Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцин против бешенства

() Г) ' :> /

V V ' ч

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

Недосеков Виталий Владимирович

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВАКЦИН ПРОТИВ БЕШЕНСТВА

16 .00. 03- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Научные руководители: член-корреспондент РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор ВИШНЯКОВ И.Ф.

доктор биологических наук ГРУЗДЕВ К.Н.

Покров-1998

Содержание

1. ВВЕДЕНИЕ 8

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14

2.1 Современная молекулярная биология вируса бешенства 14

2.2. Антирабические вакцины 20

2.3. Контроль антираби ческих вакцин 23

2.3.1. Общие положения 23

2.3.2. Методы оценки антирабических инакгивированных вакцин 26

2.3.2.1. Метод Национальных Институтов Здоровья (NIH) 26

2.3.2.2. Методы определения антигенной активности инактивированных вакцин

in vitro < 29

2.3.3. Методы определения уровня в и ру с н е йтра л изу ют и х антител 36

2.3.3.1. Реакция нейтрализации in vivo 37

2.3.3.2. Методы определения вируснейтрализующих антител in vitro 37

2.4. Моноклональиые антитела 49

2.4.1. Теоретические аспекты получения моноклональных антител 49

2.4.2. Использование моноклональных антител для изучения бешенства 44

2.5. Заключение по обзору литературы 51

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 52

3.1. Материалы 52

3.1.1. Вирусы и вакцины 52

3.1.2. Животные 53

3.1.3. Культуры клеток 54

3.1.4. Сыворотки 54

3.1.5. Питательные среды и растворы 55

3.1.6. Реактивы 55

3.1.7. Оборудование 56

3.2. Методы 57

3.2.1. Получение и титрование вируссодержащего материала 57

3.2.2. Приготовление специфических и нормальных антигенов вируса бешен-

ства 59

3.2.3. • Методы определения иммуногенности инактивированных антирабиче-

ских вакцин 60

3.2.4. Получение моноклональных антител 60

3.2.4.1. Иммунизация и контроль иммунного ответа у мышей 60

3.2.4.2. Гибридизация и клонирование гибридных клеток 61

3.2.4.3. Скрининг гибридом, продуцирующих вирусспецифические монокло-нальные антитела 61

3.2.4.4. Криоконсервирование и восстановление гибридных клеток после хранения в жидком азоте 63

3.2.4.5. Получение иммуноасцитической жидкости мышей 64

3.2.4.6. Очистка моно- и поликлональных антител 64

3.2.4.7. Коньюгирование моно-и поликлональных антител с пероксидазой хрена

и ФИТЦ 65

3.2.4.8. Лиофилизация препаратов . 65

3.2.4.9. Определение полипептидной специфичности МКА методами иммуноб-лотинга и радиоиммунопреципитации 65

3.2.5. Получение поликлональных специфических антител 66

3.2.6. Постановка прямого варианта ТФ ИФА на основе МКА 67

3.2.7. Постановка сэндвич-варианта ТФ ИФА на основе моноклональных антител 67

3.2.8. Постановка теста ингибиции фокусов флуоресценции 68

3.2.9. Постановка метода двухфазного ингибирования ТФ ИФАнаоснове

МКА для определения вируснейтрализующих антител 69

3.2.10. Определение полноты инактивации, безвредности и реактогенности 69

3.2.11. Методы статистической обработки результатов и математического моделирования 70

3.3. Результаты собственных исследований 71

3.3.1. Модификации метода контроля инактивированных вакцин in vivo 71

3.3.1.1. Модификация метода NIH с однократной иммунизацией. 71

3.3.1.2. Разработка "периферического" теста. 72

3.3.2. Получение моноклональных антител 74

3.3.2.1. Иммунизация мышей и контроль иммунного ответа 74

3.3.2.2. Гибридизация клеток 76

3.3.2.3. Разработка методов скрининга МКА, специфичных к антигенам вируса бешенства 76

3.3.2.3.1. Разработка непрямого варианта ТФ ИФА для скрининга МКА 77

3.3.2.3.2. Разработка иммунопероксидазного монослойного метода для скрининга МКА 78

3.3.2.3.3. Разработка экспресс-варианта реакции нейтрализации для скрининга вируснейтрализующих МКА 4 . 79,

3.3.2.4. Тестирование специфической антителопродукции гибридных клеток 80

3.3.2.5. Клонирование гибридных клеток 81

3.3.2.6. Определение активности МКА в иммунологических реакциях 81

3.3.2.7. Определение полипептидной специфичности МКА методами имму-ноблотинга и радиоиммунопреципитации _ 83

3.3.2.8. Определение эпитопной специфичности вируснейтрализующих МКА. 84

3.3.3. Получение ноликлональных антител 86

3.3.3.1. Получение и использование иммуноасцитической жидкости, специ фи-ческой к вирусу бешенства 87

3.3.3.2. Приготовление антигенсодержащего материала для гипериммунизации животных. 87

3.3.3.3. Получение антирабической сыворотки лошадей 88

3.3.3.4. Изучение влияния места и способа введения антигена на формирование антирабического иммунитета 89

3.3.3.5. Получение антирабической сыворотки овец 89

3.3.4. Конъюгирование МКА и ПКА с пероксидазой хрена и контроль активности коньюгатов прямым вариантом ТФ ИФА 91

3.3.5. Разработка вариантов ТФ ИФА с использованием МКА для контроля инактивированных антирабических вакцин 93

3.3.6. Разработка прямого варианта ТФ ИФА на основе МКА для обнаружения антигенов вируса бешенства 93

3.3.6.1. Определение чувствительности и специфичности прямого варианта ТФ

ИФА 93

3.3.6.2. Определение антигенной активности инактивированных антирабиче-

ских вакцин прямым методом ТФ ИФА 95

3.3.7. Разработка сэндвич-варианта ТФ ИФА на основе МКА для обнаружения антигенов вируса бешенства 97

3.3.7.1. Определение оптимальных условий постановки сэндвич-варианта ТФ ИФА 97

3.3.7.2. Определение чувствительности и специфичности сэндвич-варианта ТФ ИФА на основе МКА 102

3.3.7.3. Определение антигенной активности инактивированных антирабиче-

ских вакцин сэндвич-вариантом ТФ ИФА 104

3.3.8. Разработка метода титрования вируса бешенства в культуре клеток ПС 105

3.3.8.1. Контроль активности ФИТЦ-конъюгатов в методе титрования вируса бешенства в культуре клеток ПС _ 106

3.3.8.2. Определение чувствительности и специфичности метода титрования вакцинного вируса бешенства на культуре клеток ПС 107

3.3.9. Разработка теста ингибиции фокусов флуоресценции для обнаружения антирабических вируснейтрализующих антител 109

3.3.9.1. Определение оптимальных условий постановки теста ингибиции фокусов флуоресценции 110

3.3.9.2. Определение чувствительности и специфичности ТИФФ 111

3.3.10. Разработка и применение двухфазного ингибирования ТФ ИФА на основе МКА для определения вируснейтрализующих антител 112

3.3.10.1. Оптимизация условий постановки двухфазного ингибирования ТФ

ИФА на основе МКА для обнаружения вируснейтрализующих анти- 113 тел

3.3.11. Определение уровня вируснейтрализующих антител разработанными методами 114

3.4. Использование разработанных методов при изготовлении инакти-

вированной антирабической вакцины 116

3.4.1. Изучение накопления антигена и вируса бешенства в культуре клеток

ПС 116

3.4.2. Определение инфекционной активности вируса бешенства при использовании сред с различным содержанием сыворотки КРС 118

3.4.3. Использование сэндвич-варианта ТФ ИФА при выборе препаратов для инактивации вируса бешенства 119

3.5. Результаты изучения иммунобиологических свойств инактивированной антирабической вакцины из штамма ТС-80 121

3.6. Применение разработанных методов для контроля активности антирабических вакцин 126

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 136

5. ВЫВОДЫ 151

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ , 152

7. СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 153

8. ПРИЛОЖЕНИЯ 173

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФРТ - аденинфосфорибозилтрансфераза;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

В НА - вируснейтрализующие антитела;

ГАТ - селективная среда для гибридных клеток, включающая гипок-сантин, аминоптерин, тимидин;

ГГФРТ - фермент гипоксантин - гуанин - фосфорибозилтрансфераза;

ГПХ - гельпроникающая хроматография;

ГС - гибридомная среда;

ГТ - селективная среда для гибридных клеток, включающая гипоксантин и тимидин;

ДМЕМ - модифицированная Дульбекко среда Игла;

ДМСО - диметилсульфоксид;

ДСН - додецилсульфат натрия;

ИБ -иммуноблотинг;

ИММ -иммунопероксидазный монослойный метод

ИФА - иммуноферментный анализ;

кДа - килодальтон;

ККИД -культурально клеточная инфекционная доза;

ККЭ - клетки куриных эмбрионов;

КРС - крупный рогатый скот;

М.м. - молекулярная масса;

МКА - моноклональные антитела;

МЛД - мышиная летальная доза;

НАФ - неполный адъювант Фрейнда;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ПАФ - полный адъювант Фрейнда;

ПКА - поликлональные антитела;

ПТ - периферический тест;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РДП - реакция диффузионной преципитации;

РИД - радиальная иммунодиффузия;

РИП - радиоиммунопреципитация;

РН - реакция нейтрализации;

РНП - рибонуклеопротеин;

ТИФФ - тест ингибиции фокусов флуоресценции;

ТНМ - тест нейтрализации на мышах;

ТС А - тест связывания антител;

ТФ ИФА - твердофазный иммуноферментный анализ;

ТХУ - трихлоруксусная кислота;

ФБР - 0.01 М фосфатный буферный раствор, pH 7,2 - 7,4;

ФБР-БСА - фосфатный буферный раствор, содержащий 1 % БСА;

ФБР-Т - фосфатный буферный раствор, содержащий 0.05% Tween-20;

ФИТЦ - флюоресцеин изотиоцианат;

ФС - фетальная сыворотка;

ABTS - диаммониевая соль 2,2'- азиноди - (3 -этилбензодиазолин-сульфоновой кислоты);

IgG - иммуноглобулины класса G;

gp 66 гликопротеин вируса бешенства с молекулярной массой 66 кДа;

Sp2/0-gl4.1 - перевиваемая культура клеток миеломы мыши дефектная по гену гипоксантин - гуанин - фосфорибозил трансфераза.

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

По данным ВОЗ (25) в мире ежегодно регистрируют более 30 тысяч случаев гибели людей от бешенства. Сложная эпидемическая и эпизоотическая ситуации по бешенству в последние годы наблюдается более чем в 80 странах мира, что в значительной мере связывают с качеством вакцин и эффективностью вакцинации против бешенства. (267,273).

Несмотря на более чем столетний период применения антирабических вакцин, до сих пор остается нерешенным ряд вопросов, касающихся оценки эффективности антирабических вакцин, что является предметом постоянных исследований, дискуссий и публикаций (77).

Для определения иммуногенной активности инактивированных антирабических вакцин используют рекомендованный ВОЗ метод United States National Institutes of Health - NIH (168). Данный метод является основным тестом и широко применяется в различных странах. Однако, по мнению многих исследователей, он имеет ряд существенных недостатков: интрацеребральное заражение не повторяет естественный путь трансмиссии вируса бешенства; наличие низкой корреляции между тестом NIH и уровнем вируснейтрализующих антител у иммунизированных животных, а также при сравнении результатов тестирования, полученных на целевых животных (65,101). Кроме того использование двух инъекций вакцины при традиционном методе NIH ведет к искусственному завышению активности препаратов; требуется большое количество животных, времени (28 дней), применение инфекционного вируса; наблюдается низкая воспроизводимость метода и значительная вариабельность результатов; (53,65,74,77,280).

Инфекционную активность живых антирабических вакцин определяют методом титрования вируса бешенства на мышах (165), что требует большого количества животных, временных и экономических затрат.

Одним из критериев оценки иммуногенной активности антирабических вакцин является определение вируснейтрализующих антител в сыворотках крови (111).

Для этого используют реакцию нейтрализации на мышах. Но, несмотря на доказанные временем и практикой преимущества данного метода, он трудоемкий,

дорогостоящий, требует много времени и предполагает использование инфекционного вируса.

Всё вышеперечисленное свидетельствует об актуальности поиска новых подходов к оценке эффективности антирабических вакцин.

На основании данных молекулярной структуры вируса бешенства установлено, что основным протективным белком является гликопротеин (gp 66), содержание которого коррелирует с иммуногенностью антирабических вакцин. Поэтому перспективным является разработка теста in vitro, основанного на определении содержания протективного антигена - гликопротеина (gp 66) в антирабических вакцинах, коррелирующего с иммуногенностью (92,258); кроме этого, необходим подбор чувствительной культуры клеток для определения инфекционной активности вируса бешенства, а также разработка методов оценки поствакцинального иммунитета, оцениваемого по уровню вируснейтрализующих антирабических антител.

Указанные выше проблемы послужили основной предпосылкой для разработки и усовершенствования средств и методов контроля антирабических культу-ральных вакцин.

1.2 Цель и задачи исследования

Целью работы была разработка и совершенствование средств и методов определения антигенных и иммуногенных свойств антирабических кулыуральных вакцин и оценки напряженности поствакцинального иммунитета. Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать метод определения инфекционной активности вакцинного вируса бешенства, штамм ТС-80, в культуре клеток;

- модифицировать метод NIH определения иммуногенной активности инак-тивированных антирабических вакцин;

- получить МКА к гликопротеину вируса бешенства, штамм ТС-80, и на их основе сконструировать набор препаратов для определения антигенной активности инактивированных вакцин методом иммуноферментного анализа;

- разработать экспрессные методы оценки поствакцинального иммунитета у животных, привитых против бешенства;

- определить степень корреляции результатов, полученных разработанными методами и тестами, рекомендованными ВОЗ;

- изучить иммунобиологические свойства инактивированной культуральной антирабической вакцины, изготовленной из штамма ТС-80, выращиваемого в перевиваемой культуре клеток ПС.

1.3. Научная новизна

Научная новизна работы состоит в том, что в результате проведенных исследований:

- модифицирован традиционный метод оценки иммуногенной активности инакгивированных антирабических вакцин (тест КПП), заключающийся в однократной иммунизации мышей, что ведет к сокращению времени проведения и стоимости анализа;

- впервые получены МКА, специфичные к трем эпи гонам гликоиротеина ^р 66) вируса бешенства. штамм ТС-80, индуцирующим образование вируснейтрализующих антител;

- разработан новый метод (сэндвич-вариант ТФ И ФА) оценки качества инакгивированных антирабических вакцин на основе использования моноклональных антител к антигенным детерминантам гликопротеина ^ 66) вируса бешенства;

- впервые показана возможность определения инфекционной активности вируса бешенства, штамм ТС-80, в культуре клеток ПС;

- разработаны метод двухфазного ингибирования ТФ ИФА и тест ингибиции фокусов флуоресценции (ТИФФ), являющиеся высокоэффективными методами при определении антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотках крови животных. Получено положительное решение ФИПС о выдаче патента "Способ определения антирабических вируснейтрализующих антител" № 97116427/13 (017362) с приоритетом от 1.10.97 г.

1.4. Практическая ценность

Разработаны и рекомендованы для контроля эффективности антирабических вакцин чувствительные, производительные и экспрессные методы ТФ ИФА на основе моноклональных антител.

Разработан проект нормативных документов на "Набор препаратов для определения активности инакгивированных антирабических вакцин иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител". (Временные инструкции по изготовлению и контролю "Набора...", Технические условия, Наставления по применению "Набора..." и Методические указания по постановке иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител).

Разработаны ТИФФ и ТФ ИФА, на основе МКА, для оценки напряженности поствакцинального антирабического иммунитета у вакцинированных животных.

Разработанные методы внедрены во ВНИИВВиМ при определении активности вируса на различных стадиях производства антирабических вакцин, их имму-ногенной активности, вируснейтрализующих антирабических антител в сыворотках крови привитых животных.

1.5 Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту

1. Результаты модификации метода определения иммуногенности инакти-вированных антирабических вакцин.

2. Результаты исследований по получению вируснейтрализующих моно-клональных антител к гликопротеину вируса бешенства для выявления протектив-ного антигена в антирабических вакцинах сэндвич-вариантом ТФ ИФА и обнаружения вируснейтрализующих антител в сыворотках крови привитых животных с помощью метода двухфазного ингибирования ТФ ИФА.

3. Результаты разработки теста ингибиции фокусов флуоресценции и метода определения инфекционной активности вируса бешенства (штамм ТС-80) с использованием перевиваемой культуре клеток ПС.

4. Результаты изучения иммунобиологических свойств инактивированной ан-тирабической вакцины, изготовленной из штамма ТС-80.

1.6. Апробация результатов работы.

Материалы диссертации были доложены на научных конференциях в Донском государственном аграрном университете (г. Новочеркасск, 1998), ВИЭВ (г. Москва, 1998), на заседаниях Ученого Совета ВНИИВВиМ и совещаниях научных сотрудников лаборатории "Диагностика" ВНИИВВиМ (1996-1998).

1.7. Публ�