Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Усовершенствование диагностикумов для обнаружения специфического антигена ротавируса крупного рогатого скота

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАШНИ ' ВЕТЕРИНАРНАЯ АКАДЕМИЯ имени К.И.СКРЯБИНА ■

На правах рукописи БАБУРИНА ТАТЬЯНА МИХАЙЛОВНА

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ДИАГНОСТИКУ)*® ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО АНТИГЕНА РОТАВИРУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 - ветеринарная микробиология,*вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1991

Диссертационная работа выполнена в Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии ни. К.И.Скрлбина.

Научный руководитель:

доктор ветеринарных и биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РСФСР, академик ВАСХНИЛ СЮРИН В.Н.

Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук, профессор Воронин Е.С.

2. Кандидат ветеринарных наук Гоголев М.М.

Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени государствен-

дегош ученой степени кандидата наук в Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии имени К.И.Скрябина /109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23, тел. 377-93-83/.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВА.

Ведущая организация

ный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов.

Защита состоится " ^у^У^ 1991 г, в часов на заседании специализированного совета К 120,36,05 по прису*-

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета

Федосеева Т.Н.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди желудочно-кишечных заболеваний, поражающих молодняк крупного рогатого скота, особое место по широте распространения, тяжести клинического проявления и ощутимому экономическому ущербу занимают гастроэнтериты вирусной этиологии И,В частности,ротавирусная инфекция / Acres S.O. at' al. , 1975; Moon H.W. et ¡>1. ,1978; Babluk l.a. at al. ,1985/. Заболеваемость при ротавирусной инфекции крупного рогатого скота достигает 100£, а смертность в ряде случаев - 50% / mebua с.а. et al. ,1971/. Телята, переболевшие ротавирусной инфекцией, становятся более предрасположенными к другим заболеваниям.

Широкая распространенность инфекции и экономические потери, связанные с нею, вызывают необходимость своевременной диагностики и профилактики этого заболевания.

В ряде научно-исследовательских институтов налей страны занимаются разработкой диагностических препаратов и лабораторных методов диагностики данной инфекции. Так, сотрудниками ВИЭВ /Гоголевым М.М. с соавторами 1981,1984 гг./ разработаны Методические рекомендации по индикации ротавируса и выявлению к нему антител методом диффузионной преципитации, непрямой иммунофлуорес- ■ ценции и имыуноферментного анализа и набор диагностику!« для обнаружения ротавирусного антигена иммуноферментным методом. Однако несмотря на это, на вооружении ветеринарной слуясбы страны до сих пор отсутствуют простые, доступные и достоверные методы и средства диагностики ротавирусной инфекции крупного рогатого скота.

Цель и задачи исследований. Исходя из вышеизложенного цельо наших экспериментальных исследований явилось: подбор метода диагностики ротавирусной инфекции крупного рогатого скота для широкого использования в практических ветеринарных лабораториях и разработка технологии изготовления диагностихумов.'

Для достижения поставленной цели нам необходимо было резшть следувцие задачи:

- подобрать оптимальные условия культивирования ротавируса крупного рогатого скота;

- отработать кетод-.конпзктрйрезв?ия а етстпк poyatüpyca из куяьтурады-ао: Бируссод8р*:та;гас сусаэдзвЯ;

~ уерзерзенегга опта- : дкагносгикуин для '.е 6йаруг»:в«.ч cnsipr^í-

ческих антигенов и антител в РДП и РИФ;

' - изучить специфичность и чувствительность усовершенствованных диагностикумов в условиях экспериментальной и естественной ротавирусной инфекции;

- провести комиссионное межведомственное испытание набора диагностикумов, изготовить опытную серию препарата и испытать его в производственных условиях.

Научная новизна. Усовершенствован способ выращивания рота-вируса в культуре клеток перевиваемой линии ВДВК на микроносителе "Цитолар-3" (авторское свидетельство № 1540070, приоритет 'от 24.05.1988 г.).

■ Усовершенствован способ очистки и концентрирования ротавиру-са из культуральных вируссодержащих суспензий с использованием фильтрационно-хроматографического метода (авторское свидетельство № 1522493, приоритет от 21.03.1988 г.).

Отработаны оптимальные условия постановки встречного имму-г ноэлектрофореза применительно к диагностике ротавирусной инфекции крупного рогатого скота (рационализаторское предложение "Метод встречного иммуноэлектрофореза для диагностики ротавирусной инфекции крупного рогатого скота" № 149 от 31.05.1989 г.).

Практическая ценность работы. Результаты диссертационной работы нашли отражение в нормативно-технических документах на опытную серию набора диагностикумов ротавирусной инфекции крупного рогатого скота, предназначенного для обнаружения ротавирус-ного антигена и выявления антиротавирусных антител методом ветрах кого иммуноэлектрофореза.

Сотрудниками лаборатории вирусологии и биотехнологии МВА изготовлена опытная серия препарата, которая проходит испытание в производственном опыте.

Адробаци;. работы. Основные положения диссертации доложены на отчетных научно-практических конференциях МВА им. К.И.Скрябина в 1983-1989 гг.

Публикация материалов исследований. По материалам диссертаг-ционных исследований опубликовано б статей, I статья находится в печати, получено 2 авторских свидетельства.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 227 страницах маяшногшеного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов

исследований, выводов, сведений о практическом использовании полученных результатов, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 34 рисунками. Список литературы включает 227 источников, из них 50 отечественных и 177 зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в I98I-I990 гг. в лаборатории вирусологии Московской ветеринарной академии им. К.И.Скряблна. Методику концентрирования и очистки вируса отрабатывали з лаборатории очистки природных соединений института биоорганическо" химии им.М.М. Шемякина АН СССР.

Опыты на животных проводили в БелНИЭВ и учхозе "Леоновсяоея,

В исследованиях использовали эталонный штамм "Линкольн" ро-тавируса крупного рогатого скота, полученный из музея штаммов института вирусологии им. Д.И.Ивановского, и изоляты ротавируса 1®27» ВДз2> ®3б я выделенные нами от больных энтеритами телят, и изоляты KgQ и Kgj, выделенные Самойловым П.П. (1982 г.).

В работе использовали монослойные первично-трппсинизирован- . ные культуры клеток: почки и легкого эмбриона коровы /ПЭК и ЛЭК/, почки теленка /ПТ/, почек зеленой мартышки /ПЗМ/ я перевиваемые культуры клеток: почки взрослого быка /'-ЩЕК/, почки эмбриона коровы /ППЭК/, почек эмбриона макаки-резуса /МА-104/, почек зеленой мартышки А' 4647/, почек собаки /ЩСК/, слизистой оболочки носа эмбриона коровы /fbn /, слизистой оболочки прямой ккпкл эмбриона коровы / fbg- /.

Вирусы выращивали в стационарных и роллерных культурах я ' в культуре клеток на микроносителях.

Перед заражением в зируссодеряащуп суспензии добавляли трипсин " Qtfca " з конечной концентрации 5 и 10 мкг/мл; при культивировании вируса в МА-104 трипсин добавляли в п о да ор'з! п гдгуэ среду в концентрации 0,5-2 мкг/нл.

Инфеяционцуя антитостъ вируса определяли в шноелойной пробирочной культуре клеток при .роллорном методе культивирования вируса. Расчет титра проводили по Reed L.s. миэпск ot а!./1939/.

Концентрированно ?! очастгу роуаггаруса из ¡¡узаяурегмаз

вируссодержащих суспензий проводили следующими методами:

1. ПоЛИЭГИЛеНГЛИКОЛеМ M.B. 6000 ПО Методу Takahashi е. et el. /1977/,

2. Сульфатом аммония 35^ от насыщения по методу Митова Б. /1983/.

3. В изоэлектрической точке с применением 0,05^ гексаызта-фосфата натрия.

4. Ультрацентрифугировакием в 20-6линейном градиенте сахарозы.

Удьтрацентрифугировакием в градиенте хлористого цезия по методу, описанному Beards G.M. /1982/.

■ 5. Фильтрационно-хроиатографическим методом /§ХМ/. ФХМ вклвчает микрвфильтрагого и молекулярно-ситовую хроматографию.

Для микрофильтрации использовали полисульфонамидше мембраны с диаметром пор 450 А и синтетические мембраны типа Рипйр I-I к Pimop 1-3 с диаметром пор 200-250 А и 100-150 А соответственно.

Хроматографию проводили на аналитических и препаративных, колонках размером 0,9 х 45; 23 % 90 и 3 х НО см объемом $Q, 360 и 780 мл соответственно. В качестве сорбента использовали-модифицированные химическим способом макропористые кремнеземы /ШС/ с диаметром пор 2000 А, 1000 А и 700 А. •

Степень очистки вирусной суспензии оценивали по результатам электронной микроскопии и электрофореза вирусных белков, а также по степени очистки по белку и удельной активности.

Электронную микроскопию /ЭМ/ негативно контрастированиях 2% водным раствором"ураниладатата препаратов проводили на микроскопе зем -100 В при инструментальном увеличений 30000-50000 ■ раз.

Электрофорез вирусных белков в блоке полиакриламидного га-л в присутствии додецилсульфата натрия /ЭФ в ПААГ-ДСН/ осуществляли по модифицированной методике King 3. и Laeem.lt utк/1971/

Содеркание белка в препаратах определяли по uowry о.н. et. el. /1951/.

Сыворотки к ротавирусу штамм "Линкольн" и изолятам ротави-руса Kqq, ИФ27, ЯДз2> полУ43^ на кроликах к морских свинках при иммунизации их концентрированными и очищенными антигенами с адъовантами по схемам, предложенным Fauvel и. et al. /1978/ И Matsuno s. et »1. /1977/.

Конъюгацию гамма-глобулинов, выделенных из специфических сывороток, с флуорохромол флуоресцеинизотиоцианатом натрия /ФИТЦ/ проводили ПО методу Marshall 3.D. /1958/.

Ротавирусный антиген з пробах фекалий выявляли в реакциях прямой иммунофлуоресценции /РИФ/, диффузиошгай преципитации /РДП/, связывания комплемента /РСК/ и зстречно.ч иммуноэлектрофо-реэе /БИЭФ/.

Прямул РИФ ставили в указках, приготовленных из осадка деск-вамированных клеток слизистой кишечника после ¡шзкоскоростного центрифугирования фекалий /РИ$и/, и в культуре клеток, зараженной суспензией фекалий /РИФ к.к,/. РДП и РСК проводили общепринятым методом. ВИЭ5 ставши? в 0,85й-ном растворе агарозы в приборе для электрофореза ПЭФ-3.

Для выявления антиротавирус'шх антител в сыворотках кропл телят и коров использовали РСК, ВИЭ$, РДП, реакции нейтрализации /РН/ и иммунофэрмектиый анализ /ИФА/.

РН ставили с постоянной дозой вируса 1000 ТЦ%q/iJC?I в монослое культуры клеток ЦЦВК.

Экспериментальное заражение проводили на 4-х новорохдетшх безмолозивных телятах. Телят заражали изолятом ротавируса тфуп-ного рогатого скота 243 на уровне V-го и 12-го пассажа в пульту-ре клеток МДВК с инфекционным титром 6,0 и 7,0 lg W%o/iux соответственно. Один теленок был контрольным.

Полученные результаты были обработаны статистически по методикам, описанным Ойвин И.А. /I960/ и Лавровой И.Г. /1984/.

2.2. Результаты исследований

Поиск оптимальных условий культивирования ротавируса крупного рогатого скота

Поиск чувствительной культуры. При поиске чувствительной культуры гслет01с учитывали характер и сроки проявления ЦПД и на-коплс1ие вируса в 3-х к более серийных пассатах. Штамм "Линкольн" и иэолят Kqq ротавируса крупного рогатого скота успешно репродуцировались в первичнотрнпсинизированных культурах ПЗК, G3M, субкультуре ПЭК I-3-го пассшка и перевивает« линиях ИА—104, ЗДВК, №4647 и ППЭК.

В итоге сравнительного изучения nraufosee чузс?гк?«льиой из ncpOBJraaem'X культур -лесок оказалась '-iA-iOi (I>Ii: "¿зллз 16-24

часа на 4-е креста, титр 7-8 lg ТЦД^д^). Культура клеток перевиваемой линии ВДВК была менее чувствительной к ротавирусу (Щ через 24-120 час на 3-4 креста, татр 5-7 lg "ЩДбо/мдЬ однако она позволяла стабильно получать вирус, была менее прихотливой и поэтому была использована для накопления вируса с цель» приготовления диагностикумов.

Поиск оптимального способа культивирования ротавируса. Использовали стационарный и роллерный способы культивирования и микроноситель "Дитолар-З". Роллерный способ культивирования вируса в перевиваемой линии МДВК был более продуктивным, чем стационарный: инфекционный титр вируса на 1-1,5 lg ТЦЦ^Дщ выше, а сроки максимального проявления ЦПД на 3-5 суток короче по сравнении со стационарным.

Наибольший урожай вируса получали в культуре клеток на микроносителях (титр на 0,5-1,0 lg Щ%о/мл выше» чеи в роллерах).

Определение оптимальной множественности заражения. Культур} клеток МДВК в роллерах инфицировали ротавирусои штамм "Линкольн" с множественностью заражения от 1,0 до 0,0001 Wgo/клетка*

Таблица I

Влияние множественности заражения на репродукции ротавируса.( л » з )

№ ГШ ! Множественность ! заражения, • ^^%0/клетка j ! Средние сроки ! ! проявления ! Проявление ! максимального ! ЦПД ! ЦПД i 444( и ¿ в ) i i ! logg

I 1,0 20,7+ 3,1 ++++ 1-2

2 ■ 0,1 43,0+ 4,8 ++++ 1-2

3 0,01 56,6+13,3 ++++ 1-2

4 ' 0,001 61,0+12,8 +++ и ++++ цельный

5 0,0001 78,0+16,1 ++ иЧ++ отр.

Результаты, представленные в табл. I, показывает, что множественность заражения влияет на сроки проявления ЦПД и время сбора максимального урожая* С уменьшением множественности заражения сроки репродукции вируса увеличивались. Кроме того, при множественности заражения ижже 0,01 ЭД%о/клетка ^ проявлялось

в меньшей степени и антигенная (преципитирувщля) активность вируса снижалась. Поэтому для приготовления антигена мы рекомендуем использовать вирус с множественностью заражения не ниже

^О/клетка.

Определение оптимальных сроков репродукции ротавируса. При изучении динамики репродукции ротавируса штамм "Линкольн" с множественностью заражения 0,01 ТЧ%о/югетка ®ыл0 установлено, что через 48 часов после инфицирования роллерной культуры клеток ВДВК и при поражении ыонослоя на 50-70^, инфекционный титр вируса достигал максимального значения, тогда как преципитирующая активность появлялась на сутки позже и при более выраженном ЦПД на 70-ЮСЙ.

Изучение влияния трипсина на репродукцию ротавируса крупного рогатого скота. Изучали влияние трипсина на репродукцию адаптированного к клеточной культуре эталонного птамма "Линкольн", а также выделение и адаптации изолятов ротавируса к клеточным культурам МА-104, ВДВК и ПЭК. В результате опытов мы подтвердили литературные данные о том, что трипсин оказывает существенное влияние на культивирование полевых вирусов, неадаптированных изолятов и вирусов с низкой множественностью заражения и не влияет на культивирование вирусов адаптированных к клеточным культурам с высокой множественностью заражения.

Усовершенствование метода концентрирования и очистки

ротавируса из культуральных вируссодержащих суспензий

Активность антигенов, полученных с помощью полиэтиленгля-коля, сульфата.аммония и в изоэлектрической точке рН 3,0,была низкой и не превышала 2-3 1од2 в РДП. Кроме того, при осалде- • нии вируса полиэтиленгликолен были получены 4 серии антигенов активностью 1,0 1од2 я 8 серий антигенов отрицательных в РДП. .

Таким образом, использование вышеупомянутых методов не сопровождалось получением активных антигенов,

Вириода ротавируса, очищенные в градиенте хлористого цезия, также обладали слабой преципитирующей активностью.

В последующих исследованиях для концентрирования и очистки ротавируса был применен фильтрационно-хроматографичсский метод, разработашгый для очистки вируса гриппа /Репетов П.Д. я др., 1981/.

В результате опытов, поставленных с целью определения оптимальных условий проведения ыикрофильтрации и молекулярно-ситовой хроматографии, нами было установлено, что наибольший выход по антигенной активности /64%/ получен на мембране Ркпор-1-3 с диа-

ч

центром пор 100-150 А, наиболее эффективное отделение вируса ог примесных компонентов происходило на ШК 700 А. При исполъзова-ш этого кремнезема практически весь вирус выходил в пзрвой фракции, активность которой составляла 5-6 Ход,» в РДП и 8-9 1од2 в ВИЭФ.

Однако при ЭМ исследовании в вирусной фракции мы обнаруживали аморфные клеточные образования, состоящее из липидных агрегатов, с размерами значительно большими, чем вирионы ротавируса. Для удаления их из очищенной вирусной суспензии концентрат перед нанесением па колонку обрабатывали фреоноы-ПЗ, цетилтриме-етшаммошйбрамадоы /ЦТАБ/ и сульфопроизводными бетаина СВ-10 и СБ-12. Лучшие результаты были получены при использовании СБ-12.

Удаление ллпидов из концентрата способствовало увеличению вш:ода вируса до 64% и степени очистки по удельной активности и 256 раз по сравнению с исходной ВКЖ.

Сравнительный анализ вирусных суспензий концентрированных полиэтиленгликолем, сульфатом еииошя и фильтрационно-хромато-графическим методом показал, что наивысший выход /64%/ по антигенной активности и наивысауо степень очистки по удельной активности /68 раз/ имели препараты, полученные ФХМ /табл. 2/,

Таблица 2

Сравнительный анализ антигенов, полученных различными методами

Метод

Содержание Антиген- Выход Удель- Степень

концентриро- белка по ная актив-по ан- ная ак- очистки

вания

Лоури, мг/мл

кость, титр в

ВИЭФ

тиген- тйвносгь,по удельной ак- а.е./нг ной актив

тивности,

ности,

Исходная ВКЖ 0,53 1:4 100 7,5 — -

Полиэтиленгликолем 0,70 1:16 4 22,8 3,0

Сульфатом аммония 1,05 1:16 4 15,2 2,0

Фкльтрационно-гро»*ато графическим методом 0,50 1:256 64 512,0 68,0

Результаты ЭМ изучения и 35 в ПААГ-ДСН очищенной фраками идетельствовали о высокой степени очистки вируса фильтрацион--хроматографичесюпд методом.

Усовершенствование диагностических препаратов и использование их в реакциях иммунофлуоресценции, диффузионной преципитации и встречном ишуно электрофорезе для обнаружения специфического антигена и антител.

В качестве инактиваций концентрированных ВКЖ использова-[ дкмер этиленимина в 0,02% конечной концентрация.

В результате проведенных нами испытаний по определения анионной активности ротавирусов, концентрирозанных и очищенных 1зличжл:и метода!^!, наиболее активные агеоротки с титром -10 loa, з РДП, 7-12 1од2 э ВЙЭФ, 8-10 1од2 з РH н 8-12 10д2 FCC были полутени при кгагуняоацяи кроликов и морских свинок п'авирусом, очищенным в градиенте плотности сахарозы. Аитиген-1Я активность вирусной фракции, полученной ФХМ, Taiœe была >статочно высокой: активность гипериммунных сывороток состаз-тла 6-8 1од2 в РФ и 9-10 lo«^ в ВИЭФ.

Титр антител, получеших при введении двух доз очищенного яигена 90 и 180 ;<кг, практически не отличался. Более активные ¿воротки были получены при внутримышечном и внутрикожноа методе введения по'сравнению с'подкожным.

При иммунизации кроликов антигеном с различными адьозан-ами /полный и неполый адыовант Фрейнда, ланолин с вазелином, t гидроокись адлсминия и 2% аэросил/ нами не установлено првн-удество маеллнкых адьввантов.

Иммунофлуоресценвдя. В РИЗ использовали ФИТЦ конъягаты с расящим титром 4-6 1од2 .

При постановке прямой РИФ в культуре клеток, инфицированной штаммом "Линкольн", изолятами ^32» ^36» к успензий фекалий, наблюдали идентичную картину специфического вечения цитоплазмы, что свидетельствовало об антигенном род-тве эталонного штамма, выделенных изолятов к полевых ротавиру-ов и позволяло использовать полученные нами коньюгаты для об-аружения ротавирусного антигена в полевом материале.

В мазках из фекального материала наблюдали диффузное я ■ранулярное свечение цитоплазмы эпителиальных клеток слиэистоХ

кишечника.

Для постановки РИФ к.к. в основном использовали культуру клеток MA-I04, как наиболее чувствительную. Обработка вируссо-держащей суспензии, полученной из фекалий, трипсином /10 мкг/мз и добавление его в поддерживающую среду /0,5-2 мкг/мл/ увеличи! ло количество флуоресцирующих клеток до 60-80^.

При сравнительном исследовании 36 проб фекалий в РИФм. и РИФ к.к. в 23 пробах установлено совпадение результатов.

Чувствительность метода РИФм. по отношению к РИФк.к. составила £ специфичность - 802.

Метод диффузионной преципитации. РДП в основном использове ли для обнаружения ротавирусного антигена. При параллельном исследовании 194 проб фекалий в РДП и РИФм. в РДД выявляли на 24 /12,5$/ положительных проб больше, чем в РИФм.. Всего обеими методами было обнаружено 79 /42^/ положительных проб.

В результате сравнительного испытания 16 проб фекалий в РИФм., РИФк.к., РДП, РСК и ЭМ установлено совпадение результато разрабатываемых нами реакцией с ЭМ. Чувствительность РИФм., РДП и РСК по отношению к ЭМ составила 755£, специфичность - 100%. Чувствительность РИФк.к. превысила ЭМ на 12,5%.

Встречный иммуноэлектрофорез. Активность специфических антигенов и сывороток в ВИЭФ была в 4-8 раз выше, чем в РДД. При параллельном исследовании 114 проб антигенов, содержащихся в фекалиях, в ВИЭФ и РДП в ВИЭФ выявляли на 8 /6,8$/ положительных проб больше, чем в РДП.

При параллельном исследовании 89 сывороток коров и телят в ВИЭФ и РДП в первом методе положительными оказались все 89 /100%/ исследованных сывороток, а во втором - 27 /ЗЭ%/ сыворото1

Ретроспективная диагностика. При исследовании в ВИЭФ 200 сывороток телят и коров антиротавирусные антитела обнаруживали в 100? сывороток коров и 70? сывороток телят. Для подтверждения специфичности ВИЭФ 36 проб сывороток телят и коров были параялез но исследованы в ВИЭФ и РН. Среднегеометрические титры сыворото! в РН составляли 5,35+0,21 1од2 , в ВИЭФ - 2,36^,19 Ход2 . Хотя между величинами титров преципитирущих и нейтрализующих антител корреляции не установлено, все сыворотки положительные в ВИЭФ были положительными и в РН.

При изучении антительного ответа у больных и переболевших

ютавирусной инфекцией телят было установлено нарастание уров-ш антиротавирусных антител к 14 дно после заболевания.

В результате нами был сделан вывод, что диагноз на рота-¡ируснуп инфекцию может быть поставлен не только по обнаружению , ютавирусного антигена в фекалиях, но и по четырехкратному и бо-tee увеличению титра антител в парных сыворотках крови телят.

Разработанные нами диагностикумы и возможность их примене-шя в реакциях были проверены комиссиями. Имеется акт комиссион-гого межкафедрального испытания набора диагностикумов в РИФ, РДП, *СК от 26 июня 1986 г. и акт комиссионного межведомственного ис-гытания набора диагностикумов в ВИЭФ от 4 мая 1989 г. и положи-•ельным заключением.

Набор диагностикумов ротавирусной инфекции в ВИЭФ был ис-[ытан в ряде научно-исследовательских и производственных лабо-тторий. Положительное заключение получено из лаборатории виру-:ологии БелНГОЗ, Белгородской и Донецкой областных ветеринарных ¡абораторий и Киргизского СХИ.

Изучение некоторых вопросов экспериментальной и естественной ротавирусной инфекции

При проведении исследований на экспериментально и естеетвен-го инфицированных животных мы пытались установить следующее:

- клиническую реакцию телят на инокуляцию изолята ротави-iyca крупного рогатого скота;

- сроки выделения вируса с фекалиями;

- серологический ответ у экспериментально зараженных телят;

- возраст телят, наиболее подтвержденный спонтанной рота-1ирусной инфекции.

Экспериментальная ротавирусная инфекция« Через I8-3Q час. юсле инокуляции вируса телята заболевали. У них отмечали диа->еп, депрессию, анорексию и небольшое повышение температуры до !9,8°С.

Телягга I I и > 2, зараженные изолятом ротавируса 243 на уровне 7-го пассажа в культуре клетох ЦЦВК, переболевали в более •яжвлой форме, чем теленок № 3, зараженный разведенным (1:10) мрусом, и теленок № 4, зараженный хзолятои на уровне 12-го пар» :ажа.

В результате теленок пал на 3-й день после зараженал, ■еленок *2 был убит на 4-й день после заражения с целые про»е-

дения патологоанатомического и гистологического исследования. У теленка № 3 и № 4 к 8-9-ому дню диарея прекратилась, отмечали улучшение общего состояния.

Ротавирус был выделен из фекалий всех зараженных телят: з теленка № I - через 28 часов после заражения, у остальных тре> животных - через 20 часов. Вирус выделяли в течение 6-ти дней из фекалий теленка № 3 и 5-ти дней - из фекалий теленка К' 4. Электронномикроскопически ротавирус обнаруживали в фекалиях те лят с первого дня заболевания в течение 6-7 дней. Ротавируснъп антиген выявляли: в РИФк.к. - в течение 4-5 дней, РИФм. - 2-4 дней; ВИЭФ - 3-5 дней, в РДП - 3 дней от начала заболевания. I пробы фекалий положительные в испытанных нами методах были положительными в прямой и иммунной Эт.

При сравнительном исследовании проб фекалий эксперимента: но зараженных телят в РДП и ВИЭФ последний метод оказался боле чувствительным. Так, у теленка № 3 ротавирусный антиген выявлг только в ВИЭФ. Титры антигенов, обнаруженных в фекалиях методом ВИЭФ, были на 2-3 1од2 выше, чем в РДП, и составляли от I до 6 1од2 .

В результате изучения серологического ответа у двух экспе риментально зараженных телят было установлено нарастание уровня антител к 14 дню после заражения /в РН-1:32; в ВИЭФ—1:8 -1:32; в ИФА - 1:12800/. До заражения антиротавирусные антителг не выявляли.

Между титрами антител в сыворотках крови экспериментально зараженных телят №3 и №4,выраженных в 1°д2 , в ВИЭФ и РН усч новлена статистически достоверная сильно выраженная прямая за! симость ( гг = + 0,9337+0,16... Р<0,01; г2 = + 0,9325+0,18 Р<0,01). Титры антител в ИФА были адекватны титрам в ВИ&Ф и I но в 100-400 раз выше.

Полученные результаты еще раз подтвердили специфичность I активность разработанных нами диагностических препаратов и дос таточную чувствительность метода ВИЭФ, используемого для обнаружения ротавирусного антигена в патологическом материале и выявления антиротавирусных антител в сыворотках крови коров и телят.

Естественная ротавипуснап инфекция. Ротавирусные энтерит! наблюдали у телят 1-13-дневного возраста, наибольшее количесач у телят 5-8-дневного возраста.

- 1с5 -

Ротавирусный антиген в фекалиях чаще выявляли на 5-8-й нь после рождения и на 1-6-й день с начала проявления диареи. 69% случаев ротавирусный антиген обнаруживали у телят 5-ти евного возраста.

Ротавирусные антигены выявляли в РДП и Р®м. в первые че-ре дня с начала заболевания, Наибольший процент выявления при-дился на первый день: в РДП - 100%, в РИФм - 81%\ на второй нь: в РДП - 44%, в РКФм.- 311; на третий день: в РДП - 10%; РИФм. - 31%; на четвертый день: в РДП - Ы, в РИФм,- 19% почтительных из исследовашшх проб фекалий.

Ротавирусная инфекпия была диагностирована в пятнадцати зяйствах Московской области; ротавирусше антигены обнаруживали 36^ из исследованных проб фекалий.

3. ВЫВОДЫ

1. Установлены оптимальные условия культивирования ротави-са крупного рогатого скота в культуре клеток ЗДВК, которые зволяют получать вирус с титром 5-7 1д ТЦД50/мл: ,ш°яествен-сть заражения 0,01 1д метод культивирования - рол-рный, сроки репродукции 48-72 часа при 37°С, среда Игла или на и 199, взятые в равных количествах.

2. Более эффективному выделении ротавируса из патологичес-го материала способствуй1 применение перевиваемых культур зток МА-104 и ЭДВК, выращенных зроллеро, и предварительная заботка инокулята трипсиноы /10 мкг/мл/. Использование этих говий позволял.о нам выделить четыре изолята ротавируса.

3. Ротавирус активно размножается в культуре клеток ЦЦВК, защенной на микроносителе "Цитолар-3" /авторское свидетельст-№ 1540070/. . .

4. Для очистки и концентрирования ротавируса из кульгураль-с вируссодержащих суспензий может быть использован фильтра-)нно-хроматографический метод, позволяющий получать вирусные ;пенэии с выходом по антигенной активности 64%, степень» [стки по белку 90%. Удельная активность при атоы возрастает 56 раз /авторское свидетельство 1522493/.

5. Установлена возможность использования иммунофлуорвсцен-

[, диффузионной преципитация и встречного иммуноэлаггрофореза • разработанными нами антигенами к сыворотками к гаи) дхя

диагностики ротавирусной инфекции крупного рогатого скота.

6. Ротавирусный антиген может быть выявлен в РИФ, поставлен ной в мазках из патологического материала, в течение 2-4 дней,

в зараженной культуре клеток 3-5 дней, в РДП - 3-4 дней, в ВИЭФ-3-5 дней от начала заболевания.

7. Выявлена высокая положительная корреляция /г - 0,93/ между титрами нейтрализующих и преципитирующих антител в сыворотках крови экспериментально зараженных телят.'

4. СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Разработаны и утверждены нормативно-технические документы на набор диагностикумов ротавирусной инфекции крупного рогатого скота.

Технические условия ТУ-10.07.129-89 на опытную партию набора диагностикумов ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. Утверждены 04.07.1989 г. ГУВ Госагропрома СССР.

Временная инструкция по изготовлению и контролю набора диагностикумов ротавирусной инфекции крупного рогатого скота.

Утверждена 13.10.1987 г. ректором МВА, согласована в ВГНКИ 28.06.1989 г.

Временное наставление по применению набора диагностикумов ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. Утверждено 17.08. 1989 г. ГУВ Госагропрома СССР.

Методические указания по диагностике ротавирусной инфекции крупного рогатого скота. Утверждены 17.08.1989 г. ГУВ Госагропрома СССР.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бабурина Т.М., Пантелеев Ю.В., Самойлов П.П. Обнаружение ротавирусного антигена методом прямой РИФ //Проблемы вирусологии, мол. биологии и гистологии с.-х. животных: Сб. науч. тр./Моск. вет. академия им. К.И.Скрябина.-1983.- С.28-30.

2. Бабурина Т.Н., Бугаева Л.И., Пантелеев Ю.В. Диагностика ротавирусной инфекции телят в РИФ и РСК //Проблемы ветеринарной биологии: Сб. науч. тр./Моск. вет. академия им. К.И.Скрябина.-1984.- С. 48-51. .

3. Бабурина Т.М., Пантелеев Ю.8., Бугаева Л.И. Получение зецифических активных сывороток для диагностики ротавируснсй {фекции. //Теоретические основы профилактики инфекционных и «азионных болезней животных: Сб. науч. тр./Моск. вет. академия д. К.И.Скрябина.- 1985.- С. 17-18.

4. Бабурина Т.М., Пантелеев Ю.В., Бугаева Л.И. Сравнительная чувствительность методов диагностики ротавирусной инфекции ?упного рогатого скота //Проблемы биологии и патологии сельско->зяйственных животных: Сб. науч. тр./Моск. вет. академия им.К.И, срябина.-1987,- С. 100-103.

5. A.C. 1540070 Способ выращивания вирусов-возбудителей гспираторных и кишечных заболеваний крупного рогатого скота 5елоусова Р.В., Сюрин Б.Н., Лобова Т.П., Завальный М,А.,Му-1вьев В.Н., Третьякова И.В., Резова Т.И., Бабурина Т.М. -4431499, заяв. 24.05.1988 г. //Официальный бюллетень. Откры-гя и изобретения.- Москва, 1990. -14.

6.,A.C. 1522493 Способ очистки вирусных суспензий /Жигис С., Решетов П.Д., Копьев В.П., Иванов А.Е., Бабурина Т.М., «лина В.Е., Зубов В.П., Сюрин В.Н., Пантелеев Ю.В. - N4395952, швл. 21.03.1988 г. //Официальный бюллетень. Открытия и изобретя.- Москва, 1989 г. - № 42.

7. Культивирование ротавируса и вируса инфекционного рино-1ахеита крупного рогатого скота в культуре клеток на микроно-[телях /Белоусова Р.В., Муравьев В.Н., Бабурина Т.У., Третьяка И.В., Резова Т.И., Лобова Т.П. //Тезисы докл. Всесоюзной уч.-практ. коиф. Интенсификация с.-х. производства в условиях дикальной экономической реформы .- Сумы, 1989.- С. I7I-I72.

8. Фильтрационно-хроматографический метод очистки ротави-■сов /Копьев В.П., йигис Л.С., Решетов П.Д., Бабурина Т.М., ылина B.C., Пантелеев D.B., Сюрин В.Н. //Вопросы вирусологии.-'89,- № 6.- С. 760-765.