шафикова, Р.А. Применение реакции энзим-меченных антител при диагностике хламидиозного аборта овец /Р.А.Шафикова, Х.З.Гаффаров, А.З. Равилов// Матер. Всесоюзн. конф Львов, 1988. - С. 107 - 108.
162. Шесточенко, М.А. Люминесцентный анализ в ветеринарии /М.А.Шесточенко, Н.А Кузьмин//- М.: Колос. 1979. - С. 195 - 203.
163. Шляпников, С.В. Внеклеточная эндонуклеаза Serratia marcescens. II. Аминокислотные остатки активного центра и гипотетический механизм функционирования фермента / С.В. Шляпников, Е.В. Благова, В.М. Левдиков,
164. B.Ю. Лунин, В.В. Лунин, A.M. Михайлов, К.С. Райшанкар, X. Бетзель, М. Пербрандт // Молекулярная биология. 1999. - Т. 33., № 3. - С. 454-461.
165. Шубладзе, А.К. Электронно-микроскопическое изучение вируса острого энцефаломиелита человека / А.К. Шубладзе, А.Ф. Бочаров, Е.Н. Бычкова, Л.И. Бодрина // Вопросы вирусологии. 1974. - № 2. - С. 201-203.
166. Шубладзе, А.К. Изучение антигенного родства различных штаммов вирусов группы бешенства / А.К. Шубладзе, Е.Н. Бычков // Вопросы вирусологии. 1975. - № 6. - С. 571- 574.
167. Юсупов, Р.Х Оценка эффективности методов выделения уличных штаммов вируса бешенства в биологических системах / Р.Х. Юсупов, Н.А Хисматуллина, М.А. Селимов, А.Г. Татаров, В.Я. Кармышева // Ветеринария. -1989,-№4.-С. 27-30.
168. Юсупов, Р.Х. Иммунологический мониторинг в системе защиты животных от инфекционных болезней / Р.Х. Юсупов // Гигиена, ветеринария и экология животноводства / Матер. Всерос. научно-произ. конф. -Чебоксары. — 1994. С. 499-500.
169. Юсупов, Р.Х. Эпизоотологические и экологические аспекты бешенства животных / Р.Х. Юсупов // Междунар. научн-практ. конф., посвящ. 40-летию ВНИИВВ и М. Покров. - 1998. - С. 169-170.
170. Юсупов, Р.Х. Разработка и сравнительная оценка методов диагностики бешенства / Р.Х. Юсупов, Н.А. Хисматуллина // Ученые записки Каз. гос. академ. вет. Медицины. Казань, 2003. - Т. 174. - С. 190-196.
171. Amano, Т. Neurotransmitter syntesis by neuroblastoma clons /T.Amano, E.Rioheison, M.Nirenberg // Proc. nath. Akaj. Ski. USA. 1972. - V. 69. -P. 258-263.
172. Arya, S. A. Therapeutic failures with rabies vaccine and RIG / S.A Arya // Clin. Infect. Dis. 1999. - Vol. 29, N 6. - P. 1605.
173. Atanasiu, P. Animal inoculation and the Negri body / P. Atanasiu // The Natural History of rabiesio.- T.l. Baer G.M. Ed Academic Press. - New York, 1975.-P. 373.
174. Atanasiu, P. Evaluation de l'immunite cellulaire apres vaccination rabique chez l'homme / P. Atanasiu, J. Nozaki, V. Savy et al. // C.R. Acad. Sci. Paris, Ser. D., 1977. -v. 285.-p. 1187-1190.
175. Atanasiu, P. Rabies neutralizing antibody response to different schedules of serum and vaccine inoculations in non-exposed persons / P. Atanasiu, D.A. Cannon, D.I. Dean et al. // Bull. Org. mond. Sante. — 1961. — Vol. 25. — P. 103—114.
176. Baer, G.M. The pathogenesis of street rabies virus in rats /G.M.Baer, T.R.Shanthaveerapa, G. Bourne// Bull. WHO. 1968. - V. 38. -119.
177. Beilin, B. Effects of mild perioperative hypothermia on cellular immune responses / B. Beilin, Y. Shavit, J. Razumovsky, Y. Wolloch, A. Zeidel, H. Bessler // Anesthesiology. 1998. - 89. - P. 1133-1140.
178. Bell, J.F. Effects of high ambient temperature on various stages of rabies virus infection in mice / J.F. Bell, G.J. Moore // Infect. Immun. 1974. - 10. - P. 510-515.
179. Benedik M.J. Serratia marcescens and its extracellular nuclease / M.J. Benedik, U. Strych // FEMS Microbiology Letters. 1998. - N. 165. - P. 1-13.
180. Bhatt, D.R. Human rabies: diagnosis, complications, and management / D.R. Bhatt, M.A. Hattwick, R. Gerdsen, R.W. Emmons, H.N. Johnson // Am. J. Dis. Child. 1974.-127.-P. 862-869.
181. Biedermann, K. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by E.coli / K. Biedermann, P. K. Jepsen, E. Riise, I. Svendsen // Carlsberg Res. Commun. 1989. - Vol. 54. - P. 17 - 27.
182. Biedrmann, K. Homogeneity analisis of a nuclease secreted by E. coli / K. Biedermann, B. Nielsen // Pharm. Thechnol. Inter. 1990. - Vol. 2. - P. 37-41.
183. Bourhy, H.Ecology and evolution of rabies in Europe /H.Bourhy, B.Kissi, L.Audry//J.Gen.Virol. -1999. Vol.80, №10. P.2545-2557.
184. Breakfield, X. O. Neurobiasmitter metabolism in murin neuroblastoma cells /X. O. Breakfield// Life Sci. 1976. - V.18. - P. 267- 278.
185. Brochier, В. Elimination of fox rabies from Belgium using a recombinant vaccinia rabies vaccine: an update / B.Brochier, F.Costy, P.- P. Pastoret // Veter. Microbiol. - 1995. - V. 46. - № 1/3 - P. 269 - 279.
186. Bussereau F. Treatment of rabies in mice and foxes with antiviral compounds / F. Bussereau, M. Picard, J. Blancou, P. Sureau // Acta Virol., 1988. -Vol. 32,-Nl.-P. 33-49.
187. Co, M.S. Humanized antibodies for antiviral therapy / M.S. Co, M. Deschamps. R.J. Whitley et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88. - P. 2869-2873.
188. Crick, J. The vaccination of man and other animals against rabies / J. Crick // Postgrad. Med., J., 1973. V. 49. - P. 551—564.
189. Dean, DJ. The fluorescent antibody test / D.J. Dean, M.K. Abelseth, P. Atanasiu, F.-X. Meslin, M.M. Kaplan, H. Koprowski // Laboratory Techniques in Rabies. Geneva, 1996. P. 88-93.
190. Eaves, G.N. Isolation and properties of an exocellular nuclease of Serratia marcescens / G.N. Eaves // Bacteriol. 1963. - Vol. 85. - P. 273-278.
191. Emmons, R.W. A case of human rabies with prolonged survival / R.W. Emmons, L.L. Leonard, F. Jr. DeGenaro, et al // Intervirology. 1973. - 1. - P. 6072.
192. Fenje, P. Protection of rabbits against experimental rabies by poly I «poly с / P. Fenje, B. Postic // Nature, 1970. - v. 226. - P. 171—172.
193. Fitzgerald, E.A. A collaborative study to establish an international Standart Rabies immunoglobulin of human origin. / E.A. Fitzgerald, S.C. Rastogi // Journal of biological standartization, 1985. P. 327-333.
194. Fleischer, R. Nucleoside analogues and mitochondrial toxicity / R. Fleischer, D. Boxwell, K.E. Sherman // Clin. Infect. Dis. 2004. - 38. - P. 79-80.
195. Francki, R.I.B. Classification and Nomenclature of viruses / R.I.B. Francki, et al. // Wien, 1991.
196. Friendhoff, P. Analysis of the mechanism of the Serratia nuclease using site-directed mutagenesis / P. Friendhoff, B. Kolmes O. Gimadutdinow W. Wende K. Krause , A.Pingoud // Nucl. Acids Res. 1996. - V. 24 № 6. - P. 2632-2639.
197. Glick, M.C. Glicopeptides from membranes of neuroblastoma cells /M.C.Glick, Y.Kimhi, U.Z. Littaner// Proc. nath. Acad. Sci. USA. - 1973. - V. 70. - surface P. 1682-1687.
198. Gode, G.R. Treatment of 54 clinically diagnosed rabies patients with two survivals / G.R. Gode, R. Saksena, R.K. Batra, P.K. Kalia, N.K. Bhide // Indian J. Med. Res. 1988. - 88. - P. 564-566.
199. Gode, G.R. Intensive care in rabies therapy: clinical observations / G.R. Gode, A.V. Raju, T.S. Jayalakshmi, H.L. Kaul, N.K. Bhide // Lancet. 1976. - 2. -P. 6-8.
200. Grandien, M. Evaluation of tests for rabies antibody and analysis of serum responses after administration of three different types of rabies vaccines / M. Grandien // J. clin. Microbiol. — 1977. — Vol. 5. — P. 263—267.
201. Grasset, N. Etude de la diffusion, en Gelose D'Anti-genes de La Rage fixe obtemis sur culture de Tissues /N.Grasset, P. Atanasiu// Ann. Inst. Past. 1961. -V. 1015.-P. 639-647.
202. Harmon, M.N.Studies of the interferon inducer Poly-I Poly-C on rabies / M.N. Harmon, B. Janis // — J. infect. Dis., 1975. - V. 132. - P. 241-249.
203. Hattwick, M.A. Recovery from rabies: a case report / M.A. Hattwick, T.T. Weis, C.J. Stechschulte, G.M. Baer, M.B. Gregg // Ann. Intern. Med. -1972. -76.-P. 931-942.
204. Ikeda, S. Identification and characterization of a mitochondrial endonuclease from yeast Schizosaccharomyces pombe / S. Ikeda, N. Maeda, T. Ohshima, N. Takata // Biochemistry and molecular biology international. 1996 a.-V. 40. - P. 1017-1024.
205. Jackson, A.C. Extraneural organ involvement in human rabies / A.C. Jackson, H. Ye, C.C. Phelan, et al // Lab. Invest. 1999. - 79. - P. 945-951.
206. Jackson, A.C. Management of rabies in humans / A.C. Jackson, M.J. Warrell, C.E. Rupprecht, et al // Clin. Infect. Dis. 2003. - 36. - P. 60-63.
207. Jackson, A.C. Rabies virus infection: an update / A.C. Jackson // J. Neurovirol. 2003. - 9. - P. 253-258.
208. Jogai, S. Rabies viral antigen in extracranial organs: a postmortem study / S. Jogai, B.D. Radotra, A.K. Banerjee // Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2002. -28.-P. 334-338.
209. Jorgenson, R.D. Experimental rabies in a great horned owl. /R.D.Jorgenson, P.M. Gough, D.L.Graham// J. Wildl. Dis. 1976. -V.12. - P.444.
210. Kantorovich, R.A. Natural foci of a rabies-like infection in the far north. /R.A.Kantorovich// J. Hyg. Epidemiol. Miorobiol. Immunol. 1964. - V. 7. - P. 100.
211. Kantorovich, R.A. Experimental investigations into rage and rabies of polar foxes. Natural hosts of the infection. /R.A.Kantorovich, G.V.Kanovalov, G.I.Buzinov, V.R. Riutova// Acta Virol. Praque. 1963. - V. 7. - P. 554.
212. Kissi, В. Genetic polymorphism in the rabies virus nucleoprotein gene / B. Kissi, N. Tordo, H. Borhy // Virology. 1995. - V. 209. - № 2. - P. 526-537.
213. Kolmes, B. Analysis of the reaction mechanism of the non specific endonuclease of Serratia marcescens using an artificial minimal substrate / B. Kolmes, I. Franke, P. Friedhoff, A. Pingoud // FEBS Letters. - 1996 - № 397. - P. 343-346.
214. Komarov, A. Diagnosis of rabies in dogs comparing smears, biological tests and fluorescent Antibody staining /A.Komarov, R.A.Goldwasser// WHO Expert Committee on Rabies.- Geneva. -1959.- V.19. P.107.
215. Krebs, J. W. Rabies surveillance in the United States during 1994. / Krebs J. W., Strine T. W., Smith J. S. et al. // J. Am. Veter. Med. Assn. 1995. -V. 207.-№ 12.-P. 1562-1575.
216. Krueger, R.F Nifuratrone, a new nitrofuran: in vitro and in vivo activities / R.F. Krueger, H.W. Ritter, A.D. Sill // US 3662062 (1970); Can. 993794; Chem. -Abstr., 77, 52349e (1972).
217. Kuwert, E. The complement fixation test /E.Kuwert// In: Laboratory Techniques in Rabies.- WHO. Geneva. -1973. - P. 124.
218. Lockhart, B.P. Inhibition of rabies virus transcription in rat cortical neurons with the dissociative anesthetic ketamine / B.P. Lockhart, N. Tordo, H. Tsiang // Antimicrob. Agents Chemother. 1992. - 36. - P. 1750-1755.
219. Lodmell, D.L. Comparative study of abortive and nonabortive rabies in mice / D.L. Lodmell, J.F. Bell, G.J. Moore, G.H. Raymond // J. Infect. Dis. 1969. -119.-P. 569-580.
220. Manual "Benzon nuclease", Darmstadt, Merck, 1989, p.l.
221. Meiss, G. Biochemical Characterization of Anabaena spec. Strain PCC 7120 non-specific nuclease Nuc A and its inhibitor Nui A / G. Meiss, I. Franke, O.
222. Gimadutdinow, С. Urbanke, A. Pingoud // Eur. J. Biochem. 1998. - V. 251. - P. 924-934.
223. Meredith, C.D. Rabies confirmed in Megachiroptera in South Africa /C.D. Meredith// Rabies Information Exchange. -1980. -V.3. -P.26.
224. Mertz, G. J Antibody responses to human diploid cell vaccine for rabies with without human rabies immunoglobulin / G.J. Mertz, K.E. Nelson, N.E. Vithagasai et al. // — J. infect. Dis., 1982. V. 145. - P. 715-719.
225. Mifune, К Essential Role of T cells in the postexposure prophylaxis of rabies in mice / K. Mifune, E. Takeuchi, P.A. Napiorkowski et al. // Microbiol. Immunol. — 1981. — Vol. 25. — P. 895—904.
226. Miller, M.A. Structure of Serratia endonuclease suggest a mechanism for binding to double-stranded DNA // M. Miller, J. Tanner, M. Afpaugh, M. Benedik, K.L. Krause // Nature Struct. Biol. 1994. - N. 1. - P. 461-468.
227. Mrak, R.E. Rabies encephalitis in humans: pathology, pathogenesis and pathophysiology / R.E. Mrak, L. Young // J. Neuropathol. Exp. Neurol. 1994. - 53. -P. 1-10.
228. Nadin-Davis, S.A. Identification of regional variants of the Canadian province of Ontario. /S.A.Nadin-Davis, G.A. Casey, A. Wandeler// Gen. Virol. -1993. -V. 74. № 5. -P. 829-837.
229. Nargi-Aizenman, J.L. Glutamate receptor antagonists protect from virus-induced neural degeneration / J.L. Nargi-Aizenman, M.B. Havert, M. Zhang, D.N. Irani, J.D. Rothstein, D.E. Griffin // Ann. Neurol. 2004. - 55. - P. 541-549.
230. Nestle M. An extracellular nuclease from Serratia marcescens: I. Purification and some properties of the enzyme / M. Nestle, W. Roberts // J. Biol. Chem. 1969 a. - V. 244. - P. 5213- 5218.
231. Nestle M. An extracellular nuclease from Serratia marcescens: II. Specificity of the enzyme / M. Nestle, W. Roberts // J. Biol. Chem. 1969 b. - V. 244. - P. 5219-5225.
232. Nicholson, K.G. Enzyme-linked immunosorbent Assay: A Reaped Reproducible. Test for the Measurement of Rabies Antibody / K.G. Nicholson, H. Prestage // J. Med. Virol. 1982. - P. 43-49.
233. Porter, R.H. Regional variations in the pharmacology of NMDA receptor channel blockers: implications for therapeutic potential / R.H. Porter, J.T. Greenamyre // J. Neurochem. 1995. - 64. - P. 614-623.
234. Reich, D.L. Ketamine: an update on the first twenty-five years of clinical experience / D.L. Reich, G. Silvay // Can. J. Anaesth. 1989. - 36. - P. 186-197.
235. Robinson, B.V. Critical Review of the kinetics and toxicology of polyvinylpyrrolidone (Povidon) / B.V Robinson // CRC Press, 1990.
236. Rodney, E. Survival after Treatment of Rabies with Induction of Coma / E. Rodney, M.D. Jr. Willoughby, S. Kelly, D.O. Tieves, M. George, et al // New England Journal of Medicine, 2005. 352. - P. 2508-2514.
237. Rubin, R.H. A case of human rabies in Kansas: epidemiologic, clinical, and laboratory considerations / R.H. Rubin, L. Sullivan, R. Summers, M.B. Gregg, R.K. Sikes // J. Infect. Dis. 1970. - 122. - P. 318-322.
238. Rudd, R.G. Tissue culture technique for routine isolation of street strain rabies virus /R.G.Rudd, C.V.Trimarchi, M.K.Abelseth// J. Clin. Microbiol. 1980 -12.-590-593.
239. Ruiz-Carrillo, A. Primers for mitochondrial DNA replication generated by endonuclease G / A. Ruiz-Carrillo, J. Cote // Science. 1993. - V. 261. - P. 765769.
240. Rupprecht, C.T. Current issues in rabies prevention in the United States /C.T.Rupprecht, J.S.Smith, J. Krebs et al.// Publ. Health Rep. 1996. - V. 3. - P. 400-407.
241. Sacramento, D. PCR technigue as an alternative method for diagnosis and molecular epidemiology of rabies virus /D.Sacramento, H.Bourhy, N.Tordo// Molecular and cellular probes. 1991, 5: 229-240.
242. Schluter, H. Tollwutbekampfung in Deutssfolgerungen aus uber 10 jahriger bekampfung /H.Schluter, T.Muller// Tierarztl. Umsch. 1995. - V.50. -№11.-S. 748-758.
243. Schneider, L.G. The cornea test: a new method for the intravitum diagnosis of rabies /L.G.Schneider// Zentralbl. Veterinarmed. 1969. - V.16 - P. 24.
244. Selimov, M.A. New strains of rabies-related Viruses isolated from bats in the Ukraine / M.A. Selimov, A.M. Smeknov, L.A. Antonova, E.A. Snablovskaya, A.A. King, L.G. Kylikova // Acta virol. 1991. - V. 35. - P. 326-231.
245. Siebel, H. Tollwutein europaisches problem / H.Siebel // Kleintier -Prax. 1969. - V. 143. - P. 70-76.
246. Smith, A. Alsolation and assay of rabies serogroup viruses in CER cells /A.Smith, G.H.Tignor, K.Mifune, T.Motchaski// lntervirology. 1974. - V. 8. - P. 92-99.
247. Smith, A.L. Isolation of field rabies virus strains in CER and murine neuroblastoma cell cultures /A.L.Smith, G.H.Tignor, R.W.Emmons, J.D.Woodie// lntervirology. 1978. - V. 9. - N 6. - P. 359-361.
248. Smith, A.L. Isolation and assay of rabies serogroup viruses in CER cells. /A.L.Smith, G.H.Tignor, K.Mifune, T.Motohaski// lntervirology. 1977. - V. 8.-P 92-99.
249. Sodja, J. Experimental chemotherapy of rabies. Preliminary results. / J. Sodja // Acta virol. 1986. - V. 30. - P. 63-68.
250. Superti, F. Effect of amantadine on rhabdovirus infection / F. Superti, L. Seganti, A. Pana, N. Orsi // Drugs Exp. Clin. Res. 1985. - 11. - P. 69-74.
251. Sureu, P. Epidemiologic analysis of antigenic variations of street rabies virus. Detection by monoclonal antibodies /P.Sureu, P.Rollin, T.J, Wiktor//Amer. J. Epidem. 1983. -V. 117. -№ 5. - P. 605-609.
252. Tierkel, E.S. Reaped microscopic examination for Negri bodies and preparation of specimens for biological test /E.S.Tierkel// In: Laboratory Techniques in Rabies. Kaplan M.M. and Koprowski H. E d s. WHO. - Zeneva. - 1973. - P. 41.
253. Turner G. S. Humoral and cellular immune responses of mice to rabies and smallpox vaccines / Turner G. S // Nature. — 1972. — Vol. 241. — P. 90—92.
254. Vincent, R.D. Sequence and expression of NUC 1, the gene encoding the mitochondrial nuclease in Sacchromyces cerevisiae / R.D. Vincent, T.J. Hofmann,
255. H.P. Zassenhaus //Nucleic Acids Res. 1988. - V. 16. - P. 3297-3312.
256. Wang X. Profiles of glutamate and GAB A efflux in core versus peripheral zones of focal cerebral ischemia in mice / X. Wang, M. Shimizu-Sasamata, M.A. Moskowitz, R. Newcomb, E.H. Lo // Neurosci. Lett. 2001. - 313. - P. 121124.
257. Warrell, D.A. Pathophysiologic studies in human rabies / D.A. Warrell, N.M. Davidson, H.M. Pope, et al // Am. J. Med. 1976. - 60. - P. 180-190.
258. Webster, L.TEarly diagnosis of rabies by mouse inoculation. Measurement of humeral immunity to rabies by mouse protection test /L.T.Webster,
259. R.Dawson// Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1935. - V. 32. - P. 570.
260. Webster, W.A. Miyor antigenic groups of rabies Virus in Canada determined by anty-nuoleocapsid monoclonal antibodies /W.A.Webster, A.Caseyc, K.M.Charlton// Сотр. Immunol, monoclonal antibodies. Microbiol, infect. Dis. -1986. V. 9. - № 1. - P. 59-69.
261. Weemen, B.K. Immunoassay using antigen enzyme conjugate /B.K.Weemen, A.H.W.H. Schnurs// TEES letters.- 1971. -V.15.-P.232-236.
262. Weemen, S.K.V. ELISA: Nighlights of the present state of the art. /S.K.V. Weemen//J.Virol. Meth. -1985. -V.10 -№4. -P. 371-378.
263. Wehril, W. The rifamycins—relation of chemical structure and action on RNA polymerase / W. Wehril, M. Starhelin // Biochim. biophys. Acta. 1969. - V. 182.-P. 24-29.
264. Wide H. Failure of postexposure treatment of rabies in children / H. Wide, S. Sirikawin, A. Sabcharaen et al. // Clin. Infect. Dis. 1996. - Vol. 22. - P. 228-232.
265. Wiktor, T.J. Radioimmunoassay procedure for rabies binding antibodies /T.J.Wiktor, H.Kaprowsky, P.Dixen// J. Immunol. - 1972. - № Ю9. - P. 404-407.
266. Wiktor, T.J In vitro evidence of cell-mediated immunity after exposure of mice to both live and inactivated rabies virus / T. J. Wiktor, P.C. Doherty, H. Koprowsky // Proc. nat. Acad. Sci USA. — 1977. — Vol. 74. — P. 334—338.
267. Wiktor, T.J. Monoclonal antibodies against rabies virus produced by somatic cell hybridization: detection of antigenic variants /T.J.Wiktor, H.Koprowski// Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75. - P. 3938-3942.
268. Wiktor, T.J. Use of monoclonal antibodies in diagnosis of rabies virus infection and differentiation of rabies and rabies-related viruses / T.J. Wiktor, A. Flamand, H. Koprowski // J. Virol. Meth. 1980. - V. 1. - № 1. - p. 33^6.
269. Willoughby, R.E. Recovery of a patient from clinical rabies / R.E. Willoughby, M.M. Rotar, H.L. Dohnau, et al // Wisconsin, 2004. - MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2005. - 53. - P. 1171-1173.
270. WHO Expert Committee on Rabies. 8-th Report (1992). Wld Hlth Org. techn. Rep. Ser., № 824, Geneva, 1992.
271. WHO. Report of a WHO Consultation on intradermal application of human rabies vaccine. WHO, Geneva, 1995.
272. WHO recommendations on rabies post-exposure treatment and the correct technique of intradermal immunization against rabies.WHO/EMC/ZOO.96.6. 1997.
273. WHO Expert Consultation on Rabies: first report. WHO technical report series 931, 2005, Geneva, Switzerland.
274. WWW, who .Rabies Bulletin Europe
275. Yolken, R.H. Investigation of enzyme immunoassay time courses development of rapid assay systems /R.H.Yolken, P.J.Leister// J. Clin. Microbiol. -1981.-V. 13.- №4. -P. 738-241.
276. Zimmermann, Th. Zur Brauchbarkeit des Cornea-Testes bei der Tollwutdiagnose /Th. Zimmermann// Berl. Munch, tierarztl. Eschr. 1971. -V. 84. -N9.-P. 172-174.