Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Сравнительный анализ генома вакционных и эпизоотических штаммов возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота

РГ6 од

- 6 АВГ 1858

На правах рукописи УДК 619: 616.98:579.887.111:636.22/.28

ЧЕВЕЛЕВА Татьяна Сергеевна

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ-ГЕНОМА ВАКЦИННЫХ И ЭПИЗООТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ КОНТАГИОЗНОЙ ПЛЕВРОПНЕВМОНИЙ КРУПНОГО ЮГАТОГО СКОТА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Г

Покров -1998

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВиМ) Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор доктор биологических наук

А. Л. Семенныт С.Ж. Цыбанов

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор В.Л. Узюмов (ВНИИЗЖ)

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко ( г.Москва)

Защита диссертации состоится "18" сентября 1998 г. в "12.30" часов на заседании специализированного совета по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120,Владимирская обл., Покров, ВНИИВВиМ. С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан

кандидат ветеринарных наук

В.В. Куриннов (ВНИИВВиМ)

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Г.П. Федоров

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Наиболее патогенным и значимым видом микоплазм у крупного рогатого скота является возбудитель контагиозной плевропневмонии КРС (mycoides subsp. mycoides Mmm-SC тип), который входит в кластер Mycoplasma mycoides subsp. mycoides. В антигенном отношении они имеют сродство с микоплазмами М. mycoides subsp. mycoides (Mmm-LC тип), которые вызывают пневмонию у коз, а также М. sp. группы 7, вызывающие маститы и урогенитальные инфекции у коров. Отличить их в серологических реакциях невозможно (DaMassa A.J. и соавт.,1992).

Актуальность вопроса возрастает в связи с продолжающимся расширением современного ареала болезни. В Португалии после длительного благополучия (с 1956 года) в 1983 году было зарегистрировано сразу 1507 случаев заболевания крупного рогатого скота. Возникновение КПП в Италии (1990-1991 гг.) произошло после почти 100-летного перерыва. В условиях наличия и дальнейшего расширения обширных торгово-экономических связей России с зарубежными государствами существует постоянная угроза заноса возбудителя и возникновения болезни в нашей стране.

Непосредственное выделение микоплазм от больных животных при естественных и экспериментальных инфекциях удается осуществить с большим трудом и в основном в остром периоде заболевания. Однако, используемые для выделения микоплазм методы, обладая рядом определенных преимуществ (специфичность, воспроизводимость), не лишены и существенных недостатков (низкая чувствительность и производительность, трудоемкость и длительность). Поэтому совершенствование средств и методов диагностики и дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя КПП КРС с целью выяснения возможного источника

заноса инфекции остается актуальной проблемой. Данные литературы свидетельствуют также о том, что фенотипические признаки бактерий могут широко варьировать в зависимости как от условий культивирования, так и от аллельного состояния ответственных за экспрессию генов (Altwegg М., 1995; Kempf I., 1997). Поэтому наиболее консервативной структурой, характеризующей вид микроорганизма остается его геном. В этой связи основанная на характеристике генома возбудителя диагностика представляется наиболее перспективной.

Определение геномного полиморфизма полевых нзолятов и других микоплазм из кластера М. mycoides subsp. mycoides на основе использования метода RAPD-fingerprint позволил дифференцировать патогенные микоплазмы (Kobayashi Н.и соавт.,1996; Geary S.J. и соавт.,1996). Кроме того, в научной литературе имеются сообщения, свидетельствующие о том, что различия, обнаруженные в вариабельных участках 16 S рРНК, могут быть использованы для дифференциации различных штаммов возбудителя КПП КРС (Ros Barcunana С. И., 1994). Указанные обстоятельства послужили основной предпосылкой для разработки более чувствительных и специфичных средств и методов диагностики КПП КРС.

Поэтому нами были проведены исследования по оценке возможности дифференциации различных штаммов возбудителя КПП КРС от других представителей рода Mycoplasma с помощью метода ПЦР.

1.2. Цель и задачи исследования. Целью настоящих исследований явилось проведение сравнительного анализа генома различных штаммов возбудителя контагиозной плевропневмонии на основе полимеразной цепной реакции.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи;

- определить специфичность и чувствительность метода полимеразной цепной реакции для идентификации возбудителя КПП КРС;

- провести генотипирование вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя КПП КРС на основе анализа гипервариабельных последовательностей хромосомной ДНК;

-провести сравнительный анализ генома с помощью метода рибо-типирования с целью дифференциации штаммов возбудителя КПП КРС;

- разработать тест-систему на основе полимеразной цепной реакции для выявления микоплазменной контаминации клеточных культур, сывороток и вакцин.

1.3. Научная новизна работы. Впервые изучен геномный полиморфизм вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота на основе анализа вариабельных участков хромосомной ДНК. Определены праймеры и разработаны условия постановки ПЦР, позволяющие дифференцировать возбудитель контагиозной плевропневмонии крупного рогатого схота от других видов микоплазм.

Показана возможность дифференциации вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота методом риботипирования .

1.4. Практическая значимость. Практическая ценность работы состоит в том, что на основании экспериментальных данных разработаны методы идентификации и дифференциации возбудителя КПП КРС на основе анализа генома , которые могут быть рекомендованы для включения в схему и порядок лабораторных исследований с целью диагностики и выяснения возможного источника возникновения инфекции. Предложенные методы RAPD-fmgerprmt и риботипирования генома возбудителя разных штаммов КПП КРС могут быть использованы

для дифференциации штаммов и изолятов и паспортизации производственных штаммов, а также для контроля за изменениями вакцинных вариантов в процессе их хранения и культивирования.

1.5. На защиту выносятся следующие положения:

- результаты изучения геномного полиморфизма хромосомной ДНК эпизоотических и вакцинных штаммов возбудителя КПП КРС методами риботипирования и RAPD-fingerprint;

- результаты разработок полимеразной цепной реакции для выявления ДНК возбудителя КПП КРС с использованием праймеров, комплементарных вариабельным областям рРНК возбудителя КПП КРС;

- результаты исследований по выявлению ДНК микоплазм в биопрепаратах методом ПЦР.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1995-1997 г.г. во ВНИИВВиМ в соответствии с утвержденными плановыми заданиями.

1.6. Апробация результатов исследований. Материалы диссертационной работы доложены на научных конференциях: ВНИиТИБП, Щелково 1996, МГАВМиБ имени К.И.Скрябина 1996, а также на заседании Ученого совета ВНИИВВиМ 1996 г.

1.7. Публикации по работе. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ в материалах научных конференций.

1.8. Объем и структура работы.

Материалы диссертации изложены на 119 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, список литературы, содержащий 212 отечественных и зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 21 таблицей и 18 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 .Материалы и методы В работе были использованы эпизоотические и вакцинные штаммы возбудителя КПП M.mycoides subsp. mvcoides:

Эпизоотические штаммы: М2 (выделен в Монголии в 1970 г., получен из ВИЭВ); Madugri- 8 (выделен во время вспышки болезни в Нигерии в 1967); Gladyesdale (получен из Австралии в 1986 г).

Вакцинные штаммы: КН 3 J (получен из лаборатории Фарша (Чад) в 1969 г.); Т1-44 (получен из Сенегала в 1977 г.); МА-ВНИИВВиМ (получен аттенуацией на куриных эмбрионах из эпизоотичекого штамма М2 в лаборатории "Эпизоотологии" ВНИИВВиМ).

Контрольные штаммы: Acholeplasma granularum (шт.379) (возбудитель серозно-фибринозных артритов у свиней); Mycoplasma mycoides subsp.capri (вьщелен в ВИЭВ в 1970 году из легких козы, больной пневмонией); M.bovirhinis (im\V255/2g) (возбудитель бронхопневмонии у телят); A.laidla\vii (шт. 10116). Все перечисленные штаммы получены из музея бактериальных культур ВНИИВВиМ.

Ферменты: Рестриктазы Kpnl, Sail, PstI, BamHI, EcoRI, HindlH, Dral, Taq-полимера-за, фрагмент Кленова.

2.1.1. Культивирование возбудителя КПП КРС. Возбудитель КПП крупного рогатого скота вносили в бульон на основе триптического перевара сердца крупного рогатого скота (БТП) с рН 7.4-7.8 из расчета 1:10 в конечной концентрации и культивировали при 37°С в течение 3-5 суток. О наличии жизнеспособных микроорганизмов, по истечении 3-7 суточного культивирования на АТП, судили по появлению характерного опалесцирующего помутнения в БТП и колоний на агаре. Титр микоплазм определяли с применением метода Кербера, модифицированного Ашмариным И.П. и Воробьевым А.А. и выражали в

репродуцирующих (РЕ 50/мл) в жидкой питательной среде или колониеобразующих единицах (КОЕ 50/мл) на плотной питательной среде.

2.1.2. Контроль культур микоплазм на бактериальную контаминацию. В приготовленные питательные среды вносили для ингибиции роста бактерий пенициллин 100-1000 ЕД/мл в конечной концентрации и ацетат таллия - 1:1000-1:10000. Для контроля на бактериальную контаминацию среды выдерживали в условиях термостата при 37 0 С в течение 1-2 суток и делали высевы на питательные среды: МПБ, МПА, МППА, МППБ, среды Сабуро и Китт-Тароцци. Посевы выдерживали в течение 10 суток при 37 °С (на средах Сабуро - при 20-22°С), просматривали каждые 2-3 суток.

2.1.3. Титрование возбудителя КПП КРС. Чистоту и типичность роста контролировали микроскопией мазков, приготовленных из 3-суточных бульонных культур и окрашенных общепринятыми методами по Романовскому-Гимза, по Динсу и в серологических реакциях.

2.1.4. Выделение хромосомной ДНК микоплазм . Осадок клеток, отмытый от остатков питательной среды центрифугированием, суспендировали в буфере БТЕ, добавляли ДСН и протеиназу К до конечной концентрации 0,5%, 200 мкг/мл соответственно и инкубировали при 37 ° С 11,5 часа. Из лизата клеток ДНК выделяли трехкратной экстракцией смеси фенола и хлороформа (1:1). После переосаждения спиртом хромосомную ДНК обрабатывали РНК-азои и протеиназой К в конечной концентрации 10 и 100 мкг/мл в течение 30 мин при 37 °С. После обработки хлороформом препараты хромосомных ДНК переосаждали этиловым спиртом и хранили в 70%-ном этиловом спирте при -20° С.

2.1.5. Рестрикция ДНК, разделение продуктов гидролиза электрофорезом в геле агарозы. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили, применяя 10-кратный рестрикционный буфер

согласно паспорту, прилагаемому изготовителем для каждой рестриктазы. Размеры фрагментов определяли с помощью пакета прикладных программ DNASIS.

2.1.6. Введение радиоактивной метки в ДНК с помощью ДНК-полимеразы I ( ник-трансляция ), "фрагмент Кленова" проводили согласно инструкции к наборам фирм- изготовителей.

2.1.7. Риботипирование. Препараты ДНК микоплазм гидролизовали рестриктазами Hindi 11, EcoRl. Продукты рестрикции разделяли в 0,8 % агарозном геле, переносили на нитроцеллюлозный фильтр по методу Саузерна и гибридизовали с рДНК микоплазм.

2.1.8. Амплификацию фрагментов ДНК проводили в 20-50 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl (рН 8,9), 3 мМ MgCl, 40 mMKCI, 0,1 мг/мл БСА, 0,2 мМ смеси dNTP, 1 мкМ каждого праймера, 110 нг тотальной ДНК, 1-2 ед. акт. Taq-полимеразы. Амплификацию осуществляли 30-кратным повторением последовательности следующих стадий: денатурации (94° С, 1-3 мин), отжига (37- 65 0 С,1-3 мин) и полимеризации (70-72° С, 1-5 мин) на термоциклере Pharmacia-LKB, Gene- ATAQ Controller, с использованием Taq-полимеразы и dNTP фирм (Pharmacia, Швеция, Promega, США).

2.1.9. Компьютерный анализ и сравнение первичных структур нуклеиновых кислот, расчет олнгонуклеотидов. Обработку информации по первичной структуре проводили с использованием пакетов прикладных программ DNASIS/PROSIS версия 3.00 (Pharmacia, Швеция). Расчет вероятных схем спаривания праймеров осуществляли по методу определения оптимальных вторичных структур нуклеиновых кислот с использованием соответствующих энергетических правил по программе "OLIGO". Синтез олнгонуклеотидов проведен Н-фосфатным методом к.х.н. А.И. Ломакиным (ВНИИЗЖ).

2.2. Результаты исследований.

2.2. ¡.Идентификация возбудителя КПП КРС с помощью полимеразной цепной реакции.

Для индикации возбудителя были использованы специфические праймеры, комплементарные нуклеотидным последовательностям генов 16S рРНК микоплазм. Для дифференциации штаммов возбудителя КПП КРС были использованы праймеры комплементарные спейсерным последовательностям рибосомальной РНК, а также вариабельным последовательностям хромосомной ДНК (метод RAPD- fingerprint).

2.2.1.1. Разработка ПЦР для индикации возбудителя КПП КРС.

Известно, что наряду с консервативными последовательностями рРНК микоплазм имеются вариабельные межгенные участки между 16S и 23S , которые широко используются для индикации возбудителя КПП КРС. Поэтому целью данного этапа работы было изучение возможности выявления ДНК возбудителя КПП КРС с использованием праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям 16S рРНК штамма F38 из кластера М. mycoides subs . mycoides (Bascunana С., 1993).

При отработке оптимальных режимов амплификации в основном варьировали pH буферной системы, концентрацию ионов магния с использованием «Набора.......» фирмы «Силекс» (Москва), а также температуру

отжига от 50°С до 65°С.

Результаты выявления различных штаммов микоплазм методом полимеразной цепной реакции при различных температурах отжига представлены в таблице 1. При анализе вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя КПП КРС и других видов микоплазм (А. granularum, A.laidlawii и M.bovirhinis) с использованием данных праймеров при температуре отжига 50-55 ° С выявлены все виды исследуемых микоплазм, кроме ДНК- и РНК-содержащих вирусов, проб

органов животных. Однако при температуре отжига 62°С специфические прод>тсты ПЦР размером 548 п.о. получены только с ДНК различных штаммов возбудителя КПП КРС.

Для подтверждения специфичности проводили рестрикцию продукта ПЦР размером 548 п.о., полученного при температуре отжига 55° и 62°С, рестриктазой Pstl. В результате исследований установлено , что продукты ПЦР возбудителя КПП КРС (кластера М. mycoides subsp. mycoides) расщеплялись на 2 фрагмента размером 420 и 128 п.о.. тогда как остальные микоплазмы не имели сайта для рестрикгазы Pstl. Эти данные свидетельствуют о том, что возбудителя КПП КРС кластера М. mycoides subsp. mycoides можно выявлять с помощью ПЦР и последующего рестрикционного анализа Pstl.

Для определения порога чувствительности метода ПЦР тестировали 10-кратные разведения штамма МА-ВНИИВВиМ. Параллельно количество микоплазм анализировали микробиологическим высевом на жидкую и твердую питательные среды (БТП, АТП). Таким образом, описанная процедура позволяла обнаруживать в образцах ДНК возбудителя КПП КРС (штамма МА-ВНИИВВиМ) в концентрации 100-1000 КОЕ и 100 фг ДНК КПП КРС.

Для выявления вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя КПП КРС нами была использована следующая пара праймеров, комплементарных спейсерному участку рРНК мелкобляшечного варианта возбудителя КПП КРС кластера Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (референс-штамм GlXDedieu Т., 1994).

Электрофоретический анализ продуктов ПЦР, полученных с праймерами, специфичными для выявления кластера Mycoplasma mycoides subsp. mycoides показал, что все исследованные штаммы

Таблица 1

Результаты выявления ДНК возбудителя КПП КРС с использованием праймеров С(1+2), комплементарных 16Б рРНК при различных температурах отжига. ( п = 4 )

№ Наименование проб 50°С 55°С 62°С

Вакцинные штаммы:

1. МА-ВНИИВВиМ + + +

2. КН31 + + +

3. Т1-44 + + +

Эпизоотические шт.:

4. М2 + + +

5. Мадугри-8 + +

б. С1ас1уе$с1а1е + + +

7. Лимфа зараж. теленка + + +

Контроли:

8. А^гапи1ашт + + -

9. A.laidlawii + + -

10. М.ЬоУ1гЫшз + + -

11. М. туе. БиЬьр. сарп + + -

12. 55-ВНИИВВиМ (сиб.язва) 4- - -

13. В.сегеиз + -

14. Ь.топосу1о§. + -

15. Легкие теленка - -

16. Селезенка теленка - - -

17. Лимфа теленка - - -

18. Вирус болезни Ауески - -

19. Вирус оспы овец - -

возбудителя КПП КРС имели размеры, соответствующие расчетному значению 460 и 275 и.о.

Результаты выявления различных штаммов микоплазм методом полимеразной цепной реакции при различных температурах отжига представлены в таблице 2. Из представленных данных видно, что с использованием данной пары праймеров при температуре отжига 50°С были выявлены все виды исследуемых микоплазм, кроме листерий, бацилл, а также ДНК- и РНК-содержащих вирусов , проб органов животных. При использовании матриц гетерогенных микоплазм , бацилл и листерий при температуре отжига 55°С аналогичных продуктов ПЦР не выявлено .

Как видно из представленных данных, при мягких условиях отжига (температура 50°С) данная пара праймеров связывается с ДНК различных штаммов микоплазм. Повышение температуры отжига до 55°С позволяет выявлять только ДНК различных штаммов возбудителя КПП КРС.

Поэтому для дифференциации штаммов возбудителя КПП КРС и других видов микоплазм, дополнительно проводили рестрикцию продукта ПЦР размером 275 п.о. рестриктазой Dral.

В результате исследований установлено , что продукты ПЦР возбудителя КПП КРС (кластера М. mycoides subs . mycoides) расщепляются на на 2 фрагмента 175 и 100 п.о., тогда как остальные микоплазмы не имели сайта для рестриктазы Dral.

Эти данные свидетельствуют о том, что возбудитель КПП КРС кластера М. mycoides subs, mycoides можно выявлять с помощью ПЦР с использованием 2 пар праймеров и последующего рестрикционного анализа. Результаты определения чувствительности метода показали, что

Таблица 2

Результаты выявления ДНК возбудителя КПП КРС с использованием праймеров Д(1+2). Д(3+4) при различных температурах отжига

№ проб Пробы ДНК Результаты ПЦР Праймеры

да+ 2) Д(з + 4)

50°С 55°С 50°С 55°С

Вакцинные шт.:

1. МА-ВНИИВВиМ + + +

2. Т1-44 + + + +

3. KH3J + + + +

Эпизоотические шт.:

4. Мадугри-8 + + 4- +

5. Gladvesdale + •г + +

б. М2 + + + +

7. лимфа зараж. тел. + + + +

Контроли:

8. A.granularum + - - -

9. A.laidlawii -г - - -

10. M.bo-virhinis + - - -

i П. M.m.subsp. capri + + - -

12. 55-ВНИИВВиМ (сиб.язва) - - - -

13. В. cere us - - - -

14. L.monocytog. - - - -

15. Легкие теленка - - - -

16. Селез. теленка - - - -

17. Лимфа теленка - - - -

18. Вирус болезни Ауески - - - -

19. Вирус оспы овец - -

возбудитель КПП КРС (штамма МА-ВНИИВВиМ) обнаруживается в концентрации 5-10 КОЕ 5«Умл и 1-10 фг ДНК КПП КРС.

Таким образом, показана возможность использования ПЦР для идентификации различных штаммов возбудителя КПП КРС. На основании проведенных исследований был разработан «Набор препаратов для выявления ДНК возбудителя КПП КРС с помощью ПЦР» и проведены внутриикститугские комиссионные испытания.

2.2.2. Генотипирование хромосомной ДНК вакцинных и эпизоотических штаммов КПП КРС с помощью ПЦР.

У представителей микоплазм кластера M.mycoides subsp. mycoides -возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС не выявлено ярко выраженных генов, ответственных за патогенность микоплазм. Поэтому для дифференциации штаммов данного кластера основное внимание было уделено поиску генетических маркеров, локализованных на хромосомной ДНК. Такими маркерами могут служить гнпервариабель-ные последовательности хромосомной ДНК, которые используются для дифференциации микоплазм методом RAPD-fingerprint.

Поэтому для генотипирования хромосомной ДНК возбудителя КПП КРС в качестве универсальных праймеров были использованы 5 олигонуклеотидных затравок длимой 12-20 нуклеотидов.

С использованием двух праймеров (N5, N6) длиной 20 нуклеотидов эффективно амплифицирован набор мажорных и минорных фрагментов из 8-10 полос размером от 800 до 1900 п.о. Набор ПЦР-фрагментов по мажорным полосам был одинаков для всех исследованных штаммов M.mycoides subsp. mycoides - возбудителя КПП КРС (таблица 3). Из трех исследованных вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя КПП КРС (МА-ВНИИВВиМ, Мадугри-8, Gladyesdale) различий между ними не

выявлено. Изменение температуры и времени отжига праймеров, а также концентрации ионов М§2 + не позволило дифференцировать штаммы возбудителя КПП КРС. В то же время различия по минорным фрагментам наблюдались у других видов микоплазм (А^гагш1ашт, A.laidlawii, М.1хтгЫгш), не являющихся возбудителем КПП КРС. С помощью праймера N5 выявлены по 5 общих мажорных полос у всех штаммов возбудителя КПП КРС - 2300 п.о., 2000

Таблица 3 .

Результаты ПЦР с универсальным праймером N5

(размер продуктов в т.п.о.). п=5

кол-во фрагм МА-ВНИИВВиМ Мадугри-8 в^уез-ёа1е А^гапи-1агигп А.Ш1а\\и М.Ьоуп-Ышэ

1 2,3 2,3 2,3 2,3

2 2,0 2,0 2,0

3 1,9 1,9 1,9 1,9

4 1,7 1,7

5 1,6 1,6 1,6

б 1,5 1,5

7 1,4

8 1,3

9 1,2 1,2

10 1.0 1,0 1,0

11 0,8 0,8

п.о., 1900 п.о., 1600 п.о., 1000 п.о. Штаммы гетерогенных микоплазм (A.laidlavvii- 2300 п.о., М.Ьо\1гЫшб - 1900 п.о.) имели по одной общей мажорной полосе с возбудителем КПП КРС и отличались от штаммов

кластера M.mycoides subsp. mycoides наличием отдельных уникальных минорных полос (A.granularum - 1700, 1400, 1300, 800, A.laidlawii -2300.1500,1200, 800, M.bovirhinis - 1700, 1500,1200).

При использовании праймера N6 выявлены 4 мажорных полосы общих для всех штаммов возбудителя КПП КРС - 1700 п.о., 1600 п.о., 1300 п.о., 1000 п.о.. Штаммы гетерогенных микоплазм (A.granularum- 1700, 1300 п.о., A.laidlawü - 1700, 1600 п.о, M.bovirhinis - 1700, 1300, 1000 п.о.) имели по 2-3 общих мажорных полосы с кластером M.mycoides subsp. mycoides и отличались от штаммов возбудителя КПП КРС наличием 1-3 отдельных уникальных полос (A.granularum - 2000, 1500, 1400, 1100, Alaidlavvii - 1500, 1400, 1100, 900, M.bovirhinis - 1500).

При использовании другого праймера N IS для исследования 3 вакцинных (МА-ВНИИВВиМ, KH3J, TI-44) и 3 эпизоотических штаммов возбудителя КПП КРС различия между вакцинными шгаммами и эпизоотическими штаммами выявлены по 1-3 минорным фрагментам (KHjJ-600 п.о., Т1-44 - 1900, 1200, 450 п.о., Gladyesdale - 1200 п.о.). При этом три мажорных фрагмента являются общими для двух вакцинных штаммов МА-ВНИИВВиМ, KH3J (1700, 1600, 1300, 900) и также характерны для эпизоотических штаммов Мадугри-8 и Gladyesdale, тогда как у эпизоотического штамма М2 отсутствует мажорная полоса размером 1700 п.о., а у вакцинного штамма Т1-44 - 1700, 1600, 900 п.о.

Таким образом, межштаммовые различия с M.mycoides subsp. mycoides- возбудителя КПП КРС выявлялись наличием уникальных единичных полос. Вакцинные и эпизоотические штаммы возбудителя КПП КРС характеризовались 3 общими мажорными фрагментами, размерами от 1700 , 1300, 900 п.о, специфичных для каждого штамма .

Другой разброс величин фрагментов был получен с использованием другого праймера (N7) длиной 12 нуклеотидов. Межштаммовые

различия штаммов M.mycoides subsp. mycoides- возбудителя КПП КРС характеризовались наличием 11 фрагментов: МА-ВНИИВВиМ-1800, 1400 п.о.. Мадугри-8 - 1800, 1600, 1400 560 п.о., Gladyesdale - 1700, 1400, 1200, 700, 560 п.о.. Все исследованные штаммы имели 1 общий фрагмент, размерами 1400 п.о., при этом штаммы МА-ВНИИВВиМ. Мадугри-8, Gladyesdale отличались, кроме нескольких уникальных фрагментов, по одному общему фрагменту 1800 п.о., отсутствующего у штамма Gladyesdale. Гетерогенная микоплазма A.granularum отличается от возбудителя КПП КРС по всем полосам (1900, 1500, 1300, 1000 п.о.), за исключением двух уникальных полос (700, 560 п.о.). Результаты

Таблица 4.

Результаты ПЦР с универсальным праймером N7 (размер продуктов в т.п.о.).

Кол-во МА- Мадугри-8 Gladyesdale A.granula

фрагментов ВНИИВВиМ rum

1 1,9

2 1,8 1,8

3 1,7

4 1,6

5 1,5

6 1,4 1,4 1,4 1,4

7 1,3

8 U2

9 1,0 1,0

10 0,7 0,7 0,7

11 0,56 0,56 0,56

электрофоретического анализа продуктов ПЦР различных штаммов микоплазм, полученных с использованием праймера N7 представлены в таблице 4.

При исследовании различных штаммов микоплазм с использованием универсального праймера N10 установлено.что картина ПЦР-фрагментов ДНК у вакцинного штамма КН31 и эпизоотических Мадугри-8 и М2 соответственно совпадает только по 1 мажорному фрагменту (1700 п.о.), а у эпизоотического СЬсЗуеясЫе и вакцинного Т1-44 тоже по 1 фрагменту (1600 п.о.). Выявлены 2 минорных фрагмента: высокомолекулярный - у штаммов КН31, Т1-44, Мадугри-8 (2000 п.о.) и низкомолекулярный - у штаммов КН3Х Т1-44 (560 п.о.). У Мадугри-8 и ОЫуеБсЫе этих фрагментов не выявлено. У МА-ВНИИВВиМ отмечен только низкомолекулярный фрагмент (560 п.о.). Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Результаты ПЦР с универсальным праймером N10 (размер продуктов в т.п.о.).

Кол-во фрагм. М2 вЫуез-<3а1е Мадугри-8 КН3Д Т1-44 МА-ВНИИВ-ВиМ А^гапи-1агит

1 2,0 2,0 2,0

2 1,9

3 1,7 1,7 1,7

4 1,6 1,6

5 1,0

6 0,56 0,56 0,56 0,56

Из 5 использованных универсальных праймеров только два праймера (N7 и N10 ) давали уникальный для каждого штамма микоплазм набор мажорных и минорных фрагментов ДНК.

Таким образом, показана возможность использования ПЦР для анализа генома штаммов микоплазм. Универсальные праймеры позволяют осуществлять генотипирование штаммов возбудителя КПП КРС и могут быть использованы для дифференциации и паспортизации производственных вакцинных штаммов.

2.2.3. Выявление геномного полиморфизма штаммов возбудителя КПП КРС методом риботипирования Данный раздел работы посвящен исследованию геномного полиморфизма штаммов микоплазм зондированием последовательностей хромосомной ДНК с помощью ДНК-зонда, комплементарного 16Б рРНК с целью оценки генетилического разнообразия и возможной дифференциации штаммов, характеризующихся высокой степенью фенотипического родства .

Анализ результатов молекулярного зондирования фрагментов ДНК, полученных с помощью рестриктазы ЕсоИ и НтсПН, показал, что профили гибридизации с ДНК-зондом (размером 830 п.о.) различных штаммов микоплазм имеют мажорные и минорные полосы, которые являются как общими, так и специфичными для штаммов (таблица 6 ).

Профили гибридизации рестрикцированных фрагментов (ЕсоЮ, НтсИИ) ДНК штаммов возбудителя КПП КРС и других микоплазм (Мг, Мадугри-8, С1ас1уе5(1а1е, ЬСН31 Т1-44, А-ЫсНаум) отличались между собой при температуре гибридизации 65° С. Наряду с 2-мя общими фрагментами 1,7 и 6,0 т.п.о. ( НтсПП ) и тремя 3,0, 5,5, 6,5 ( ЕсоШ ). присутствущими в ДНК исследованных штаммов, гипервариабельные

Таблица 6

Результаты блот-гибридизации 16 8 рРНК с хромосомной ДНК микоплазм, после рестрикции эндонуклеазой ЕсоШ при 65® С.

№ МА-ВНИИВВиМ Т1-44 Мадугри-8 вЫуез-с!а1е м2 А.1ш<1-1а\\'п

1. 23

2. 15 15 15

3. 8,0 8,0

4. 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5 6,5

5. 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5

6. 4,0

7. 3,7 3,7

8. 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

9. 2,3

10. 2,0

11. 1,8 1,8

12. 1,5 1,5

повторы выявляются во фрагментах со специфическими, только для их ДНК, размерами ( 1,5; 1,8; 2,0; 2,3; 3,7; 4,0; 8,0; 15; 23 т.п.о,- ЕсоЮ, 4,1 т.п.о. - НшсШГ).

При этом, наряду со специфичными для каждой из групп штаммов возбудителя КПП КРС фрагментами, различающимися по молекулярной массе, выявлены и общие одинаковые для всех штаммов фрагменты с одинаковой молекулярной массой , которые свидетельствуют об их принадлежности к одному виду.

2.2.4. Выявление микоплазменной контаминации биопрепаратов с помощью ПЦР.

Задачей данного этапа работы явилась разработка универсальной тест-системы на основе ПЦР для анализа возможных контаминации микоплазмами биопрепаратов и их компонентов (клеточных культур, сывороток и вакцин). В работе использовали микоплазмы, спонтанно инфицирующие клетки животных, культивируемые in vitro (Mycoplasma bovirhinis, Acholeplasma laidlawii) и возбудитель контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота (штамм МА-ВНИИВВиМ). Нуклеотидные последовательности пранмеров выбраны на основании консервативных участков 16S рРНК штамма M.capricolum (Christiansen G., 1990).

Размеры амплифицированных фрагментов соответствовали ожидаемым ( 830 п.о.) и не различались для разных видов микоплазм в пределах точности измерения. При использовании гнездовых праймеров (МЗ+М4) получены продукты ПЦР размером 330 п.о. для тех же видов микоплазм .

При использовании препаратов эукариотической ДНК, выделенной из органов свиней, цыплят, кроликов (почки, печень, легкие, лимфатические узлы, селезенка) не обнаружено продуктов амплификации даже при увеличении количества ДНК в пробе до 1мкг.

Следует отметить, что при температуре отжига 50°С и использовании в качестве матриц ДНК бактерий L. monocytogenes и B.cereus, были получены продукты ПЦР аналогичного размера. Эти данные свидетельствуют о том , что данные праймеры (М1+М2) и (МЗ+М4) комплементарны высококонсервативным участкам последовательности рРНК прокариот и могут быть использованы для выявления не только различных видов микоплазм, но и других бактерий, контаминирующих биопрепараты.

Поэтому с целью дифференциации различных видов микоплазм от бактерий была увеличена температура отжига до 58°С, при которой не выявлено продуктов ПЦР при использовании в качестве матриц ДНК других бактерий.

С целью дифференциации микоплазм от других видов бактерий (спорообразующих сапрофитов: В сегеиз, В.зиЫШз, В.тезеМепсиз, В.р5еис1оа1й11гасо1(1е5 и бацилл сибирской язвы шт. 55-ВНИИВВиМ, М-71) нами был также проведен рестрикционный анализ продукта ПЦР (830 п.о., праймеры М1+М2), полученного при температуре отжига 50° С.

Результаты исследований показали, что рестриктаза Крп1 расщепляет только ДНК микоплазм на два фрагмента, размером 560 и 270 п.о. Таким образом, рестрикционный анализ продуктов ПЦР, полученных при температуре отжига 50°С, позволяет дифференцировать микоплазмы от бацилл и листерий.

Указанные праймеры были использованы для тестирования перевиваемых культур клеток ПСГК и сыворотки теленка «Ну-С1опе» (США), искусственно контаминированных 10-кратными разведениями микоплазм (МА-ВНИИВВиМ и А. ЫсИаип). Параллельно культуры клеток анализировали методом электронной микроскопии и микробиологическим высевом на жидкую (БТП) и твердую питательную (АТП) среды. Проведенные исследования показали, что "Набор..." позволяет получать положительные результаты при анализе проб с расчетной концентрацией микоплазм 10-100 КОЕ 50/ил •

Результаты выявления ДНК микоплазм в перевиваемых культурах клеток (МДВК, ПС, ПЭКр, ПО, РК, СУ-1, БК-6, ПТП, РК-15Г, РК-15П, ПСГК), а также различных серий сывороток КРС производства Владимирского и Московского мясокомбинатов, используемых для выращивания культуры клеток, спонтанно инфицированных неиден-

тифицированными микоплазми показали, что с использованием гнездовых праймеров в большинстве образцов (60-70%) обнаружена ДНК микоплазм .

Для исследования возможности удаления из коммерческих серий сывороток микоплазм, контрольную сыворотку «Ну-С1опе» США, искусственно контаминировали 10-кратными разведениями микоплазм (АсЬокркята ЫсИаип и шт. МА-ВНИИВВиМ), затем обрабатывали 710? о полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000). Результаты исследований показали, что обработка полиэтнленгликолем на 2-3 порядка снижает концентрацию микоплазм в заведомо контаминированных сыворотках. В следующей серии опытов были исследованы различные серии вакцин на наличие ДНК микоплазм ( КЧС из штаммов « ЛК-К», «ЛК-ВНИИВВиМ», инфекционного ринотрахеита КРС штамм «ТК-А», ИЛТ птиц из штаммов «НТ» и «ВНИИБП», болезни Ньюкасла из штаммов «Бор-74 » и «ЛА-СОТА», болезни Тешена штамм «Закарпатский»). Результаты показали, что в 75% исследованных сериях вакцин обнаружена ДНК микоплазм. Таким образом, на основании проведенных исследований был разработан «Набор препаратов для выявления ДНК микоплазм в биопрепаратах с помощью ПЦР» и проведены внутриинститутские комиссионные испытания.

3. ВЫВОДЫ

3.1. Отработаны оптимальные условия постановки полимеразной цепной реакции и синтезированы праймеры, комплементарные вариабельным участкам последовательности 16 8 рРНК микоплазм, позволяющие при температуры отжига 62° С для праймеров С (1+2) и 55°С для праймеров Д(1+2),(3+4) выявлять ДНК вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя контагиозной плевропневмонии КРС.

3.2. Для дифференциации штаммов кластера Mycoplasma mycoides subsp. mycoides от гетерогенных видов микоплазм дополнительно проводят рестрикционный анализ продукта ПЦР размером 548 п.н. (праймеры С(1+2)) рестриктазой Pstl, и продукта ПЦР размером 275 п.н. (гнездовые праймеры Д(3+4)) рестриктазой Dral, что позволяет установить принадлежность исследуемых микоплазм к возбудителю контагиозной плевропневмонии КРС.

3.3. Разработанная модификация ПЦР с использованием гнездовых праймеров Д(3+4) позволяет обнаружить ДНК возбудителя КПП КРС в патологическом материале и бульонных культурах, что соответствует 10100 КОЕ 50/мл.

3.4. Анализ ДНК различных штаммов микоплазм методом риботипирования с помощью ДНК-зонда, комплементарного рРНК микоплазм, позволяет выявить различия между геномами исследованных микоплазм и может быть использован для дифференциации эпизоотических и вакцинных штаммов возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота, а также других видов микоплазм.

Установлено, что при жестких условиях гибридизации (65 "С) каждый исследованный штамм характеризуется наличием как общих, так и индивидуальных различающихся по молекулярной массе фрагментов ДНК.

3.5. Установлено, что препараты ДНК различных штаммов возбудителя КПП КРС специфически амплифицируются с использованием универсальных праймеров (№7 и №10), комплементарных гипервариабельным последовательностям хромосомной ДНК. Полученные на матрице ДНК вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя КПП

КРС продукты ПЦР имеют размеры, специфичные для каждого штамма, и могут быть использованы для дифференциации.

3.6. Разработан "Набор препаратов для выявления ДНК микоплазм в биопрепаратах с помощью ПЦР" с использованием праймеров, комплементарных последовательностям 16 Б рРНК, обеспечивающий максимальную чувствительность 10 КОЕ5&;мл или 1-10 фг ДНК неидентифицированных микоплазм в пробах сыворотки КРС, вакцинах и культурах клеток.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

4.1. Разработанные методы идентификации и дифференциации возбудителя КПП КРС на основе анализа генома могут быть рекомендованы для включения в схему и порядок лабораторных исследований с целью диагностики и выяснения возможного источника возникновения инфекции.

4.2. Предложенный метод риботипирования генома возбудителя разных штаммов КПП КРС может быть использован для дифференциации штаммов и изолятов и паспортизации производственных штаммов, а также для контроля за изменениями вакцинных вариантов в процессе их хранения и культивирования.

4.3. Разработан "Набор препаратов для выявление ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции " и "Методические указания по выявлению ДНК возбудителя контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции", утвержденные директором ВНИИВВиМ от 14.01.97г.. Предложенный набор может быть использован для выявления возбудителя КПП КРС в патологическом материале и бульонных культурах при лабораторных исследованиях.