Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Стимуляторы неспецифической резистентности на основе РНК для ветеринарной медицины

О А ;' .)1

На правах рукописи

АЛИКИН ЮРИЙ СЕРАФИМОВИЧ

СТИМУЛЯТОРЫ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ НА ОСНОВЕ РНК ДЛЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

I

Новосибирск 1998

Работа выполнена в Научно-исследовательском конструкторско-технологическом институте биологически активных веществ Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Научные консультанты: доктор ветеринарных наук, профессор,'

член-корреспондент Россельхозакадемии, заслуженный деятель науки РФ Донченко Александр Семенович; доктор биологических наук Масычева Валентина Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор,

■ академик Россельхозакадемии, заслуженный деятель науки РФ Ямов Василий Захарович; доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Коненков Владимир Иосифович;- . доктор биологических наук Морузи Ирина Владимировна Ведущее учреждение: Новосибирский государственный аграрный университет

Защита диссертации состоится 199В г в_ч.

на заседании диссертационного совета Д. 020.23.01 при Институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН

(633128, Новосибирская область, п.Краснообск, ИЗВСиДВ)

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН.

Автореферат разослан "__1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор ветеринарных наук

^ / А. А.Самоловов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. Актуальность темы. Существование проблемы профилактики и ликвидации инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных определило тематическую направленность данной работы.

Исследованиями последних десятилетий в области биологически активных веществ (БАБ) выявлена важная роль рибонуклеиновых кислот в регуляции резистентности организма животных (Ф.И.Ершов, 1982; В.М.Земсков, А.М.Земсков, 1987; Г. А.Ноздрин, 1996).

Препараты на основе РНК обладают противовирусным действием, стимулируют неспецифическую резистентность, гемопоэз, являются иммуномодуляторами, иммуноадъювантами, антимутагенами (Ф.И.Ершов, В.М.Жданов, 1982; В.М. Земсков, А. М. Земсков и др., 1982, 1984, 1987; Ф.И.Ершов, В.В.Малиновская, 1996).

Важную роль в направленности действия препаратов на основе РНК играет структура таких соединений: двуспиральные (дс) РНК обладают выраженными интерферониндуцирующими и противовирусными свойствами, в то время как однонитевым РНК присущи свойства имму-номодуляторов, адъювантов, стимуляторов неспецифической резистентности.

Все это позволяет использовать препараты с подобной структурой в различных биологических моделях: двуспиральные РНК - в эндогенной интерферонизации, однонитевые РНК - в фенотипической коррекции Ir- и Т-независимости иммунного ответа, тахифилаксии, антидотной и фагоцитарной терапии, стимуляции неспецифической резистентности и коррекции иммуннодефицитов (Ф. И. Ершов, А.С.Ново-хатский, 1981; H.H.Носик, Ф.И.Ершов, 1982, 1984; В.М.Жданов, Ф.И.Ершов, 1983; Ф.И.Ершов, И.Ф.Баринский и др., 1983; В.М'. Земсков и др.. 1982, 1984, 1987; Р. В.Петров и др., 1986, 1988; Н.А.Радомская, Т.М.Соколова и др., 1988; Ф.И.Ершов, В.В.Малиновская, 1996; J.J.Greene et al., 1984 и др.).

В последние годы интенсивно разрабатывается новое направление профилактики и терапии вирусных инфекций - интерферонизация. Она может быть пассивной, когда организм насыщается экзогенным интерфероном, и активной, когда при помощи различных индукторов в организме происходит наработка собственного эндогенного интерферона. Введение в организм индукторов интерферона инициирует раз-

витие состояния противовирусной защиты. (А.С.Садыков, Ф.И.Ершов и др., 1978; Ф.И.Ершов, В.М.Жданов, 1982).

Впервые опыты на сельскохозяйственных животных по изучению действия индукторов интерферона (фаговая дс РНК, полигуацил, ти-лорон, левамизол) были поставлены в ВГНКИ ветпрепаратов в 1982-85 гг (А.В.Селиванов и др., 1985, 1987).

Препараты фаговых дсРНК обладают широким спектром противовирусной активности при испытании на лабораторных животных (А.Н.Фомина и др.,1981; И.Ф.Баринский и др., 1982; H.H.Носик, Ф.И.Ершов и др., 1984). Это дало возможность предположить, что и на других видах теплокровных животных препараты на основе дсРНК иного происхождения будут проявлять защитное действие. Что же касается низших позвоночных, в частности рыб, то вопросы, связанные с действием на них иммуномодуляторов и индукторов интерферона практически не исследованы (A.E.Ellis, 1988; E.D.Eaton, 1990).

Исследования, выполненные в НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор" и ИЭВ-СиДВ, по получению природных и синтетических иммуномодуляторов и индукторов интерферона на основе однонитевых и двуспиральных РНК (дс РНК), позволили приступить к созданию стимуляторов неспецифической резистентности и противовирусных препаратов для применения в ветеринарии (коммерческое название - поливедрим и вестин). В качестве микробиологического источника этих препаратов были использованы дрожжи Saccharomyces cerevisiae.

Препараты на основе РНК безвредны, не способны перегружать детоксицирующую систему цитохромов Р-450.

В то же время анализ широкого спектра биологических активностей этих препаратов, выясненного к этому времени, позволил нам предположить, что они могут быть использованы для практического применения при обеспечении инфекционного благополучия широкого круга сельскохозяйственных животных, что и определило цель проведенных исследований.

Цель и задачи исследований. Разработка новых препаратов-стимуляторов неспецифической резистентности на основе РНК из дрожжей и способов их применения для животных.

Задачи исследований:

- изучить безвредность препаратов;

- исследовать специфическую, интерферониндуцирующую и проти-

вовирусную активность препаратов;

- определить специфическую активность препаратов в опытах на моделях заболеваний сельскохозяйственных животных и в условиях производства;

- изучить сравнительную противовирусную активность препаратов на основе двуспиральных РНК у низших и высших позвоночных.

Научная новизна работы. Теоретически обоснованы и разработаны препараты на основе одно- и двуспиральных РНК из дрожжей и способы их применения в ветеринарной медицине.

Оценена сравнительная эффективность препаратов у высших и низших позвоночных.

Изучен вклад отдельных систем организма, обеспечивающих состояние неспецифической резистентности под действием препаратов РНК и выяснена при этом ведущая роль системы макрофагов.

Выдвинута концепция об универсальной роли рибонуклеиновых кислот в противоинфекционной устойчивости организмов различных классов.

Практическая значимость работы. Препараты полирибонат (поли-ведрим) и вестин (ридостин)на основе однонитевых и двуспиральных РНК из дрожжей предложены как коммерческие для ветеринарной практики.

Принцип их действия отработан в процессе эволюции микро-(РНК-вые вирусы) и макроорганизмов разных классов, предложены способы иммунокоррекции и эндогенной интерферонизации.

В развитие выдвинутого принципа разработан и испытывается целый ряд комплексных препаратов иммуномодулирующего, ростостиму-лирующего, противоинфекционного действия: риболизин, элеурибон, эктериб, элеутерицид (Г.Н.Ноздрин, 1996; И.В.Наумкин, 1996), фа-гостим (А.А.Сизов, 1996).

Полученные материалы используются в курсе лекций по ветеринарной медицине НГАУ.

Разработанные препараты и способы их применения в ветеринарной практике защищены патентами:

- "Способ профилактики туберкулеза животных" (И 1790414 от 22.09.92 г. );

- "Способ выращивания телят" (Ы 2015697 от 15.07.94 г.);

- "Способ профилактики вирусных заболеваний рыб" (N 2043714

от 20.09.95 г.);

- "Индуктор интерферона Ридостин" RU (М 2083221 МКИ А61К 38/20 N19 от 10.07.97 г).

Материалы исследований вошли в следующие разработки и нормативно-технологические документы:

- ТУ 9291-008-00479979-94 "Вестин (ридостин)" и Временное наставление по применению вестина (ридостина) в ветеринарии (06.07.1994 г. N13-4-2/121);

- ТУ 9291-007-004479979-94 "Полирибонат (поливедрим)" и Временное наставление по применению полирибоната (поливедрима) в ветеринарии (06.07.1994 Г. N13-5-2/120).

Препараты утверждены Департаментом ветеринарии РФ для широких производственных испытаний (1994).

- Иммуномодуляторы нуклеиновой природы как стимуляторы неспецифической резистентности и продуктивности молодняка крупного рогатого скота (рекомендации). Утверждены Учеными Советами ИЭВ-СиДВ СО РАСХН и НГАУ, одобрены для внедрения Ветеринарным НТС Новосибирского АПК (1991).

На защиту выносятся данные о безвредности и специфической активности препаратов на основе однонитевых и двуспиральных РНК из дрожжей Saccharorayces cerevisiae на лабораторных и сельскохозяйственных животных, данные об иммуномодулирующей активности препаратов на моделях заболеваний сельскохозяйственных животных, результаты сравнительного изучения действия препаратов у высших и низших позвоночных, особенности методологии разработки и их применения в ветеринарной практике.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены:

- на ежегодных отчетных сессиях ГНЦ ВБ "Вектор" (г.Новосибирск, 1993-1996 гг);

- на научных конференциях ИЭВСиДВ СО РАСХН (г.Новосибирск, 1990-1996 гг);

- на 6-й, 7-й. 8-й Межгосударственных научно-практических конференциях "Новые фармакологические средства в ветеринарии" (г.Санкт-Петербург, 1994, 1995, 1996 гг);

- на II и III Съездах физиологов Сибири и Дальнего Востока (г.Новосибирск, 1995, 1997 гг);

- на Международном семинаре по болезням рыб (Польша, 1993 г);

- на 6-й и 8-й Международных конференциях Европейской ассоциации по болезням рыб (Франция, 1993; Испания, 1995);

- на III Международном симпозиуме по вирусам низших позвоночных (Франция, 1995).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации имеется 37 публикаций.

Реализация результатов исследований. Материалы диссертации использованы:

- для представления в Ветеринарный фармакологический совет и утверждения в Департаменте Ветеринарии РФ препарата полирибонат (поливедрим) в качестве стимулятора неспецифической резистентности, развития и иммуноадъюванта;

- для представления в Ветеринарный фармакологический совет и утверждения в Департаменте Ветеринарии РФ препарата вестин (ри-достин) в качестве противовирусного средства и иммуномодулятора;

- для утверждения в Фармкомитете МЗ РФ препарата ридостин в качестве противовирусного средства и иммуномодулятора;

- в производстве для коррекции иммунодефицитов и повышения интенсивности развития телят и поросят; для повышения эффективности противоэпизоотических мероприятий при вакцинации телят БЦЖ против туберкулеза животных (Новосибирская обл.) и жеребят при мыте лошадей (Республика Саха, Якутия); при лечении вирусных заболеваний домашних животных в ветеринарных клиниках г.Новосибирск и г.Барнаул.

Структура и объем исследования. Диссертация изложена на 314 страницах, иллюстрирована 55 таблицами и 12 рисунками, имеет 16 приложений. Список литературы включает 443 источника., из них 154 зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Субстанции однонитевых высокополимерных (вп)РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, их лекарственные формы - полирибонат и поливедрим; субстанции двуспиральных (дс)РНК из киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, их лекарственные формы -ридостин и вестин разработаны в НИКТИ БАВ.

Анализ готового продукта осуществляли по утвержденным методикам, разработанным на основе современных физико-химических методов анализа по ТУ 9291-007-00479979-94 на ОП - Полирибонат (По-ливедрим) и ТУ 9291-008-00479979-94 на ОП - Вестин (Ридостин). Полирибонат (поливедрим) содержат: впРНК - 98-99%, бежа -0,2-0,4%, влага - 0,6-1,8%; вестин (ридостин) - дсРНК - 6-17%, нуклеотидный материал - 40-65%, NaCl - 16,2-50,4%, влага -0,6-1,8%.

Экспериментальные исследования препаратов проводили в соответствии с требованиями Ветеринарного фармакологического совета Департамента ветеринарии МСХиП РФ совместно с Отделом биологических исследований института. Изучались безвредность препаратов на различных видах лабораторных животных, способы их введения, влияние различных доз, кратность введения, восстановительные периоды в условиях острого и хронического эксперимента по отношению к контрольным животным. Контрольным животным вводили физиологический раствор в аналогичном объеме и подвергали той же процедуре обследования. Регистрировали следующие показатели: вес, температуру тела, пульс, двигательную активность, поведенческие реакции в "открытом поле", проводили гематологический анализ. Патологоа-натомические и гистологические исследования осуществляли по Р.Лилли (1969).

Специфическая активность препаратов изучалась в модельных экспериментах. Исследовались иммуномодулирующие, иммуноадьювант-ные эффекты, уровень индукции интерферона, противовирусные свойства, фагоцитоз у экспериментальных и производственных сельскохозяйственных животных.

Гуморальный иммунный ответ оценивали в реакции Ерне по количеству АОК методом учета локальных зон гемолиза (по В.Н.Каледину и др., 1975); клеточный иммунитет по ГЗТ согласно (P.H.Lagrange et al.. 1974). Фагоцитоз In vitro и In vivo перитонеальных макрофагов и нейтрофилов определяли методом (Т.P.Stossel, 1975), НСТ- и ОФР-методом (А.Н.Маянский, 1989; П.Н.Смирнов и др.. 1989). Интерферон оценивали в сыворотке крови б/п мышей и поросят в различные сроки после введения препаратов. Активность интерферона устанавливали по подавлению цитопатического действия (ЦПД) тест-вируса везикулярного стоматита или энцефаломиокардита (ВВС или ЭМК) в

культурах клеток L-929 или J1-68 микрометодом (Ф.И.Ершов, А. М.Са-йиткулов, 1984). Противовирусные свойства вестина (ридостина) определяли на моделях вирусных заболеваний: гриппа А/Рг-8/34, A/Aichl-68 мышей, чумы птиц, герпеса морских свинок - совместно с сотрудниками ВНИИМБ ГНЦ ВБ"Вектор" И.В.Тимофеевым, Г.М.Игнатьевым, клещевого энцефалита (КЗ), энцефаломиокардита (ЭМК), восточного и западного энцефаломиелита лошадей (Вс и ЗЭЛ) у мышей -совместно с сотрудниками Института вирусологии им. Д. И. Ивановского Ф.И.Ершовым, Н.Н.Носиком, И.Ф.Баринским.

Все цифровые результаты обрабытывали статистически (К.Доер-фель, 1969; Г.Ф.Лакин, 1973; В. Б.Прозоровский и др., 1978).

Исследования проводились самостоятельно в рамках ГНЦ ВБ "Вектор", а также совместно с сотрудниками ИЭВСиДВ (Д.И.Найманов, Н.А.Шкиль, С.И.Прудников, Т.И.Прудникова, А.С.Донченко, В.Н.Дон-ченко, Г.П.Протодьяконова); Кафедры фармакологии и общей патологии Факультета ветеринарной медицины НГАУ (Г.А.Ноздрин, И.В.Наум-кин, Ю.Д.Шмидт), ВНИИПРХа (И.С.Щелкунов. Т.И.Щелкунова), ВГНКИ (А.В.Селиванов, В.И.Уласов), ЛВИ (А.П.Гречухин), ССХИ (Ф.А.Мещеряков, Т.М.Воронина), ВНИВИПа (Н.Д.Придыбайло), Центральной НИЛ пантового оленеводства (В. Г.Луницын).

В условиях производства ветеринарные препараты изучались в качестве: адьювантов при вакцинации телят БЦЖ против туберкулеза бычьего типа; при вакцинации поросят против классической чумы и ВГТС; стимуляторов неспецифической резистентности у телят против желудочно-кишечных заболеваний, у поросят против корона- и рота-вирусных инфекции, у цыплят-бройлеров при выращивании; профилактического и лечебного средства собак в ветеринарных лечебницах и питомниках служебного собаководства МВД и Погранвойск СССР.

Экспериментальные исследования по безвредности и специфической активности препаратов проведены на 2000 белых беспородных мышах, 500 белых крысах линии "Вистар", 800 морских свинках, 40 кроликах, 120 собаках, 200 поросятах, 15 телятах, на 20 тыс. цыплят-бройлеров, на 500 экземплярах карпа.

Результаты исследований Изучение доклинических эффектов одно- и двуспиральных РНК у экспериментальных животных

Безвредность высокополимерной РНК и полирибоната Изучение безвредности высокополимерной РНК и полирибоната проведено на различных лабораторных животных: мышах, крысах, морских свинках, кроликах и собаках.

Острую токсичность впРНК изучали на белых беспородных мышах, крысах и других животных. Препарат является малотоксичным соединением: ЛД50 для мышей при в/бр способе введения составляет 1325 (884-1991) мг/кг, для крыс - 1300 мг/кг, для морских свинок - 847 мг/кг, для кроликов - 547 мг/кг.

Картина острого отравления большими дозами препарата (2,7 г/кг) характеризовалась снижением двигательной активности, температуры тела, диареями и судорогами. При вскрытии погибших животных отмечали отечность желудка и геморрагии кишечника.

При внутрибрюшинном (в/бр) и внутримышечном (в/м) введении полирибоната значения среднесмертельных доз для мышей и крыс не выявлены, так как они превышают максимальные дозы, доступные для этих способов введения из-за низкой растворимости препарата в малых объемах растворителя, но они превышают 800 мг/кг.

При в/м введении доз 500 мг/кг и выше наблюдали дозозависи-мую картину отравления. Применение РНК при однократных и многократных инъекциях закономерно снижало количество лейкоцитов в крови у крыс. Реакция на введение препарата мышам и крысам зависела от способа введения и сопровождалась понижением температуры тела," а также торможением двигательной активности.

Патологоанатомическими исследованиями не выявлено токсического действия впРНК и полирибоната (поливедрима) на внутренние органы мышей при однократном парентеральном введении в дозах 100-1000 мг/кг.

Испытания токсичности полирибоната при одно- и многократном внутримышечном введении мышам, крысам, морским свинкам и собакам не выявило общетоксических или тканетоксических свойств у препарата в интервале доз 0.7- 500 мг/кг.

При парентеральном введении морским свинкам полирибонат в дозах 100-300 мг/кг оказывает стимулирующее влияние на гемопоэз в

костном мозге, увеличивая пул стволовых клеток на 7-14 сутки.

Патоморфологические исследования органов крыс и собак, получавших многократные инъекции полирибоната показали (табл.1), что

Таблица 1

Патоморфологический и патогистологический анализ органов крыс и собак после многократного введения полирибоната

Орган

Крысы

Собаки

Поджелудочная железа Сердце Почки

Щитовидная

железа

Надпочечники

Легкие

Тимус Печень

Селезенка

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ)

Норма

Норма

Норма

Усиление функциональной активности, активация Доза 300 мг/кг - гиперемия, увеличение на 40% весового индекса

Улучшение состояния органа по сравнению с контролем, увеличение на 12% относительной массы Активно функционирующий орган Доза 300 мг/кг - изменения носят пролиферативный характер Доза 100 мг/кг - наблюдается функциональная активация органа, при дозе 300 мг/кг-такие же изменения как и в печени Доза 300 мг/кг - в толстой кишке наблюдается диффузная клеточная инфильтрация

Норма

Норма Норма

Норма Норма

Норма

н/и Норма

Умеренная гиперплазия, более выраженная при дозе 7 мг/кг Норма

введение его крысам в дозе 100 мг/кг не приводит к значительным изменениям гистологической картины органов через сутки после 10 инъекции. При убое крыс через 10 дней после прекращения инъекций методами патоморфологического и патогистологического анализа не

удалось выявить нарушений структуры внутренних органов, которые не обнаружились бы у контрольных животных.

На основании анализа структурных изменений во внутренних органах крыс на фоне 10-кратного введения полирибоната в дозе 300 мг/кг установлено, что препарат вызывает активацию пролифератив-ных процессов в соединительной ткани печени, селезенки и, по-видимому, желудочно-кишечного тракта (ЖКТ).

При гистологическом исследовании сердца, легких, печени, надпочечников, лимфоузлов, поджелудочной железы, слизистой оболочки кишечника, срезов коры головного мозга собак через 1 и 7 суток после окончания 10-кратного введения полирибоната не выявлено существенных отклонений от уровня контроля ни у одной из исследованных опытных групп.

На основании результатов проведенного детального токсикологического исследования впРНК и полирибоната можно заключить, что препарат не оказывает выраженного токсического действия, но обладает нейротропным свойством и в малых дозах при длительном введении способствует компенсации и сглаживанию эффектов стресса.

Безвредность дрожжевой дсРНК. ридостина (вестина) Изучение острой токсичности проводили на белых беспородных мышах при внут-рибрюшинном введении образцов субстанции дсРНК и лекформы (ридостина, вестина) с различным содержанием двуспиральных РНК.

В расширенном токсикологическом эксперименте для партии препарата с содержанием дсРНК 13,1% установлены следующие параметры летальных доз: ЛД16 = 26,0 мг/кг, ЛД50 = 45,0 (34,4-59,0) мг/кг, ЛД84 = 64,9 мг/кг. Именно на этой партии были проведены углубленные изучения токсикологических и специфических эффектов ридостина.

По значениям среднесмертельных доз препарата дсРНК при внут-рибрюшинном введении можно отнести к среднетоксическим соединениям. Значения ЛД50, установленные на мышах, для 5 партий вестина (ридостина) с содержанием основного вещества не менее 6%, составляют от 45 до 55 мг/кг.

Дозы ридостина 160-200 мг/кг вызывают гибель части крыс при в/бр введении и превышают соответствующие дозы для мышей в 4-5 раз. На морских свинках дозы ридостина в 100 мг/кг не приводят к

гибели животных.

Картина острого отравления дсРНК характерна для действия больших доз препаратов РНК, но в отличие от последних наблюдаются и параличи конечностей. Патологическая выраженность действия препаратов дсРНК зависит от дозы. Чувствительным индикатором состояния животных при этом является температура и масса тела: при острых отравлениях наблюдается снижение, у выживших животных - восстановление до нормы.

Сублетальные дозы (МПД и 1/5 ЛД50) при однократном введении бельм б/п мышам приводят к изменениям картины белой крови (лейкопении, на фоне которой развивается нейтрофилез), морфологии печени, почек и желудочно-кишечного тракта, которые носят обратимый характер.

Многократное (25-кратное) введение препарата в дозе 1/5 ЛД50 может приводить к не выходящему за пределы нормы изменению ряда гематологических и биохимических показателей, вызывает нарушения морфологической картины ряда внутренних органов животных. Двухнедельный период восстановления нормализует работу всех систем организма, за исключением почек, в клубочках которых увеличение сопровождается инфильтрацией лейкоцитами. Препарат может в этой дозе вызывать обострение имеющихся воспалительных процессов в органах. Доза ридостина (вестина), равная 1/50 ЛД50 (близкая к предполагаемой терапевтической), токсическим действием не обладает.

Специфические эффекты впРНК. полирибоната и дрожжевой дсРНК

Оценка первичного иммунного ответа на ЭБ по действию 4-х опытных партий впРНК и полирибоната в аналогичных экспериментальных условиях на мышах С51В1/6 представлена в таблице 2. Показано, что препараты оказывают стимулирующий эффект на иммунный ответ: в опытных группах количество антителообразующих клеток в селезенке увеличилось в 2-3 раза, титры гемолизина в сыворотке повышались в 2-4 раза по сравнению с контрольными значениями.

Данные исследований о действии дсРНК на образование АОК в селезенке и изменения титра антител в сыворотке крови при введении животным различных доз лекарственной формы препарата (стерильной формы дсРНК), партии 10584, на которой были выполнены все

Таблица 2

Влияние впРНК и полирибоната (100 мг/кг) на гуморальный иммунный ответ у мышей линии С57В1/6, иммунизированных ЭБ в дозе 1 -10®/мышь

I I

Условия опыта (Количество АОК на | Титры

-1-1-¡1-10е ЯСКС | гемолизинов

Партия |Пол |Количество! I Ьоя2

препарата |животных |животных | I

-1-1_I_I_

Физ.р-р Самцы 6 29± 6 -

впРНК N1 6 62±13 -

Полирибонат -"- 6 82+30 -

впРНК N5 6 60120 -

Физ.р-р Самки 6 23+17 46

впРНК N3 12 48+ 8 86

Полирибонат -"- 6 50115 85

Физ.р-р Самцы 6 121 4 64

впРНК N3 12 271 9 Е--СО Ч-)

Полирибонат -"- . 6 32+ 8* 213

Примечание: * - обозначены результаты, достоверно отличающиеся от контроля.

токсикологические исследования представлены в таблице 3. Из представленных данных видно, что при оценке результатов на 3-й день после иммунизации животных антигеном (ЭБ) в дозе 1 •108 наблюдается увеличение под действием дсРНК количества АОК в селезенке мышей С57В1/6 в 2 раза. Увеличивались титры гемолизинов в сыворотке крови и относительная масса селезенки. Из полученных данных следует, что оптимальной иммуностимулирующей дозой препарата является 2,5-5 мг/кг.

Исследования действия препаратов впРНК и дсРНК на гуморальное звено иммунной системы при одновременном введении препарата с антигеном (ЭБ) показало, что как впРНК, так и дсРНК обладают иммуностимулирующим действием, увеличивая количество АОК в селезенке и повышая титры антител в сыворотке крови экспериментальных

Таблица 3

Влияние ридостина (вестина) на гуморальный иммунный ответ мышей линии С57В1/6, иммунизированных ЭБ в дозе 1 -108/мышь

Условия опыта

возраст живот-1 доза препарата, ных, мес. |мг/кг

ОВС, мг/кг

Число АОК |Титр на 10е ЯСКС|гемолизинов, lLog2

2-3

Физиологический

р-р 4, 99+0,19 23±2 3,2

1,25 5, 94+0,28 28±3 3,5

2, 50 5,98+0.26 48±3* 4.1

5,00 5, 78+0. 21 52±4* 4,1

10,00 5, 62±0,17 53±2* 4,3

Физиологический

р-р 5, 36+0, 43 4±1 0,3

2,50 5,40±0, 87 18±4* -2,8

5,00 5,17+0,67 12+3* 1,2

10, 00 5,41±0,61 14+5 1,8

1

Примечание: * - Р < 0,05

животных. Иммуностимулирующие эффекты препаратов наблюдаются в дозах: впРНК - 10-100 мг/кг, дсРНК - 2,5-5 мг/кг.

Установлено, что иммуностимулирующая активность дсРНК, ридостина (вестина) проявляется в большей степени в условиях сниженной иммунореактивности и при иммунизирующих дозах антигена ниже оптимального уровня.

Исследования действия препаратов впРНК и дсРНК на клеточный иммунитет, оцененное по реакции ГЗТ, показали, что впРНК не оказывает влияние на ГЗТ животных; ридостин (вестин) в дозе 10 мг/кг угнетает развитие реакции ГЗТ. вызванной введением оптимальной дозы антигена (ЭБ) при назначении в день сенсибилизации, а в дозе 5 мг/кг - за сутки до сенсибилизации. В случае, если реакция ГЗТ вызвана субоптимальной дозой антигена, препарат стимулировал ее

развитие через 2-е суток после введения ЭБ.

Исследование фагоцитоза перктонеальных макрофагов и нейгра-филов периферической крови у мышей под действием препаратов РНК показало следующее:

- препараты впРНК и полирибоната в дозах 10-100 мг/кг умеренно активировали фагоцитоз перитонеальных макрофагов In vivo;

- функциональная активность нейтрофилов под действием впРНК и полирибоната носила двуфазный характер: активность увеличивалась через 2 ч после введения, через 24 ч снижалась до уровня контрольных животных, а через 72 ч наблюдалось её увеличение до 250-300% по сравнению с контролем;

- ридостин (вестин), введенный мышам за 5 ч до исследования фагоцитоза, максимально увеличивает фагоцитарную активность (ФА) макрофагов в 2, 5 раза. Через 24 ч активность снижается, а через 72 ч вновь повышается в 1,5 раза по сравнению с контролем. С возрастом мышей этот показатель снижается.

Фагоцитарный индекс (ФИ) перитонеальных макрофагов мышей под действием препаратов РНК изменяется незначительно.

Для установления уровня и определения дозовой зависимости интерферониндуцирующей активности ридостина (вестина) проведено исследование продукции интерферона у б/п мышей от 5 партий препарата при в/бр введении (табл. 4). Максимальные титры наблюдаются при введении доз 5-10 мг/кг. Уровень их для всех серий достаточно высок (853-1173 ИЕ50/0.1 мл), но и в дозе 2,5 мг/кг ридостин (вестин) способен вызывать значительную продукцию интерферона.

Препарат на основе природной двуспиральной РНК киллерных дрожжей обладает выраженной интерферониндуцирующей активностью в организме мышей и кроликов, сравнимой с аналогичными свойствами синтетических (поли И поли Ц и поли Г поли Ц) и других природных интерфероногенов (фага f2). (А.Л.Тимковский, Ф.И.Ершов, 1981; Л.М.Вильнер с соавт., 1981; В.П.Ложа с соавт.. 1981; H.H.Носик, Ф.И.Ершов, 1984; N.Fuchsberger et al.. 1972). Максимальный специфический эффект развивается при введении доз дсРНК 2,5-10 мг/кг. Индукция интерферона происходит при различных путях введения препарата в организм. По скорости и динамике образования интерферона

Таблица 4

Интерферониндуцирующая активность ридостина (вестина) при в/бр введении б/п мышам

I

Серия I Титры интерферона (ИЕ50/0,1 мл) в сыворотке крови препарата! при введении ридостина (вестина) в дозах (мг/кг)

1 1 1 0,07 I 1 1 2.5 1 1 5 ! I 10 1

10584 30±3 586±39 1109+ 73 1173И73

20984 <20 512+78 960+143 960+143

30884 <20 480+72 853±135 853±135

40884 <20 576+64 1024+156 960±156

50884 <20 384+57 853±135 960±156

ридостин (вестин) следует отнести к классу индукторов "раннего" действия.

Наряду с выраженной интерферониндуцирующей активностью препараты ридостина способны сохранять эту активность при длительном хранении в лиофилизованном состоянии: не менее 2 лет. следовательно, ридостин (вестин) является эффективным индуктором интерферона. в организме экспериментальных животных.

Противовирусная активность испытана в опытах на белых мышах при профилактическом и лечебном применении препарата. В таблице 5 представлены результаты о степени защиты мышей от экспериментальных вирусных инфекций субстанцией дсРНК и лекформой - ридостином (вестином).

Результаты исследований показали, что как субстанция дрожжевой дсРНК, так и ее лекарственная форма ридостин (вестин) обладают выраженным противовирусным действием при инфекциях, вызванных вирусами гриппа, чумы птиц, энцефаломиокардита мышей, клещевого энцефалита, восточного энцефаломиелита лошадей.

Как известно интерферониндуцирующая и противовирусная активность двуспиральных РНК обусловлены наличием в них двунитевых РНК. В то же время имеются сведения о том, что большое содержание двунитевых РНК вызывает целый ряд побочных эффектов. С целью выяснения оптимальных соотношений содержания дсРНК в препарате,

Таблица 5

Степень защиты мышей от экспериментальных вирусных инфекций дрожжевой дсРНК и её лекарственной формой (ридостином)

-1-1-1-;-

Модель вирусной инфекции| Форма ¡Степень ¡Организация, прово-

I препарата|защиты, % |дившая испытания

Грипп А/Рг - 8/34

Грипп A/Aichi 68 Энцефаломиокардит (ВЭМК)

Вирус чумы птиц

Клещевой энцефалит (КЗ) Восточный энцефаломиелит лошадей (ВсЭЛ) Западный энцефаломиелит лошадей (ЗЭЛ)

Субстанция 28,4-57,5 ВНИИ Молекулярной

биологии 23,0-83,0 -"--"- 20,0-56,0 Ин-т вирусологии Лекформа 36,6-46,6

60,0-73,0 ВНИИ Молекулярной биологии

-"- 60,0-75,0 Ин-т вирусологии 20,0-75,0 -"16,0-25.0 -"-

оценки его влияния на интерферониндуцирующую и противовирусную активность, химиотерапевтический индекс были выполнены исследования на субстанции дрожжевой дсРНК.

В таблице 6 приведены данные определения интерферониндуциру-ющей активности дсРНК в зависимости от дозы препарата и содержания дсРНК в ней. Для этого воспользовались приемом, обычно применяемым в биохимии для оценки активности ферментов. Активность, как правило, отнесенная к навеске препарата, обозначается, как абсолютная, а к содержанию действующего вещества - как удельная.

Как показывают данные таблицы, абсолютная интерферониндуци-рующая активность дсРНК, начиная с дозы 1,71 мг/кг, устанавливается на одном и том же уровне 800-1000 ИЕ50/0,1 мл. В то же время интерферониндуцирующая активность, пересчитанная на содержание самой дсРНК в навеске и названная нами удельной активностью, показывает иную динамику образования интерферона в организме мышей в зависимости от дозы индуктора интерферона.

Таблица 6

Зависимость абсолютной и удельной интерферониндуцирующей активности дрожжевой дсРНК от дозы препарата

Навеска 1 1 Содержание 1 I Интерферониндуцирующая активность

препарата. 1дсРНК 1 1

мг/кг |в навеске. 1 абсолютная, | удельная,

1мг/кг Н- |ИЕ50/0.1 мл |ИЕ50/0,1 мл/мг дсРНК —1-1-

9,60+1.14 (6) 2,82 ±0,34 (6) 880,8+131,1 (6) 312.7+ 27,7 (6)

4,93+0,39 (6) 1,33 ±0,18 (6) 988,8±134,1 (5) 751,0+ 43,7 (5)

2,49+0,25 (5) 0,84 ±0,10 (5) 984,6±106,7 (5) 1183,4+ 41,4 (5)

1,71±0,20 (7) 0,41 ±0,057(7) 690,0+ 87,7 (7) 1693,0+ 43,9 (7)

0.78+0.17 (5) 0,235±0,056(5) 277,0+ 56,4 (5) 1236,6+137.9 (5)

0,63+0,18 (5) 0.208±0.045(5) 725,0±119,9 (5) 3909,2±618,8 (5)

Примечание: Цифры в скобках - число наблюдений.

Так при больших дозах (2,82±0,34) мг дсРНК. содержащейся в препарате, удельная активность резко снижена (312,7+27,7), по-видимому, за счет токсического действия дсРНК. В дозе 0,41±0,057 мг дсРНК, содержащейся в препарате, наблюдается максимум удельной активности, составляющий 1693,0±43,9 ИЕ50/0,1 мл /мг дсРНК. При малых дозах (0,208-0,235 мг дсРНК) наблюдается значительный разброс данных от 1236+137,9 до 3909,2 ±618,8 ИЕ/0.1 мл/мг дсРНК. В то же время снижение удельной активности в первом случае может быть связано с уменьшением дозы вводимого препарата, а увеличение во втором может быть обусловлено недостаточной точностью используемого анализа интерферониндуцируемой активности.

Такой прием использования показателя удельной активности для характеристики индуктора интерферона позволил определить минимальную эффективную интерферониндуцирующую дозу препарата дсРНК. Эта доза для дрожжевой дсРНК, по приведенным результатам, составляет 1,71±0,20 мг/кг, а содержание в ней чистой дсРНК 0,41±0,057 мг/кг веса животных.

На основании интерферониндуцирующих данных для различных партий дрожжевой дсРНК рассчитан модифицированный химиотерапевти-ческий индекс (мХТИ), определяемый как соотношение: ХТИ=МТД/МЭД,

где МТД - минимальная токсическая доза, МЭД - минимальная эффективная доза. В свою очередь. МТД=ЛД50/4 (А.С.Садыков с соавт., 1978). В нашем случае, использовали вместо МЭД минимальную эффективную интерферониндуцирующую дозу (МЭИД), и тогда: мХТИ=МТД/МЭ-ИД.

В таблице 7 приведены сравнительные данные рассчитанных мХТИ для различных партий дрожжевой дсРНК и их противовирусной эффективности, определенной экспериментально у мышей.

Таблица 7

Сравнение рассчитанных мХТИ различных партий дрожжевой дсРНК с их противовирусной эффективностью

1 1 1 Партия|мХТИ |Доза, ^Содержание |Противовир. эффект-сть. % защиты

1 1 1 | / ПД | диглд. I |в дозе, МГ | 1 | А/Рг-8/34 1 1 А/Аига/68 1 1 1 вэмк 1

5 5,37 6,2 5,0 1.0 3,2 2,8 0,56 28.4 33,0 43.2

6-7 4,03 5,0 1,2 45,0 23,0 30,0

9 9,30 10,0 5,0 2.5 3,4 1.7 0,9 83,0 36,0 50-52 52,0

9-10 9,48 5,0 1.6 57,5 53,0 40,0

И 8,07 10,0 5,0 2,5 3,0 1,3 0,65 20,0 32.0 56,0

Как показывают данные этой таблицы, препараты, обладающие высоким мХТИ (8,07 -9,30-9,48), обеспечивают достаточно высокую степень защиты организма мышей от экспериментальной вирусной ин-

фекции (гриппа и энцефаломиокардита).

В то же время снижение эффективности препарата при больших дозах указывает на токсические проявления дсРНК при этих дозах. Оценка связи токсичности препарата с его составом (по величинам коэффициентов корреляции и регрессии) показала, что величина среднесмертельной дозы зависит только от содержания в препарате дсРНК (табл. 8).

Точно так же интерферониндуцирующая активность определяется в основном двуспиральной РНК (коэффициент корреляции +0,801).

Анализ связи между составом препаратов дсРНК, токсичностью, интерферониндуцирующей активностью по величинам коэффициентов

Таблица 8

Коэффициенты корреляции между составом препарата дсРНК S.cerevisae, его интерфероногенной активностью и токсичностью

Показатели 1 1 Аиф г t 1 ЛД50 1 1 I дсРНК, % 1 1 1 1 HM, % | Белок, % 1 1

Аиф 1

лд50 -0,404 1

дсРНК, % +0,801 -0, 739 1

НМ, % -0,138 +0,348 -0, 349 1

Белок, % -0,343 -0,173 -0,302 -0,856 1

корреляции и регрессии показал, что между содержанием двуспиральной РНК и величиной среднесмертельных доз имеется тесная отрицательная корреляция, а с величиной интерферониндуцирующей активности - положительная.

Изучение адъювантных и иммуномодулирующих эффектов одно- и двуспиральных РНК на моделях заболеваний сельскохозяйственных животных

Для изучения эффективности препаратов РНК нами совместно с ИЭВСиДВ СО РАСХН и НГАУ были определены заболевания, поражающие молодняк крупного рогатого скота (КРС) и свиней. Для КРС - тубер-

кулез и диареи телят, а для свиней - вирусные инфекции поросят.

Иммунизация молодняка крупного рогатого скота вакциной БЦЖ является существенным мероприятием по защите его от заражения возбудителем туберкулеза. Однако применение ее в основном ограничено недостаточно высокой напряженностью иммунитета и иммунодефи-цитами, вследствие чего наблюдаются его прорывы у животных (А.С.Донченко, В.Н.Донченко, 1994; Н.Д.Александров с соавт., 1994; Г.Н.Ноздрин, 1996). Выход из этого положения был найден при использовании иммуномодуляторов, позволяющих повысить протектив-ные свойства вакцин при различных бактериальных инфекциях.

Влияние полирибоната (ПР) на иммуногенные свойства вакцины БЦЖ изучали на 18 группах морских свинок. В процессе опыта у них учитывали продолжительность жизни после заражения, индексы пораженное™ туберкулезом печени, легких, селезенки при вскрытии.

Опыт показал, что животные, зараженные без предварительной иммунизации (1-я группа), пали в течение 78 суток. Продолжительность жизни животных, привитых БЦЖ без полирибоната (2-я группа), составила 96 суток, что в среднем в 1,5 раза меньше, чем срок жизни животных, привитых БЦЖ в сочетании с иммуномодулятором. Наибольшая продолжительность жизни после заражения (убиты на 145 сутки) отмечена в группах животных, которые были привиты БЦЖ в сочетании с дробным введением полирибоната.

При анализе индексов пораженности внутренних органов установлено, что наименьший индекс был у животных, получавших имуно-модулятор в комплексе с вакциной.

Наибольшая степень иммунной защиты от заражения оттитрованной дозой возбудителя туберкулеза бычьего типа отмечена у животных, привитых вакциной БЦЖ в сочетании с дробным введением полирибоната в дозах по 15 мг на голову через 14 дней. Как уже было показано выше в опытах на морских свинках по оценке гемопоэза под влиянием полирибоната, иммуномодулятор в эти сроки максимально активировал созревание и миграцию стволовых клеток. Можно считать, что это - один из основных механизмов действия однонитевых РНК у млекопитающих.

Для изучения влияния полирибоната на протективные свойства вакцины БЦ1 в опыте на крупном рогатом скоте было использовано 15 бычков, разделенных на 4 группы. Животных 1-й группы (3 гол.) не

вакцинировали. Бычков 2-й группы (4 гол.) привили вакциной БЦЖ в дозе 1 мг внутрикожно, 3-й - вакциной БЦЖ в сочетании с однократным введением полирибоната в дозе 1 мг/кг живой массы животного, а 4-й группе вводили вакцину БЦЖ в сочетании с дробным введением полирибоната: первый раз одновременно с вакциной БЦЖ в дозе О,5 мг/кг, второй раз - через 14 дней в той же дозе без вакцины. Вакцинацию проводили до 12-дневного возраста. Через 2,5 месяца после иммунизации бычков заразили вирулентной культурой возбудителя туберкулеза М. bovis, штамм 14х ВНИИБТЖ в дозе О,15 мг/кг массы животного (табл. 9).

Таблица 9

Действие полирибоната (поливедрима) на протективные свойства вакцины БЦЖ при экспериментальном туберкулезе телят

-1-1-

Группа I Кол-во IВакци-I голов |нация

"I-г

I Эффективность| I вакцинации I I(по наличию | ¡туберкулеза) |

Полирибонат|Зара-в/м в дозе,|жение мг/кг |

ОФР

3

4 4. 4

+

+ 1 + 0,5 + 0,5

3 ИЗ 3

3 ИЗ 4

1 из 4 О

20,0+1.87 35,8±2, 55 56,8±2,91 65, 8±1,28

(через 14 дней)

Через 5 месяцев после заражения бычки были убиты с проведением ветеринарно-санитарной экспертизы внутренних органов, лимфатических узлов и бактериологического исследования взятого от них биоматериала. Установлено, что лучший защитный эффект от заражения возбудителем туберкулеза отмечен в группе животных, привитых вакциной БЦЖ с дробным введением полирибоната с интервалом в 14 дней, так как телята не заразилась возбудителем туберкулеза. В 3-й группе туберкулезные поражения найдены только у одного животного. Во 2-й группе животных туберкулез на вскрытии установлен у двух телят, у третьего - по результатам бактериологического исследования биоматериала, и у одного бычка из этой группы туберкулез исключен. Животные контрольной группы все заболели туберкуле-

зом, у двух телят отмечен генерализованный туберкулез.

Наиболее показательным тестом напряженности поствакцинального иммунитета была реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). В ходе опыта ее показатели были выше в группах животных, привитых вакциной БЦЖ в сочетании с полирибонатом. Максимальные показатели РБТЛ обнаружены через 2,5 мес после вакцинации в 4-й группе животных (20, 73±1, 23 %). У невакцинированных телят в это время количество трансформировавшихся в бласты лимфоцитов составило 0,83±0,27 %. Но этот показатель был не информативен в процессе инфицирования животных. После заражения телят возбудителем туберкулеза величины РБТЛ не отличались от первоначальных.

Иммунизация телят вакциной БЦЖ вызывала повышение интенсивности фагоцитарной активности нейтрофилов (ОФР, табл. 9). Самый высокий показатель ОФР был у телят 4-й группы, вакцинированных БЦЖ в сочетании с дробным введением иммуномодулятора. Этот показатель характеризует неспецифическую резистентность организма.

Показатели аллергических реакций (ГЗТ) у животных, вакцинированных БЦЖ, изменяются под влиянием иммуномодулятора (полирибоната). У морских свинок при введении вакцины БЦЖ с иммуномодуля-тором-полирибонатом аллергические реакции менее выражены по сравнению с животными, которым вводилась одна вакцина. После иммунизации телят наибольшие показания аллергических реакций на туберкулин отмечены через 2 месяца после вакцинации. После этого отмечено уменьшение ГЗТ показателей, а через 5 месяцев они исчезают у животных, которые были вакцинированы с одновременным введением иммуномодулятора, но сохраняются у иммунизированных без полирибоната.

Таким образом, тот факт, что один полирибонат не вызывал реакцию ГЗТ, подтверждает результаты, определенные ранее при экспериментальном изучении препарата. Важным моментом приведенных выше материалов является описание дозовых зависимостей реакции ГЗТ при комплексном применении БЦЖ с полирибонатом.

Развитие туберкулезного процесса у животных влияет на показания гуморального и клеточного иммунитета, а также общую резистентность организма. Установлено, что у животных контрольной группы на 28-е сутки после заражения"отмечалось достоверное повышение показателей клеточного иммунитета (РБТЛ). Через 3 месяца

после заражения наблюдалась активация гуморальных факторов защиты. При этом отмечено повышение количества Г^ и титров компле-ментсвязывающих антител. Но проявления этих систем защиты самого организма не достаточно для формирования эффективной резистентности против возбудителя туберкулеза бычьего вида. Об этом свидетельствовало снижение показателей клеточного иммунитета и общей резистентности. Дальнейшие исследования показали, что в организме животных этой группы развивался активный туберкулезный процесс, сопровождавшийся угнетением Т-системы иммунитета и падением защитных сил организма.

В тех же группах животных, которым вводился полирибонат в сочетании с вакциной БЦЖ, на протяжении всего опыта отмечались высокие показатели ОФР и РБТЛ, хотя показатели ГЗТ угасали раньше. чем в группе животных, вакцинированных БЦЖ без иммуномодуля-тора.

Вакцинация БЦЖ экспериментальных животных (морских свинок и кроликов) вместе с однократным введением индуктора интерферона вестин (ридостин) повышает показатели клеточного и гуморального иммунного ответа. Это приводит к увеличению иммуногенности вакцины и препятствует заражению лабораторных животных оттитрованной дозой возбудителя туберкулеза бычьего типа.

Индуктор интерферона вестин (ридостин) эффективно стимулирует гуморальный иммунный ответ, а также показатели фагоцитоза нейтрофилов периферической крови поросят при вакцинации их вирус-вакциной против классической чумы свиней. По сравнению с им-муномодулятором-левамизолом эффективность вестина (ридостина) была выше.

Противовирусные эффекты вестина (ридостина) у высших и низших позвоночных

Изучение влияния вестина на поросят. Уровень интерферона в крови поросят определяли после введения вестина в дозе 0,5; 1,0; 2,0 мг/кг в разные сроки. Доза 0,5 мг/кг приводит к повышению уровня интерферона до 128 МЕ/мл через 12 ч. который закономерно снижается в дальнейшем. Испытания других доз вестина проводили с применением более широкого спектра характеристик (табл.10). Из

представленных данных следует, что максимальные титры интерферона регистрируются через 3-6 ч после введения вестина. В течение этого времени отмечается пирогенная реакция, повышение фагоцитарной активности нейтрофилов и фагоцитарного индекса. Сравнение действия двух доз (1,0 мг/кг и 2,0 мг/кг) показывает, что эффекты зависят от дозы, хотя и очень незначительно.

Таблица 10

Характеристика состояния поросят при в/м введении вестина

1 Показатель | 1 Группа животных

1 1 1 I 1 II ! III

1 1 (ОПЫТ) | 1 (опыт) ! 1 (контроль)

Количество поросят в группе 10 10 10

Доза вестина, мг/кг 1 2 -

Доза физраствора, мл/кг - - 1

Повышение температуры тела.

на °С

через 3 ч после введения 1,5 2,1

через 6 ч после введения 1.3 1.6 -

через 9 ч после введения 0.9 1.3 -

Уровень интерферона, ИЕ/мл

через 3 ч после введения 80-160 80-320 110

через 6 ч после введения 160-640 160-640 НО

через 9 ч после введения 20-40 20-40 110

Повышение фагоцитарной

активности нейтрофилов.

в % кК 123 132 100

Поглотительная способность

нейтрофилов, в % кК 119 126 100

Заболеваемость поросят

диареями, голов в группе 0 0 4

Для действия индукторов интерферона на макроорганизм характерна фаза гипореактивности. Известно, что интерфероноген, введенный через 24 ч после первой инъекции не стимулирует образование интерферона у лабораторных животных (Н.Н.Носик с соавт., 1982; Э.Б.Тазулахова, А.М.Сайиткулов, 1982). Аналогичный вопрос был исследован нами на поросятах при введении дозы 0,5 мг/кг. Введение вестина даже через 3 и 6 суток после первой инъекции не приводит к достаточно выраженному интерферониндуцирующему эффекту. Следует отметить, что наиболее высокие показатели фагоцитарной и поглотительной активности нейтрофилов, а также их повышенное содержание обнаруживается в течение первых суток. После 2-й и 3-й инъекции вестина заметной стимуляции этих реакций у поросят не обнаружено. Это свидетельствует о том, что активация фагоцитоза у поросят является интерферонозависимым процессом. Из литературы известно, что состояние гипореактивности наступает у поросят после 3-й инъекции при режиме ежедневного введения (А.В.Селиванов с соавт., 1987), максимальное падение титров наблюдали после 4-й инъекции. Интересно, что последующее введение дсРНК восстанавливало образование интерферона. Таким образом, из собственных и литературных данных о действии дсРНК различного происхождения на поросятах (фаг, дрожжи) можно сделать заключение во-первых, о сходстве ответных реакций на природные дсРНК, во-вторых, о более пролонгированной фазе гипореактивности (около 6-и суток), наблюдаемой после введения индуктора, у поросят по сравнению с лабораторными животными. Эти данные следует учитывать при проведении противоэпизоотических мероприятий с использованием вестина у свиней.

Заслуживающими внимания, на наш взгляд, являются результаты дальнейшего наблюдения за поросятами опытной и контрольной групп. Как следует из таблицы 10, животные, заболевшие диареями, регистрировались только в контроле (40 %). Таким образом, проведенные исследования показали, что индуктор интерферона вестин у поросят приводит к активации интерфероногенеза и интерферонзависимых реакций, обеспечивающих стимуляцию неспецифической резистентности.

Изучение эффективности препарата вестин у собак Изучение эффективности применения препарата вестин у собак, при чуме плото-

ядных проводили в условиях ветеринарных клиник (г.Бердск. Новосибирской области и Факультет ветеринарной медицины НГАУ). Испытание вестина выполнено на 20-и собаках с различными формами чумы (табл. И).

Из представленных данных видно, что применение вестина перспективно для лечения всех форм чумы у собак. Вестин применяли на фоне общепринятых способов лечения. Обобщая результаты, полученные в процессе лечения вестином различных форм чумы у собак, можно видеть, что из 20 животных

Таблица 11

Результаты изучения эффективности препарата вестин при вирусных заболеваниях у собак

-1-1-1-1-1-]-

Форма |Кол-во |Доза, |Кол-во|Выздо-1 Погиб-|Эффектив-

заболевания ¡заболев.|мг/кг|инъек-1ровело|ло, (ность ле-|животн. Г 1ций I(гол.)|(гол.)|чения, %

_I_I_1_I_1_I_

Чума плотоядных 20 0,72 18 2 90

из них:

Кишечная форма 7 0,44 3-4 7 - 100

Кишечно-легочная 3 0, 70 3-4 3 - 100

Легочная форма 10 0, 93. 2-3 ■ 8 2 80

Парвовирусный 19 1,3 3 16 3 84

энтерит

погибли два, болевшие легочной формы чумы (10%). По статистическим данным смертность от этого заболевания может достигать 80% (С.Н.Снегирев, 1989; В.А.Чижов с соавт., 1990). Полученные данные убедительно демонстрируют эффективность вестина при чуме собак.

Исследование эффективности вестина при парвовирусном энтерите у собак проводилось по схеме профилактики и лечения. При помещении в питомник новых 55 собак 15-и животным был введен препарат вестин в/м, а 40 - не подвергались аналогичному воздействию. Спустя 10-12 дней из 40 животных заболели пять, а остальные переболели в течение месяца, несмотря на проводимое симптоматическое лечение. В опытной группе животных в течение 25 дней ни у одного не наблюдалось проявления заболевания, только на 28 сутки заболело 4 животных. Болезнь в этой группе протекала легко.

Наряду с общепринятой схемой лечения парвовирусного энтерита у собак, впервые использовано сочетание применения индуктора интерферона с пробиотиком (бактерином-SL, субалином), которое позволяет предотвратить секундарные бактериальные желудочно-кишечные инфекции.

Суммируя данные, можно видеть, что введение вестина в дозе 0,2-2,0 мг/кг внутримышечно привело к выздоровлению 16 из 19 собак, что составляет 84 %, и сокращению сроков лечения.

В другой серии экспериментов оценивали влияние на течение парвовирусного энтерита у собак породы немецкая овчарка. В этих экспериментах вестин вводили в виде капель в нос и в глаза. В группе животных из 25 щенков в возрасте 2-3 месяцев заболело 14 особей. Закапывание препарата на фоне комплексной терапии начинали с первого дня заболевания всем животным. Из 14 заболевших щенков выздоровело 11, погибло 3. Оставшиеся 11 особей, к которым применялся вестин профилактически, не болели вовсе.

Таким образом, в представленном разделе работы впервые продемонстрирована лечебная противовирусная активность вестина против чумы плотоядных и парвовирусного энтерита (табл.11).

Отмечено также, что при введении препарата вечером, заболевание протекало в более легкой форме, а позитивные изменения в составе крови более выражены. Введение препарата вестин (ридостин) в схему лечения собак с диагнозом чума плотоядных (Pestis canum) повышает терапевтическую эффективность до 95% и сокращает продолжительность лечения на два дня.

Изучение эффективности применения вестина у карпа на модели рабдовирусной инфекции. В работе оценивали защиту с помощью вестина разновозрастной рыбы (сеголетков, годовиков карпа) от рабдовирусной инфекции, вызывающей у карпа весеннюю виремию.

В предварительных исследованиях была оценена переносимость препаратов. Опыт ставили на сеголетках карпа (средняя масса 60 г). Препарат вводили однократно в дозах 1,0; 10,0; 20,0 мг/кг. На каждую дозу использовали по 5 рыб. Препарат вводили в объеме 0,4 мл. Рыбу после инъекции содержали при 13-14°С и постоянном кормлении. На протяжении всего срока наблюдений (до 45 суток) токсического действия препаратов не отмечено.

Возможность применения препарата вестин для профилактического использования при защите карпа от экспериментальной рабдови-русной инфекции изучали в следующих опытах.

В работе использовали годовиков карпа со средней массой 47г. Опытным группам по 20 рыб в каждой инъецировали препарат вестин в дозе 10 мг/кг. Контрольным рыбам вводили 0,5 мл среды Игла. Все группы рыб были рассажены в отдельные аквариумы. Температуру воды, имевшую в момент инъекции препаратов 9-10°С. через сутки повысили до 14-15°С, и на этом уровне поддерживали на протяжении всего опыта. Через 2-ое суток рыбу заражали интраперитонеально вирусом в дозе 107-35 ТЦД50/рь]еа. Гибель рыб в эксперименте проходила с типичными для данного заболевания признаками. Наблюдения проводили в течение 25 дней.

Динамика выживания карпов экспериментальных и контрольной групп представлена на рис.1. Эти результаты убедительно показывают положительный профилактический эффект препарата вестин на основе дсРНК по предотвращению рабдовирусной инфекции по сравнению с применением впРНК и контрольными рыбами.

Эффективность защиты карпа против заражения при однократном применении различных доз вестина представлена в таблице 12. Данные свидетельствуют о том, что эффективные дозы вестина для профилактики рабдовирусной инфекции у карпа находятся в пределах 1-10 мг/кг, обеспечивая высокую степень защиты до 70-75%, и зависят от возраста рыбы.

Таблица 12

Эффективность защиты карпа против рабдовирусной инфекции при однократном применении различных доз вестина (превышение выживаемости рыб в опытных группах по сравнению с контрольными, %)

Возраст рыбы > I Вестин, 1 в дозе мг/кг массы тела

1 1 1 | ■ 1 1 Ю | | 1 20

Сеголетки 15 зсГ 35

Годовики 70 75 75

Проведенные далее исследования по продолжительности эффекта однократного профилактического применения вестина дали неожиданные результаты.- Для проведения опытов рыба (средней массой 50 г) была рассажена в 3 группы аквариумов, по 2 аквариума в каждой, один из которых являлся опытным, а второй - контрольным. Всем опытным группам одновременно ввели вестин в дозе 10 мг/кг массы рыбы в объеме 0,5 мл. Контрольные рыбы в то же время получили инъекцию среды Игла (0,5 мг/кг). Рыбу содержали на протяжении всего опыта в тех же условиях проточности, аэрации и кормления, как и предыдущих опытах. Температуру воды поднимали постепенно с 11°С до 18°С со средней скоростью 0,25°С/сутки, моделируя весенний прогрев воды, на фоне которого в прудах развивается болезнь.

Заражение рыб каждой из 3-х групп аквариумов проводили в срок и в дозах, указанных на рис. 2, представляющем результаты гибели рыб в течение 30 дней после введения вестина. 70%-ный защитный эффект отмечали при заражении рыб спустя 21 день после введения препарата. Более того, у рыб в опытных аквариумах первой и второй групп (заражение спустя 2 и 14 суток после введения вестина) вообще не наблюдали признаков заболевания, в то время как гибель рыб от весенней виремии в контрольных аквариумах этих же групп составила соответственно 85 и 55%.

Сравнительные экспериментальные данные о противовирусной активности вестина у высших и низших позвоночных представлены в таблице 13.

Следует отметить, что у млекопитающих продолжительность защитного эффекта после однократного применения дсРНК значительно короче и составляет около 24 ч (М.Ю.Кнороз с соавт., 1985). Существуют отдельные сведения о сохранении противовирусной резистентности у поросят в течение 6 дней после введения индуктора, но авторы не связывают этот факт с активацией интерферонзависимых механизмов (А.В.Селиванов с соавт., 1987). Эти сравнительные эффекты препарата вестин у высших и низших позвоночных описаны нами впервые и представляют как практический, так и теоретический интерес.

Bec-47 г п.20

WSsq-IO7'35

Рис. 1. Эффективность профилактического применения впРНК и дсРНК против заражения КЬ;1Ьс1о\1ги1 сагрю после однократной инъекции препаратов годовикам карпа: □- контрольная группа; О - опытная группа после применения впРНК в дозе 100 мг/кг; V - опытная группа после применения дсРНК в дозе 10 мг/кг.

Инфицирование осуществляли в дозе 10,,и ТЦДя/рыба через 2 дня после инъекции препаратов.

loo

9о

во

7о

6о

50

4о

Зо

с- Но

lo

о

ТВД50.10'-°3

J ЩДьо-107-30

TUUgo-lO' 1

2 14 21

Время после введения вестина, дни

Рис. 2. Продолжительность профилактического эффекта дсРНК после однократного введения препарата в дозе 10 мг/кг у годовиков карпа и последующих заражений Rhabdovirus carpió на 2,14 и 21 день после инъекции препарата:

□ - контрольные группы (W = 50 г, п = 20); □ - опытные группы ( W = 50 г, п = 20).

Таблица 13

Экспериментальные данные о противовирусной активности вестина у некоторых высших и низших позвоночных

Животные Заболевание Семейство Доза вируса ld50 Время применения дсРНК,(час) г 1 Защитный 1 эффект, % 1 i

Собаки Чума Парамиксо- Не исследована -24 1 1

вирусы +108 1 90-100

Парвови- Парвовирус Не исследована -24 1

русный +48 1 84

энтерит 1

Мыши Бешенст- Рабдовирус 6 +4 1

во 3 +4 1 30

Карп Весенняя Рабдовирус .03-7.8 -21(дни) 1 70

веремия 1(55-85)

_i_i_i_i_i_

(-) - время до инфицирования; (+) - время после инфицирования.

Действие препаратов РНК на птиц

Исследования действия полирибоната и ридостина по сравнению с препаратами полиоксидоний "П" и "В", а также тималином были проведены In vitro на тимоцитах морских свинок и цыплят-бройлеров по образованию E-розеток с ЭБ. Контролем служило розеткообразова-ние интактных тимоцитов. Все исследованные препараты активизировали образование E-розеток. Так, если в контроле интактные тимо-циты у обоих видов давали процент розеткообразующих клеток не выше 10, то с препаратами - от 20, 8 до 40%.

Таким образом, полирибонат и ридостин повышали функциональную активность Т-клеток морских свинок и цыплят-бройлеров на уровне других иммуностимуляторов: тималин и полиоксидоний "П" и "В".

На втором этапе предварительного исследования действия препаратов полирибонат и ридостин In vivo на цыплят-бройлеров была изучена безвредность препаратов при различных способах введения птице. Установлено, что при внутримышечном (в/м), интраназальном

(и/н), конъюнктивальном (к/ю) введении максимальная доза препаратов в 10 мг/кг массы тела птицы не вызывает выраженных изменений функционального состояния различных систем организма цыплят-бройлеров. Гематологические показатели и состояние ретикуло-эндотели-альной системы остаются после введения указанной дозы в пределах физиологической нормы. Определены также дозы эффективного влияния на показатели развития при различных способах введения. Оптимальные дозы для полирибонага находятся в пределах 2-10 мг/кг, а ри-достина - от 1 до 2 мг/кг.

Проведенными исследованиями установлено, что ридостин оказывает стимулирующее влияние на прирост живой массы бройлеров при к/ю способе введения. В контрольной группе прирост в среднем составил 73 г на голову, а в группе, получавшей ридостин - 90,1 г. Испытание стимулирующего действия полирибоната, проведенное в условиях птицефабрики на 14 ООО голов, показало, что при 4-х кратном его введении различными способами введения (и/н, к/ю и аппликациями в дозах 1-2 мг/кг) через каждые 7 дней получено увеличение привесов в среднем на 80 г по сравнению с контрольной группой и повышение сохранности поголовья птиц на 10-15%. На основании учета сохранности поголовья при вспышках болезни Ньюкасла, инфекционном бронхите, сальмонеллезе применение полирибоната дает основание считать о повышении естественной резистентности под действием препарата. Выполненые ранее противовирусные исследования показали, что ридостин (вестин) на модели чумы птиц показал 60-73 %-ную эффективность защиты.

Исследование возможности модификации биологической активности препаратов РНК и механизма их действия

Анализ литературных данных о путях пролонгирования препаратов на основе РНК позволил отобрать ряд носителей, перспективных для этих целей: модифицированные декстраны, целлюлозы, латексные частицы. Важным свойством таких носителей является возможность проанализировать с их помощью один из механизмов реализации биологической активности препаратов на основе РНК - фагоцитоз. Совместный анализ пролонгирования с помощью сорбентов и фагоцитоза при этом явился целью работы.

Препараты дсРНК и впРНК в смеси с низкомолекулярным декстра-ном (полиглюкином), ДЭАЭ-декстраном, ДЭАЭ-целлюлозой обладают различной сорбционной способностью. В механизме сорбции большую роль играют ДЭАЭ-группы.

Пролонгирование активности дсРНК и впРНК различными носителями: на растворимых и нерастворимых матрицах, в смеси с низкомолекулярными декстранами в значительной степени обуславливает модулирование биологической активности препаратов, оцениваемой по фагоцитозу.

Такая активация фагоцитоза перитонеальных макрофагов мышей позволяет провести дифференциальный фармакологический анализ препаратов на основе РНК.

Анализ биологической активности модифицированных и немодифи-цированных носителей дает возможность предположить, что носители в этом случае играют роль фактора праймирования макрофагов. На фоне праймированных макрофагов дсРНК и впРНК могут дозозависимо увеличивать макрофагальную активность. Такие активированно-прай-мированные макрофаги видимо и позволяют увеличивать в 2-3 раза противовирусную активность препаратов дсРНК как для высших, так и низших позвоночных. При этом наблюдается уменьшение эффективных доз дсРНК, что можно расценивать как модуляцию активности препарата.

Концепция об универсальной роли РНК в формировании противоинфекционной устойчивости организмов разных

классов

Анализ данных литературы и результатов собственных исследований позволил рассмотреть положения об основных принципах функционирования системы резистентности с участием РНК и препаратов на её основе у организмов разных классов.

В основу концепции об универсальной роли РНК в формировании противоинфекционной устойчивости различных классов организмов вошли следующие факты и положения:

- специфические противоинфекционные эффекты препаратов на основе РНК (особенно противовирусные) наблюдаются у различных видов позвоночных и даже у растений;

- противоинфекционные эффекты однонитевых и двуспиральных

РНК выяснены в отношении широкого круга микроорганизмов, хламидий и вирусов;

- противоинфекционные эффекты препаратов РНК развиваются в зависимости от величины молекулярной массы и конформационной структуры молекулы РНК. Антибактериальные эффекты в большей степени обусловлены действием на организм однонитевых РНК, противовирусные эффекты - действием двуспиральных РНК. Эти эффекты, по-видимому, связаны с тем, что в эволюции макроорганизм сталкивался (и сталкивается) с вирусами, содержащими одно- и двуспи-ральные РНК;

- часть противоинфекционных эффектов (особенно антибактериальных), обусловленных возникновением тахифилаксии, прослеживается на уровне moho-, олигорибонуклеотидов и однонитевых РНК, часть (противовирусные эффекты) прослеживаются на уровне двуспиральных РНК;

- механизм осуществления противоинфекционных эффектов природных высокомолекулярных структур РНК реализуется , в основном, вероятно, через действие на сигнальные системы клеток, а низкомолекулярных РНК - через систему обменных (анаболических и катабо-лических) процессов;

- в осуществлении противоинфекционной устойчивости организма под действием РНК важную роль играет система неспецифической резистентности, возникшая на более ранних этапах эволюции и основанная на механизмах стимуляции фагоцитоза и ген-индуцирующей активации цитокинов и лимфокинов.

ВЫВОДЫ

1. Разработанные впервые на основе однонитевых и двуспиральных РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae препараты полирибонат (поливедрим) и вестин (ридостин) для ветеринарной медицины обладают широким спектром биологической активности и используются в качестве стимуляторов неспецифической резистентности для разных классов позвоночных животных.

2. Однонитевая высокополимерная РНК (впРНК) и препараты на ее основе полирибонат (поливедрим) являются малотоксичными соединениями. При одно- и многократном внутримышечном введении мышам.

крысам, морским свинкам и собакам не оказывают общетоксических или тканетоксических свойств в интервале доз 0,7 - 500 мг/кг.

По значениям среднесмертельных доз препарат на основе дсРНК при внутрибрюшинном введении можно отнести к среднетоксическим соединениям. Значения ДЦ50, установленные на мышах, для 5 партий вестина (ридостина) составляют от 45 до 55 мг/кг. Дозы ридостина 160-200 мг/кг вызывают гибель части крыс при внутрибрюшинном введении и превышают соответствующие дозы для мышей в 4-5 раз. На морских свинках дозы ридостина в 100 мг/кг не приводят к гибели животных.

3. ВпРНК и дсРНК обладают иммуностимулирующим действием, увеличивая количество АОК в селезенке и повышая титры антител в сыворотке крови экспериментальных животных в дозах: впРНК -10-100 мг/кг, дсРНК - 2,5-5 мг/кг. Полирибонат при парентеральном введении морским свинкам в дозах 100-300 мг/кг оказывает стимулирующее влияние на кроветворение и гемопоэз в костном мозге, увеличивая пул стволовых клеток на 7-14 сутки. Иммуностимулирующая активность дсРНК, ридостина (вестина) проявляется в большей степени в условиях сниженной иммунореактивности и при иммунизирующих дозах антигена ниже оптимального уровня.

4. ВпРНК не оказывает влияние на ГЗТ экспериментальных животных; ридостин (вестин) в дозе 10 мг/кг угнетает развитие реакции ГЗТ, вызванной введением оптимальной дозы антигена (ЭБ) при назначении в день сенсибилизации, а в дозе 5 мг/кг - за сутки до сенсибилизации. В случае, если реакция ГЗТ вызвана субоптимальной дозой антигена, препарат стимулировал её развитие через 2-е суток после введения ЭБ.

5. Исследование фагоцитоза перитонеальных макрофагов и нейт-рофилов периферической крови у мышей под действием препаратов РНК показало: впРНК и полирибоната повышают фагоцитоз перитонеальных макрофагов ln vivo в среднем в 1,7 раза, а действие вестина и ридостина более значительно - в 2,5 раза; функциональная активность нейтрофилов под влиянием впРНК и полирибоната носит двуфазный характер, увеличиваясь через 2 ч после введения, через 24 ч снижается до уровня контрольных животных, а через 72 ч наблюдается её увеличение до 250-300% по сравнению с контролем; фагоцитарный индекс (ФИ) перитонеальных макрофагов мышей под действием препара-

- 38 -

тов РНК изменяется незначительно.

6. Природная двуспиральная РНК киллерных дрожжей БассПаготу-сеэ сегеУ1з!ае обладает выраженной интерферониндуцирующей активностью в организме мышей, кроликов, поросят и крупного рогатого скота. Максимальный специфический эффект развивается при введении дсРНК в дозах 2,5-10 мг/кг. Индукция интерферона происходит при различных путях введения препарата в организм. По скорости и динамике образования интерферона ридостин (вестин) следует отнести к классу индукторов "раннего" действия. Установлено, что между содержанием двуспиральной РНК и величиной среднесмертельных доз имеется тесная отрицательная корреляция, а с величиной интерферониндуцирующей активности - положительная.

7. Противовирусный эффект ридостина (вестина) при профилактическом введении экспериментальным животным в дозах 2-10 мг/кг обеспечивает их защиту от 20 до 80% от заражения возбудителями гриппа (А/Рг-8/34; А/А1сМ-68). клещевым энцефалитом, энцефаломи-окардитом мышей. Восточным и Западным энцефаломиелитом лошадей, чумой птиц.

8. Пролонгирование биологической активности дсРНК и впРНК различными носителями на основе декстранов, оцениваемое по фагоцитозу и противовирусным эффектам, в значительной степени обусловлено фактором праймирования макрофагов, что открывает пути дальнейшего совершенствования препаратов на основе РНК.

9. Для профилактики туберкулеза у крупного рогатого скота наиболее эффективной является схема применения вакцины БЦЖ в сочетании с дробным введением полирибоната (поливедрима): первый раз препарат вводится одновременно с вакциной в дозах 0.5 мг/кг, второй раз - без вакцины в той же дозе; при этом стимулируется иммунный статус организма животных.

10. Вакцинация БЦЖ морских свинок и кроликов вместе с индуктором интерферона вестином (ридостином) повышает показатели клеточного и гуморального иммунного ответа. Это приводит к увеличению протективных свойств вакцины при заражении лабораторных животных оттитрованной дозой возбудителя туберкулеза бычьего типа.

11. Индуктор интерферона вестин (ридостин) эффективно стимулируют гуморальный иммунный ответ, а также показатели фагоцитоза нейтрофилов периферической крови поросят при вакцинации их ви-

рус-вакциной против классической чумы свиней.

12: Сравнительное изучение действия препаратов у различных классов позвоночных свидетельствует: введение вестина поросятам приводит к образованию интерферона и развитию интерферонзависимых реакций (активация фагоцитоза, повышение температуры тела), формирует фазу гипореактивности, длящуюся более 6 суток; в экспериментах на собаках отмечен высокий лечебно-профилактический эффект вестина при чуме плотоядных (90-100 %) и парвовирусном энтерите (84 %), препарат целесообразнее назначать в вечернее время; у птиц полирибонат и ридостин влияют на систему Т-иммунитета и неспецифическую резистентность, а также стимулируют рост и развитие; вестин у рыб обеспечивает высокую степень защиты от вируса весенней виремии карпа, которая сохраняется более 21 дня.

13. Сформулирована концепция об универсальной роли рибонуклеиновых кислот в формировании противоинфекционной устойчивости организмов различных классов, включающая систему неспецифической резистентности,' возникшую на ранних этапах эволюции и основанную на механизмах стимуляции фагоцитоза и гениндуцирующей активации цитокинов и лимфокинов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанные на основе дрожжевых РНК препараты являются перспективными системными средствами неспецифической резистентности, которые могут быть применены для обеспечения ветеринарного благополучия в животноводстве, птицеводстве, рыбоводстве и мари-культуре, при получении экологически безопасных продуктов АПК на основании следующих правовых и нормативных документов:

1. Патенты, выданные Роспатентом РФ:

- "Способ профилактики туберкулеза животных" (Я 1790414 от 22. 09. 92 г.) ;

- "Способ выращивания телят" (И 2015697 от 15.07.94 г.);

- "Способ профилактики вирусных заболеваний рыб" (И 2043714 от 20.09.95 г.);

- "Индуктор интерферона Ридостин" ни (Ы 2083221 МКИ А61К 38/20 БИ N19 от 10.07.97 г).

2. НТД на препараты, утвержденные Департаментом Ветеринарии РФ в 1994 г для широких производственных испытаний:

- ТУ 9291-008-00479979-94 "Вестин (ридостин)" и Временное наставление по применению вестина (радостина) в ветеринарии от

06.07.94 Г. N13-4-2/121;

- ТУ 9291-007-004479979-94 "Полирибонат (поливедрим)" и Временное наставление по применению полирибоната (поливедрима) в ветеринарии ОТ 06.07.94 г. N13-5-2/120.

3. Разрешение Департамента Ветеринарии РФ о проведении ВНИ-ИПРХом производственных испытаний препаратов "Ридостин" и "Полирибонат" против весенней веремии карпов, N 13-4-18/131 от

16.03.95 г.

4. Рекомендации " Иммуномодуляторы нуклеиновой природы как стимуляторы неспецифической резистентности и продуктивности молодняка крупного рогатого скота" (Утверждены Учеными Советами ИЭВСиДВ СО РАСХН и НГАУ, одобрены для внедрения Ветеринарным НТС Новосибирского АПК, 1991).

СПИСОК РАБОТ.

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кнороз М.Ю., Попова О.М., Давыдова А.А., Носик H.H., Ба-ринский И.Ф., Подгорный В. Ф., АликинЮ. С. Сравнительное изучение противовирусной активности природных двуспиральных РНК при экспериментальном клещевом энцефалите / Вопр.вирусологии, 1985,-т.30, N 6.-С.697-700.

2. Кнороз М.Ю., Давыдова А. А., Носик H.H., Подгорный В.Ф., Аликин D. С. Сравнительная характеристика противовирусной активности двуспиральной РНК при экспериментальной альфавирусной инфекции/В сб.: Антивирусные вещества, Минск, 1985. - С. 71-72.

3. Донченко A.C., Донченко В.Н.. Подгорный В.Ф., Протодьяко-нова Г.П., Аликин Ю.С. Повышение иммуногенных свойств противотуберкулезной вакцины БЦЖ с помощью полирибоната/Тез.докл. 1-й Меж-вуз. науч.-практ.конф."Новые фармакологические средства в ветеринарии".- Ленинград, 1989. - С.50-51.

4. Донченко A.C., Аликин Ю.С., Донченко В.Н. Применение биологически активных веществ в качестве иммуномодуляторов в ветеринарии и медицине: Обзор лит./ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние.ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 1989. - 44с.

5. Загребельный С.Н., АликинЮ. С., Д ужак А. Б., Подгорный

B. Ф., Петренко В. А. Перспективы использования биологически активных веществ микробиологического происхождения для целей марикуль-туры/Тез.докл.Всесоюзн. конф."Научно-технические проблемы мари-культуры в стране". - Владивосток, 1989. - С.18-19.

6. Аликин Ю.С. Определение устойчивости активности фермента эндонуклеазы Serratia marcescens с годовиками карпа//Там же. -

C. 172.

7. Щелкунов И. С., Щелкунова Т. И.. Аликин Ю.С. Попытка использования эндонуклеазы Serratia marcescens для профилактики рабдовирусной инфекции у карпа//Там же. - С. 189-190.

8. Аликин Ю.С., Веревкина К.Н., Загребельный С.Н., Масычева

B.И., Подгорный В. Ф., Пупкова В.И. Действие препаратов РНК на системы организма, обеспечивающие его устойчивость//Тез.докл.VIII Всесоюзн.симпоз. по целенаправленному изысканию лекарственных веществ. Компоненты нуклеиновых кислот. - Рига, 1989. - С. 92-93.

9. Аликин Ю.С. Опыт использования некоторых биологически активных веществ в ветеринарии//Тез. докл. Всесоюзн. конф."Методы получения, анализа и применения ферментов. - Юрмала-Рига, 1990. -

C. 100.

10. Донченко A.C., Аликин Ю.С., Найманов Д.Н. Индукторы интерферона и перспективных их применения в медицине и ветеринарии: Обзор лит./ВАСХНИЛ. Сиб.отделение ИЭВСиДВ, НПО "Вектор". НИКТИ БАВ. Новосибирск, 1990.-40с.

11. Найманов Д. И., БагринВ.А., Аликин Ю. С., Масычева В. И., Дубатолова Т.Д. Индукторы интерферона в профилактике массовых желудочно-кишечных болезней у новорожденных телят//В сб.: Инфекционные болезни животных. Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы. РАСХН, Сиб.отделение, Новосибирск, 1991, с.68-73.

12. Иммуномодуляторы нуклеиновой природы как стимуляторы неспецифической резистентности и продуктивности молодняка крупного рогатого скота: Рекомендации/А.С. Донченко, В.Н.Донченко, Д.И.Найманов, Г.А.Ноздрин, Ю.С.Аликин и др.// РАСХН. Сиб.отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 1992. - 20 с.

13. Патент SU 1790414 A3 (1992). Способ профилактики туберкулеза животных/А. С. Донченко, В.Н.Донченко, Ю. С.Аликин, Г.П.Про-тодьяконова, Л.С.Соколова.

14. Патент SU 1801012 A3 (1993). Способ выращивания те-

лят/Г.А.Ноздрин, Ю.С.Аликин, И.В.Наумкин.

15. Shchelkunov I.S.,Shchelkunova Т.I., Kupinskaya 0.A., Alikin Yu.S. Protective effects of some natural immunostlmulants against In viral diseases in fish/In.: Fish Diseases Diagnosis and Prevention Methods.Internat.Workshop in Poland,Sept. 1993.Olsztyn,Pulawy.

16. Shchelkunov I.S., Shchelkunova T.I., Kupinskaya O.A., Alikin Yu.S. Experimental prevention of Book of spring viraemia of carp with some immunostimulants/Abstr.Diseases of Fish Shellfish 6-th Intern.Conference of the European Association of Fish Pathologists.Brest, France, September, 1993

17. Масычева В.И., Аликин Ю.С., Левагина Г.М., Ноздрин Г.А. и др. Вестин - новое противовирусное средство при чуме со-бак//Тез.докл. 6-ой Межгос. Межвуз.науч.-практ. конф."Новые фармакологические средства в ветеринарии".- Санкт-Петербург, 1994. -С. 26.

18. Аликин Ю. С. Сравнительно-эволюционные аспекты применения БАВ в качестве индукторов интерферона и иммуномодуляторов//Там . же. - С.69-70

19. Аликин Ю.С., Клименко В.П., Масычева В.И., Фадина В.А., Щелкунов И.С., Щелкунова Т.И., Купинская О.А. Сравнительные антивирусные эффекты дсРНК у низших и высших позвоночных//Мат-лы 7-ой Межгос. Межвуз. науч.-практ. конф. "Новые фармакологические средства в ветеринарии". - Санкт-Петербург, 1995. - С.68-69.

20. Ноздрин Г.А., Наумкин И.В., Аликин Ю.С., Реутова Е.А. Средство для повышения естественной резистентности животных-поли-рибонат// Новые лекарственные препараты и кормовые добавки.Экспресс-информация. -Санкт-Петербург,1995. -С.13.

21. Патент RU 2043714 С1 (1995). Способ профилактики вирусных заболеваний рыб/Щелкунов И. С. , Аликин Ю. С., Щелкунова Т.И., Купинская О.А.

22. Masycheva V.I., Alikin Yu.S., Klimenko V.P., Fadina V. A., Shchelkunov I.S., Shchelkunova Т.I..Kupinskaya 0.A. Comparative antiviral effects of dsPNA on lower and higher vertebrates// Veterinary Research. - 1995. - V.26. - P.536-538.

23. Фадина В.А.. Аликин Ю.С.. Масычева В. И., Левагина Г.М., Клименко В.П. Исследование биологической активности модифициро-

ванных форм рибонуклеиновых кислот- на перитонеальных макрофагах мышей//Тез.докл. II съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока.

- Новосибирск,1995. - 4.2 - С.451.

24. Alikin Yu.S., Shchelkunov I.S., Shchelkunova Т.I.,Ku-p'inskaya O.A., Masycheva V. I., Kllmenko V.P., Fadlna V. A. Prophylactic treatment of viral diseases In fish native RNA linked to soluble and corpuscular carriers// Journal of Fish Biology. -1996. - V.49 - P. 195-205.

25. Shchelkunov I.S..Shchelkunova Т.I., Kupinskaya O.A.. Alikin Yu.S. Linkage of dsRNA to soluble or particulate carriers can augment its protective effect against viral deseases in fish//7-th Intern.Confer. EAFP "Diseases of fish and shellfish", 10-15 Sept.1995, Palma De Mallorca. Spain. - 1995. - P.163.

26. Аликин Ю.С. Разработка препаратов для ветеринарии на основе БАВ (прошлое, настоящее и будущее)// В сб.научн.трудов сотр. НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ"Вектор". - Бердск,1996. - С.163-167.

27. Ноздрин Г.Н., Аликин Ю..С. Хронодинамика вестина (ридос-тина) при лечении собак, больных чумой//Там же. - С.167-173.

28. Донченко А.С., Донченко В.Н., Аликин Ю. С., Донченко Н.А. Использование индуктора интерферона вестина (ридостина) для повышения резистентности организма животных и иммуногенности вакцины БЦЖ (опыты на лабораторных животных)//Там же. - с.173-181.

29. Аликин Ю.С., Клименко В.П. Ферменты как противовирусные средства для ветеринарной медицины//Мат.лы 8-ой Межгос. Меж-вуз. науч.-практ. конф."Новые фармакологические средства в ветеринарии". - Санкт-Петербург, 1996. - C.3.

30. Аликин Ю. С., Масычева В.И. .Клименко В.П. Ветеринарные препараты на основе БАВ - новый класс эффективных, экологически безвредных препаратов//Там же. - С.37-38.'

31. Фадина В.А., Аликин .Ю.С., Даниленко Е.Д.. Клименко В.П. Активация фагоцитоза макрофагов при исследовании биологической активности модифицированных форм рибонуклеиновых кислот//Там же.

- С.80-81.

32. Аликин Ю.С., Клименко В.П. Пролонгирование биологически активных веществ на основе белков и нуклеиновых кислот//0бзорн. информация "Химико-фармацевт, пр-во" НИИЭМП. - Москва, 1996. -N6. - 28 с.

33. Патент RU 2083221 А61К 38/20 (1996) Индуктор интерферона Ридостин/Аликин Ю.С., Веревкина К.Н., Дубатолова Т.Д.. Дужак A.B.

и др. -

34. Аликин Ю.С., Масычева В.И. Перспективы разработки и при-' менения препаратов, нового поколения в качестве лечебных и профилактических средств при болезнях молодняка/"Актуальные вопросы ветеринарии": ' Тез.докл. 1-й науч.- практ. конф. фак.вет.мед. НГАУ//Новосиб.гос.аграр.ун-т. - Новосибирск, 1997. - С.11-13.

35. Аликин Ю.С., Щелкунов И.С. Особенности формирования устойчивости организма под действием РНК у высших и низших позво-ночных//Тез.докл. III съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока. - Новосибирск, 1997. - С.6.

36. Щелкунов И.С., Щелкунова Т. И.. Купинская 0. А., Аликин Ю.С., Юхименко Л.Н. Лабораторные и полевые испытания иммуностимуляторов на основе РНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae для профилактики вирусных и бактериальных заболеваний рыб//Тез.докл. 1-го конгресса ихтиологов России,' Астрахань, сент., 1997. М.: Изд-во ВНИРО, 1997. - С.396.

37. Аликин Ю.С., Клименко В.П. Пролонгирование биологически активных веществ//Эпизоотология, диагностика, профилактика и меры борьбы с болезнями животных: Сб.науч.тр. /РАСХН. Сиб.отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 1997. - С. 228-235.

Подписано в печать 07.07.98 Формат 60x84/16 Печ.л. 2,5 Заказ №85 Тираж ЮС

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им Г.К.Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 5