Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Антигенные свойства штаммов ротавируса крупного рогатого скота, выделенных в различных регионах страны

1 ВСКСОГОШИ ОРДКНА ЛЕНИНА ИАУЧЛО-ИСОЩОВАТШХЬСШ ИИС1ИТУТ ЭКткРИМШГАЛЬнОИ ВИГИЙШАИМ имени Я.Р.КОВАЛШО (ШЭВ)

ВСЕСОЮНОИ ОРДЬМ ЛЕНИНА И ОРДША ТРУДОНОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДОМИ СШ^ШОХОЗЯЙШКНШХ ЯШ имени В. И.ЛЕНИНА (ВАСХНИД)

На правах рукописи

КАНАТОВ Бегали

ашмшшк свойства шташов роташрусл

КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, вьщшшных в РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНАХ СТРАНЫ

I6.0U.U3. - ветеринарная микробиология, вирусология) эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1991

Работа выполнена во Всесоюзном ордена Ленина научно-иссле-довательскоы институте экспериментальной ветеринарии иы.Я.Р.Коваленко.

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук Гоголев М.М.

Официальные оппоненты:

1. Доктор ветеринарных наук В.Г.Орлянкин .

2. Кандидат ветеринарных наук И.Т.Сатторов

Ведущая организация: Московская ордена Трудового Красного Знамени ветеринарная академия им.К.И.Скрябина

Защита диссертации состоится

_часов на заседании Специализированного совета Д 020.28.CI по защите диссертаций на соискание ученой сте.^нй доктора наук при Всесоюзном ордена Ленина научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им.Я.?.Коваленко по адресу: 109472, Иосква, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ШЗБ.

Автореферат разослан " —

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

; I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. В связи с концентрацией поголовья, большой плотностью размещения скота на единицу площади, постоянным притоком животных извне, погрешностями в кормлении и содержании создаются специфические условия, предрасполагающие к появлению и распространенно желудочно-кишечных болезней новорожденных телят, среди которых видное место занимает неонатальная диарея; За последние годы накоплены данные об этиологической структуре диарей. Современная специальная литература свидетельствует о том, что диарея у телят может вызываться различными вирусами, среди которых важное значение имеют ротавирусы.

В 1969 году МеЪиз С.А. и др. установили роль ротавируса в возникновении диарей новорожденных телят. В большинстве случаев при высокой заболеваемости (до 100%), летальность колеблется от 15 до 80%. За последние 10-15 лет зарегистрированы случаи обнаружения ротавирусов, вызывающих диарею у новорожденных телят во многих странах Западной Европы и других регионах планеты, в том числе и в нашей стране. Ротавирусный энтерит телят наносит животноводству большой экономический ущерб, обусловленный отходом телят, снижением привесов молодняка, затратами на лечение больных и проведение ветеринаряо-сакигврназс мероприятий.

Поэтоцу разработка эффективных мер специфической профилактики ротавируснык энтеритов является насущным вопросом настоящего времени. Однако без глубокого знания антигенных свойств возбудителя этой болезни указанную проблему решить невозможно.

Цель работы. Изучить в сравнительном аспекте антигенные свойства штаммов ротавируса крупного рогатого скота, ввделенных из хозяйств различных регионов страны.

Задачи исследований:

- выделить штаммы ротавируса от телят с клиническим проявлением диарей кз хозяйств разных регионов страны;

- получить на лабораторных: животных гипериммунные сыворотки к выцеленнь. штаммам ротавируса;

- изучить в сравнительном аспекте антигенные свойства выделенных штаммов ротавируса;

- определить степень антигенного родства, доминантность и различия выделенных штаммов.

Научная новизна. Изучены некоторые биологические свойства ротавируса крупного рогатого скота, выделенного в различных регионах страны, динамика накопления его в различных культурах клеток. Проведен электрофорезический анализ РНК штаммов ротавируса .крупного рогатого икота. Дана сравнительная оценка чувствительности реакции нейтрализации, диффузионной преципитации в ар 1е, метода иммуноферментного анализа и метода выделения вируса в культуре клеток при диагностике ротавирусных энтеритов телят. Впервые изучены антигенное родство, различия и доминантность штаммов ротавируса крупного рогатого скота, циркулирующего'среди поголовья телят в различных регионах страны. Полученные экспериментальные данные создают научную основу для разработки эффективных средств специфической профилактики с использо*"здием доминирующих штаммов ротавируса.

Практическая ценность работы. Показана широта распространения ротавирусной инфекции среда поголовья телят в различных регионах страны. Рекомендован метод определения антигенного родства, различий и доминантности штаммов ротавируса крупного рогатого скота, даны критерии их оценки. Результаты диссертационной работы вошли в "Методические рекомендаций по определению антигенного родства, различий и дойинантноети штаммов и изолятов ротавируса крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа",

которые одобрены Ученъм советом ВИЭВ.

Апробация работы. Материалы диссертационной' работы доложены -и получили положительную оценку на научной конференции ВИЭВ "Проблемы иммунологии, физико-химической биологии и биотехнологии в инфекционной патологии сельскохозяйственных животных" (1986); научной конференции молодых ученых ВИЭВ "Проблемы ветеринарной биотехнологии и инфекционной патологии животных" (1987); заседании Ученого совета ВИЭВ (1987); научной конференции КазШВИ ВО ВАСХНИЛ "Вклад молодых ученых Казахстана в решение продовольственной программы страны", посвященной 118-ой годовщине со дня рождения В.Й.Ленина (Алма-Ата, 198В); научной конференции молодых ученых КазШВИ ВО- ВАСХНИЛ, посвященной 119-ой годовщине со дня рождения В.И.Ленина (Алма-Ата, 1989); научной конференции молодых ученых Института экспериментальной биологии АН Казахской ССР, посвященной 119-летию со дня рождения В.И,Ленина (Алма-Ата, 1989), межлабораторном совещании ВИЭВ (1989).

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации опубликованы в 4-х научных работах.

Объем работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов^ выводов. Материалы диссертации иллюстрированы 17 таблицами, 6 рисунками. Список использованной литературы содержит 52 работы отечественных и 139 иностранных авторов.

* 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики вирусных желудочно-кишечных болезней крупного рогатого скота" ВИЭВ, в виварии лаборатории и на опытной базе института о.Лисий Вышневолоцкого района Калининской области в период 1984-1967 гг. ■

В опытах бьпи использованы: референтный штачм ротавируса обезьян " ад II", штаммы ротавируса крупного рогатого скота -референтна штамм "аз?" (итамм Тиверваль, Франция), отечественный штамм "РМ", выделенный из фекалий больного диареей теленка совхоза "Марьинский" Загорского района Московской области, а также семь полевых рславирусньк изслятов, ввделенных из фекалий больных диареей телят из разных регионов страны {Амурской, Новосибирской, Ярославской областей РОлСР; Киргизии, Казахстана, Молдавии, Таджикистана).

Для поддержания штаммов и ввделения ротавируса крупного рогатого скота использовали первично трипсинизированные культуры клеток почки эмбриона коров (ПЭК), почки телят (ПТ) и их субкультуры, перевиваемые линии клеток: почек коров (МДБК), обезьяны макаки-резус МА-1С-1, зеленых мартышек (линия 4647), эмбриона свиньи (СиЭВ); легкого амбриона коровы (ЛЭЮ, гибридная культура клеток - КД5-У (ШЭ£+КЗК - клеток из килечника эмбрионов коров).

Культуры клеток выращивали по общепринятой методике. Перевивку культур проводили без центрифужным методом (Сергеев В.А,, 1963; Осидзе Н.Г., Сергее 11.к. и Сушов а.В., 1964). Нервично-трипсинизированны- нультуэн клеток ¡Ш, нТ и- их субкультуры, а также диплоидную культуру (ЛЭК) и перевиваемые лиши клеток Ш8В получали в лаборатории технологии клеточных культур и питательных сред ВИЭВ; гибридную культуру леток КДЬ-У любезно предоставила Майдта Е.В., аспирантка названной лаборатории. Культуры клеток МДШ и ЙА-104 культивировали сами в лабораторных условиях. Перевиваемая линия клеток почек зеленых мартшек (4647), б^а получена из Института полиомиелита и вирусньк энцефалитов АМН СССР (любезно предоставил канд.мед.наук Хаус-тов В.И.). Вир/ссодеркацне положительные в РД[1 ми Шк пробы (суспензии фекалий и кусочков тонкого отдела киаечникив). перед заражением культуры клеток фильтровали через фильтры "Мшшипор"

с диаметром пор 0,45'Н . Использовали различные варианты обра-Сотки испытуемого материала и различные концентрации трипсина (от 15 до ЗСО нг/мл). Размножение вируса в культурах устанавливали по проявлению цитопатогенного действия (4W). а также титрованием полученного материала методом ША, РН.

Концентрирование и очистку ротавируса проводили методом ультрацентрифугирования в линейном градиенте плотности сахарозы (совместно со старшим научны« сотрудником лаборатории биофизики Г.А.Надточим); комбинированным методом (полиэгиленгликоль+сульфат аммония); фреоном 113 по общепринятой методике.

Гипериммунныа антиротавирусные сыворотки к ротавирусным антигенам получалм на кроликах по разработанным й лаборатории схемам. Гипериммунизацию проводили с интервалом 21 день.

Для у ;ентифлкации и количественного определения ротавирус-ного антигена, а также специфических антител к нему применяли реакцию диффузионной преципитации (РД1), метод иммуноферментного анализа (ИФА), для определения их инфекционных титров - титрование вируса в культуре клеток, для выявления составных сегментов двухнитевой (дн) РЖ ротавируского генома - электрофорез в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ). Постановку РД1 и И$А осуществляли в соответствии с методическими рекомендациями, разработанными в лаборатории. 93 в ПААГ ставили совместно с научными сотрудниками лаборатории молекулярной биологии и биохимии Артшиным С.К, и Гращук В.Н. по методике Xaemmii (1970). Для ввделения да РНК ротавируса очищенные вирусные частицы подвергали депротеинизации. Для этого к очищенному вирусу добавляли додецилсульфат натрия (0,5%) и инкубировали в течение 60 мин. при 37°С. Экстракцию вирусной PIK проводили стандартным фенольным методом. Профиль миграции сегментов двухнитевой РНК получали диск - электрофорезом в слое 10% разделяющегося полиак-. риламидного геля.

- б -

Степень антигенного родства, доминантность и различия между штаммами и изоляташ ротавируеов определяли по результатам РН, РДП, ИФА. Дгь вычисления степени антигенного родства использовали формулу Архетти и Хорсфалла (i960); доминантность вычисляли по формуле, описанной. Кореа и соавт. (1971); для определения различий использовали формулу Прискока В.А, (1983).

Всего по серологическим реакциям исследовано с повторностью 253 пробы вируссодержащей культуральной жидкости, 375 проб фекалий, 42 пробы кишечников от павших телят, 38 проб сывороток крови телят, Ь7 проб молозива и 103 пробы сывороток крови от коров-матерей из 35 хозяйств 12 регионов страны. В проведенных вкспериментах использовали 21 кролика, двух телят.

Статистическую обработку полученных результатов проводили • по общепринятым методам (Сюрин В.fl., 1966; Лакин Г.Ф., 1930; Лярски 3., 1980).

3. РКЗУЯЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Выделение и идентификация ротавируса от крупного рогатого скота и специфических антител к нему.

3.I.I. Сравнительная оценка реакции диффузионной преципитации и метода иммуноферментного анализа для обнаружения рота-вирусного антигена п специлчческих ентител к нему.

Дяя сравнения и оценки методов ИФА и РД1 параллельно исследовали 252 пробы, в том числе 218 проб фекалий, Iii проб кишечников от павших с признаками диареи те..,гг, 5 проб сывороток крови от больных телят, 14 проб сывороток крови от коров-матерей из 24 различных хозяйств восьми регионов.

Результаты исследований проб материала, отражены в таблЛ.

Таблица I

Обнаружение ротавирусного антигена и специфических антител к нему методами РД1 и ИФА

^ ¡Регионы

ПП. | !

¡Животные)Мате- | Результаты исследований

I риал | ! !

РД1 ! ИФА

IВсего|Пол¡Отр(Всего]Пол ¡Отр

I. Амурская обл. Телята Фекалии 26 20 6 26 22 4

2. Кишечники 4 4 0 ' 4 4 0

3. Молдавская ССР Фекалии 5 4 I 5 4 I

4. Таджикская ССР' 14 8 б 14 8 6

5. Коровы Сыворотки крови • 2 I I . 2 I I

б. Яросла-окая оол. Телята Фекалии 3 2 I 3 . 2 I

7. Магаданская • обл. \ 5 I 4 5 I 4

8. Московская обл. 117 29 68 117 26 91

9. Кишечники II 2 9 II 7 4

10. Сыворотки крови ■ 5 [ I 4 5 4 I

И. Коровы 12 5 7 •12 ' 12 0

12. Киргизская ССР Телята Фекалии 20 9 II 20 9 II

13. Украинская ССР 28 17 II 28 21 7

252 103 149 252 40,958 59, 121 48£ 131 5235

Кз данных таблицы I следует, что результаты исследований в РД1 и в ИаА, в основном, различаются незначительна. Так, из 252 проб материала от телят оказались положительными в РД1 - 103 (40,9%), а в ИМ - 121 (4835). В 80,6% исследований результаты ША и РД1 совпали. Однако, имели кесто и отдельные расхождения. Так, в одном случае в РД1 получено больше, а в ИФА меньше положительных результатов. В то же время в пяти случаях методом ИФА выявлено больше положительных проб. Учитывая, что в обеих реакциях исследовался один и тот же патологический материал, можно говорить о более высокой чувствительности метода ИФА по сравнению с РД1. Не совпадение результатов исследований отдельных проб материала в РД1 и И5А не сказало влияния на установление группового диагноза на ротавирусные энтериты телят по хозяйствам в целом.

3.1.2. Выделение ротавируса в культуре клеток

Культивирование ротавируса является трудоемким, и не всегда успешным процессом. Вопросы стабильного размножения вируса в культуре клеток и использование его как метода диагностики до скх пор остается открытым.;.

В задачу наши: иссяепований входило определение возможности выделения-ротавируса из фекалий больных ьоворождинных теля и изучение его некоторых биологических свойств. В качестве материал для выделения ротавируса использовали фек.а. .и от больных диареей и кусочки тонкого отдела кишечника павших телят. Всего использовано 28 проб из 8 регионов, в гом числе 24 пробы фекалий и 4 пробы кишечников от павших телят с клиникой "диарея". Из фекалий и ра- .ертых проб кишечника готовили 10-20& суспензии на среде Игла. После екстракции в течение 2-3.часов суспензии центрифугировали при 6000 об/мин и фильтровали через фильтры "М'.илипор" с диаметром пор 0,45-,-м . В отдельных случаям материал обрабатывали антибиотиками (пенициллин, стрептомицин) в концентра

ции 1000 Ед/мл. Вирусоввделение осуществляли с применением трипсина различной концентрации. Контролем служили незараженные культуры клеток, а также культуры, зараженные ротавирусом шт. "РМ".

В результате проведенных исследований было установлено, что в 835? зараженных фильтратами культурах клеток на 2-3 сутки культивирования отмечалось развитие Ц11Д, проявляющегося в образовании зернистых округлившихся клеток, отслаивающихся от стекла, разрежении монослоя. Через 72 часа культивирования все зараженные культуры тривды промораживали и этим материалом заражали свежие культуры клеток. Таким образом, было проведено по 5 пассажей материалов. После'каждого пассата материал титровали в ША независимо от проявления ЦПД. В третьем пассаже количество проб,, вызывающих ЦПД, снизилось до 28%, а к 5-му пассажу осталась лишь I проба, из которой и был выделен вирус идентифицированный как ротавирус. Исследование в ИМ промороженных суспензий различных пассажей показало, что к 3-му пассажу практически все пробы показывали отрицательный результат, несмотря на высокие титры исходных материалов. Выборочные результаты исследований отражены в таблице 2. Из таблицы видно, что большинство испытуемых проб, положительных по ротавирусу, пассировали з культуре клеток легкого эмбриона коровы. На указанной культуре ни в одном случае не удалось изолировать ротавирус, хотя в первом пассаке отмечалось развитие ЦОД в 87% проб. Малочувствительной для выделения ротавируса оказалась и культура МДБК. Наиболее приемлемой [угя этих целей оказалась перевиваемая линия клеток почек обезьяны (4647). Изолированный штамм ротавируса, обозначенный нами как "РК", в дальнейшем адаптированный к культурам МДБК, ЛЭК, СПЭВ, вызывает' через 36-48 часов во Есех культурах четко выраяенноа |1Д, которое так же как и при пассировании шт. "РМ", проявляется'

Таблица 2

Выделение ротавкруса в различных культурах клеток. Титры выражены в (М + т )■"

Регионы: : Молдавия Таджикистан Казахстан Амурская оол. Московская обл. Ярославская Новосибир- Киргизия обл. ска" обл.

Пробы Кишечник Ф Е К А Л И И

Титры РДД 0,71 0,76 0,52 0,69 0,78 - 0,90 0,67 .1,04 1,04

исходного +0,16 +0,14 +С,С ' +0,15 +0,16 ±0 +0,37 +0,001 +0,001

материала ИФА 1,58 1,50 1,60 1,74 .2,73 3,41 1,35 2,41 2,5

+0,13 +0,17 ±с, л +0,18 +0,38 +0,001 +0,53 +0,001 +0

I пассаж лэк ЛЭК ЛЭК МА 104 ЛЭН ЫДг^С ЛЭК.4647 КД о-У лэк ЛЭК ЛЭК.ПЭК КК 4647 1 ьч

ЦЯД 50% 20% 100% 0 25% 10 0% 100% 100% 100% 1

РД1 0 • 0 0 0 0 0 0 . 0 0

И«А 0,15 0,06 0,45 0,39 0,07 ' 0,60 0,60 0,30 1,04

+0,001. +0 +0 +0,001 • +0 ±0 +0,001 +0 +0,001

2 пассаж ЛЭК • ДЭК . ЛЭК ЛЭК • ЛЭК.4647, КД 6-У ЛЭК ЛЭК Г1'Г,ПЭК КК 4647

цзд 75% 20% 20% 0 0 50% 50% 50% . 100%

РДО . 0 0 0 0 0 0 Оь 0 . 0

ш •' . 0 0 0 0,3+0 0 0,30+0 0,30+0 0,15+0 1,04+0

I 2 3 4 5' 6 7 6 9 10

Продолжение таблицы 2

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10

3 пассаж' лэк лэк- ЛЭК,ГШ лэк ЛЭК,464?, КД 5-У ЛЭК, шэа лэк.пт пт.пэк лэк КК.4647

№ 10% 0 0 207* 0 0 20% 20% 100%

РДО 0 0 0 0 0 и 2 0 0

И 2А 0 0 0,15 ±0 0,60 +0 0 0 0 0 1,04 +0

4 пассаж ■ лак ЛЭК ЛЭК,[¡ЭК лэк ЛЭК,4647, КД 0-у лэк . ОШ лэк.пт пт.пэк, ЛЭЙ КК 4647

ВДД о 0 - 0 0 0 0 0 0 100%

0 У 0 0 0 0 0 V 0

ЙША 0 0 0 0 и 0 . 0 и 0,90+0

5 пассаж лэк лэк лэк,пак лэк ЛЭК,464?, ад 5-у лэк, . С!Ш лэк.пт пт.пэк лэк ЛЭК.4747 вдвй.аш

тд 0 0 0 0 0 и 0 0 ЮиГ»

РД" и 0 0 о 0 0 и 0 0

ИОД 0 0 и и 0 0 0 0 +0,99 "о

в формировании зернистых округлившихся клеток, отторгавшихся от стекла, и образовании "окон" в монослое. Титр изолята "РК" в 16-ом пассаже на культуре клеток СПЭВ составлял 1,81в ИМ; и 3,06 1вТЦ%) - на культуре клеток СПЭВ.

Таким образом, наиболее пригодными- для вьделения ротавиру-сов оказались культуры клеток обезьяньего происхождения. Культуры ЛЭК, МДБК и СПЭВ можно использовать для массового культивирования изолированных штаммов ротавирусов.

3.1.3. Динамика накопления выделенного штамма "РК" ротавируса телят в различных культурах клеток

Для изучения степени накопления изолированного шт. "РК" использовали культуры клеток ЛЭК, МДЕК, МА-104 и СПЭВ. Культивирование вируса 14-го пассажа проводили в стационарных условиях с добавлением трипсина в рабочей дозе (15 мкг/мл) в поддерживающую среду. Проведено по 3 последовательных пассажа в каддой культуре клеток. Уровень накопления виру-а определяли титрованием методом ИФА.. Для сравнения использовали шт. ротавируса "РМ". Проведенные исследования показали, что оба штамма одинаково размножались в культуре клет-к МДЕК. Однако, наибольшие титры • ротавируса штамма "РК" получены на культуре СПЭВ, а штамма "РМ" - на культуре ЛЭК.

3.1.4. Электрофоретипы разных штаммов и изолятов ротавируса

В последнее время при идентификации и классификации ротавирусов широкое распространение получил метод элехтрофоретического типирования. Целью настоящего исследования было изучение электро-форетипов (Э2-типов) ротавирусов крупного рогатого скота из. разных регионов страны. Для сравнения в качестве эталонного штамма использовали обезьяний ротавирус Б А II. Данный вирус пассировали на перевиваемой культуре клеток почек свиньи (линия СПЭВ). Телячьи ротавирусы пассировали на перевиваемой культуре клеток легкого эмбриона коровы. В поддерживающую среду вносили

трипсин в рабочей концентрации.

Всего исследованию подвергнуто 10 штаммов и изолятов. Из

них в 9 определен профиль миграции сегментов двухнитевой РНК

(„„ РШ) генома ротавирусов. Следует отметить, что в одной пробе дн

8) не удалось выявить элекгрофоретип, несмотря на то, что в предварительных исследованиях по РД1 и ИМ она показала положительный результат. Среди изученных профилей нами выделено 6 различных ЭФ-типов ротавирусов. Анализируя выделенные Sí-типы, мы придерживались классификации электрофоретипов, предложенной Lourenco M.H., 1981. В-соответствии с ной ÍI фрагментов дН РШ делятся на 4 группы. Полосы, соответствующие фрагментам 1-4, обозначены как группа I, фрагментам 5-6 - как группа Ц фрагментам 7-9 - как группа III и фрагментам 10 и II - пак группа 1У. Различия в относительной миграции полос Pi К внутри группы обозначены строчным* буквами.

В результате проведенных исследований установлено, что наибольшее количество вариаций обнаружено в I и III группах сегментов. При анализе 3£-типов выявлены только "длинногеномные" ЭФ-типы, т.е. у них 10-й и II-й фрагменты мигрировали вместе с 10-м и II—м фрагментами вируса S А II,

Анализируя полученные результаты, сравнивая электрофоретипы штаммов ротавируса телят, выделенных из различных регионов страны, мы пришли к выводу, что в налей стране циркулируют "длинногеномные" электрофоретипы ротавируса телят.

3.2. Изучение антигенных-свойств штаммов ротавируса крупного рогатого скота, выделенных в различных регионах страны

3.2.1. Получение гипериммунных антиеывороток к различны* штаммам ротавируса.

Для получения гипврйммунных сывороток к вьщвленным рота'ви- . русныи штаммам и изодятам, использовали кроликов весом 2,5-3,5 кг. Предварительно культуральные ротавируснью антигены (1-го пассажа)

концентрировали двухфазным методом {7% полиэтиленгликоль, м.в, 6000+34,3$ сульфат аммония на I л жидкости). Титры рогавирусных антигенов в РДП после концентрирования двухфазным методом повысились в среднем в 2,5 раза по сравнению с исходным титром, в ИФА - в 4,5 раза. Один препарат (ротавирусный антиген из Казахстана, выделенный из фекалий больных телят) дополнительно очищали фреоном 113 по общепринятой методике.

К концентрирозанньы препарата;.; добавляли стерильный масляный ■ адьюваьгг (87$ минеральное масло, 13$ ланолин) в равном объеме и гомогенизировали. До иммунизации сыворотки крови кроликов проЕзряли на наличие ротавирусньк антител. Подопытных кроликов, не имеющих ротавирусных антител, разделили на 10 групп. Отрицательной культуральной суспензией без вируса (концентрированной, с масля--чм адьюэантом) иммунизировали животных контрольной группы. Препараты вводили подкожно и внутримьшечно по I мл каждым способом. Через 21 день после I иммунизации, подопытных кроликов повторно иммунизировали тем же способом и через 14 дней после II иммунизации подопытных кроликов тотально обескровливали. Полученные сыворотки хранили при -20°С. Результаты проверки антисыаороток на активность представлены в табл.3.

Как видно из таблицы полученные антисыворотки имели достаточно высокую активность: их титры составляли от 2,75xg до . 4.811е .

3.2.2. Изучение антигенных свойств штаммов и изолятов в У1Ш, РДП, РН

Для исключения неспецифического фона при посгановке ИМ предварительно из антисывороток, полученных к разным ротавирусам, вуделяли глобуливдвую фракции высаливанием сульфатом аммония по общепринятой методике. С этой же целью при постановке РДП, рота-вирусы, на которые получены антисыворотки, очищали в градиенте плотности'(20 , 40 и 60%) сахарозы. После этих операций материал-перекрестно исследовали в РН, РДО, ИФА. В РН титры сывороток

крови с гетерологичными вирусами во всех случаях достоверно ниже, чем с гомологичным. Однако, разница в титрах колеблется в пределах от 1,2 раза (сыворотка на ротавирус ЭАП с ротавирусом РМ) до 3,2 раза (сыворотка на ротавирус РМ и РК с ротавирусом ЗА II). Разница в титрах антител к ротавирусам РМ и РК в перекрестной Рг1 колеблется в 1,5 - 2,0 раза.

Учитывая, что в РИ можно испытывать только шгаммы и иэоляты ротавируса, которые вызывают Ц11Д, нами проведено исследование гипериммунных сывороток крови перекрестно в реакции диффузионной преципитации в агаре и методом иммуноферментного анализа.

Результаты титрования антител в РД1 незначительно отличались от таковых, полученных ранее в РН. Так, разница в титрах антител к ротавирусам РМ и РК з перекрестной РД11 не превышала 1,6 и 3,6. раза что близко к результатам, полученным в РП. Аналогичные результаты получены и при исследовании гипериммунных сывороток в И$А.

РД1 и ИМ позволили провести перекрестныз исследования сывороток крови и иммуноглобулинов из них, полученных на изоляты ротавируса плохо культивирующиеся или не культивирующиеся в перевиваемых культурах клеток.

Результаты этих исследований показали, что степень реагирования специфических антител с различными атаммами и-иэолягами ротавируса колеблется в широких пределах. Разница в титрах специфических антител, определенных с различными штаммами ротавируса достигала 20-32 раза в РД1 (титр сыворотки на'РМ и РК со штаммами изолированными в Таджикской и Казахской "ЧР, Ярославской области) и 7,2 - 8,5 раза в ИФА. Б то же время сыворотки к штаммам "РТаджикский", "РЯрославский", оттитрованные с ротавирусом "РМ" показали более высокие титры, чем с гомологичными вирусами.

Таким образом, анализ результатов, проведенных исследований показал', что в различных регионах и хозяйствах страны циркулируют

Таблица 3

Активность гипериммунных сывороток, полученных к ротавирусу крупного рогатого скота /в ^ М + т /

пп. Наименование препаратов После I иммунизации После П иммунизации

РД1 Мк РДО Мк

Р <0,001 Р> 0,001 Р> 0,001 Р> 0,01

I. Культуральная жидкость без вируса, конц., с масл.адъюв. 0 0 0 0

2. Шт."РМ",концен.', очиц. с масляным адьювантом 2,51 +0,10 4,41 • ¿0,30 2,63 . ±о;о7 5,01 +0,01

3. Изолят.ротави-рус "Киргизский" 1,70 +0,10 4,11 2,01 +0,06 4,81 +Р:Ю

4. Ротавилусный антиген "Амурский" 0,60 +р;н 2,15 +0,15 1,65 +0,15 3,35 +0,15

5. "Казахский" 0,77 +0|2б 2,30 ¿0,29 0,95 +р!з5 • 3,96 +0)15

6. очищенный доп. фреоном 113 0,90 +0,01 2,15 +0,15 1,81 ±о;о1 4,11 +¡0,01

7. "Новосибирский" 0,15 +о;о1 1,70 ±0,01 0,60 ±0*01 2,75 +0,15 ■

8. "Молдавский" 0,27 ±0,07 1,85 1,45 ¿3,22 3,20 +р!о!

9. "Таджикский" 0,94 +0,07 2,60 +0|01 1,70 ¡р|20 3,65 ±0^15

10. "Ярославский" 1,18 ±0|21 2,75 ±0,01 2,11 ±о|зо 3,65 +0,45

штаммы ротавируса крупного рогатого скота отличающийся в антигенном отношении дчуг от друга.

3.2.3. Антигенное родство, различия и доминантность

различных штаммов и изолятоа ротавируса крупного рогатого скота.

Антигенное родство, доминантность и различия между отечественным штаммом "РМ", референтным штаммом " НУ " ротавируса крупного рогатого скота и штаммом " ЗА II" ротавируса обезьян, а также 7-ю изолятами крупного рогатого скота, выделенными из разных регионов страны изучали по результатам трех реакций: Рн, РДО и ИФА. Учитывая литературные данные и результаты собственных исследований для оценки антигенного родства были взяты следуицие критерии (параметры):

При родстве 50$ и выше считали штаммы и изоляты идентичными от Ь% до 50$ - антигенно родственными в разной, степени, до 5% -антигенно различными. Расчеты проводили в абсолютных числах, а не в логарифмах.

При сравнении трех реакций (РН, РД1, ИйА) отмечена высокая чувствительность И$А. Известно, что ротавирусн имеют дье специфичности: видовую, которая выявляется в РН, и групповую (по>;-групповую), которую обнаруживают в ИФА и ИД1. В дальнейшем дая изучения антигенных свойств штаммов и изолятов ротавируса исполь-. зовали ИФА в связи с тем, что остальные изоляты ротавируса крупного рогатого Скота не размножались в культуре клеток, а при сравнении с РД1 эта реакция обладает большей чувствительностью;

« Анализ полученных результатов показывает, что все изучаемые штаммы и изоляты ротавируса антигенно родственны или идентичны, ' однако степень антигенного родства колеблется в довольно широких пределах, от 15,6%. до 56,1$ при исследовании в РД1 и от 18% до -91% - в.-ИФА, Изучаемые штаммы и изоляты имеют также разнуп степень

доминантности друг над другом. Так, иэоляты "Таджикский", "Казахский" доминируют лишь над 2 и 3 из 10 штаммов и изолятов ротавируса, выделенных в различных регионах страны. Наибольшей доминантностью обладают штаммы "РК" (над всеми изученными) и "РМ" (над 6 из 10). Высокой доминантностью обладают и некоторые изоляты ротавируса. Так, изолят "Новосибирский" доминирует над 9 другими штаммами и изолягами ротавируса, а изоляты "Ярославский" и "Амурский" такие свойства проявляют к 7 другим штаммам и изолятам ротавируса. В то ие время обезьяний штамм ротавируса " ЗА II" доминирует лишь над ротавирусом крупного рогатого скота "Казахский" и " (Франция), а ротавирус "К? " не доминирует ни над одним из изученных штаммов и изолятов.

Анагчз данных показывает, что степень антигенного различия зависит от степени антигенного родства штаммов и изолятов. Идентичные штаммы и изоляты показали антигенные различия менее 50%.' В то же время антигенные различия родственных штаммов и изолятов колебались в пределах от 50% до 90%.

Таким образом, зсе изученные штаммы и изоляты ротавируса)1 выделенные в различных регионах страны имеют различные степени антигенного родства и различий, но принадлежат к одной антигенной подгруппе ротавирусов - первой.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружение ротавируса и специфических антител в пробах материала от больных диареей телят и переболевших животных из 35 хозяйств разных регионов страны свидетельствует о широком распространении этой инфекции среди крупного рогатого скота.

2. ИФА и РД1 являются специфическими методами обнаружения ротавируса и специфических антител в испытуемом материале и дают совпадающие результаты в 80,6% случаев.

Дня постановки группового диагноза оба метода оказались одинаково пригодными. Метод иммуноферментного анализа обладает более высокой чувствительность», однако реакция диффузионной преципитации более проста в исполнении.

3. Из фильтрата фекалий больного диареей теленка в культуре клеток обезьяньего происхождения изолирован вирус, который идентифицирован в серологических реакциях как ротавирус, Указанный штамм ротавируса адаптирован к культурам клеток ИДИ, ЛЭК и СПЭВ,

4. Наиболее пригодными для ввделения ротавируса оказались культуры клеток обезьяньего происхождения. Культуры ЛЭК, МДйС и СПЭВ можно использовать для массового культивирования изолированных штаммов ротавируса.

5. Геном изученных штаммов ротавируса крупного рогатого скота представлен XI сегментами дн РШ, характеризуемыми их принадлежность к роду ротавирус. По типу миграции двух последних сегментов РШ рогавирусы нрупного рогатого скота относятся

к "длинногеномным" электрофоретипам ротавирусов.

6. Наделенные в разных регионах страны штаммы ротавирусов имели различную степень антигенного родства и доминантности. Среди 7 исследованных штаммов доминировали штаммы "РК" и РМ".

7. Метод иммуноферментного анализа является наиболее специфичным и чувствительным для изучения подгруппового антигенного родства,- различий и доминантности штаммов ротавируса.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРВДЯОЖШЯ * Полученные нами результаты вошли в "Методические рекомендации по определению антигенного родства, раз.- .чий и доминантности штаммов и изолятов ротавируса крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа", одобренные Ученым советом ШЭл 5 октября 1989 г., протокол № 22.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Канатов Б. Изоляция и культивирование ротавируса крупного рогатого скота // Бюллетень ШЗй. - Выпуск 66. - М., I98B. -с. 17-19.

2. Канатов 3. Сравнительная оценка реакции диффузионной преципитации и метода иммунофер^ектного анализа для обнаружения рота-вирусного антигена у телят // Бюллетень ШЭВ. - Выпуск 68. -И., 1988. - С.29-32.

3. Канатов Б., Гоголев М.М., Артшин С.К., Гра1дук В.Н. Электро-форетипы ротавирусоа телят // Депонирован в ШШНИ. М., 1990. -» 4 (222U - C.I44.

4. Кана'.jb Б., Гоголев М.М., Макова JI.A. Получение гипериммунных сывороток к различнш ротавирусам и изучение их специфичности // Актуальные вопросы вирусологии. Тезисы докладов научно-теоретической конференции молодых ученых. - Владимир, 1990. - С.17.

/

Подасадо .в печать 15.08,91р. Заааз 597 Формат 60x90/16 Тира* НО '

Москва. Типография ВАСХЕШ