Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка и совершенствование экспресс-метода индикации листерий

На правах рукописи

УДК 619:579.869.1:616-078

Фирсова Татьяна Евгеньевна

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭКСПРЕСС-МЕТОДА ИНДИКАЦИИ ЛИСТЕРИЙ

- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Щелково - 2005

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Котляров Виталий Михайлович

Масимов Нусрат Абулфат-оглы Пономарев Виктор Николаевич

Ведущее учреждение: Федеральное Государственное учреждение "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГУ ВНИИЗЖ), г. Владимир, пос. Юрьевец.

Защита состоится « июня 2005 г. в 10°° часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 141142, Московская область, Щёлковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбинат.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « /Г» мая 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

^ CXV^/__Ю.Д.Фролов

гжё5~

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Листериоз зарегистрирован во многих странах мира. У животных он проявляется как в единичных случаях, так и эпизоотией. Листериоз чаще всего регистрируют у овец, реже у крупного рогатого скота и свиней. На территории России за период 1956 - 1996 гг. было зарегистрировано 6153 неблагополучных по листериозу хозяйств, из них: 4970 - овцеводческие, 338 - скотоводческие, 845 - свиноводческие. В 2000 г. в России было выявлено 47 неблагополучных хозяйств, в которых заболело 1207 животных; из них пало - 444. Аналогичная ситуация наблюдалась и в последние годы.

В РФ сведения о заболевании людей листериозом как пищевой инфекции начали учитывать с 1992 года. В 1992-1999 гг. зарегистрировано 447 случаев листериоза людей, в том числе 119 - в Москве, 120 - в Ивановской области, 71 - в Тульской, 37 - в Волгоградской. В конце 20-го столетия в Канаде, Франции, Мексике, Великобритании, Швейцарии, США зафиксирован ряд крупных вспышек листериоза с высоким уровнем смертности при употреблении пищевых продуктов животного происхождения (молоко, молочные продукты, мясо, мясные продукты, яйца птиц), контаминированных листер иями.

Для ранней диагностики заболеваний, вызванных разными микроорганизмами, первостепенное значение имеет обнаружение возбудителя в патологическом материале и специфических антител в сыворотке крови. Основное значение при этом приобретают экспресс-методы.

Род Listeria представлен семью видами листерий, однако патогенными являются только два: L. monocytogenes и L. ivanovii. Согласно СанПиН при выделении листерий необходимо идентифицировать L. monocytogenes.

Биологические свойства различных видов листерий близки и поэтому идентификация L. monocytogenes в исследуемом материале часто затруднена вследствие морфологических и биохимических особенностей возбудителя листериоза.

Предлагаемые ранее серологические методы не удовлетворяют полностью запросам практических врачей из-за необходимости приобретения дорогостоящего оборудования, сложности постановки реакций и многочисленных контролей к ним, а иногда и недостаточной специфичности получаемых результатов.

Учитывая возрастающую потребность практики в диагностических препаратах и необходимость выполнения микробиологического анализа с целью индикации листерий в пищевых продуктах и биоматериалах, целесообразность разработки и усовершенствования экспресс-метода является актуальной.

Простота реакции латекс агглютинации (РЛА) с латексными диагностикумами позволит решить данную лль«лТ1делило

выбор темы и направление исследований. I библиотека ]

' L

1.2. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка чувствительного, быстрого и несложного в выполнении и учете результатов метода индикации листерий и обнаружения антител к ним на основе полимерных микросфер (латексов).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить антигены листерий как в виде очищенных живых и инактивированных бактерий, так и цитоплазменных после разрушения бактерий ультразвуком.

2. Получить из гипериммунных сывороток разных видов животных специфические к листериям антитела.

3. Провести подбор микросфер и выбрать образец для приготовления латексных диагностикумов.

4. Отработать технологические параметры иммобилизации листерийных антигенов и антител на полимерных микросферах и изготовить экспериментальные образцы латексных диагностикумов.

5. Провести сравнительную оценку чувствительности, специфической активности, стабильности полученных серий иммунохимических латексных диагностикумов в реакции латекс агглютинации и тест-систем для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА).

6. Оценить новые латексные диагностикумы для экспресс индикации листерий, а также для выявления листерийных антител в сыворотках крови животных.

1.3. Научная новизна. В результате проведенных исследований впервые разработана методика получения латексных диагностикумов на полимерных микросферах с реакционноспособными альдегидными группами для экспресс метода индикации листерий и обнаружения антител к ним.

Проведена сравнительная характеристика экспресс метода индикации листерий и обнаружения антител к ним в РЛА и РИГА.

Усовершенствован иммуноферментный метод индикации листерий.

1.4. Практическая значимость. Результаты проведенных исследований позволили разработать антигенные латексные диагностикумы для выявления листерийных антител в сыворотках крови больных или переболевших животных и антительные латексные диагностикумы для экспресс индикации листерий в различных биоматериалах.

Разработаны инструкции по изготовлению антигенных и антительных латексных диагностикумов и методические рекомендации по их применению с целью экспресс индикации листерий и обнаружения антител к ним.

Внедрение в практику разработанных средств и методов индикации листерий и обнаружения листерийных антител позволит сократить время проведения экспертизы и повысить результативность диагностики.

1.5. Положения выносимые на защиту.

1. Технологические принципы изготовления латексных диагностикумов на основе листерийных антигенов и антител.

2. Экспресс-метод на основе полимерных микросфер (латексов) для индикации листерий и обнаружения антител к ним.

3. Результаты изучения чувствительности, специфичности, стабильности полученных серий иммунохимических латексных диагностикумов в реакции латекс агглютинации в сравнении с аналогичными тест-системами для РНГА.

1.6 Апробация результатов работы. Результаты, представленные в диссертации, доложены на научно-практических конференциях ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (г. Покров) 2001-2004п\; совещании научных сотрудников ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 23.12.2004 г.; на заседании ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 20.01.2005г.

Проведены комиссионные испытания диагностикумов для постановки реакции латекс агглютинации и иммуноферментного анализа (ИФА) для экспресс-индикации листерий и листерийных антител.

1.7 Публикация результатов. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе в центральных научных журналах, материалах международных научно-практических конференций, а также в материалах XV Международного симпозиума по проблемам листериоза (ISOPOL XV, Уппсала, Швеция, 2004 г.).

1.8 Участие соискателя в получении научных результатов. Основные разделы диссертационной работы были выполнены лично автором. Разработки антительных и антигенных латексных диагностикумов осуществляли совместно с сотрудниками лаборатории "Прионных болезней".

1.9 Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 стр. машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей, 6 схемами, 1 фотографией и дополнена приложениями. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования (материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов исследований), выводы, практические предложения, список литературы, приложения, содержащие документы, подтверждающие практическую значимость работы. В списке литературы 150 источников, в том числе 73 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в 2001 - 2005 гт. в лаборатории "Бактериология" Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук по программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2000-2005 г.

2.1. Материалы и методы

2.1.1. Материалы

Микроорганизмы. В работе использовали эталонные штаммы листерий: Listeria monocytogenes: штамм 766 (1 серогруппа), штамм 634 (2 серогруппа); L. ivanovii, L. seeligeri, L. grayi, L. murray, L. innocua, L. welshimeri. Полевые изоляты листерий, выделенные из продуктов питания, патологического материала, объектов окружающей среды. Штаммы других видов бактерий: Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Контрольные штаммы получены из музея лаборатории "Бактериология" ГНУ ВНИИВВиМ. Всего было исследовано 156 изолятов.

Животные. Использовали: белых мышей весом 12 - 14 г в количестве 250 гол; кроликов весом 2,5 - 3 кг в количестве 140 гол; морских свинок весом 250 - 300 г в количестве 150 гол.; свиней весом 20 - 35 кг в количестве 2 гол.; лошадь в количестве 1 гол; куриные эмбрионы 5-7 суточного возраста в количестве 130 штук.

Содержание и кормление животных проводили согласно принятым нормам.

Латексы. Для приготовления латексных диагностикумов в качестве носителя использовали полиакролеиновый латекс (10%-ная суспензия) двух типов частиц с различным диаметром: первый - 0,7 - 0,9 мкм и второй -1,4 - 1,5 мкм, представляющие собой суспензию из частиц ярко розового цвета, приготовленные в институте биоорганической химии имени М.М. Шемякина, Ю.С. Овчинникова, г. Москва.

Антигены. Для иммунизации животных и получения гипериммунных сывороток; получения латексных антигенных диагностикумов; для определения активности и специфичности антительных латексных и эритроцитарных диагностикумов использовали антигены, полученные из листерий шт. 766 (1-я серогруппа) и 634 (2-я серогруппа): 1) цельные микробные клетки - живая культура и инактивированная формалином; 2) цитоплазменный антиген после разрушения бактерий ультразвуком на дезинтеграторе Soniprep-150. Антигены стандартизировали по следующим показателям: концентрация микробных клеток в 1 мл по стандарту мутности (ГИСК им. Тарасевича) и содержанию белка.

Сыворотки получали путём иммунизации разных видов животных. Антиген цельных микробных клеток, инактивированных формалином вводили кроликам по следующей схеме: в концентрации 3 млрд. м.т./мл вводили внутривенно в объёмах 2; 4; 5; 5,5 мл на одну инъекцию. Интервал между инъекциями составлял 5 дней. Через 6-7 дней после последней инъекции АГ проводили кровопускание. Полученные сыворотки исследовали в РСК и РА. Титры антител, выявляемые в РСК, составляли 1:160- 1:640; в РА - 1:64-1:2560.

В опытах были также использованы сыворотки от иммунизированных листериями и не иммунизированных (интактных) кроликов, свиней и лошадей; сыворотки листерийные агглютинирующие: поливалентная, серогрупповые (1-ой и 2-ой серогрупп); сыворотки сибиреязвенные и

б

колибактериозные от крупного рогатого скота. Всего было исследовано 508 проб сывороток крови животных.

Эритроцитарные диагностикумы. Использовали экспериментальные серии антигенных и антительных листерийных эритроцитарных диагностикумов, изготовленных сотрудниками лаборатории "Бактериология"

Питательные среды. Для культивирования и выделения листерий использовали простые и селективные питательные среды отечественных и зарубежных фирм: МПА, МПБ, бульон Фрезера, агар Палкам. Посевы культур, патологического и клинического биоматериала, объектов окружающей среды проводили согласно «Методическим рекомендациям по лабораторной диагностике листериоза животных и людей», утверждённым Минсельхозом и Минздравом России (1996г.), а исследование пищевых продуктов - согласно ГОСТ Р 51921 -2002.

2.1.2. Методы

Микроскопическое исследование. Мазки-отпечатки из патологического материала животных; изоляты культур микроорганизмов, выделенные из продуктов питания, объектов окружающей среды, грызунов, и смывов, окрашивали по Граму.

Идентификация возбудителя. Применяли общепринятые классические методы выделения возбудителя листериоза: посев на индикаторные и селективные питательные среды, определение подвижности, гемолиза, ферментативных свойств; проба на каталазу, определение чувствительности листерий к бактериофагам. Серо групповую принадлежность выделенных штаммов листерий определяли с помощью листерийных сывороток в пластинчатой РА и листерийных бактериофагов согласно наставлениям.

Биологическое исследование проводили на морских свинках, белых мышах и куриных эмбрионах. Качественную оценку вирулентности листерий осуществляли по результатам конъюнктивальной пробы на морских свинках путем нанесения на конъюнктиву глаза животного испытуемой бульонной культуры. При высокой вирулентности штаммов листерий у морских свинок появлялся конъюнктивит на 2 - 3-й день, при низкой - на 7 - 10-й день.

Количественную оценку вирулентности проводили путем заражения 5-7- дневных развивающихся куриных эмбрионов. Культуру листерий в концентрации 10 млрд. м.т./мл титровали с 10-кратным шагом в забуференном физиологическом растворе (ЗФР). Заражение проводили в аллантоисную полость из разведений 10"5 - 10 по 0,1 мл, используя на каждое разведение 4 эмбриона. Параллельно из каждого разведения суспензии делали высевы на агар, который выдерживали при температуре 37°С в течение 24 - 48 часов, а затем подсчитывали колонии листерий (для контроля количества микробных клеток, вводимых в каждый эмбрион). Белых мышей-сосунов (7-8 дневного возраста) заражали подкожно по 0,2 мл каждым разведением, используя по 4 мыши. Специфичность гибели куриных эмбрионов и белых мышей проверяли посевами на МПА и МПБ с

последующей идентификацией выделенных листерий. Расчёт летальной дозы, дающей 50% эффект (1ЛЭ50) проводили по методу Кербера.

Выделение иммуноглобулинов проводили методом солевой преципитации насыщенным раствором сульфата аммония с последующим центрифугированием и диализом по методике Р.Ь. Еу е! а1. (1978).

Определение концентрации белка проводили по методу Ьоиту (1951).

Эксперименты проводили с числом повторностей (п>=3). Статистическую обработку результатов исследований осуществляли методом наименьших квадратов, принятым в биологии (Лакин Г.Ф.).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Разработка латексного антительного диагностикума (Л -ЛТД) и постановки реакции латекс агглютинации

Изучение образцов латексов показало, что наилучшей адсорбционной способностью обладал полиакролеиновый латекс (10% суспензия) с размером частиц 0,7 - 0,9 мкм. Для определения оптимальной концентрации иммуноглобулинов (ИГ) для присоединения их к поверхности латексов были сделаны опытные образцы диагностикумов. Поскольку мы не имели иных характеристик альдегидных латексов кроме концентрации (10 %) и размеров сферических частиц, мы выравнивали концентрацию всех полученных специфических листерийных иммуноглобулинов по белку (10 мг/мл), смешивали с равным объёмом латекса в 10%-ной концентрации, и после проведения реакции связывания, латекс осаждали центрифугированием, а в надосадке определяли количество не связавшегося белка (4,0 - 4,5 мг/мл). Таким образом, по разнице исходного и не связавшегося белка определяли количество белка, пошедшего на иммобилизацию 1 мл 1%-ного латекса: в наших опытах оно колебалось от 20 до 50 мкг.

Л-АТД получали двумя методами. В первом варианте ИГ был присоединен к поверхности латексных частиц через спейсер (ножку), обеспечивающую ИГ большую свободу взаимодействия с антигенами. Во втором методе использовали свойства альдегидных групп на поверхности латекса взаимодействовать с а- и е- аминогруппами аминокислотных остатков ИГ с образованием оснований Шиффа и последующим восстановлением этих оснований борогидридом натрия. Таким образом, ИГ оказывались "привязанными" непосредственно на поверхности латекса. Поскольку второй метод был проще в исполнении и не требовал импортного бифункционального реагента БРДР (И- сукцинимидил 3 (2-пиродитио) пропионат), а по результатам реакции не уступал первому методу, в дальнейшем мы использовали второй метод для получения конъюгатов латекс-ИГ. Для этого 10%-ную взвесь латекса с диаметром частиц 0,7 - 0,9 мкм отмывали в 0,02 М фосфатном буфере с 0,14 М ЫаС1 рН 7,2 с последующим осаждением центрифугированием. Затем осадок растворяли 0,02М ЗФР с 0,14 М №С1, рН 7,2 и разделяли по 2 мл 1%-ной взвеси латекса (по 20 мг латекса в пробирке). К латексу добавляли ИГ (10 мг/мл) в ЗФР рН 7,3 и 0,2 мл карбонатно-бикарбонатного буфера рН 9,6 с последующим инкубированием при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 2 часов с последующим добавлением глицина и продлением инкубирования ещё на 2 часа при комнатной

температуре для блокирования свободных альдегидных групп. Для восстановления неустойчивых шиффовых оснований добавляли раствор борогидрида натрия (8 мг/мл) и выдерживали 24 часа при 4°С. Конъюгат осаждали центрифугированием, как указано выше, и осадок ресуспендировали в 2 мл ЗФР рН 7,3 до конечной концентрации 1%-ного диагноста кума. Рабочие образцы латексов были заложены на хранение при различных температурах (+4°С, +20°С, +37°С) для определения стабильности основных свойств диагиостикума.

Для предотвращения спонтанной самоагглютинации к 1%-ному латексному диагностикуму добавляли буфер для разбавления: 1% нормальной сыворотки лошади и 0,05% Твин-20 или 1% нормальной сыворотки кролика и 0,05% Твин-20 в физрастворе. Рабочая концентрация латекса в диагностикуме составляет 0,33%.

Разработана методика постановки PJIA с JI-АТД, которую ставили на 96-ти луночных полистироловых пластинах с V -U дном в объёме 0,2 мл. Все реагенты подогревали до температуры 18 - 25° С. В лунки разливали по 180-мкл буфера для разбавления, кроме первого вертикального ряда, в который заливали по 200 мкл антигенов в концентрации 1 млрд. м.т./мл. Раствор антигена титровали в микропластине с десятикратным шагом, перенося по 20 мкл в каждую лунку, кроме последней, оставляя её с буфером в качестве контроля. Затем во все лунки добавляли по 20 мкл суспензии диагиостикума и пластину после встряхивания оставляли при комнатной температуре. Реакцию учитывали через 3 часа визуально по 4-х крестовой системе. Минимальную концентрацию антигена определяли по последней лунке с положительной реакцией. Реакцию считали положительной при агглютинации на 3 - 4 креста. В отрицательных контролях агглютинации не было. Установлено, что оптимальной температурой для постановки PJIA является температура 22°С, при температурах 4 и 37°С диагностикум был менее чувствителен, реакция замедлялась.

Проведенные исследования позволили отработать оптимальные условия сенсибилизации латексов антителами, проведения и учета PJIA.

2.2.2. Оценка чувствительности, специфичности, и стабильности латексного антительного диагиостикума

Были изготовлены опытные образцы диагностикумов на основе иммуноглобулинов, выделенных из сывороток разных видов животных, полученных против целых клеток L. monocytogenes 1-ой серогруппы (штамм 766), 2-ой серогруппы (штамм 634). Чувствительность диагностикумов для выявления листерийных антигенов определяли по числу микробных клеток в 1 мл. Минимальная концентрация антигена, которую выявляли в PJIA, определяли по последней лунке с положительной реакцией.

Анализ полученных данных (Таблица 1) показывает, что минимальная концентрация выявления листерий в PJIA была 1х103 м.т./мл, при использовании 5-ой серии Л-АТД.

Таблица 1

Чувствительность и специфичность латексных антительных __диагностикумов в РЛА_

Исследуемые антигены Серии латексного антительного диагностикума

Л-АТД №1 (ИГ свиньи шт. 766) Л-АТД №2 (ИГ лошади шт. 766) Л-АТД №3 (ИГ кролика шт. 766) Л-АТД №4 (ИГ свиньи шт. 634) Л-АТД №5 (ИГ кролика шт. 634)

L. топ. (живой) 766 1x10" 1x103 1х104 1х105 lxlO3

L. топ. (инакгив) 766 - 1x10" 1х108 - -

L. топ. (живой)634 1х104 1x10s lxl 0s 1х104 lxlO3

L. топ. (инакгив) 634 - 1x10' 1х108 - -

Е. coli - - - - -

St. aureus - - - - -

Примечание: 1x10 количество бактерий в мл.

Установлено, что латексные антительные диагноста кумы специфически активны и позволяют обнаружить живую культуру листерий в концентрации 1х103 м.т./мл. Диагностикумы не реагировали с антигенами других бактерий (Е. coli, St. aureus).

Оценку стабильности латексного антительного диагностикума проводили в течение 12 месяцев. Результаты изучения показали его стабильность в течение этого срока: диагностикум был стерилен, обладал выраженной специфичностью с сохранением чувствительности при условии его хранения при температуре +4°С с добавлением 0,08% азида натрия в качестве консерванта.

На основании положительных результатов исследований Л-АТД разработали постановку «пластинчатой» реакции латекс агглютинации для индикации возбудителя листериоза. В качестве антигенов использовали культуры листерий (7 референс-штаммов) и гетерологичные культуры (Е. coli, St. aureus). Диагностикум показал четкую положительную реакцию с штаммами листерий и отрицательную реакцию с гетерологичными культурами. «Пластинчатая» реакция выполняется в очень короткий срок (в течение 3 мин.) и является скрининговым тестом при исследовании большого числа проб. Всего исследовано более 130 культур.

2.2.3. Сравнительная оценка эритроцитарного и латексного антительных диагностикумов при исследовании антигенов в РНГА и РЛА

В качестве образцов для сравнения при оценке чувствительности и специфичности латексных тест-систем использовали листерийные

антительные диагностикумы: латексный и эритроцитарный, изготовленные в лабораториях "Прионных болезней" и "Бактериология" ГНУ ВНИИВВиМ.

Сравнительная чувствительность РЛА и РНГА выявлена при титровании антигенов одновременно в обеих реакциях (Таблица 2).

Таблица 2

Сравнительная оценка чувствительности латексных и эритроцитарных антительных диагности кумов при исследовании антигенов листерий

п=3

Антигены Средний титр (lg) Всего проб

РЛА РНГА

L. monocytogenes 6,8±0,4 5,2±0,6 35

L.welshimeri 6,6±0,5 5,ftt0,4 11

L. innocua 6,7±0,3 5,0±0,4 19

L. seeligeri 4,2±0,3 3,0±0,1 23

Livanovii 6,7±0,3 4,8±0,7 2

РЛА была чувствительнее РНГА при выявлении листерийных антигенов. Так при определении L. monocytogenes средний титр в РЛА составил - 6,8 lg, а в РНГА - 5,2 lg, L. ivanovii - 6,7 lg в РЛА, 4,8 lg в РНГА.

При исследовании гетерологичных антигенов с латексным диагностикумом агглютинации не наблюдали, или её наблюдали в незначительных титрах (1:10), что говорит о высокой специфичности Л-АТД при индикации листерий.

Проведенные исследования свидетельствуют о высокой чувствительности и специфичности Л-АТД в РЛА.

2.2.4. Индикация листерий в патологическом материале, объектах окружающей среды, пищевых продуктах с помощью антительного латексного диагностикума

Целью данного этапа работы являлось определение возможности использования разработанного высокочувствительного и специфичного латексного антительного диагностикума и РЛА для обнаружения антигенов возбудителя листериоза в патологическом материале, объектах окружающей среды, пищевых продуктах.

Для индикации и идентификации листерий применяли: классический микробиологический метод обнаружения листерий (микроскопия, выделение чистой культуры, изучение культурально-морфологических и биохимических свойств изолятов, определение каталазной и гемолитической активности, биопроба), серологический метод (РА, РЛА). Исследования проводили по усовершенствованной нами схеме (Схема 1):

Схема 1

СХЕМА ИНДИКАЦИИ ЛИСТЕРИЙ

| Предварительное £ селективное

обогащение: 10 мл селективной среды + 1 г (см3) исследуемого материала 30±1°С - 18-48ч.

Микроскопия окраска поГраму

ективныи

агар 18-48ч при 37°С

Определение подвижности при двух температурах (18-22°С) и (37±1°С)

Нативный материал

4"

Постановка РЛА с латексным антительным диагностикумом

3 Пересев - подозрительных колоний на простые питательные среды 37°С- 24-48ч.

-освещение по Генри -тест на катал азу

Гемолитическая активность 37°С - 24-48ч

Ферментация углеводов

Биопроба 12

I этап: При получении материала в первые сутки:

• Полученные пробы измельчали, доводили до однородной суспензии.

• Подготовленную навеску измельчённого продукта (гомогената) в количестве 1 г (см3) вносили в 10 см3 среды для первичного обогащения (бульон Фрезера). Посевы термостатировали при температуре 30±1 °С в течение 18-48 часов. При росте листерий на средах предобогащения, содержащих эскулин, наблюдается почернение среды за счёт гидролиза гликозида эскулина до глюкозы и эскулетина. Эскулетин реагирует с ионами железа, образуя комплекс чёрного или оливкового цвета. При необходимости делали пересев на среду для вторичного обогащения в соотношении 0,1 см3 пробы в 10 см3 среды.

• Параллельно далали посев в чашки Петри по 0,1 см3 на агаризованную дифференциально-диагностическую среду (агар Палкам). Посевной материал распределяли стерильным шпателем. Посевы термостатировали при температуре 37±1 °С в течение 18-48 часов.

• Проводили микроскопию окрашенных по Граму мазков.

П этап: При изменении цвета бульона Фрезера (почернение) и обнаружении характерных колоний на агаре Палкам отбирали колонии для постановки PJ1A с латексным антительным диагностикумом. Метод PJIA позволил быстро в течение 3 минут - «пластинчатый» вариант; 1,5-3 часов - в иммунологических пластинах провести индикацию листерий.

При наличии подвижности, характерного роста на селективных питательных средах и положительной реакции с Л-АТД подтверждали принадлежность выделенной культуры к бактериям рода Listeria. Ill этап: Для подтверждения видовой принадлежности выделенных бактерий определяли ферментативные и гемолитические свойства, и ставили биопробу на морских свинках или заражали 5 - 7-дневные развивающиеся куриные эмбрионы.

С учётом вышеизложенного, латексный антительный диагностикум можно применять для индикации возбудителя листериоза непосредственно после этапа предварительного селективного обогащения, что существенно ускоряет постановку предварительного диагноза и даёт возможность на ранних этапах выбирать дальнейшее направление исследований.

По вышеуказанной схеме было проведено бактериологическое исследование 196 проб патологического материала животных, людей, грызунов, рыбы, почвы, продуктов питания, из которых выделено 105 изолятов листерий. При постановке биопробы на морских свинках и заражении куриных эмбрионов установили, что 62 штамма оказались патогенными. Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3

Обнаружение листерий в биологическом материале, сырье животного _происхождения и пищевых продуктах _

Число проб Вид выделенных листерий Количество культур, давших положительную РЛА с Л-АТД Количество выделенных культур листерий, подтверждённых исследованиями биохимических свойств Количество культур листерий, подтверждённых РА

L. monocytogenes 62 62 62

L. innocua 36 36 36

196 L. welshimeri 4 4 4

L.grayi 2 2 2

L.seeligeri 1 1 1

Было исследовано 196 проб с применением разработанного нами экспресс метода с использованием Л-АТД, из которых было выделено 105 изолятов листерий, в том числе L. monocytogenes - из 62 проб, L. innocua из 36 проб, L. welshimeri из 4 проб, L. grayi из 2 проб и L. seeligeri из одной пробы, в остальных пробах листерии обнаружены не были. Следует отметить, что приведенные в таблице данные, свидетельствуют о совпадении в 100% случаев РЛА с данными бактериологического исследования и серологического теста - пластинчатой РА.

Следует отметить, что латексные тесты предельно просты, быстры в исполнении, не требуют инструментального учета результатов и могут проводиться в необходимых случаях в полевых, не приспособленных к работе условиях в определенных эпизоотических ситуациях. Этим и определяется их преимущества по сравнению, например, с бактериологическим методом, который требует несколько дней и даже недель для проведения анализа и стоит в несколько раз дороже.

2.2.5. Разработка латексных антигенных диагностик/мое (Л-АГД) и постановки РЛА

При подборе условий получения латексного антигенного диагностикума во многих работах [Severin, Демина] использовали свойства белков (AT, AT) иммобилизироваться к поверхности латекса при pH 9,0 -9,6. Мы же химически, ковалентно, используя альдегидные группы, иммобилизировали АГ (а также AT) через аминогруппы белков.

Для каждого антигена определяли дозу для связывания с латексом. Эффективность связывания антигена латексом и эритроцитами контролировали по максимальному титру в PJIA с гомологичной стандартной референс-сывороткой.

Наиболее серологически активным оказался цитоплазменный антиген в диапазоне соответствующем дозам 25 - 70 мкг на 1 мл 1%-ной взвеси латексных частиц. В дальнейшем мы использовали конечную сенсибилизирующую дозу цитоплазменного антигена равную 50 мкг на 1 мл 1%-ной взвеси латексных частиц.

Процесс иммобилизации антигенов на латексы осуществляли по следующей методике. По 1 мл суспензии листерий эталонных штаммов 766 1-ой серогруппы и 634 2-ой серогруппы в концентрации 200 - 300 млрд. м.т./мл, обрабатывали ультразвуком в течение 10 циклов по 30 сек при колебании зонда 16 цк и добавляли к 5 мл 1%-ной взвеси промытого ЗФР рН 7,2 альдегидного латекса. После встряхивания в течение 2 часов при комнатной температуре суспензию выдерживали в течение 24 часов при температуре 4°С, а затем не прореагировавшие альдегидные группы нейтрализовывали глицином. Далее шиффовы основания восстанавливали борогидридом натрия, выдерживали при температуре 4°С 2-3 суток, затем латекс трёхкратно промывали в ЗФР рН 7,3 центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 минут. Осадок (Л-АГД) растворяли в 5 мл ЗФР рН 7,2 и консервировали азидом натрия.

Были изготовлены три образца латексных антигенных диагностикумов на основе антигена листерий: первый - из штамма 766 - Л-АГД 766; второй - из штамма 634 - Л-АГД 634; третий комплексный -из штаммов 766 и 634 -Л-АГД 766+634.

Диагностикумы и контрольную суспензию латекса хранили при температуре +4°С. После испытаний рабочие образцы диагностикума заложили на хранение при различных температурных режимах (+4°С, +20°С, +37°С). При определении концентрации латекса, обеспечивающей четкость учета результатов реакции было установлено, что наиболее четкие реакции были получены при использовании суспензии латекса в пределах 0,25 - 0,33%-ной концентрации. При использовании 0,1%-ной концентрации латексной суспензии из-за бледности диагностикума создаётся некоторое затруднение при учёте результатов реакции. Рабочая концентрация диагностикума и контрольного латекса составила 0,33%.

В ходе опытов установили, что к полученным латексным конъюгатам следует добавлять 1% нормальной сыворотки лошади и 0,05% Твин-20 или 1% нормальной сыворотки кролика и 0,05% Твин-20 для предотвращения

спонтанной самоагглютинации. Сыворотки перед использованием прогревали при температуре 56°С в течение 30 минут, для инактивации комплемента. Это обеспечивало до 97% положительных реакций при исследовании иммунных листерийных сывороток и четкий отрицательный контроль.

Разработана методика постановки РЛА с латексным антигенным диагностикумом. Реакцию ставили в V и и- образных лунках полистироловых пластин в объеме 0,06 мл. Перед постановкой реакции все реагенты прогревали до температуры 18-22° С. Во все лунки (кроме первого ряда) вносили дозатором по 50 мкл ЗФР рН 7,2 с 1% нормальной сыворотки лошади и 0,05% Твин-20. В первые лунки каждого ряда вносили по 100 мкл испытуемой сыворотки, а затем готовили двукратные разведения сывороток от 1:2 до 1: 2048, т.е. из первой лунки переносили 50 мкл сыворотки во 2-ю лунку, перемешивали и 50 мкл смеси переносили в 3-ю лунку и т.д. Из 11-й (последней при титровании) лунки 50 мкл удаляли. Затем в каждую лунку добавляли по 10 мкл 0,33%-ной суспензии латексного антигенного диагностикума, затем пластину встряхивали и оставляли при 22°С. Реакцию учитывали через 1,5 и 3 часа. При положительной реакции на дне лунки формировался окрашенный агглютинат. Реакцию учитывали визуально по 4-х крестовой системе. Полностью реакция заканчивалась через 3 часа. За титр сыворотки принимали максимальное её разведение, при котором наблюдалась агглютинация латекса на «3+» и «4+». При титровании сывороток с контрольным латексом наблюдали полное отсутствие агглютинации латекса.

Определяли влияние температурного режима на скорость течения реакции при трёх различных режимах: 1 - 4°С, 18 - 22°С и 37°С. Установлено, что оптимальной температурой для постановки РЛА является температура 22 °С, при этом реакция проявляется полностью за 1,5 часа с более высокими титрами. При температуре 4°С - реакция в среднем протекала за 2 - 3 часа, а при температуре 37°С - за 3 часа. Через 24 часа результаты реакции не изменялись.

2.2.6. Оценка чувствительности специфичности, и стабильности латексного антигенного диагностикума

Для оценки чувствительности и специфичности латексного антигенного диагностикума для обнаружения антител к возбудителю листериоза в сыворотках крови животных в РЛА исследовали гипериммунные сыворотки кроликов (листериозные) и гетерологичные. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Чувствительность и специфичность латексных антигенных диагноста кумов

вРЛА

Исследуемые сыворотки Чувствительность Л-АГД (титр сыворотки в РЛА)

Л-АГД 766 Л-АГД 634 Л-АГД 766+634

с-ка кролика листерийная (шт.634 -2 серогр.) 1:256 1:512 1:512

с-ка кролика листерийная (шт.634- 2 серогр.) 1:256 1:512 1:512

с-ка кролика листерийная (шт.766-1 серогр.) 1:512 1:256 1:256

с-ка кролика листерийная (шт.766-1 серогр.) 1:512 1:256 1:256

с-ка крс сибиреязвенная - - -

с-ка крс колибактериозная - - -

норм, с-ка лошади 1:2 1:2 1:2

норм.с-ка кролика 1:2 1:2 1:2

Листерийная референс-сыворотка 1:1024 1:1024 1:1024

Установлено, что латексные антигенные диагностикумы активны и специфически реагируют в РЛА с листериозными сыворотками в титрах до 1:512 и не реагирует с гетерологичными сыворотками. Чувствительность латексных диагностикумов проверяли с листерийной референс-сывороткой. Максимальный титр в РЛА с гомологичной референс-сывороткой составил 1:1024 при использовании листерийных латексных антигенных диагностикумов.

Результаты изучения сохранности основных свойств показали их стабильность в течение 12 месяцев (срок наблюдения): диагностикумы были стерильны, обладали специфичностью при исследовании листерийных сывороток и не снижали чувствительность при условии их хранения при температуре +4°С с добавлением 0,08% азида натрия в качестве консерванта.

2.2.7. Сравнительная оценка эритроцитарного и латексного антигенных диагностикумов при исследовании сывороток в РИГА и РЛА

Для практических ветеринарных и медицинских специалистов чрезвычайно удобно использовать для обнаружения противомикробных антител простые и доступные воспроизводимые методы, а также не дорогие высокочувствительные и специфичные реагенты, к числу которых относятся латексные диагностикумы.

В качестве образцов для сравнения при оценке чувствительности и специфичности латексных тест - систем использовали листерийные антигенные диагностикумы: латексный и эритроцитарный, изготовленные в лаборатории «Бактериология» ГНУ ВНИИВВиМ. При сравнении

17

1

указанных диагностикумов сыворотки исследовали в РЛА и РНГА. Более высокая чувствительность РЛА в сравнении с РНГА выявлена при одновременном титровании в обеих реакциях сывороток животных (Таблица 5).

Таблица 5

Сравнительная оценка чувствительности латексных и эритроцитарных антигенных диагностикумов при исследовании листерийных и гетерологичных сывороток

п=3

Сыворотки от: Средний титр (1°й)

РЛА РНГА Всего проб

Кроликов больных 7,9±0,9 6,2±1,1 14

Кроликов иммунизированных 8,2±0,9 6,6±1,4 139

Свиней иммунизированных 11,8±0,6 8,7±0,7 6

Овец иммунизированных 8,4±0,6 7,2±0,6 14

КРС иммунизированного 8,1±0,4 6,9±0,5 15

Лошадей иммунизированных 11Д±0,7 10,2±1,0 3

Сыворотка колибактериозная 0 3,8±0,4 3

Нормальная сыворотка лошади 0 2,1±0,5 3

Титрование осуществляли с двукратным шагом разведений. Более высокие титры антител, выявляемых в РЛА, показаны при параллельном титровании сывороток: РЛА была на два - три разведения чувствительнее РНГА при выявлении листерийных антител. Положительные результаты в РЛА отмечены в 97 % случаев, тогда как в РНГА - в 95 % случаев.

При исследовании гетерологичных сывороток с латексным диагности-кумом положительной реакции не наблюдали, что говорит о его высокой специфичности, тогда как с эритроцитарным диагностикумом наблюдали незначительные перекрестные реакции с колибактериозной и нормальной сыворотками в титрах 1:16 и 1:4 соответственно.

2.2.8. Выявление AT в РЛА как дополнительный метод серологической диагностики листериоза

В последнее время серологические методы все шире используются для подтверждения диагноза на листериоз. В задачу данного раздела настоящей работы входило изучение возможности использования антигенных латексных диагностикумов для обнаружения листерийных антител в сыворотках больных и иммунизированных животных с целью уточнения серологического диагноза данной инфекции. Титровали сыворотки больных листериозом животных; животных, иммунизированных антигенами L. monocytogenes штаммов 766 и 634, а также сыворотки здоровых животных. Результаты титрования подтверждены бактериологическими и серологическими исследованиями.

При выборе диагностического титра были определены параметры диагностической ценности для каждого разведения листерийных сывороток, гетерологичных сывороток и сывороток интактных животных, исследованных в качестве контроля. Было исследовано 508 проб сывороток

крови: от кроликов - 188, свиней - 96, овец -129, крупного рогатого скота -88, лошадей - 7.

Для определения диагностического титра листерийных антител в РЛА проводили титрование сывороток крови здоровых животных, используя листерийный латексный антигенный диагностикум (таблица 6).

Таблица 6

Определение антител в сыворотках крови здоровых животных в PJIA

п=3

Исследуемые сыворотки от здоровых животных Количество проб Конечный титр в РЛА (logs)

Кроликов 30 0,5±0,2

Свиней 20 1,1±0,4

Овец 15 1,4±0,5

КРС 15 1,8±0,7

Лошадей 4 1,5±0,3

Средний титр антител в сыворотках крови от здоровых кроликов, выявляемый в РЛА, составил 0,5 1о&; от овец - 1,4 1ой2; свиней - 1,1 1о£2; КРС - 1,81о£2; лошадей -1,5 1о§2.

Таким образом, с учётом индекса сероконверсии мы приняли за диагностический титр в РЛА уровень антител у кроликов 1:4; у овец - 1:32; свиней -1:16; КРС - 1:64; лошадей - 1:32.

Титр антител в РЛА в сыворотках от больных кроликов составил 7,9 log2, а от иммунизированных - 8,2 log2, средний титр листерийных антител в сыворотках крови иммунизированных свиней составил - 11,8 log2, иммунизированных овец - 8,4 log2, иммунизированного КРС - 8,1 log2, иммунизированных лошадей - 11,2 log2 (Таблица 5).

Приведенные данные позволяют заключить, что латексный диагностикум на основе антигенов, выделенных из L. monocytogenes не уступает по чувствительности и специфичности традиционно используемым эритроцитарным диагностикумам, что позволяет рекомендовать РЛА работникам практических лабораторий для решения диагностических, прогностических и экспериментальных задач. Использование синтетического носителя снизило частоту положительных реакций при исследовании проб сывороток крови здоровых животных (контрольная группа) за счет исключения изоагглютинации, имеющей место при использовании биологических носителей - эритроцитов.

2.2.9. Индикация листерий с помощью ИФА

Для иммуноферментного анализа в качестве антигенов были использованы живые бактерии L. monocytogenes. Для получения конъюгата (ИГ-каталаза) специфические листерийные иммуноглобулины кроликов метили ферментом каталазой (ЕС 1.11.1.6) с помощью глютарового диальдегида.

Функцией катал азы является предотвращение накопления перекиси водорода, образующейся при дисмутации супероксидного аниона:

4Н20 —*■ 02 +2Н20

В качестве положительного контроля использовали листерийный антиген, в качестве отрицательного - контроль конъюгата в ЗФР рН 7,4.

Реакцию ставили в прозрачных полистироловых пластинах с плоским дном. Для индикации культур листерий (антигенов) пластины сенсибилизировали в течение 16 - 18 часов при температуре 4°С испытуемым антигеном. Для этого в первую лунку вносили 100 мкл 0,1М карбонатно-бикарбонатного буфера (КББ) pH 9,6 и 100 мкл испытуемого антигена в концентрации 1 млрд. м.т./мл; во 2-ю, 3-ю лунку и т.д. вносили КББ по 180 мкл. Затем из первой лунки 20 мкл смеси переносили во вторую, перемешивали и 20 мкл переносили в 3-ю и т.д., т.е. делали десятикратные разведения АГ. В качестве контроля использовали ЗФР и гетерологичный антиген - Е. coli.

После сенсибилизации при 4°С в течение 16-18 часов содержимое пластины удаляли (хорошо встряхивая), затем в лунки вносили по 200 мкл конъюгата ИГ-каталаза. Пластины ставили в термостат при температуре 37°С на 1 час.

Затем из пластин встряхиванием удаляли содержимое и в каждую лунку вносили по 200 мкл перекиси водорода в концентрации 0,0005% и выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре (18 - 20°С), а потом в каждую лунку добавляли по 25 мкл 5%-ного йодистого калия и 25 мкл 0,1%-ного раствора крахмала.

При постановке реакции одновременно ставили контроли:

1. Положительный контроль - в лунку, сенсибилизированную антигеном листерий, вносили конъюгат, перекись водорода, йодистый калий, раствор крахмала;

2. Отрицательный контроль - вносили конъюгат в несенсибилизированную антигеном лунку пластины, ЗФР pH 7,4 с 0,05% Твин - 20, перекись водорода, йодистый калий и раствор крахмала.

Результат реакции учитывали через 10-15 минут:

• положительная реакция - в лунках со специфической реакцией антиген-антитело (листерийный АГ - противолистерийный иммуноглобулин, меченный каталазой), присутствует катал аза, которая разлагает вносимую перекись водорода, при этом йодистый калий не восстанавливается до йода и крахмал не синеет - содержимое лунки бесцветное или слабо окрашенное;

• отрицательная реакция - содержимое лунки меняет цвет на синий, т.е. листерийный антиген не обнаружен.

В таблице 7 представлены результаты опытов.

Таблица 7

Определений листерий методом ИФА_

№ п/п Вид бактерий Концентрация листерий, м.т./мл

1x10 1x10* 1x10' 1x10" 1х105 1х1(г 1x10" lxlO2

1 L.m.766 ++-И- -н-и- +++ +++ +++ ++ — -

2 L.m.634 ++++ ) 111 4 i Н ++++ ++++ -н-н- +++ -

3 Е. coli

4 ЗФР pH 7,4

Примечание: «-», «+»- синий цвет, каталазы нет - реакция отрицательная; «++++», «+++», «++» от бесцветного до слабо окрашенного, присутствие каталазы -реакция положительная.

выводы

1. Разработан экспресс-метод индикации листерий и обнаружения антител к ним, на основе полимерных микросфер (латексов).

2. Разработана технология изготовления латексного антительного диагностикума, позволяющего выявлять листерии в концентрации 1х103 м.т./мл и более в нативном материале, пробах патологического материала, объектах окружающей среды и пищевых продуктах.

3. Разработана технология изготовления латексного антигенного диагностикума, для обнаружения листерийных антител в сыворотках крови больных, переболевших и иммунизированных животных.

4. Установлено преимущество латексных диагностикумов по сравнению с эритроцитарными, т.к. в отличие от эритроцитов в латексных частицах отсутствуют перекрёстно-реагирующие антигены. Латексные диагностикумы высокоактивны, специфичны и стабильно сохраняют свои свойства.

5. Простота постановки и воспроизводимость результатов позволяют использовать РЛА с латексными антительными и антигенными диагностикумами в качестве дополнительного теста бактериологического и серологического метода диагностики листериоза.

6. Разработана усовершенствованная схема индикации листерий, влючающая РЛА с антительным латексным диагностикумом и позволяющая в течение 24 часов определить наличие листерий в исследуемом материале.

7. Показана возможность использования ИФА для обнаружения листерий в нативном материале, пробах патологического материала, объектах окружающей среды и пищевых продуктах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основе проведенных исследований подготовлена и утверждена следующая нормативная документация:

Методические рекомендации по использованию «Латексного антигенного диагностикума для постановки реакции латекс агглютинации при листериозе», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ 18 июня 2004г.

Методические рекомендации по использованию «Латексного антительного диагностикума для постановки реакции латекс агглютинации при листериозе», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ 18 июня 2004г.

Предложена усовершенствованная схема индикации листерий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кольпикова Т.И., Котляров В.М., Фирсова Т.Е. Эффективность метода «Холодового» обогащения листерий // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных: сб. ст. Междунар. науч.-практ.конф. / ВНИИВВиМ.- Покров, 2000.-С.274-276.

2. Жаргалова Т.Т., Котляров В.М., Цыбанова Л.Я., КольпиковаТ.И., Фирсова Т.Е., Варакин Е.В., Мумуева Г.Б. Характеристика листерий выделенных из клинических проб // Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, Крейтцфельдта-Якоба и другие прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена: материалы Междунар. науч.-практ. конф. / ВНИИВВиМ. -Покров, 2001. - С.115-116.

3. Зайкин В. Л., Малышев Н.А., Фирсова Т.Е. Лабораторная диагностика листериоза в медицинской и ветеринарной практике // Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, Крейтцфельдта-Якоба и другие прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена: материалы Междунар. науч.-практ. конф. / ВНИИВВиМ. - Покров, 2001. - С. 135-141.

4. Фирсова Т.Е., Котляров В.М. Перспективы использования латексных диагностикумов при листериозе // Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, Крейтцфельдта-Якоба и другие прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена: материалы Междунар. науч.-практ. конф. / ВНИИВВиМ. - Покров, 2001.-С. 141-142.

5. Жаргалова Т.Т., Колбасов Д.В., Фирсова Т.Е. Генотипирование листерий методом полимеразной цепной реакции //Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота: материалы конф. молодых ученых / ВНИИЗЖ. - Владимир, 2002. - С. 124-127.

6. Колбасов Д.В., Котляров В.М., Жаргалова Т.Т., Фирсова Т.Е. Генодиагностика листериоза // Генодиагностика инфекционных заболеваний. V Всероссийская науч.-практ. конф.: сб. тез. / под ред.

B.И. Покровского. - М., 2002. - С. 339-340.

7. Карпова Т.И., Фирсова Т.Е., Родина Л.В., Котляров В.М., Тартаковский И.С., Ермолаева С.А. Титрование Listeria monocytogenes на основе полиформизма генов факторов патогенности // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2003. - Т.5, №3. -

C. 251-258.

8. Фирсова Т.Е., Котляров В.М., Чевелева С.С., Горюнова Т.В. Микробиологические критерии безопасности при сертификации пищевых продуктов как один из факторов предотвращения зооантропонозов // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов : тр. Междунар. науч.-практ. конф. / ГНУ ВНИИВВиМ. - Покров, 2003. - С. 620 - 623.

9. Соколов Д.М., Котляров В.М., Фирсова Т.Е. Индикация Listeria monocytogenes бактерий рода Listeria spp. и сальмонелл в продуктах методом визуальной иммунохроматографии (VIP - тест) // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: тр. Междунар. науч.-практ. конф. / ГНУ ВНИИВВиМ. - Покров, 2003. - С.631 - 632.

10. Чевелева С.С., Фирсова Т.Е. Ассоциированное воздействие на организм сельскохозяйственных и диких животных вирусов и условно-патогенных бактерий // Болезни диких животных: тр. Междунар. науч.-практ. конф./ ГНУ ВНИИВВиМ. - Покров, 2004. - С. 99 - 102.

11. Бакулов И.А., Котляров В.М., Фирсова Т.Е., Чевелева С.С., Кольпикова Т.И. Листериоз как пищевая инфекция и современные методы лабораторной диагностики // Болезни диких животных: тр. Междунар. науч.-практ. конф./ ГНУ ВНИИВВиМ,- Покров, 2004. -С.102 - 106.

12. Фирсова Т.Е., Котляров В.М., Sengh S., Соколов Д.М. Использование методов диагностики листериоза в лабораторной практике // Болезни диких животных: тр. Междунар. науч.-практ. конф. / ГНУ ВНИИВВиМ.- Покров, 2004. - С.111 - 115.

13. Фирсова Т.Е. Листериоз диких животных // Болезни диких животных: тр. Междунар. науч.-практ. конф./ ГНУ ВНИИВВиМ.-Покров, 2004. - С. 108 - 110.

14. Фирсова Т.Е., Чевелева С.С., Мещерякова Т.В. Болезни диких животных бактериальной природы // Болезни диких животных: тр. Междунар. науч.-практ. конф. / ГНУ ВНИИВВиМ.- Покров, 2004. -С. 93 - 95.

15. Фирсова Т.Е. Ранняя диагностика заболеваний и идентификация возбудителей при помощи латекс - агглютинации // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2004. - №5. - С. 15 -16.

16. Kotlyarov V.M., Firsova Т.Y., Kolbasov D.V. et.al. Methods of listeria indication and identification in Russia // XV International Sysposium on Problems of Listeriosis: Abstract. - Uppsala; Sweden, 2004. - 125 abstr.

М 091®

РНБ Русский фонд

2006-4 7465

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ, г.Покров Владимирской области. Тираж 100

Листериоз — инфекционное заболевание человека и животных, вызывается листериями, характеризуется различными клиническими проявлениями, высокой летальностью у новорожденных, лиц с иммунодефицитом и пожилого возраста. Установлено множество источников инфекции,а также разнообразие путей и факторов передачи возбудителя,

Листериоз зарегистрирован во многих странах мира. У животных он проявляется как в единичных случаях, так и эпизоотией. Листериоз чаще всего регистрируют у овец, реже у крупного рогатого скота и свиней. На территории России за период 1956 - 1996 гг. было зарегистрировано 6153 неблагополучных по листериозу хозяйств, из них: 4970 - овцеводческие, 338 - скотоводческие, 845 - свиноводческие. В 2000 г. в России было выявлено 47 неблагополучных хозяйств, в которых заболело 1207 животных; из них пало - 444. Аналогичная ситуация наблюдалась и в последние годы.

За период 2002-2003 гг. листериоз животных зарегистрирован: крупный рогатый скот - выявлено неблагополучных пунктов 22, заболело4 147 животных, пало 29; мелкий рогатый скот - выявлено неблагополучных пунктов 15, заболело 322 животных, пало 100 животных; свиньи - выявлено неблагополучных пунктов 21, заболело 377 животных, пало 61 животное.

В настоящее время проблемой является листериоз как пищевая инфекция у людей. В РФ сведения о заболевании листериозом начали учитывать с 1992 года. В 1992-1999 гг. зарегистрировано 447 случаев листериоза людей, из них 119 - в Москве, 120 - в Ивановской области, 71 - в Тульской, 37 - в Волгоградской, всего по 2-4 случая в других областях. В США заболеваемость листериозом составила около 1600 случаев в год. Во многих развитых странах отмечается 4-8 случаев заболевания в год на 1 млн. населения. В конце 20-го столетия в Канаде, Франции, Мексике, Великобритании, Швейцарии, США зафиксирован ряд крупных вспышек листериоза с высоким уровнем смертности при употреблении пищевых продуктов животного происхождения (молоко, молочные продукты, мясо, мясные продукты, яйца птиц), контаминированных листериями [8, 13,30, 33, 38, 39, 44, 54,85,100,145].

Характеристики различных видов листерий близки и поэтому идентификация Listeria monocytogenes - возбудителя листериоза в исследуемом материале часто затруднена вследствие морфологических и биохимических особенностей возбудителя листериоза [6, 45, 55, 60].

Для диагностики листериоза первостепенное значение имеет обнаружение возбудителя в патологическом материале и специфических антител в сыворотке крови больных и переболевших. Основное значение при этом приобретают экспресс-методы. Род Listeria представлен семью видами листерий, однако патогенными являются только два: L. monocytogenes и L. ivanovii. Согласно СанПиН при выделении листерий необходимо идентифицировать L. monocytogenes.

Предлагаемые ранее серологические методы не удовлетворяют полностью запросам практических врачей из-за необходимости приобретения дорогостоящего оборудования, сложности постановки реакций и многочисленных контролей к ним, а иногда и недостаточной специфичности получаемых результатов [6, 9, 18, 56, 63, 109, 114]. Во ВНИИВВиМ также много внимания уделяли этой важной как в научном, так и в практическом плане проблеме [8, 19, 33, 36].

Указанное выше, послужило основанием поиска новых носителей антигенов и антител, которые были бы биологически инертными, стабильными, не разрушающимися при длительном хранении; а применяемые реакции -простыми по технике постановки, чувствительными, а исследования с их помощью — экономичными.

Анализ данных литературы показал, что в диагностике заболеваний, вызванных различными микроорганизмами, все большее применение находит реакция латекс агглютинации (PJIA). Латексные частицы с успехом можно сенсибилизировать как антителами (AT), так и антигенами (АГ). Объектами исследований PJIA могут быть сыворотка крови, моча, фекалии, продукты питания и др., то есть все доступные объекты, содержащие AT и АГ [10, 15,57, 108, 143].

Учитывая возрастающую потребность практики в диагностических препаратах и необходимость выполнения микробиологического анализа с целью индикации листерий в пищевых продуктах и биоматериалах, целесообразность разработки и усовершенствования экспресс-метода является актуальной.

Наглядность, простота, чувствительность реакции латекс агглютинации для ускоренного обнаружения и идентификации листерий и антител к ним позволит решить данную проблему, что и определило выбор темы и направление наших исследований.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлась разработка чувствительного, быстрого и несложного в выполнении и учете результатов метода индикации листерий и обнаружения антител к ним на основе полимерных микросфер (латексов).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить антигены листерий как в виде очищенных живых и инактивированных бактерий, так и цитоплазменных после разрушения бактерий ультразвуком.

2. Получить из гипериммунных сывороток разных видов животных специфические к листериям антитела.

3. Провести подбор микросфер и выбрать образец для приготовления латексных диагностикумов.

4. Отработать технологические параметры иммобилизации листерийных антигенов и антител на полимерных микросферах и изготовить экспериментальные образцы латексных диагностикумов.

5. Провести сравнительную оценку чувствительности, специфической активности, стабильности полученных серий иммунохимических латексных диагностикумов в реакции латекс агглютинации и тест-систем для реакции непрямой гемагглютинации (РИГА).

6. Оценить новые латексные диагностикумы для экспресс индикации листерий, а также для выявления листерийных антител в сыворотках крови животных.

Научная новизна

В результате проведенных исследований впервые разработана методика получения латексных диагностикумов на полимерных микросферах с реакционноспособными альдегидными группами для экспресс-метода индикации листерий и обнаружения антител к ним.

Проведена сравнительная характеристика экспресс-метода индикации листерий и обнаружения антител к ним в PJIA и РИГА.

Усовершенствован иммуноферментный метод индикации листерий.

Практическая значимость

Результаты проведенных исследований позволили разработать антигенные латексные диагностикумы для выявления листерийных антител в сыворотках крови больных или переболевших животных и антительные латексные диагностикумы для экспресс индикации листерий в различных биоматериалах.

Разработаны инструкции по изготовлению антигенных и антительных латексных диагностикумов и методические рекомендации по их применению с целью экспресс-индикации листерий и обнаружения антител к ним.

Внедрение в практику разработанных средств и методов индикации листерий и обнаружения листерийных антител позволит сократить время проведения экспертизы и повысить результативность диагностики.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Технологические принципы изготовления латексных диагностикумов на основе листерийных антигенов и антител.

2. Экспресс-метод на основе полимерных микросфер (латексов) для индикации листерий и обнаружения антител к ним.

3. Результаты изучения чувствительности, специфичности, стабильности полученных серий иммунохимических латексных диагностикумов в реакции латекс агглютинации в сравнении с аналогичными тест-системами для РИГА.

Апробация результатов работы

Результаты, представленные в диссертации, доложены на научно-практических конференциях ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (г. Покров 2001-2004 г.г.); совещании научных сотрудников ГНУ ВНИИВВиМ

Россельхозакадемии 23.12.2004 г.; на заседании ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 20.01.2005г.

Проведены комиссионные испытания диагностических наборов для постановки реакции латекс агглютинации и иммуноферментного анализа (ИФА) для экспресс-индикации листерий и листерийных антител.

Публикация результатов

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе в центральных научных журналах, материалах международных научно-практических конференций, а также в материалах XV Международного симпозиума по проблемам листериоза (ISOPOL XV, Уппсала, Швеция, 2004 г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 124 стр. машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей, 6 схемами, 1 фотографией и дополнена приложениями. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования (материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов исследований), выводы, практические предложения, список литературы, приложения, содержащие документы, подтверждающие практическую значимость работы. В списке литературы 150 источников, в том числе 73 иностранных.

5. ВЫВОДЫ.

1. Разработан экспресс-метод индикации листерий и обнаружения антител к ним, на основе полимерных микросфер (латексов).

2. Разработана технология изготовления латексного антительного диагностикума, позволяющего выявлять листерии в концентрации 1x10 м.т./мл и более в нативном материале, пробах патологического материала, объектах окружающей среды и пищевых продуктах.

3. Разработана технология изготовления латексного антигенного диагностикума, для обнаружения листерийных антител в сыворотках крови больных, переболевших и иммунизированных животных.

4. Установлено преимущество латексных диагностикумов по сравнению с эритроцитарными, т.к. в отличие от эритроцитов в латексных частицах отсутствуют перекрёстно-реагирующие антигены. Латексные диагностикумы высокоактивны, специфичны и стабильно сохраняют свои свойства.

5. Простота постановки и воспроизводимость результатов позволяют использовать РЛА с латексными антительными и антигенными диагностикумами в качестве дополнительного теста бактериологического и серологического метода диагностики листериоза.

6. Разработана усовершенствованная схема индикации листерий, влючающая РЛА с антительным латексным диагностикумом и позволяющая в течение 24 часов определить наличие листерий в исследуемом материале.

7. Показана возможность использования ИФА для обнаружения листерий в нативном материале, пробах патологического материала, объектах окружающей среды и пищевых продуктах.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основе проведенных исследований подготовлена и утверждена следующая нормативная документация:

Методические рекомендации по использованию «Латексного антигенного диагностикума для постановки реакции латекс агглютинации при листериозе», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ 18 июня 2004г.

Методические рекомендации по использованию «Латексного антительного диагностикума для постановки реакции латекс агглютинации при листериозе», утвержденные директором ГНУ ВНИИВВиМ 18 июня 2004г.

Методика постановки РЛА при листериозе включена в «Методические рекомендации по использованию латексного антигенного диагностикума для постановки реакции латекс агглютинации при листериозе» и «Методические рекомендации по использованию латексного антительного диагностикума для постановки реакции латекс агглютинации при листериозе».

Предложена усовершенствованная схема индикации листерий.