Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Разработка тест-систем иммуноферментного анализа для обнаружения вирусного антигена и специфических антител ротавирусов группы А

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ ГРУЗИЯ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ II КЛИНИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

На правах рукописи

ТОПУРПЯ ТЕЙМУРАЗ ЮЗОВИЧ

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ

ИММУНОФЕРМЕПТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСНОГО АНТИГЕНА II СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ РОТАВИРУСОВ ГРУППЫ А

М.00.36 — Аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Тбилиси — 1992

Работа выполнена 1! Институте медицинской биотехнологии Академии паук Республики Грузия.

Научные; руководители: доктор биологических наук Г. Г. Рухадзе

консультант член-корресиондепт АН Грузин, профессор В. II. Бахуташвнлн

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Б. М. Корсантин кандидат медицинских паук С. А. Купрадзе.

Ведущее учреждение —■ Тбилисский государственный медицинский институт.

Защита состоится «-^Ч)

1992 г. в «

-^Чг час.

па заседании специализированного совета Д 078.02.01 в НИИ экспериментальной и клинической терапии МЗ п СО РГ по адресу: 380050, Тбилиси, ул. Любляны, 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан »------1992 г.

Ученый секретарь

специализированного совета Д 078 02.01

кандидат медицинских наук С. Г. Хомершш

_ / ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

, |;Актуальность проблемы. Прошло 15 лет после "ДЕ ЮРЕ" признания ротавирусов,.как основных этиологических агентов острых гастроэнтеритов, "ДЕ ФАКТО" эти вирусы были открыты значительно раньше у некоторых видов млекопитающих, однако медицинские вирусологи, в течение почти двух десятилетий игнорировали или, по всей вероятности, не замечали этих сообщений, считая рота-вирусы патогенами исключительно животных. Ирония заключается в том, что в дальнейшем благодаря морфологической идентичности и близкого антигенного родства с ротавирусами человека, а также единого механизма патоиммуногекеза, именно ротавирусы животных и вызываемые ими инфекции стали модельными объектами для широких исследований в этой области. Этому во многом способствовал и тот факт, что ротавирусы человека при применении традиционных методов культивирования ке размножались в клетаках ш \л1го и в течение нескольких лет их поддерживали в гетерологической системе ш щчо

В настоящее время на вызывает сомнекзя, что ротавирусы являются важными патогекамп человека, особенно детей, проявляя строго дифференцированный тропази в отнопеиия энтероцатсв тонкого отдела кишечника. Известно, что около 50^-всех случаев гастроэнтерита у детей в экономически развитых странах вызываются ротавирусами. Убикватерная природа этих вирусов обуславливает их Еярокуп циркуляцию в природе. Она поражают не только человека, но н молодмяк сага« различных видов животных. В связи с этим разработке эффективных вакцинных препаратов против ротаварустгх инфекций придается исключительно важное значение.

Наряду с разработкой средств профилактика вирусных гастроэнтеритов необходимо изыскание высокочувствительных тест-скс-

тем, пригодных как для идентификации вируса и вирусного антигена, так и для обнаружения специфических антител в сыворотке крови и различных биологических секретах. Эти же методы пригодны для оценки иммунного статуса.

В последние годы в самых различных областях медицины стали широко применять методы иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющие определить широкий спектр биологических соединений - от низко молекулярных гормонов, до вирусных и бактериальных антигенов. 1'М - наиболее специфичный и универсальный тест, отличающийся шсокой чувствительностью, удобный для автоматизации и стандартизации реагентов. Возможность визуального учета реакции делг,.эт его доступным для лабораторий любого класса.

Лишний раз подчеркивая актуальность разработки высокоэффективных средств экспресс-диагностики вирусных гастроэнтеритов, следует уделить особое внимание дальнейшему усовершенствованию аналитических тест-систем необходимых для широкомасштабного скрининга исследуемых проб, а также для оптимизации различных схем и способов иммунизации животных. Это направление исследований активно развивается в настоящее время.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы разработка эффективных средств экспресс-диагностики ротавирус-ных инфекций.

В соответствии с этим в задачи исследования входило: -Изучить структурно-топографическую организацию ротавирусов.

Для этого необходимо было предварительно отработать высокоэффективные и хорошо воспроизводимые методы культивирования, концентрирования и очистки ротавирусов и их субъединичных компонентов .

-Разработать высокоспецифические, высокочувствительные

тест-системы иммуноферментного анализа для выявления ротавирус-ных антигенов, пригодных для контроля вирусного сырья. -Разработать высокочувствительные, высокоспецифические тест-системы для количественного определения ротавирусоспецифичес-ких антител.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ, ВЫДВИГАЕМЫЕ ДЛЯ ЗАЩИТЫ :

1.Разработка тест-систем ИФА для выявления специфических нтител к ротавирусу.

2.Разработка и оптимизация схем гипериммунизации животных га получения высокоактивных моноспецифическкх сывороток к ро-1вирусу.

3.Разработка тест-систем ИФА для выявления антигенов рота-русов.

Научная новизна и практическая ценность. В результате про-ценных исследований выяснены принципиальные особенности моле-тярной организации ротавируса свиней. Выявлены общие принципы >уктурно-топографической организации вирионов ротавирусов. Предложены эффективные методы концентрирования и очистки авирусов. На основе очищенных препаратов с использованием гинальных схем иммунизации порссят-гнотобиотов получены вы-эактивные моноспецифические сыворотки для конструирования эеменных диагностических тест-систем.

Разработанные высокочувствительные тест-системы для индика-и количественной оценки ротавирусного антигена к ротавиру-антител на основе иммуноферментного анализа. Данию?! метод ноферментного анализа отличается своей простотой в испол-I экономичности и дает возможность для массового оСследо-I в максимально короткие сроки.

- б -

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученных советов Институт та экспериментальной морфологии АН ГССР (1990) и Института Ме дицинской биотехнологии АН Республики Грузия (1991, 1992).

Публикация результатов исследований. Основные материалы диссертации опубликованы в 2 научных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста, и включает в себя введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение резул татов, выводы, практические предложения и список литературы.

Диссертация документирована 3 рисунками и 42 таблицами.

Автор приносит глубокую благодарность профессору В.И.Бахуташвили и доктору биологических наук Г.Г.Рухадзе за научно-методическую помощь в организации и проведении исследований, а также научным сотрудникам Л. .Картозия, Г.И.Алиперу, В.И.Хаустову, М. .Деканозишвили за совмест-юе проведение опытов и обсуждение результатов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вирусы и культуры клеток. В работе использовали оригинальный аттекуированкый штамм К ротавируса свиней, референтный штамм 0 ротавируса свиней, референтный штамм ротавируса обезьян £А II и аттенуированный штамм ротавируса крупного рогатого скота. Пассирование вирусов проводили в культурах клеток СПЭВ, 46/47 и МБШ.

Концентрирование ротавирусов. Концентрирование вирусосодер-жащей суспензии проводили о использованием нескольких методов:

а) осаждение ПЭГ 6000: к культурной вирусосодержащей суспензии добавляли ПЭГ 6000 до 7,5% и 0.14 М ЫлС£ . Смесь переме шивали и выдерживали 12ч при 4°С;•затем преципитат осаждали при 12000^ в течение 30 мин.

б) концентрирование в двухфазной системе: к вирусосодержащей суспензии добавляли ПЭГ 6000 до 10% и перемешивали на магнитной мешалке до полного растворения. Затем к суспензии пост< пенно добавляли сульфат аммония из расчета 340г на 1л жидкое?] Для восстановления рН к раствору добавляли 10% раствор аммиак (0,7 мл на 200 мл жидкости). Сульфат аммония растворяли 30 ми на магнитной мешалке и оставляли на ночь при 4°С. После рассл ения жидкости на 3 фазы, нижнюю удаляли аспирацией, а верхнюк и среднюю центрифугировали в режиме 6000 ^ в течение 30 мин, результате чего вновь образовывались 3 фазы - верхнюю и тот удаляли, в среднюю ресуспендировали в ФБР (1:50) и осаждали при 6000£ в течение 30 минут.

в) осаждение через 30%-ную сахарозную подушку: культурал ную суспензию осветляли при 2000^ в течение 20 минут. Освет

ленную суспензию наслаивали на подушку 30%-ной сахарозу (приготовленной на TEW -буфере) в соотношейии 6:1. Ультрацентрифугирование осуществляли в режиме 100000^ в течение 90 мин.

Очистка ротавирусов. Концентрированный вирус наслаивали на ступенчатый градиент хлоридаа цезия (плотность 1,25-1,50 г/см3) и центрифугировали в роторе 50 в течение 2 часов при 150000^. Опалесцирующие полосы очищенного вируса отсасывали с помощью перистальтического насоса и переосаждали центирфугиро-ванием в том же режиме.

Постановка ИФА для выявления антител к ротавирусу. Лунки полистироловых пластин (фирма "Flow ») сенсибилизировали очищенными антигенами ротавируса в рабочем разведении в объеме 1000 мкл. Пластины инкубировали в течение нови при 4°С и дважды отмывали раствором фосфатного буфера (рн 7,2) с добавлением 0,05% Твин 20. После этого вносили исследуемые образцы, предварительно разведенные 1:50 и раститровывали их. Пластины инкубировали при в течение 1,5 часов. Затем лунки четырежды отмывали и вносили антивидовой коныогат в рабочем разведении. После инкубирования в течение 1,5 часов при 37°С и шестикратного отмывания вносили субстратную смесь, содержащую сртофени-лендиамин в концентрации 400 мкл/мл и 0,06^ Н202. Через 15-20 минут реакцию останавливали внесением в каждую лунку 50 мкл 2Н раствора HgisO^.

Результаты учитывали спектрофотометрически при длине волны 490 нм на ридере фирмы ""Оукяте^н Положительным считали то разведение сыворотки, прз котором разность величин сигналов опытного и контрольного образцов (Р/ь1) составляла не менее 3,0

Выделение 1<$р из гипериммунных сывороток. Специфическую активность полученных гипериммунных сывороток оценивали с помощью разработанного нами непрямого теста ИФА. Высокоактивные сыворотки отбирали и обрабатывали насыщенным раствором сульфата аммония (1:2) при постоянном перемешивании, в течение бч (4°С). Сформировавшийся осадок отделяли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 30 мин, ресуспендировали (1/20 от исходного объема) в 0,025 М фосфатном буфере рН 6,7 (стартовый буфер) и диализовали в течение 18 ч при 4°С против того же буфера. Выделение фракции 1^0 проводили на системе Р Р1С (фирма "РНАК-МАс " путем хроматографии материала на преформирован-ной колонке о Н 5/5. В качестве элюирующего буфера ис-

пользовали 0.025 Ы фосфатный буфер рН 6.7. Степень чистоты по; лученной фракции иммуноглобулина проверяли методом электрофореза в градиенте 8-25$ полиакрилакидного геля на системе Рна$ (фирма "РНДВМ«С.|А »),

Конъюгирование . Использовали пероксидазу хрена (НПО "Биохимреактив" г.Олайне) с Р.? =3,0. Конъюгирование осуществляли по методу К Никлые и А.Ко.*/ав1. с небольшими модификация Постановка ИФА для выявления ротавирусного антигена. Луга полистироловых микротитрационных панелей фирмы " " сенсибилизировали антиротавирусными 1<£р в концентрации 50-100 ши в течение 18 часов при 4°С. Несвязавшийся 1оСг удаляли, луни промывали 3 раза по 5 мин 0,02 М ФСБ (рН 7,2 с 0,05% Твин 20 а заетм вносили по 50 мкл исследуемого материала в каждую лу; ку. Панели инкубировали при 37°С I час, материал из лунок уд ляли, лунки промывали, как описано выше, и подсушивали. Рабо разведение пероксидазного кокыогата, приготовленное на 0,01

КБ рН 7,2 с 1% БСА и 0,05% Тви'на 20, вносили по 50 мял во все лунки панели. Инкубировали I час при 37°-С, несвязавшийся перо-ксидазкый конъюгат удаляли, лунки промывали 5-браз и высушивали. Вносили по 100 мкл ферментного субстрата - 0,4 мг/мл ортофенилендианина и 0,05% Н202 в цитратно-фосфатном буфере (0,1 М раствор лимонной кислоты и 0,2 М раствор И42НР04 -рН 5,0)7 Инкубировали 30 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2Н раствора серной кислоты. Результаты учитывали визуально или фотометрически при длине волны 490 нм (ридер фирмы "Оу^дтеск ") и считали положительными, если оптическая плотность содержимого опытных лунок превосходила оптическую плотность контрольных лунок (Р/У) в 2,1 раза и более. В качестве отрицательного контроля во всех случаях использовали вирус транссмиссивного . гастроэнтерита свиней (коронавирус), выращиваемый в культуре клеток СПЭВ.

Электронная микроскопия (ЭМ). Для ЭМ использовали 10% суспензию фекалий. Препараты готовили методом негативного контрастирования с применением 2% водного раствора фосфорно-воль-фрамовой кислоты (рН 7,0). Исследования проводили на электронном микроскопе ЛЕИ 100 СХ II при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Выделение вирусной РНК. 10% суспензию фекалий обрабатывали в ультразвуковом дезинтеграторе в течение 30с., затем осветляли при 12 000в течение 10 мин. Вирус концентрировали центрифугированием осветленной суспензии при 125 000^ в течение 2 часов. Осадок ресуспендировали в ТЕ-буфере (ЮмМ трис XI, I мМ ЭДТА, рН 8,0), добавляли 0,5% додецилсульфат натрхя (ДСН), протеиназу К (500 мкг/мл) и инкубировали 1ч при 37°С, г. о еле чего проводили депротеинизацию смесью фенол-хлороформ. Экстра? тированную РНК преципитировали 3 "бтемами 70% этанола, содпр-

жащего 0,3 М ацетата натрия, в течение ночи при -20°С. Для разрушения сопутствующих ДНК препарат обрабатывали дезоксири-бонуклеазой при 37°С в течение 30 мин.

Электрофорез вирусной РНК в полиакриламидном геле (ПААГ). Препараты РНК анализировали в ПААГ, содержащем 1С)% акриламида и 0,3% бисакрилаиида. Для проведения электрофореза использовали буферную систему / /. Разделяющий гель содержал 0,375 М трис-НС1 (рн 8,8) и 0,1% ДСН. Концентрирующий гель с 3% акрил-амида содержал 0,125 М трис-НС1 (рН 6,8) и 0,1% ДСН. Гель по-лимеризовали химически добавлением тетраметилендиамина (ТЕМЕЭ) в конечной концентрации 0,025% и персульфата аммония. В качестве электродного буфера испльзовали раствор, содержащий 0,025 М трис-НС1 (рН 8,3), 0,192 М Глицин и 0,1% ДСН. Электрофорез вирусной ДНК проводили в пластинчатом ПААГ в течение 4 ч при силе тока 50мА. Гель окрашивали раствором бромида этидия (2 мкг/мл) в течение 60 мин. Электрофореграммы РНК ротавиру-сов фотографировали при ультрафиолетовом облучении.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I.Структурно-топографический анализ "Ротавириона" и капсидных полипептидов ротавирусов.

1.1.Морфология и биофизическая характеристика вирусных частиц. Для детального изучения морфологии ротавирусов исследовали препараты, приготовленные на основе культуральной виру-ссодержащей жидкости, а также тонкого отдела кишечника экспериментально инфицированных двухдневных поросят-гнотобиотов. Электронная микроскопия методом негативного контрастирования показала, что в обоих препаратах в основном превалировали дву-капсидные вириошл ротавируса диаметром 72-75 нм, с плавучей плотностью в градиенте хлористого цезия 1,36 г/см3. Внешний вид двукапсидных вирионов напоминал колесо с широкой ступицей, короткими спицами и четко очерченным ободом. Наружный капсид в виде тонкого слоя (толщиной 4-5 нм) покрывал внутренний капсид и представлял собой нестабильную морфологическую структуру, которая, вероятно, могла легко удаляться с поверхности вирионов при ультрацентрифугировании вируссодержащего материала. Это подтвердилось при исследовании вируса, очищенного и концентрированного в отсутствие двухвалентных ионов кальция. Вирусные скопления полностью состояли из однокапсидных вирионов диаме-•ром 58-65 нм, с плавучей плотностью 1,38 г/см3. При этом наблюдали -вирионы с разорванным капсидным слоем, частично или олностью утратившими капсомеры. При проникновении коготрасти-ующего вещества в вирионы выявлялись гексагональные электрон-плотные сердцевины (со е), диаметром 38-30 нм. В этих ну (следах, окруженных электроннопроэрачным белковым слоем, локали-

зуется вирусная РНК. Иногда такие структуры выглядели "пустыми".

Таким образон, среди многообразных переходных форм вирио-нов ротавируса, наблюдаемых в электронном микроскопе, можно выделить четыре основных вида частиц, как результат деструктивных изменений, происходящих с двукапсидными цельными вири-онами (таблица I).

Все типы вирионов ротавируса свиней, фракционирование с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности, были исследованы на инфекционность путем инокуляции культуры клеток СПЭВ концентрированными препаратами указанных типов. Проведенные исследования показали, что инфекционностью обладают только интактные двукапсидные вирионы ротавируса свиней.

Таблица I

Характеристика различных типов ротавируса свиней

№ Тип вириона Диаметр Плавучая плот' ность в гради енте хлористо Инфек- цион- ность

I. Цельные, двукапсидные 72-76 1,36 +

2. "Голые",однокапсидные 58-65 1,38 -

3. Сердцевины 38-40 1,44 -

4. "Пустые" частицы 40-65 1,30-1,32 -

1.2.Структурные полипептиды ротавируса свиней и их локализация в капсиде. Электрофорез в ПААГ вирусных белков показа что двукапсидные Еирионы ротавируса свиней, не подвергавшиеся

обработке трипсином, содержат б структурных полипептидов. Полипептиды р^(УР4) и р38(уР7) являются'компонентами наружного капсида, т.к. не обнаруживаются у однокапсидных вирионов.

Иажорным белком вириона является полипептид внутреннего кап-42

сида р (уРб) группоспецифический антиген ротавирусов. Минорные вирионные белки рПб(УР1), р98МР2) и р92(^Р5) ассоциированы с сердцевиной ротавируса свиней (для получения вирусных сердцевин однокапсидные вирионы ротавируса свиней обрабатывали высокими концентрациями хлористого кальция (1,5 М), а затем фракционировали с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности.

1.3. Гемагглютинин ротавируса свиней. Ротавирусы, изолированные от некоторых видов животных и птиц, а также человека, благодаря наличию вирусного гемагглютинина, агглютинируют эритроциты различных видов животных. Однако сзедения о гемаг-глютинирующей активности ротавируса свиней в мировой литературе отсутствуют. Исходя из этого перед нами была поставлена задача изучения гемагглютинирующей способности штамма К ротавируса свиней, адаптированного к росту в культуре клеток СПЭВ.

-. В первом опыте исследовали способность ротавирусйп различного происхождения агглютинировать эритроциты морской свинки в зависимости от приготовления гемагглютинирулщего антигена. Для сравнения использовали ротавирус обезьян, обладающей гемагглютинирующей активностью.

Таблица 2

Гемагглйтинирующая активность ротавирусов различного происхождения

№ ""Т..... ■ — Ротавирусы Неконцентрированный антиген Методы концентрирования антигена

ультрацен трифугиро вание двухфазный 'Конц. ПЭГоы

титр гемагглютининовсЦаО

I. Ротавирус свиней (штамм Ю 3,3 8,2 5,1 4,3

2. Однокапсидные вирионы ротавируса свиней (штамм К) н.и. 2,6 н.и. н.и.

3. Ротавирус свиней (штамм 0 ) 0,7 3,6 2,0 2,0

4. Ротавирус обезьян 5,3 9,3 7,15 8,2

5. Контроль.культуры - 1,7 1,0 1.0

н.и. не исследованы

Как видно из таблицы 2, ротавирус обезьян и штамм К рота-вируса свиней обладают выраженной гемагглютинирующей активностью, которая наиболее выражена у антигенов концентрированых путем ультрафугирования. Тат факт, что гемагглютинирующей активностью обладают только интактные вирионы ротавируса свинец указывает на локализацию гемагглютинина в наружном капсиде ви-риона.

В дальнейших исследованиях было показано, что гемагглю-тинирующая активность штамма К ротавируса свиней не являлась температурозависимой (таблица 3), хотя снижалась после трехкратного цикла замораживания-оттаивания и при пролонгированной обработке высокими концентрациями трипсина (100 мкг/мл, 60 мин), (таблица 4).

Таблица 3

Влияние температуры на гемагглютинирующие свойства ротавирусов

№ Ротавирусы Титр гемагглютининов ( 2) :

4°С Г 37°С :

I. Ротавирус свиней 8,3 ! 8,7 :

2. Ротавирус обезьян 9,3 : 9,0 :

*t

Таблица 4

Влияние трипсина и 3-кратного цикла замораживания-оттаивания на гемагглютинирующую активность ротавируса свиней

ь : Ротавирусы Титр гемагглютининов (1<>ъ 2) :

до обработки 'после обработки :

, :Обработка трипсином . :3-кратнее зам.-оттаив. 8,0 : 6,0 : : р 0,05 : 8,3 : 5,з :

Вероятным объяснением снижения гемагглютинирующей активиста ротавируса свиней после обработки трипсином является ютеолитическое расщепление гемагглютинина р®® на две субъ-^ницы, что, по-видимому, сопровождается конформационными менениями в первичной структуре этого полипептида и частич-« подавлением гемагглютинирующей способности.

2. Получение высокоочшценных препаратов ротавирусов.

2.1. Очистка ротавирусов. Как известно, выделение ротавии русов во внеклеточное пространство происходит посредством разрушения плазматической мембраны и -лизиса клетки. Несмотря на это, основная часть вирионов ассоциирована с мембранами клеток, что в известной степени, затрудняет процесс очистки ротавирусов. Первым этапом этого процесса, как и в случае очистки других вирусов, является осветление вируссодержащей суспензии путем низкоскоростного центрифугирования (12 000^; 30 мин). Для достижения максимального выхода ротавирусных частиц важнейшее значение приобретает высвобождение той части вируса, которая прочно связана с мембранными компонентами клетки. С этой целью мы использовали три различных метода. Первый из них включает обработку ресуспендированного осадка в ультразву ковом дезинтеграторе, второй - трехкратный цикл замораживания -оттаивания вирусного препарата, а третий - солюбилизацию кле точных мембран с помощью трифтортрихлорэтана. В каждом случае после обработки препараты контролировали с помощью электронной микроскопии. Было отмечено, что ультразвуковая обработка ведет к дезинтеграции не только клеточных мембран, но и част] вирионов, что особенно проявляется в разрушении лабильного ■ наружного капсида. В результате трехкратного цикла замораживания-оттаивания также нарушается интактная целостность вири онов, происходит незначительная деструкция наружного капсида содержащего функционально важные полнпептиды - инициаторы т фекционного процесса. Наиболее щадящим является использован1/

трифтортрихлорэтана, известного под коммерческим названием Фреон ИЗ. При обработке этим препаратом достигается высвобождение около 9055 вируса, связанного с клеточным лизатом, при этом максимально сохраняется интактная структура вирионов.

Третий этап очистки ротавирусов включал переосветление рееуспендированного осадка для удаления солюбилизированных клеточных элементов путем центрифугирования при 7000 в течение 30 мин. В результате образуется три фракции: верхняя -осветленная вирусная суспензия, средняя - интерфаза солюбилизированных. клеток, нижняя - фреоновая фракция. Осветленные супернатанты первого и третьего этапов объединяли. Указанный препарат представлял собой предельно осветленную суспензию с максимальным сохранением исходной концентрации вируса. На четвертом этапе с целью дальнейшей концентрации вируса препарат ;ентрифунировали в режиме 125 000^ в течение 2 часов при 4°С. )садок ресуспендировали в буфере, содержащем ТОмМ двухвалент-сых ионов кальция (1/100 от исходного объема), наслаивали на тупенчатый градиент хлористого цезия (плотность 1,25-1,50г/см3) центрифугировали в течение 2 часов при 150 000 (пятый тап). Опалесцирующие полосы очищенного вируса отсасывали с п омсщью перистальтического насоса и переосаждали центрифуги-эваниеы в том же режиме (шестой этап). Конечный осадок ресу-1ендировали в минимальном объеме Са++- содержащего буфера, изливали по аликвотам и до использования хранили при -70°.

3. Разработка тест-систем ИФА для выявления специфических антител к ротавирусу

3.1. Сравнительный анализ антигенов, используемых для нсибилизации твердой фазы. Благодаря наличию перекрестных

антигенных детерминант, локализованных во внутреннем капсиде ротавирусов группы А (полипептид УРб), становится реальным использование в ИФА гетерологических ротавирусов в качестве антигена для сенсибилизации твердой фазы. Это позволяет исключить трудоемкий этап приготовления высокоочищенного препарата ротавируса человека.

В процессе оптимизации условий постановки ИФА были приготовлены и проверены три вида антигенов: штамм К ротавируса свиней, аттенуированный штамм ротавируса крупного рогатого скота и референтный штамм ротавируса обезьян $АП. Проведанный анализ показал, что испытуемые антигены ротавирусов могут быть в равной мере использованы для сенсибилизации микропанелей. Необходимым условием при этом является высокая степень очистки вируса или, альтернатигно, выращивание ротавирусов в гетерологичной культуре клеток, так как присутствующие в неочищенной культуральной вируссодеркащей жидкости клеточные компоненты, при наших исследованиях являлись причиной ложно--положительннх результатов.

3.2. Определение рабочего разведения■антивидового конъюга та. В опытах использовали антисвинной пероксидазный конъюгат, изготовленный лабораторией иммунологии ВНИИТИБП. В ходе оптимизации разрабатываемой системы И$А было проведено сравнитесь ное испытание трех разведений кот>югата: 1:50, 1:100, 1:200. В опыт брали стандартные положительные и отрицательные по отношению к ротавирусу свинные сыворотки. Разведение конъюгата 1:100 незначительно отличается .от разведения 1:50, тогда как последнее разведение (1:200) оказывается явно недостаточным, что особенно проявляется при высоких разведениях положитель-

ной сыворотки. В дальнейших исследованиях в качестве рабочего разведения использовали конъюгат, приготовленный с добавлением 10% эмбриональной сыворотки коров, в разведении 1:100.

3.3. Сопоставление результатов ИФА и РДП. С целью подтверждения специфичности полученных в ИФА результатов в качестве контрольного теста использовали реакцию диффузионной преципитации. При сопоставлении результатов, полученных пря исследовании 15 проб сыворотки кров^ и молока свиней, выявляли значительную положительную корреляцию (г =0,86).

Таким образом, можно заключить, что разработанная тест-система ИФА для выявления специфических антител к ротавирусу юмимо высокой чувствительности обладает и выраженной специ-¡ичностью.

4.Разработка тест-системы ИФА для выявления антисена ротавирусов

4.1. Получение гиперимм.унных сывороток к ротавир.ус.у свиней.

териммунную сыворотку получали из крови коз массой ЬЬ-65кг,

мунизированных очищенным и концентрированным препаратом ро-

.вируса свиней.

Очищенный и концентрированный вируссодержащий материал

ешивали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда и вводили

0,5мл в предлопаточные и подколенные лимфатические узлы

}. Через 30 дней проводили реиммунизацию очищенным и концен-

фованным препаратом ротавируеа, который вводили подкожно

адт.юванта в области предлопаточных и подколенных лимфати-

ких узлов и внутримышечно. Спустя 7-10 дней после реиммуни-

ии от коз брали кровь (1% от массы животного) для получения

кротки и вновь вводили вирус в предлопаточные и подколенные

лимфатические узлы. Через 25-30 дней повторно брали кровь. Проводили 3 цикла иммунизации коз. Полученную гипериммунную сыворотку с титром преципитирующих антител 1:64-1:28 использовали для выделения фракции 1<а6 .

Моноспецифическую гипериммунную сыворотку к ротавирусу свиней получали от псросят-гнотобиотов. На 2-3-й день жизни поросят иммунизировали перорально вакцинным штаммом ротавиру-

д

са свиней в дозе 5x10 ТЦЦ^д. Через 7 дней поросятам вводили перорально вирулентный штамм ротавируса в дозе 2хЮ3ЛДе|д. После этого с интервалом 7 дней поросйтам вводили внутримышечно очищенный препарат ротавируса из расчета не менее 100 мкг на животное. Через 7 дней после последнего введения животных обескровливали. Гиперимыунные сыворотки с титром специфических антител в ИФА не менее 1:10^ использовали для выделения фракции .

4.2. Оптимизация условий постановки ИФА. На первом этапе работы были определены рабочие разведения меченных пероксида-зой иммуноглобулина класса О (индикаторных антител). Антигены ротавирусов свиней и человека наслаивали на твердую фазу & концентрации 10-50 нг в лунку, после чего реакцию ставили при различных разведениях коныогата.

Концентрация коныогата 1,25 мкг на лунку является достат< чной для получения величины сигнала, позволяющего четко идентифицировать положительную пробу от контроля. При концентрац] коныогата 10 мкг на лунку наблюдались высокие фоновые значения. Концентрация кснъюгата 1,25 мкг на лунку резко снимала •.зувствительность теста, что может быть связано с отсутствием необходимого количества индикаторных антител. Таким образом

концентрация меченных иммуноглобулинов 1,25 мкг на л.унку является оптимальной, так как позволяет четко идентифицировать ротавирусный антиген при минимальных затратах коньюгированно-го препарата.

Дальнейшая оптимизация метода включала определение рабочего разведения иммуноглобулина С для сенсибилизации твердой фазы. Для этого панели сенсибилизировали различными концентра-

воротки коз, после чего реакцию ставили как описано в разделе "Материалы и методы", используя ротавирусные антигены в концентрациях 10 и 50 нг на лунку и рабочее разведение конъвгата (1,25 мкг на лунку).

Проведенные исследования показали, что оптимальной является концентрации 5-10 мкг на лунку. Сенсибилизация такими концентрациями обеспечивала высокий уровень регистрируемой оптической плотности, а также достоверное различие величины сигналов при положительных и отрицательных пробах (Р:М=5-15).

4.3. Анализ чувствительного метода ИФА. Для определения чувствительности разработанной нами тест-системы проводили шализ с использованием различных концентраций антигена рота-(ирусов человека, свиней и обезьян. Наличие в исследуемсм ма-ериале гомологичного (свинного) антигена в концентрации 2,5 г на лунку является достаточным для получения достоверного азличия величины сигналов между положительными и контрольными робами (Р:^=2,6). Для ротавирусов человека и обезьян минималь-ш концентрация антигена, выявляемая с помощью тест-системы, ютавляет 5 нг на лунку (РЛ7=2,2).

циями

выделенного из гипериммунной антиротавирусной сы-

Для сравнения чувствительности ИФА с другими диагностическими тестами копрофильтраты от больных гастроэнтеритом людей, поросят, телят и жеребят исследовали с помощью ИФА, РДП и ЭМ.

ИФА и ЭМ обладают одинаковой чувствительностью при выявлении ротавирусов в фекальных пробах. РДП по чувствительности уступает вышеуказанным тестам. Следует также отметить, что при скрининге проб с помощью ИФА не было случаев лодегаполо-жительного сигнала, так как во всегс положительных в ИФА проба с помощью ЭМ были обнаружены частицы ротавирусов.

Таким образом, разработанная нами тест-система помимо высокой чувствительности обладает и высокой специфичностью.

4.4.Сопоставление ИФА с электрофорезом вирусной РНК. Результаты ИФА сравнивали с результатами такого высокоспецифического теста как выявление вирусспоцифической РНК методом электрофореза. Были разработаны ускоренные и наиболее просты методы анализа РНК, которые позволяют исключить предваритель ное выделение вируса К /копрофильтрата (см. "Материалы и методы"). При анализе вирусспецифической РНК в полиакриламиднс геле были выявлены II фрагиентов, при этом совпало 13 полож! тельных результатов и по одному положительному результату н( было подтверждено другим методом.

Методы ИФА и электрофорез РНК обладают примерно одинако чувствительностью. Однако были обнаружены пробы, результата анализов которых двумя методами не совпали. Это можно объяс нить как ложноположительными и ложноотрицательными результг тами в ИФА, так и рядом других причин, например, наличием г тител при отсутствии вирусспецифической РИС в результате а

тивной репродукции вируса или, напротив, разрушением вирусного белка при сохранении вирусспецифической РНК, а также и другими причинами.

ВЫВОДЫ

1. Наружный капсид вириона ротавируса представлен полипептидами VP4 и VP?, внутренний капсид сформирован единственным полипептидом Р6, а сердцевина .состоит из трех структурных белков -VPI, VP2, VP3.

2. Штамм К ротавируса свиней обладает выраженной гемагглю-тинирующей активностью. Гемагглютинирующую активность проявляют только интактные вирионы ротавируса свиней.

3.Отработаны оптимальные условия концентрирования и очистки ротавирусов. На основе очищенных препаратов с использований ем оригинальных схем иммунизации поросят-гнотобиотов получены высокоактивные (титры антител 10® в ИФА) и моноспецифические сыворотки для конструирования современных диагностических тест-систем.

4.Разработаны высокочувствительные тест-системы для индикации и количественной оценки ротавирусного антигена и рота-вирусных антител на основе ищуноферментного анализа. Определены оптимальные условия постановки ИФА.для выявления ротавирусного антигена в различных субстратах и специфических антител в сыворотках крови, молозива, молока и других биологических секретах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ

Разработан и внедрен комплекс мероприятий по лабораторной экспресс-дианностике ротавирусной инфекции человека:

-Инструкция по изготовлению и контролю диагностического набора для выявления антигенов ротавируса человека методом Ш>А.

-Наставление по применению диагностического набора для выявления антигенов ротавирусов методом ИФА.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ротаиммунолактан: Оценка специфической активности in vivo (Вопросы вирусологии №1, 1992г.).

2. Рухадзе Г.Г., Гвинджиния М.Э., Топурия Т.Ю., Бахуча-

о

швили В.И. Оценка иммуногенной и антигенной активности нового вакцинного препарата против ротавируса свиней и трансмиссивного гастроэнтерита (Ветеринария, 1992г., в печати).

а г; з э fi о i oioneofiot пзъои а э

пЭэБпзойаоБ^эсго ¿obJ-bob^QSob ^ SaOS"^ АтфазпйзЬобпО зпЛ^Ьд^о дбйоадбоЬо С?о ЬЗосЯЗ"^0 об5пЬЬэдс;о5пЬ oqjQcnljofioS^i?

i 3 J' fi й О 3 О ii i 4 О С Р>зЬзс1 обЛо)

oSocyibo 1 9 9 2 ^.

ПЕЧАТНЫХ.Л. 1,5 УЧЕТ .ИЗЯАТ .Л,- 1.0S

БЕСПЛАТ НО

ЗАКАЗ К МГ9-6 \ii37 ТИРАЖ 100

УОП ГРУЗГИДРО/ЛГТА. ТБИЛИСИ, пр. ДАВИДА ЛГНЛШС НГБГЛИ 150

Специализированный ученый Сонет при IIIIII эксиери-зптальной и клинической терапии министерства идравоохра-чптя Ii соцобеспочспия Республики Грузия является звеном тестащш научных кадров Высшей аттестационной комиссии ЗАК) в рамках бывшего СССР.

IIa Совете защищаются диссертации но КАРДИОЛОГИИ, ЗРАПИН, АЛЛЕРГОЛОГИИ II ИММУНОЛОГИИ.

Руководствуясь Положением ВАК, Совет публикует на авах рукописи автореферат (100 экз.), который рассылает в бллчиые библиотеки всех республик и крупиеншне научные цтры по этим специальностям:

ПРЕДЛАГАЕМ: на задней обложке и последних страпп-к автореферата публиковать аннотации повейшпх лекарст-1ных препаратов, перечни выпускаемых лекарственных ¡дств и реактивов для лабораторией диагностики, а также бут другую, интересующую Вас, информацию.

Приняв наше предложение, Вы получаете [льную возможность расширить круг своих клиентов» ибо: •— авторефераты читают наиболее квалифицированные, рчески работающие специалисты;

■—■ Вы охватываете своей информацией всю территорию штего СССР;

— Вата информация попадет в ведущие клинические уч-сденпя, имеющие, наряду с заинтересованностью, доста-1то высокие материальные возможности;

— Вы можете впестп своп предложения по дополнению ска рассылки.

— Маленький тираж компенсируется:

— целевой доставкой информации п

— короткими сроками исполнении.

но наш ГЛАВНЫЙ КОЗЫРЬ—САМЫЕ НИЗКИЕ В МН-РЕКЛЛМЬТ цены.

Компановка текстового и эмблемпого материала в преде-стапдартпого листа A4—дело Вашего вкуса и возможно— материал идет в издание без пзмепепнй. Материал в экземплярах присылайте по адресу: 380050, Тбилиси, ТПТ1Т экспериментальной п клинической терапии Ученому секретарю Спецсовста — Хомернкн С. Г. Контактные телефоны — 54-74-89 и 00-43-20. Известные Вам тенденции рынка несомненно приведут в зм времени к росту цен. Снетппте использовать наш ВТТЫП КОЗЫРЬ п Вы убедитесь, что на Советском рын-аксимальпая эффективность возможна при минимальных 1тах. I

Iio j.K'HIiyyyi.ll. rtyll.l^ftyflj.l зноо:;:) «АпсиЬп,(.П^Лои^СПЬ ^.-I (^OC. (ii'ciSy j Iii >4 h<) ikJCiU1"1 HEART S!J

int^coio bcjd.iSiciaoCTib :'or,uniting "omoi.fiijлсо^тгл •

GEORGIAN NATIONAL ATHEROSCLEROSIS ASSOCIATIC

4 Ljubljana str., Tbilisi 380059, Republic of Georgi Tel. (8832) SI 74 89 Tele* 212297 HEART SU

Грузинская национальная ассоциация по атеросклер является официально зарегистрированным юрндичеы лицом н сотрудничает с Всемирно]'! ассоциацией по ате склерозу.

Ассоциация объединяет врачей, научных работник предпринимателей, людей других специальностей, правляющих свои усилия на оздоровление населения

Ассоциация проводит научные исследования, апроба медикаментозных средств и экспертизу научных р по проблемам атеросклероза и связанных с ним заб ваппй.

Ассоциация оказывает населению услуги, связанные становлением здорового образа жизни, рациопалг питания, профилактики и лечения .атеросклероза.

Ассоциация щшиим.аст от организаций и отдельных граждан добровольные денежные взносы, направляв На осуществление своих уставных целен.

Паш расчетный счет № 0006091 Промстройбанке Дндубпнского ' г. Тбилиси, индекс МФО 521783