Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Изучение биологических свойств эмульгированной формолвакцины против ротавируса крупного рогатого скота

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ П ЗАКУПИМ

УКРАИНСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО ¡ФАСНОГО 3НАШ?НИ

СЕЛЬСКОХОЗ Г*!СТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

ОГБУ ОГБОННАЙА

УДК 61Э:57В.К)Ч.1

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПЙУПЬГИРОВАШЮЙ 'ЮПЮЛВАКЦИНИ ПРОТИВ РОТАВИРУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

дипаартации на соиоканиэ ученой степени кандидата иятеричарннх паук

К кс и \У)

работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии Украинской ордена Тр/дового Присного Знамени сельскохозяйственной акадашш.

Научны!' руководить)ль - доктор биологических паук,

профессор, члеи-корр.ВАСХНМЛ

В.П.ОКУФРЙЕВ ,

Официальное оппоненты: доктор венерннаршк наук,

профаооор И.й.ГШШКАР

кандидат ветеринарных наук, ассист. Н.В.Г.РСТШШ

Ведущая организация - Украинский научно-исследовательский ветеринарных институт ЮОВАСХНИЛ

Защита диссертации состоится "¿2." г. в

_Щ__часов сгг> минут на заседании специализированного совета К 120.71.05 в украинской ордена Трудового Красного знамени сельскохозяйственной академии по адресуг 252127, Киев-127, ул.Полковника Иотехина, 16, учебниИ корпус » 12, аудитория.

Просим принять участие в заседании совета или выслать отзыв на автореферат в 2-х экз., заверенный печатью, по адресу: 252041, Киев-41, ул.Героев оборони, 15, УСХА, секретариат специализированнах советов.

С диссертацией исжно ознакомиться в библиотеке академии. Автореферат разослан СПсТ^с^З 1990 г.

у«ень'Н секретарь ^ /'

сп'Дциализириранного совета / С ( с с 4ЦА.Бортя1тк

)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теши Желудочно-кишечные заболевания занимают особое место среди инфекционных болезней молодняка крупного рогатого скота. В большшотво случаев в этиология массовых заболеваний новорожденная: телят вэдутцуг роль играют Е.Коли и кишечные вирусы, в том числе ротавггрус.

Для лечения ротавирусной инфекции, которая способна наносить больной экономический урон животноводству, прицеплялись солевые растворы электролитов, глюкоза, аминокислоты, каолин, пектин, иммунная сыворотка, плазма и иптефероп, а также антибиотики. Но эффективность перечисленных препаратов оказалась незначительной, поэтому во многих отралах мира были разработаны средства специфической профилактики /как живая, так и инактизированная вакцины/. Из имеющихся вакцин ' значительное место отводится инактивированным препаратам, применяемым для ишуникацги коров в расчете на создание коло-отрального иммунитета у новорожденных телят.

Кафедра микробиологии и вирусологии и лаборатория вирусологии ветери (арного факультета УСХА являются одним из ведущих подразделений в Советском Союзе в области изучения ротавирусной инфекция крупного рогатого скота. В настоящее время исследования находятся на этапе создания новой эмульгированной форыолвакцитш против ротавируса с испольпраннем мастного изолята.

При конструировании новой антивирусной вакциим, я го?! чисчр против ротавируса, определенно биологически счойстн такого препарат-! лплчотся сеот-мч актушнюг, градаций - тая как протчиосткзоотическая гффвктярпость применяемых вакцин ззви-

сит oí способности этих препаратов индуцировать поствак-щшный иммунитет у привитых.

цель и задачи исследований, целью работа являлось изу-чоиио и разработка лабораторного метода контроля эмульгированной формолвакцшш против ротавируса крупного рогатого скота на юшуногенпую активность, а такхе полноту инакт ива-i ции, стерильность и реактогенность. Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач.

1. Разработка и совершенствование метода контроля инак-тивированных вакцин против ротавируса крупного рогатого скота на стерильность, вирулентность и реактогенность.

2. Изучение иимуногепности экспериментальных образцов вакцин против ротавирусной инфекции крупного рогатого скота путей разработки лабораторного метода определения на лабораторных животных,

3. Определение оптимальной дозы адьюванта и установле-. ние прививнейдозы вакцины для крупного рогатого схота.

Научная новизна работы состоит в том, что нами впервые разработан метод определения шшуногенных свойств эмульгированной формолвакцшш против ротавируса крупного рогатого скота и дани экспериментальные доказательства пригодности исследуемых образцов препарата к использовании для прививки животных,

установлено, что экспериментальные образцы препарата были стерильными. Экспериментально доказаны их безвредность, умеренная реактогенность для лабораторных животных и Kpj того рогатого скота, а токсичность для культуры клеток МДО.'С.

Впервыо разработан лабораторный иетод определения ШПчп

па лабораторных животных, позволивши!! оптимизировать прививную дозу для крупного рогатого скота. Высокая воспроизводимость результатов, полученных в опытах, позволяет считать пригодный данный метод для практического использования. Па./" чениз соотношения адьюзвпта с антигена!® в вакцина показало, что оно должно находиться в пределах 1:1. Выяснено-, что с помощью №А мокно обнаружить антитела к ротавирусу в снворот» ко крови привитых бычков на 5-Я день послз иммунизации, а с помощью РН и РСК - на 10-й день.

Теоре.тицоска^ значимость и пр&ктичоскад донио.сть работа,, ца основании проведенных исследований установлено, что мотшо использовать чувствительную культуру клеток и лабораторных ■тавотных /морские свинки, белые крысы и белые мвпги/ для определения биологической активности эмульгированной формолвак- • цины против ротавпруса крупного рогатого скота. Иинуногешвя доза препарата для крупного рогатого скота составляет 25 КИДзд по результатам проверки на морских свинках и белых мысах и 20 ПМДзд, на белых крысах. Показано, что после введения такой дозы вакцины животным,максимально напряхеагенный иммунитет отмечается с 25 по ад день. Подтверждением этому являются возрастание и снижение титра виру сне йтрализующих антител в сыворотках привитых животных.

Параллельное выявление поствакцкшшх антчтел в сыворотках крови с помощью реакции нейтрализации /РГТ/, ишуно^ермян®-. пого штли?а /ША/ и связыгания компанента/гСК/ показлло достаточно впсокуп эффектиш ость эти;: мчтоло?. сзрологичсогиг «с-смг.оя&тя* Специфичность ГН пооголяет ч-грп* о ис110/,т--'>от|.'г:ь че япп обпаругория пяруснвйтргляпупчсг лит»*»» ч :ииарггусу, а

чувствительность 1йА дает возможность обнаружить антитела к ротавирусу в ранней стадии их появления в сыворотках крови, поэтому во многих лабораториях она нашла широкое применение, особенно, для определения имыуногенных свойств антиротавирусных вакцин.

Апробация работы, материалы диссертации доложены на , конференции аспирантов и преподавателей ветеринарного факультета украинской сельскохозяйственной академии, г.Киев, 1988 и 1989 гг.; на Всесоюзной конференции по борьбе с бесплодием и профилактике инфекционных заболеваний молодняка, г.Харьков, 1988 г., а также на расширенном заседании кафедр эпизоотологии, микробиологии и вирусологии /октябрь, 1990 г,/

Публикации.Основ¡ше положения диссертации опубликованы в трех научных работах.

Объем и структура работ». Диссертационная работа изло-гепа на 149 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 таблицами, 5 рисунками, 12 снимками, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения материалов, выводов и практических предложений. Список лито-ратуры включает в себя 268 источника, в том числе 257 работ зарубеиних авторов.

СОБОТВЕНШЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

работа выполнялась на кафедре микробиологии и вирусоло-гиу! и в лаборатории вирусологии ветеринарного факультета украинской ордена Трудового Красного знамени сельскохозяйственной академии в 1987-1990 годах.

И-мтеридли.к «ото,к», в опытах использовали три зпизооти-

ческих штамма ротавируса: Белорусом /Б/, Московский /М/ и рове.чский Л>/. Все штампы были предварительно адаптированы п культуре перевиваемых линий клоток МДШ.

Противсротавирусные януяьтированные фориолвакщшы ГОЭВ-Б, ПРЭВ-М и ПРЭВ-Р конструировались в лаборатории вирусологии ветеринарного факультета УСТА с использованием эпизоотических итаямов ротавируса, адаптированных к культуре клеток МДШ и инактивированшгх формальдегидом. Еакгеоты изготовлены совместно с доцентом СЕибицкин В.Г., ассистентом цись-ковпчем С.В. под руководством профессора Онуфрпсва В.П.

Мясо-нептошгай агар /МПА/ и перевивав!,с.'в линии клеток МДБК получены из Щ1И питательных сред /г.Махачкала/ и московской ветеринарной академии /МВА/ соответственно.

В опытах использовали 2<->8 бе лих мышей, 216 белых крыс, 2'Ю ггорских свинок и 152 головы откорночных бычков воэрастон до одного года. Сыворотки крови в количестве 864 образца были получены от подопытных и контрольных животных. Для получения сыворотки лабораторных животных тотально обескровливали путен вскрытия бедренных вен под общим наркозом, а у бычков из пгрешой вепы. Полученную кровь выдерживали п термостате при температуре 37°С в течение 1-го часа, затем оставляли та 18 часов при температуре И°С. Отделившуюся сыворотку отсасы-зали пастеровской пинеткой, затеи центрифугировали, обрабатывали антибготиком и замораживали при тештературе -20°0 до исследования в серологических реакциях.

При проверке яяоперт'оптэлмшх "браэдор. плпктявррротш-

|ОЙ В1КЩПШ па СТОТЯП.ПОСТЬ, ГРГТ'П 0%'1П«>« ГП;чч:!Г7 «[ИОПЧЯ

1 ироПтфгн,., сод9р.п1!див'ПО н.п пясопептоняого йгата под

иаолоп и без него, Пробир:;н со средой поело внесении в них 0,5 кл вакшш шраду с контролем помещали в термостата при +37°0 /на семь суток/, отшт повторяли двукратно. Стерильны;.® стлались образцы вакциаи, после внесения которых прозрачность питательной среду не изменялась. И тоборот, если в течение наблюдаемого периода обнаруживали номунюшы . среды, такой образзц считался не стерильным.

Определение авирулентности окспершенталышх образцов вакцин. Поскольку исследуемые образцы икактивированной вак-цшш изготовлены из ротавируса, адаптирован-

ного к перепиваемым клеткам ¡ЦБК, в своих оштах по изучении полноты цнактивирования ми использовали эту линию кпеток. На культуре клеток ИДБК проводились трехкратные слепые пас-саки каждого образца вакцины.

Дополнительную проверку авнрулентнзети экспериментальных ооразцов инактивировалной вакцины на животных при имыу-, низании вели путем подкожного введения препарата морским свинкам и белым крысам по l,'t мл, белым шшам - по 1,0 мл, бичкам - по 10,0 на кивотное. Проби фокалий отбирали в течение Ю дней. Обнаружение ротавирусного антигена в фекалиях проводили путем использования непрямого метода ИМ и РСК.

Изучение реактогеггности эмульгированной формолвакцины против ротавирусной инфекции крупного рогатого скота.

Экспериментальные образцы вакцин состояли из вакционного антигена, ииактивировакного формальдегидом, гидроокиси алюминия и масляного адьюванта /5С$ по объему/, состоящего из синтетического минерального масла и эмульгатора.Поэтому изучение реактогенности на лабораторных хивотных /морских свинках,

боных тфнсезс и бегах шг-яжг/, а тш-ло па бычках позволило пая ршгаять реактогэтшо ксипонэяти или дозы вапципы, обусловливание побочное влияние на оршшзм животного.

реаятогзпность эцуллгаровмшоЯ фзриоявакцшш, вакцинного антигена-и г»асляного адьюванта вели в отдэлышх опытах, использовали по Ч животных на дозу. Прививали подкозно морским свинкам 1,2 и I,') пл., белим шиан 0,8 и 1,0 мл., бич-там 10,0 мл, а белим крысам вводили ил эмульгировались закц'пш. За подопытными лквоишч веля пайлэдешгэ в точен::;? ?1 дня, учитывая общее состояние хшо-лшх, врсип появления п ¡счэзновения припухлости на месте введзнЛя препарата. Кроме >того, мы учитывали езодновпо роктальпо температуру тела, !ульс, частоту дыхания, размер и характер припухлости на иас-:в введения препарата.

Изучение иммуногенных свойств эмульгированной формол-акцнна против ротавируса крупного рогатого скота.

Глаэпой целью этих исследований являлась разработка оличественного метода определения на лабораторных животных миуногенпой активности экспериментальных образцов эмульги-ованной формолвакцины, состоящей из полевых штаммов ротави-уса, адаптированного к культуре клеток МДБК.

В опытах использовали 88 голов морских свинок, такое э количество белых крыс, 56 голов белых мышей. Морских сви-ок и белых крыс прививали возрастающими дозами трех образцов 1кцин от С,2'до 1,4 «л, белых мьгаей от 0,2 до 0,8 мл. зививали по 4 животных одной дозой. Пробы сыворотки полу-1ли по общепринятому методу, а зируспейтрализу1кци? антито-1 выявили в РН, которую повторяли четкрехкратко.

Ъ последующих опытах ии определили минимальные дозы зяуяьгированной форгэлвакцины, вшивающие у 130/ привитых лабораторных животных иммунитета с вирусиейхралнзувдей активностью сывороток в титра 1:32 и более. Для зтощрли мы прививали подкожно по (66 морских свинок и белых крыс в дозах 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2 и 1,4 мл и 112 болых мышей

i

в дозах от 0,2 до 0,8 по б животных на каздую дозу, через 21 день лабораторные животные тотально обескровливались и сыворотку крови исследовали в PH.

В опытах при определении ИЗД^д мы использовали формулу

лог.имДдд - лог.дн - б / ¿.i./ -0,5/, где

ВД50 - минимальная иммунизирующая доза вакцины, которая индуцировала у 50$ привитых лабораторных животных вируснейтрализующйй антитела в титре 5 лor.gj

дн - максимальная из испытываемых доз;

б - логарифм кратности дозы вакцины, который в наших

опытах был равен 2; í,í-\ - сумма значений;

l_¡ - отношение числа положительных результатов проверки сыворотки привитых животных к общему числу испытанных по каждой дозе.

При установлении возможности использования для определения ЩД50 различных видов лабораторных животных в опытах мы одновременно прививали морских свинок, белых крыс и белых мышей, Для установления воспроизводимости результатов определение ИМДд0 каждого образца повторяли пять раз. рн ставили по общепринятому методу, инфекционную активность вируса

оценивали по методу Рида я Ивнча /1930/.

Изучение иннуногенпых свойств эмульгированной форноя-вакщш» против ротавируса на крупном рогатом скоте проводили в три этана. На первом ьтапе определяли тнпшальпое количеот-во едъгтанта, котороэ обуславливает максимальную стимуляцию иммуногенеза, в этой серии опытов при постоянной дозе вакци-опного антигена обменом в 5,о мл испытывали разные доз« адьп-ваята: 2, б, 8 я Ю мл. Изучая» три образца вакцтш ПРЭВ-Б, ПРЭВ-М я ПРЭВ-Р. На каждую дозу адыовапта использовала по четыре бычка. В отдельном опыте исследовали иммунологический эффект на крупном рогатой скоте после применения постоянной дозы адьвванта 5,0 мл и различных доз вакциояного антигена от 0,2 до ю,0 млн. Сыворотку кропя отобрали перед прививкой и через 3 недели после вакцинации.

Па второй этапе исследования с учетом ВД^ па лабораторных животных мы определяли объем эмульгированной формоя-вакцины, который создает после прививки у крупного рогатого скота через три-четыре недели наиболее напряженный иммунитет. В опытах были использованы различные пршзивггае дозы ткция, которые содержали по 5, ю, 15, 20, 25, 30, 35 и »0 ИМДзд. Каждой прививной дозой прививали по Ц животных. Еров!^ для получения сыворотки отбирали через 21 депь попчо

фЯВЯВКИ.

На третьем этапе исследования яяу*ти двтмику ви-(уенрйтрдлпэую'ипх пнтитрл у припитыг бычков оптимально!' пря-:итгК1 дочой эмуямиропятк'И фориоличкцпт», л которой '•'»"••с ■ ■я л ось Л)-30 йМДг0. [Грпрл гг.ят нолу^ии" "мпори'^м отбирал" ерез хатки" 5 суток р точена 50 дней. На игат;ды(? образец

вакцшш било использовано по 4» бычка. чотирви аивонши были введет.) только вакциыише антигены без адыэванта. Полученные сыворотки исследовали с помощью РН, ИФА и РСК общепринятый методом. Статическую обработку результатов исследований осуществляли общепринятыми методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проверка экспериментальных образцов эмульгированной вакцшш против ротавируса крупного рогатого скота показала, что высевы из образцов препарата на жидкий Ш/ в аэробных и анаэробных условиях не сопровождались бактериальным ростом, в то га время, как внесение в МПА материала заведомо нестерильного образца аналогичной вакцины систематически сопровождалось в аэробных условиях помутнением среды в результате бактериального роста.

Таким образом, результаты говорят о том, что технология, разработанная для конструирования образцов вакцин, обеспечивала их стерильность и в дальнейшем позволила нам при изучении авирулептности и иммуиогенности препарата использовать только стерильные образцы вакцины.

Результаты исследования экспериментальных образцов ин-активированной вакцины ПРЭВ-Б, ПРЭВ-М и ПРЭВ-Р и контрольных антигенов I и 2 на остаточную вирулентность показали, что использованная вакцина и контрольный антиген № 2 /изготовленный из суспензии разрушенных клеток культуры без вируса/ ЦПД но наблюдалось, в то жэ время при пассаже антигена № I, >;ото-рнИ содержит вирулентный вирус, было обнаружено ЦПД на первом

я 2 пассам. Попытки обнаружения ротавирусных антигенов в фзкалях подкожно привитых экспериментальными образца;« вакцины ПРЗВ-Е, ПРЭВЧ$ я ПРЭВ-Р морских свинок, белш шгаой, болях крыс и бычков в И£а и рек ие увенчались успехом, итак, полученные результаты дали основание заключить, что экспериментальный образец инактиаированпой вакцшш против ротавиру-оа крупного рогатого скота не содержит вирулентные антигены и пригоден для дальнейших исследований.

Изучение ре ант о генное та эмульгированной формолвакципн на лабораторных животных показало, что все экспериментальное образцы вакцины в дозе 1,0 мл через 4-12 дшй поело подкогао-го введения вызывали гибель белых нашей, у мьгаей этой группы отмечали явленно токсикоза, сопровождавшегося в течение 4-6 сутск общим угночением и поносами. у белых шшей, ког торым было введено по 0,8 мл вакцины, каких либо отклогоняи общего состояния отмечено та было. Не наблюдали также каких либо изменений в обком состоянии белых крыс, которым вводит по 1,4 ил рлкцтга. У 4 из 12 привитых вакциной морских евпнок но 1,4 мл череп б дней после инъекции препарата отмечалось выраженное 4-10 та в диаметре уплотпеппо на мосте введения препарата и парупеггае двтеения. Среди морских свинок, прибитых экспериментальны™ образцами эммулъгировачной вакциной по 1,2 «л, только у одного животного из 12 тблртпли гнрагачпул нестпуп реакции и нарупвпие движения.

Анализ результатов изучения рватотптюти 9;«ульгпгоп.*гч-ном Зорчоленкщтн ка крупном рогатом с к с те покч?№<>, ч?г. г. ло?р ГО,0 мл ятот препарат V 10-12 тоячныг бьп«ог " солим*-ьгзе счгчадв 'М'зигял крат-опоеменнсе повычничч* температуры

тела на 0,5-1учащоняе пульса на 5-10 ударов/мин, которое длилось 2-5 дней, образование небольшой припухлости на песте введения, без существенного нарушения общего состояния оргшшзча.

Из опытов по изучению реактогенности вакцинных антиго-иоб па лабораторных животных и крупной рогатом скота видно, что у бычков, которым вводили антиген в дозе 10,0 ил, отмечалось кратковременное повышение температуры тела на 0,5-1,0°С и образованно на месте введения антигенов небольшой припухлости, которая через педелю исчезла при отсутствии отклонений в общем состоянии подопытных животных, у белых мышей после подкожного введения им по 0,8 мл различных вакцинных антигенов и у морских свинок, которым вводили по 1,2 мл этих препаратов, отсутствовали признаки наруиения общего состояния, однако введение этих препаратов белыми мышами по 1,0 мл сопровождалось токсическими нарушениями общего состояния, поносом и в 50-72$ случаев гибель» подопытных животных. Около 50# морских овинок, которым было введено по'1,1» мл антигенов, имели небольшие припухлости на месте ин-ьекции, у некоторых животных нарушалось движение.

Изучение реактогенности масляного адъюванта на лабораторных животных и крупном рогатом скоте показали, что у всех бычков, которым вводили по 10,0 мл адъввакта отмечалось кратковременное повышение температуры тела на 0,5-1,0°0, учащение пульса на 5-10 ударов в минуту, появление небольшой припухлости на месте инъекции. Общее состояние животных не чару-йпдосъ, Введение адъюванта белым мышам по 0,8 мл и по 1,2 мл морским свинкам не сопровождалось видимыми отклонениями в

общей состоянии животных. Дозы испытуемого адъшшига 1,4 ил на морских свинках и 1,0 мл на белых мышах оказались токсичными, вызывающими 100$ гибель миией, образование припухлости на месте инъекции и нарушзнив движений у морских свинок,

Б опытах показано, что характер и выраженность побочного действия эмульгированной вакцины и ее составных частей па организм животного зависит от вида животного и дозы испы-'тнваамых препаратов. Этими исследованиями установлены предельные дозы вакцины, которые били использованы при дальнейшем изучении иммуногенной активности лрепарата на лабораторных животных и крупном рогатом скоте.

результаты изучения иымуногенных свойств эмульгированной формолвакцины против ротавируса на лабораторных животных дали возможность установить, что их можно использовать для определения ишуногенных свойств эмульгированной формолвакцины. В опытах по изучению зависимости напряженности противоротавирусного иммунитета от дозы вводимых образцов препарата морским свинкам, белый крысам и бапыи иияаи отманено, что титры вируснейтрализующих олтитал в сыворотках крови привитых животтпс через 21 дань после иммунизации во всех спуч&ях характеризовались высокими показателями. Инициальные и максимальные титры антител в сыворотках крови морских свинок, привитых образп/ши вакцины ПРЭВ-Б, ПРЭВ-И1 и ПРЭВ-Р в возрастающих в дозах от 0,2-1,4 мл, колебались в пределах от.3,5-3,8 ДО 5,в-6,:> лог.?. По результмам опытов на белых крыс*у колебания титров янтитрл в чакивииогти от внеденных доз обратной впкщпш находились в иррдемт от

»

3,0-3,5 ДО 5,0-5,5 лог..,. Колебания титров антител находились в гредэлах 2,5-^,5 и 5,5-6,0 лог.^ в сыворотках шгаей после введения препарата в дозах 0,2-0,8 мл.

При выяснении воспроизводимости результатов изучения зависимости напряженности поствакцнонного иммунитета у лабораторных кивотних от дозы вакцины образца ПРЭВ-Р ми осуцествлили пятикратное повторение опыта с установлением среднеарифметического, квадратического отклонения и коэффициента вариапяи.

Изучение фономена "доза-эффект" на лабораторных животных, привитых эмульгированной вакциной в разных дозах, свидетельствуют о высокой воспроизводимости полученных результатов от опыта к опыту. Показатель квадратического отклонения титров антител находился в пределах 0,2-0,4, а коэффициент вариации не превыиал П,2£. убедившись в том, что морские свинки, белые крысы п белые мной являются хорошими биологическими моделями для количественного, определения имму-ногешшх свойств эмульгированной формолвакцины против рота-вируса крупного рогатого скота, в дальнейших ог гтах мы определяли процент хпвотпнх, у которых после прививки определенной дозы вакппш в сыворотках кропи были обнаружены антитола р титре 1:32 и вьчае.

1?чш!"апьной напряженностью иммунитета у лабораторных сироти»': мы играли титр вируонейтрялизугпих антител 1:32 потоку, что г предг,".рителыг1Х опитаз: обнаружили в сыворотках гспк.к бе я у?. >'»пгчя , ррц? кп'г рмультровишой фурчолепкпиноп , ре с о дер 7<*ге!' гйкдингих ркгаляторс р титрах I :н

рО">.»льт/1~1.' оччтов го'чг'чл!!, V« '.'микуплмг.я доза,

которая может индуцировать образование антител в титре 1:32 и выше у 50$ привитых лабораторных животных находится в пределах 0,2-1,0 мл.

Поэтому при разработке методов определения ИЩЦф на морских свинках, белых крысах и белых мышах мы манипулировали дозами эмульгированной формолвакцины в пределах 0,21,2 мл, так рак в опытах по изучению реактогеиности было показано, что в этих дозах препараты обладали умеренной реак-тогенностью для лабораторных животных.

учитывая результаты, полученные в предыдущих опытах по изучению реактогепности и иммунс! лшости эмульгированной формолвакцины на лабораторных животных, в следующих опытах мы определяли схему опытов и математические расчеты, которые позволяют установить минимальный объем вакцины, прививка которой вызывает у 50# лабораторных животных индукцию вирус-нейтралиэугщих антител в титрах 1:32 и более. Результаты этих исследований показали, что указанные титры у морских свинок и белых мышей отмечались после введения им 0,3'(-0,'12 мл вакцины, а белым крысам после 0,50-0,60 мл этого препарата. Опыты по изучению воспроизводимости показателей ИМД^ при повторении исследований одних и тех же образцов вакцины несколько раз на аналогичных партиях лабораторных животных говорят о высокой достоверности полученных результатов /табл.1/.

результат изучения воспроизводимости показателей имнупогенности эмульгированном формолвакцини /НРЭВНР/ 1фотив ротавируоа на лабораторных яивоншх

Таблица I

№ !.!ЛД50 в мл. на:

опытов морские свинки белые крысы белые шли

I 0,42 0,50 0,40

2 0,42 0,60 0,48

3 0,50 0,50 0,48

4 0,42 0,50 0,48

5 0,42 0,50 0,34

Среднее арифметическое 0,44 0,52 0,44

Квадратичес-кое стклоне-и ко б 2 +0,03 10,04 ±0,05

Коэффициент вариации Г- в % Ш

Таким образом, результаты этих опытов показали, что морские свинки, белые мыши и белые крысы могут быть аффективно иопопьзовапь' при определении РКЛгф змульгкровалыой форчопепк-ПЩ1Ч ггротип [>о1я?1труоа «рупиого ротто'ч) скота,

Гезукмлтн ;1пуче|1яя иммушичннооти эмульгированной •{01Ч'пп1«»»,ик|г» про гиг ротавируоа на кручи он ротгом счото через 21 деп- после врпденкч прчггарятп покп?эли, что макор-«альнер вирус»«» чтр.-»п<пу т?я актин ноет г гделррткп > пркпитух

бычков /8,9-9)3 nor.g/, а также самые высокий титры антител в ИМ и РСК /10,8-12,0 лог.2/ отмечались после введения аи-вотшн 9,0-11,0 мл экспериментальных образцов знулыирован-ной формолвакцины ПРОВ-Б., 1ГРЭВ-М и ПРЭВ-Р. Оптимальными соотноизниями вакцинных антигенов и адьюванта при возрастающей дозе адьюванта и постоянной дозе вакционного антигена били 5,0:4,0" или 5,0:6,0 мл. При изменении доз вакцинного антигена и постоянной дозе адьюванта оптимальными соотношениями этих компонентов оказалось 4,0:5,0 или 6,0:5,0.

В отдельных опытах ш изучали вируснейтрализующую активность сыворотки крови бычков «чрез 21 день после введения им экспериментального образца эмульгированной форыолвак-цины ГГРЭВ-Р в дозах, содержащих от 5 до 40 ШД50. В этих опытах было показано, что прививная доза эмульгированной фор • молвакцины для крупного рогатого скота находятся в пределах 20-25 ИМДзд, которые были определены при проверке этой вакцины на морских свинках и белых мышах. Титри вируснейтраяи-зующих антител в РН после введения указанных доз вакцины бычкам были в пределах 9,0-9,5 лог.,,. В то же время прививные дозы, которые содержали меньше 20 ПНД^д индуцировали у привитых животных существенно более низкие татры вирус-нейтрализусщих антител /табл.2/.

Динамика титров антител в сыворотке крови привитых бычков показала, что максимальные титры антител в сыворотке крови привитых животных различными образцами эмульгированной формолвакцигш отмечались на 20-25 сутки после введения препаратов и удерживались на высоком уровне в течение

Tat л и из 2

Определение оптимальной дозы эмульгированной формолвакцины 1Ш0В-Г против ротпмруса на крупном рогатой ското

ИМЛ50 на морских- свинках и~бопих нишах

Титр сыворотки а ГН /в лог.,,/

э 10 15 20 25 30 35 НО

6,0 ± 0,1

7.0 ± 0,1 В,2 i 0,3 9,3 + 0,2 9,5 + 0,3

9.1 + 0,2 8,8 ¿ 0,3 8.5 + 0,2

]У

ХО-15 дгвИ. Максииаяышо щ-хри антител в цроьв киастиих, п ¡^¿т их вакдишшм антиген о и, ь рн, ш и рек ошн па порядка низе, чем титры антитез в сыворотке кров« шмшг, привитых различишь образцами зиудьгированноП формолвакшши. Продолжительность нахождения высоких титров анхшол в сыворотке привитых животных вакцишши антигенш «е иревшиш, 15 дней, в "р время как у животных, которых прививали сиуль-^гировиппой вакциной, высокие титры антител отмечались н течи-гний 15-25 дней. Показатегш титров антител в рн находились в пряной коррелятивной зависимости с показателями титров в ИМ и РСК, хотя в ИМ п РСК они ы всех случаях были на 1-2 порядка выше, чей в рн.

ВЫВОДЫ II ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРЕДЛОЖЕНИЕ

1. экспериментально обоснована возможность использования лабораторных животных /морских свинок, белых ншей и белых крыс/ и культур клеток при изучении реактогеннооти, остаточной вирулентности и иимуяогеннЬй активности эмульгирован-пой кулыуральной формолвакцшш против ротавирусной инфекции крупного рогатого скота;

2. Исследованиями трех экспериментальных образцов

знультированной формолвакцины на культурах клеток, лабораторных животных и бычках по обнаружена остаточная оулент-ность /наличие вирулентного вируса/ препарата и достаточно высокая иммуиогвппость при умеренной реактогеннооти препарата, что указывает ял '.»фиктивность технологии изготовления пакциям,

3. Экспериментально показано, что характер и выраженность побочного /токсического/ действия эмульгированной формолвакцинн и масляного адыопанта на организм аивотных зависел от вида подопытных животных и дозы испытываемых образцов препарата. Дозы о,В, 1,2 и Ю,0 мл препарата оказались умеренно реактогешшми /переносимыми/ для мышой, морских свинок п бычков соотшгствепно.

4. Прямая коррелятивная зависимость между величиной введенной дозы вакцины и титрами вируснейтрализувщих антител в сыворотках крови вакцинированных лабораторных кивот-пых позволила использовать белых нишей, морских свинок и белых крыс для количественного определения ЙНД^ /иммуно-генной активности эмульгированной формолвакцинн/ против ротавируса крупного рогатого скота.

5. экспериментально разработана схема опыта, подобран аппарат математического расчета, позволяющие установить минимальный объем вакцины, прививка которой вызывает у 5С# лабораторных животных индукцию вируснейтрализувщих антител

в титрах 1:32 и более. Показатели Ш,!Дг)0 эмульгированной $ор~

молвакцшга колебались в зависимости от того, на каком виде

лабораторных животных проводилось исследование, так, если

на морских свинках и белю; кипах И1Ц одних и тех ке об:. 50 резцов еакцш? колебались в пределах 0,34-0,42 мл, то па

белых крысах эти покупатели находились л пределах 0,50-

О.Г^О мл.

С. опчтс.х показано, что оптимальная прививная доза л!!! крунчото рогатого ско-а «кульг про»чиной фор/юлпакшшы

должна со дер:-:.'!!!, в предел0:: 20-2Г> Й1!:15:) г-; тнкнм прпроркг

активности этого препарата на морских свинйах или белых мышах. титры антител в РН на 21 день после прививки бычков достигали 9,0-9,5 лог.

7. Сравнительное изучение в рн, 1ЙА. и РСК сывороток крови привитых бычков эмульгированной формолвакциной и вакцинный антигеном показало, что максимальные титры антител отмечались а 20-25 сутки после введения препаратов и удерживались на высоком уровне в течение Ю-25 дней.

В. Максимальные титры противоротавирусных антител в сыворотке крови бычков, привитых вакцинным антигеном, были на 2-4 порядка ниже, чем максимальные титры антител в крови животных, привитых эмульгированной формолвакциной. Это свидетельствует о стимуляции иммуногенеза масляным адьсвантом.

9, Во всех опытах изучения поствакцикальиого иммунитета у бычков показатели титров противоротавирусных антител в РН находились в прилов коррелятивной зависимости к показателям титров антител в И<М, РСК, хотя в НФА и РСК они били на 1-2 порядка выше, чем в рн.

Проведенные исследования позволяют нам рекомендовать методы определения иммуногенных свойств, авирулентности и реактогепности эмульгированной формолвакщшы против рота-вирусной инфекции крупного рогатого скота вести на лабораторных животных и культуре клеток не только во вр лиг конструирования препарата, но и при изготовлении вакцинь1 в про-мыилештх условии.

•¿г

ОПИСОК. РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНИИ 110 ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

I. Дкабир Г шиш к., Онуфриев В.П., Миськевич C.B., Огбу 0-, Гонга л.Е. Сравнительное изучение антигенных ' свойств пекоторнх штаммов ■ротввируса/'Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа; Всесоюзный симпозиум. Тезисы докладов г Киев, I989.~C.220.

?.. собко Г.А., Огбу 0., Галим Л., Гонка Л.И., Онуфриев р.п. Штаммовне различия ротавируса телят по размеру бляшек в культуре клеток мдбк/Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программам Всесоюзный симпозиум. тезисы докладов.-Киев, I989.-C.I37.

3. Онуфриев В.П., Огбу 0., Джабир Г.А., Скибицкий В.Г. Миськевич C.B. Определенно иммуногенности к безвредности инактивировапной вакцины против ротавируса крупного рогатого скота//Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа." Всесоюзный симпозиум. Тезисы докладов .-Киев, 1989 ."С. 222.

>и Огбу 0., Онуфриев В.П., Скибицкий В.Г., Миськевич C.B., Гонка Л.И. Опыт по шмктивировашт ротавируса крупного рогатого скота. /Находится п печати/.

5. Огбу 0. Изучение устойчивости новых эпизоотических штампов ротавируса крупного рогатого окота г; формальдегиду. ■'Находится' в нччати/,

iJo/jiHHfiro в печать 24.I0.IS90 г. Формат 00x84 1/16. Гум.гич. v 3. 7прял 100 эко. Заказ № 0:Ъ. Eocimmcn.

Печатной уччеток У!И УОА, i!!'£04I Kwn. Со.пьско},-оз«ЙС"в'?нннЯ пер., 4, ••,