Автореферат и диссертация по медицине (14.00.09) на тему:Клинико-иммунологическая оценка течения БЦЖ-вакционного процесса и формирования противотуберкулезного иммунитета (клинико-экспериментальное исследование)

Актуальность проблемы. Важное место в профилактической работе педиатра занимает иммунопрофилактика туберкулеза, по которому в России с 1990 года сложилась крайне неблагоприятная эпидемиологическая ситуация, с ростом всех эпидемических показателей по детскому туберкулезу [19, 21, 115, 116, 248, 249, 293]. С целью создания активного противотуберкулезного иммунитета у детей в Национальном календаре профилактических прививок (приказ МЗ РФ №229 от 27.06. 2001 г.), предусмотрена вакцинация на 3-7 день жизни всех новорожденных, не имеющих противопоказаний, и ревакцинация детей в 7 и (или) 14 лет вакциной БЦЖ или БЦЖ-М (приказ МЗ РФ №109 от 21,03,2003). Осуществление специфической профилактики туберкулеза возложено на медицинских работников общей педиатрической лечебной сети и является приоритетным методом среди мероприятий по защите от туберкулеза детей раннего возраста. Охват детей БЦЖ-вакцинацией в последние годы достиг оптимальных цифр (95,9% - 98%) [21, 115, 299], и, несмотря на это, уменьшения инфицированности и заболеваемости туберкулезом среди детей раннего и дошкольного возраста не наблюдается [19, 41]. Одной из причин сложившейся ситуации является изменение в последние годы иммунобиологической реактивности организма детей под влиянием внешних и внутренних неблагоприятных факторов, увеличение груза генетических факторов, ухудшение состояния здоровья с увеличением числа детей со сниженной противоинфекционной защитой [27, 77, 80, 124, 154, 310]. Это не может не влиять на течение вакцинного процесса и формирование адаптивного противотуберкулезного иммунитета. Как следствие этого - низкая эффективность иммунизации, не обеспечивающая гарантированную защиту от туберкулезной инфекции, резервуаром которой является взрослое население [42]. Известно, что на формирование противотуберкулезного иммунитета кроме генетических факторов, контролирующих резистентность и восприимчивость к заболеванию, влияют многие эндогенные и экзогенные факторы, определяющие состояние здоровья вакцинированных детей [2, 3, 22, 87, 120, 135, 164, 205, 267, 268, 281, 284, 350]. Очевидно, тактика проведения иммунопрофилактики у детей с отклонениями в состоянии здоровья должна быть индивидуализирована и включать мероприятия, направленные на повышение эффективности вакцинации [121, 131, 152, 250]. В этом нас убеждает положительный опыт применения такой технологии по повышению иммунологической эффективности вакцинации детей с соматической патологией в отношении таких инфекций, как дифтерия и корь [101, 120, 121, 141, 203, 251, 276, 303], а также экспериментальные данные по противотуберкулезной иммунизации животных с разными моделями иммунологической недостаточности [284]. Однако в отношении иммуннопрофилактики туберкулеза у детей такой подход не применялся. Выраженная положительная динамика эпидемических показателей по детскому туберкулезу в 1960-80-е годы исключала постановку такого вопроса. В результате, у детей с соматической патологией течение БЦЖ-вакцинного процесса и формирование противотуберкулезного иммунитета не исследовались. Это особенно важно для повышения эффективности профилактики у детей из групп риска по заболеванию туберкулезом. Одной их таких групп риска являются дети раннего возраста, имеющие хронические расстройства питания по типу гипотрофии, сопровождающиеся вторичной иммуннологической недостаточностью, преимущественно клеточного звена иммунитета [211, 236, 377], имеющего ведущее значение в механизмах защиты от туберкулеза [45, 138, 280, 289, 314]. На увеличение в последние годы числа детей с недостаточностью питания указывают данные официальной статистики [28], свидетельствующие о наибольшей распространенности этой патологии у детей первых 2-х лет жизни и, особенно, в семьях социального риска [301], в которых имеется одновременно и риск заболевания туберкулезом [171, 181]. Однако состояние противотуберкулезного иммунитета после вакцинации БЦЖ у детей с гипотрофией не исследовалось.

Сдерживающим фактором в изучении иммунных аспектов противотуберкулезной вакцинации у детей с отклонениями в состоянии здоровья является отсутствие у педиатров объективных критериев оценки напряженности противотуберкулезного иммунитета. Несмотря на многочисленные исследования по иммунологической перестройке организма, наступающей после внутрикожного введения вакцины БЦЖ (А.И. Тогунова, 1955; ЕЛ. Кан, 1962; В.И. Пузик, 1966; А.А. Ефимова, 1968; М.А. Авербах, В.И. Литвинов, 1970, 1976; Л. А. Митинская, 1975), и бесспорные доказательства эффективности специфической иммунопрофилактики туберкулеза, вопросы, связанные с индивидуальной оценкой напряженности противотуберкулезного иммунитета, разработаны только на экспериментальном материале [1, 8, 136]. У детей эта проблема остается открытой, так как рекомендуемые для этой цели туберкулиновые пробы и величина поствакцинального рубчика имеют ограниченное значение в определении резистентности против туберкулеза, особенно в отдаленные сроки после вакцинации [9, 40, 73, 166,]. Более информативными для оценки напряженности противотуберкулезного иммунитета являются клеточно-опосредованные реакции, характеризующие состояние Т-клеточного звена иммунитета: РБТЛ, РТМЛ с ППД [36, 52, 85], но сложность их постановки, а главное, трудности при индивидуальной оценке результатов, не позволили им «прижиться» в практической педиатрии. В отечественной литературе не было найдено работ по исследованию состояния противотуберкулезного иммунитета у детей с разным состоянием здоровья в динамике после вакцинации БЦЖ с использованием иммунологических тестов, отражающих состояние противотуберкулезного иммунитета. В связи с этим не существует единого мнения о продолжительности противотуберкулезного иммунитета после первичной вакцинации и нет сведений о зависимости этого процесса от состояния здоровья вакцинированных.

Исходя из вышеизложенного, в педиатрии велика необходимость в простых и надежных специфических тестах, позволяющих оценивать напряженность противотуберкулезного иммунитета у любого вакцинированного ребенка, имеющего соматическую патологию. На кафедре патофизиологии ПГМА под руководством профессора В.Н. Каплина были разработаны методы, основанные на ранних специфических реакциях клеток крови (нейтрофилов, лимфоцитов) при инфекционных заболеваниях и вакцинации. К этим методам относятся: метод исследования специфического изменения ФАЛ крови, который уже применялся при БЦЖ-вакцинации и туберкулезной инфекции у детей [231, 232]; метод определения специфической адгезивной способности лимфоцитов крови, который использовался для диагностики туберкулезной инфекции у детей, длительно и часто болеющих [278]; а также модифицированный метод диагностического исследования титров антител в РНГА, который применялся для диагностики туберкулезной инфекции [102] и других инфекций [139, 291, 295]. Исследований с применением такого комплекса специфических реакций, характеризующих функциональное состояние фагоцитарного звена, клеточного и гуморального звеньев противотуберкулезного иммунитета, для контроля за течением БЦЖ-вакцинного процесса и формированием противотуберкулезного иммунитета у здоровых детей и детей с соматической патологией, в том числе с тяжелой недостаточностью питания, при которой преимущественно нарушается клеточный иммунитет [211, 236], не проводилось. Существующие на сегодня жесткие регламентированные сроки противотуберкулезной вакцинации и ревакцинации не исключают возможности научных исследований в направлении поиска новых технологий повышения эффективности иммунопрофилактики туберкулеза у детей. Одной из таких технологий является применение индивидуального подхода к вакцинации БЦЖ, реализация которого не возможна без разработки методов индивидуальной оценки состояния противотуберкулезного иммунитета и критериев его напряженности.

Необходимость решения проблемы индивидуальной оценки специфического иммунитета у детей после вакцинации БЦЖ диктуется еще и тем, что в современной эпидемиологической обстановке возрастает доля детей дошкольного возраста среди инфицированных и больных туберкулезом [19, 43, 124, 179, 243], что указывает на угасание противотуберкулезного иммунитета к этому периоду [37, 74].

Цель исследования. Установить особенности формирования противотуберкулезного иммунитета после вакцинации БЦЖ в эксперименте, у здоровых детей и детей раннего возраста с гипотрофией 2-3 степени, применив комплекс методов, основанных на выявлении специфических реакций клеток крови и антителообразования.

Задачи исследования:

1. Определить в динамике становление противотуберкулезного иммунитета в условиях экспериментального БЦЖ-вакцинного процесса с помощью комплекса лабораторных тестов, включающих определение количественного и качественного состава лейкоцитов крови, состояния фагоцитарной защиты, специфических изменений ФАЛ крови, специфической адгезивной способности лимфоцитов крови и специфического антителообразования.

2. Выявить возрастные особенности формирования противотуберкулезного иммунитета при экспериментальном БЦЖ-вакцинном процессе.

3. Усовершенствовать метод диагностической оценки определения специфической адгезивной способности лимфоцитов крови при вакцинации БЦЖ.

4. Обосновать возможность применения предложенного комплекса специфических реакций для индивидуальной оценки активности БЦЖ-вакцинного процесса и состояния противотуберкулезного иммунитета у детей.

5. Дать клиническую характеристику БЦЖ-вакцинному процессу у здоровых детей и определить закономерности становления у них противотуберкулезного иммунитета в динамике поствакцинального периода с помощью комплекса специфических тестов, апробированных в эксперименте.

6. Определить клинические особенности гипотрофии 2-3 степени тяжести у детей Пермского региона, оценить состояние системы противомикробной защиты, выявить у них особенности течения БЦЖ-вакцинного процесса и формирования противотуберкулезного иммунитета с помощью апробированного в эксперименте и у здоровых детей комплекса специфических реакций.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное клинико-экспериментальное исследование по вакцинации БЦЖ в Пермском регионе, включающее оценку клинического течения вакцинного процесса, состояния естественной противоинфекционной защиты организма, реакций специфического иммунитета (специфических изменений ФАЛ крови, специфической адгезивной способности лимфоцитов крови, специфического антителообразования), результаты которого необходимы для эффективной организации специфической профилактики туберкулеза в условиях детской поликлиники.

Впервые в регионе изучено течение БЦЖ-вакцинного процесса у здоровых детей и детей с тяжелыми расстройствами питания по типу гипотрофии и выявлены клинические особенности его течения. Показано, что у здоровых детей эффективность вакцинации, определяемая по размерам прививочных рубчиков, за 20 лет сохраняется стабильной, течение прививочной реакции не изменилось, а поствакцинальная аллергия по пробе Манту с 2 ТЕ ППД-Л в первые 2 года после вакцинации стала выявляться чаще. У детей с гипотрофией установлены отклонения от физиологического течения вакцинного процесса, проявляющиеся медленным развитием кожной прививочной реакции, с более частым вовлечением в процесс регионарных лимфатических узлов, с большей частотой осложнений, в редком развитии поствакцинальной аллергии и рубчиков оптимальной величины.

Впервые в экспериментальных условиях для контроля за течением БЦЖ-вакцинного процесса применен комплекс специфических реакций, включающий индивидуальную оценку специфических изменений ФАЛ крови, специфической адгезивной способности лимфоцитов крови и продукции специфических антител. Установлено, что данный комплекс реакций многогранно характеризует становление противотуберкулезного иммунитета и может использоваться для его индивидуальной оценки в любой срок поствакцинального периода. Показана высокая эффективность оценки специфических изменений ФАЛ крови в определении активности вакцинного процесса и состояния противотуберкулезного иммунитета; специфической адгезивной способности лимфоцитов - в определении состояния противотуберкулезного иммунитета и его напряженности, но показана малая информативность определения специфических антител для оценки противотуберкулезного иммунитета. Установлены в эксперименте возрастные особенности формирования специфических реакций при противотуберкулезной вакцинации, и выявлено влияние возраста на клеточное звено противотуберкулезного иммунитета.

Усовершенствован метод исследования специфической адгезивной способности лимфоцитов крови с унифицированной количественной оценкой реакции по ИСРО, позволяющему после вакцинации БЦЖ выявлять индивидуальное состояние напряженности противотуберкулезного иммунитета.

Впервые применен предложенный комплекс специфических реакций для индивидуальной количественной оценки специфического иммунного ответа у здоровых детей в динамике БЦЖ-вакцинного процесса до срока 1-й ревакцинации БЦЖ. Установлен характер, выраженность и продолжительность специфических реакций в организме вакцинированных детей, свидетельствующих об угасании противотуберкулезного иммунитета через 3 года после вакцинации по всем специфическим показателям (кожному рубчику, туберкулиновой чувствительности, ИСФэаг> ИСА, ИСРО).

Впервые дана клиническая характеристика тяжелых расстройств питания по типу гипотрофии у детей в Пермском регионе и особенности формирования у них противотуберкулезного иммунитета после БЦЖ-вакцинации. Установлен высокий процент детей первых 4-х месяцев жизни среди детей с тяжелой гипотрофией; выявлена большая распространенность у них недостаточности фагоцитоза. Показано, что противотуберкулезный иммунитет достигает у них наибольшей напряженности через 5-9 месяцев с последующим быстрым угасанием через 1 год.

Изучены взаимосвязи предложенных специфических реакций и связь их с туберкулиновой чувствительностью по пробе Манту с 2 ТЕ ППД-Л и величиной поствакцинального рубчика. Показано, что для оценки противотуберкулезного иммунитета преимущество имеют изученные специфические реакции клеток крови, выявляющие иммунный ответ даже при отсутствии прививочного рубчика и отрицательной пробе Манту.

Теоретическая и практическая значимость. Работа направлена на решение проблемы индивидуальной оценки противотуберкулезного иммунитета у детей, вакцинированных БЦЖ, и в перспективе - повышения эффективности противотуберкулезной вакцинации у детей с соматической патологией.

Предложенный комплекс специфических реакций, простых в выполнении и высоко информативных, позволяет осуществлять индивидуальный контроль за течением иммунологического процесса после вакцинации БЦЖ, за формированием специфического иммунитета. Фагоцитарный тест и исследование специфической адгезивной способности лимфоцитов крови позволяют индивидуально и дифференцированно от периода вакцинного процесса оценить характер, интенсивность и длительность изменений, вызванных вакциной БЦЖ. В связи с этим, методы перспективны для изучения проблемы формирования противотуберкулезного иммунитета у детей с различной хронической патологией, с осложненным течением вакцинного процесса, с отсутствием кожного рубчика, с отрицательной пробой Манту с 2 ТЕ ППД-Л.

Полученные данные об иммунобиологической реактивности здоровых детей и детей с тяжелой гипотрофией, вакцинированных БЦЖ, необходимы педиатрам для адекватного наблюдения за клиническим течением вакцинного процесса и раннего выявления осложнений с последующей своевременной консультацией фтизиопедиатра.

Определены практические рекомендации по применению методов исследования специфического изменения ФАЛ крови, специфической адгезивной способности лимфоцитов крови, специфического антителообразования у детей после вакцинации БЦЖ. Показан низкий иммунизирующий эффект вакцины БЦЖ у детей с гипотрофией 2-3 степени, что является основанием считать этих детей группой риска по заболеванию туберкулезом.

Полученные данные о причинах развития тяжелых расстройств питания по типу гипотрофии у детей раннего возраста в Пермском регионе позволят сконцентрировать усилия многих служб для организации и осуществления комплекса профилактических мероприятий и ранней диагностики этого заболевания.

Положения, выносимые на защиту:

Экспериментальный БЦЖ-вакцинный процесс сопровождается фазным течением кожной прививочной реакции, количественными и качественными изменениями лейкоцитов крови, изменением состояния фагоцитарной защиты, специфическим повышением ФАЛ крови, повышением специфической адгезивной способности РОЛ крови и специфическим антителообразованием, отражающих формирование противотуберкулезного иммунитета, на становление которого влияет возраст экспериментальных животных.

2. Для индивидуальной оценки эффективности противотуберкулезной вакцинации у детей наряду с полевакцинным рубчиком, туберкулиновой чувствительностью по пробе Манту с 2 ТЕ ППД-Л рекомендуется применять комплекс методов, выявляющих специфический иммунный ответ: исследование специфических изменений ФАЛ крови, определение специфической адгезивной способности лимфоцитов крови и РНГА с модифицированным способом оценки.

3. У детей с гипотрофией 2-3 степени эффективность противотуберкулезной вакцинации ниже, чем у здоровых детей. Дети с гипотрофией имеют недостаточность фагоцитарной защиты, отклонения от физиологического течения БЦЖ-вакцинного процесса, которые сопровождаются нарушением нормального механизма формирования адаптивного противотуберкулезного иммунитета.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены на 9-й Межинститутской научной конференции (Челябинск, 1989), на 4-ом Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989), на 2-й научной межвузовской конференции «Актуальные вопросы клинической педиатрии, акушерства и гинекологии» (Киров, 1993), на 1-й научно-практической конференции Ассоциации детских врачей Пермской области (Пермь, 1996), на Всероссийском симпозиуме (с международным участием) «Клиническая лаборатория на пороге XXI века: синтез традиций и новаций (аналитика, диагностика, техника, экономика» (Москва, 1999), на областной научной конференции молодых ученых «Молодежная наука Прикамья» (Пермь, 2000), на Всероссийской конференции «Внутриутробные инфекции плода и новорожденного» (Саратов, 2000), на 5-й Международной научной конференции «Здоровье семьи - 21 век» (Мармарис, 2001), на 1-й Всероссийской научно-практической конференции «Здоровье и образование ребенка» (Пермь, 2002), на 2-й конференции иммунологов Урала (Пермь, 2002), на научной сессии ПГМА (Пермь, 1998, 2001), на 2-й Всероссийской научно-практической конференции «Здоровье и образование» (Пермь, 2004), на Юбилейной научной сессии ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера (Пермь, 2006), на 9-1 Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Томск, 2006), межкафедральных заседаниях по педиатрии и фтизиатрии ГОУ ВПО «ПГМА Росздрава» (2003-2007).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования иммунобиологической реактивности детей, вакцинированных БЦЖ, внедрены в работу иммунологических лабораторий и используются в работе поликлиник ДГКБ №13, ДГКБ №15 и Пермской краевой детской клинической больницы. Полученные данные по клиническим аспектам противотуберкулезной вакцинации используются в учебном процессе на кафедре педиатрии ФПК и ППС ГОУ ВПО «ПГМА им ак. Е.А. Вагнера Росздрава». По результатам исследований изданы информационное письмо «Фагоцитарный тест в диагностике туберкулезной инфекции и в оценке противотуберкулезной вакцинации у детей» (г.Пермь, 1995) и методические рекомендации «Применение метода диагностического определения специфической фагоцитарной реакции у детей при вакцинации БЦЖ и туберкулезной инфекции» (г.Пермь, 2006). Методы определения специфических изменений ФАЛ крови и специфической адгезивной способности лимфоцитов крови могут быть использованы в ЛПУ после включения их в медико-экономические стандарты для иммунологических лабораторий.

Личное участие автора. Автором проведены: анализ всей необходимой медицинской документации, клиническое обследование детей, вакцинация БЦЖ кроликов и весь период наблюдения за ними.

Автором выполнены все специфические дополнительные лабораторные исследования у экспериментальных животных, детей, взрослых (исследование ФАЛ крови, определение специфического изменения ФАЛ, специфической адгезивной способности лимфоцитов, РНГА), анализ и статистическая обработка полученных результатов.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 25 работ, в том числе 5 статей и 1 тезисы в центральных журналах рецензируемых ВАК РФ, 1 информационное письмо по рекомендации управления научных исследований МЗ и МП РФ, 1 методические рекомендации ГОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Росздрава. Имеется 3 патента на изобретение.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментальный БЦЖ-вакцинный процесс сопровождается фазным течением кожной прививочной реакции, и соответствующим иммунному процессу изменением состава лейкоцитов крови. Инфильтративно-экссудативная фаза, определяемая до 1 месяца, сопровождается в начале своего развития моноцитозом, эозинофилией, базофилией. Продуктивная фаза, продолжающаяся до 2 месяцев, характеризуется лимфоцитозом, моноцитозом, эозинофилией, нейтропенией и кратковременной базофилопенией. Фаза фиброза, заканчивающаяся через 3 месяца образованием рубчика, сопровождается лимфоцитозом. и нейтропенией. Лимфоцитоз с лимфобластозом и моноцитопенией, определяемые через 6 месяцев после вакцинации, свидетельствуют о продолжающихся в организме процессах иммуногенеза и после заживления кожного аффекта.

2. Исследование ФАЛ крови с оценкой ИАФСТ характеризует активность БЦЖ-вакцинного процесса и степень адекватности реакции системы противомикробной защиты на иммунизацию. Для физиологического течения БЦЖ-вакцинного процесса характерна активация фагоцитоза в инфильтративную и нормализация его в продуктивную фазу кожной прививочной реакции. Вакцинация БЦЖ не оказывает негативного влияния на систему фагоцитарной защиты. Недостаточность фагоцитоза способствует персистенции вакцинного штамма БЦЖ в организме привитых детей и отрицательно влияет на формирование противотуберкулезного иммунитета.

3. Становление противотуберкулезного иммунитета сопровождается специфическим изменением ФАЛ крови, выявляемым по повышению ИСФэаг, отражающим активность иммунного процесса, даже в случае отсутствия кожного прививочного рубчика и отрицательных результатов пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л. У экспериментальных животных наблюдается двухволновый характер повышения ИСФЭаг, определяемый на протяжении 3-х фаз кожной реакции (первая волна) с максимальной частотой в фазу инфильтрации (у

90,9%), и в отдаленный период после заживления кожного аффекта через 6 месяцев (у 85,7%)(вторая волна). У здоровых детей повышение ИСФЭаг выявляется через 2 месяца-3 года после вакцинации с наибольшей частотой и выраженностью реакции через 3 месяца-1,5 года (86,5%); чаще - у детей с нормальной фагоцитарной защитой, положительной пробой Манту с 2 ТЕ ППД-JT, с большим диаметром рубчика через 1 год, с наличием рубчика через 3 года. У детей с гипотрофией не выявлено существенных отличий фагоцитарной иммунной реакции от таковой у здоровых детей.

4. Наблюдаемое после вакцинации БЦЖ специфическое изменение фагоцитоза Эк/туб, преимущественно в виде повышения ИСФэк, предшествует иммунной фагоцитарной реакции и отражает циркуляцию в крови субстанций БЦЖ. У экспериментальных животных чаше определяется в активный период кожного процесса и период реактивации. У здоровых детей выявляется редко (в среднем у 25,7%) и не продолжительно (через 1 месяц - 2 года), имея волнообразный характер. Реакция определяется в 1,8 раза чаще у детей с недостаточностью фагоцитоза. У детей с гипотрофией реакция свидетельствуют о более частой (в 2,8 раза чаще), выраженной и продолжительной бактериемии, возрастающей в периоды снижения специфического иммунитета.

5. Становление противотуберкулезного иммунитета характеризуется увеличением адгезивной способности РОЛг>б крови в отношении Эаг/туб, определяемой по повышению ИСА, характеризующему специфический клеточный иммунный ответ. У экспериментальных животных повышение ИСА выявляется у 100% с 5 сут. до 4 мес.; у здоровых детей - с 3 месяцев до 7 лет, с наибольшей частотой через 5-9 месяцев (87,5%), 1 год (100%) и 2 года (85%) после вакцинации. Повышение ИСА чаще имеют дети с прививочным рубчиком и с положительной пробой Манту. У детей с гипотрофией реакция определяется реже и меньшей величины, что свидетельствует о недостаточности клеточно-опосредованного специфического иммунного ответа.

6. Физиологический процесс становления противотуберкулезного иммунитета характеризуется прогрессирующим увеличением содержания РОЛт>б1-го класса и повышением их адгезивной способности, выявляемой по повышению ИСРО, отражающему состояние напряженности адаптивного противотуберкулезного иммунитета. У экспериментальных животных повышение ИСРО определяется чаще всего через 3 недели - 4 месяца, у здоровых детей - в период 3 мес. - 2 года с момента вакцинации и у подавляющего большинства детей ослабевает после 3-х лет. Чаще выявляется у детей с прививочным рубчиком и положительным результатом пробы Манту. Напряженный противотуберкулезный иммунитет сохраняется через 5-7 лет у 67% здоровых детей. У детей с гипотрофией напряженный иммунитет формируется поздно, через 5-9 месяцев, через 2 года сохраняется только у 25%> детей.

7. Накопление ПТАТ после вакцинации БЦЖ у экспериментальных животных, выявленное по повышению ИСТ, особенно в начальный период, достаточно полно коррелирует с напряжением всего комплекса защитно-приспособительных механизмов (диаметром инфильтрата, ИСФэаг, ИСА), инициируемых микобактериями БЦЖ. Между средними значениями ИСТ и ИСРО в период от 10 дней до 1,5 месяцев выявлена высокая корреляционная связь (г=0,93, р=0,019), свидетельствующая об обратной зависимости гуморального и клеточного звена в механизме противотуберкулезного иммунитета. У здоровых детей повышенная продукция ПТАТ выявляется редко, эпизодически до 2 лет с наибольшей частотой через 1 месяц. ПТАТ-IgM определяются в единичных случаях через 2-3 месяца, 1-2 года после прививки. Дети с гипотрофией имеют хорошо выраженный специфический гуморальный ответ, свидетельствующий о сохранности гуморального звена и преобладании его в механизме противотуберкулезного иммунитета.

8. Возраст экспериментальных животных влияет на становление противотуберкулезного иммунитета. У неполовозрелых кроликов течение кожной прививочной реакции и результаты исследования специфической адгезивной способности POJlT>6 и РОЛт>б1 -го класса свидетельствуют о недостаточности клеточного звена и низкой степени напряженности противотуберкулезного иммунитета, преобладании в защитных реакциях специфического гуморального ответа, поддерживаемого более сильным антигенным воздействием в первые недели после вакцинации. 9. Эффективность вакцинации БЦЖ, определяемая у здоровых детей по размерам прививочных рубчиков, за 20 лет не изменилась. У здоровых детей наблюдается физиологическое течение постпрививочной реакции с определением через 1 год у 94,3% рубчика со средним диаметром 4,8±0,3 мм. У детей с гипотрофией кожная прививочная реакция появляется позднее, имеет затяжное течение с поздним образованием рубчика, меньшими его размерами через 2 года после вакцинации, меньшей частотой оптимальных размеров рубчика, с более частым увеличением подмышечных лимфатических узлов и развитием осложнений.

10.3а последние 20 лет у здоровых детей в первые 2 года после вакцинации БЦЖ повысилась частота поствакцинальной аллергии, определяемой по пробе Манту с 2 ТЕ ППД-Л, характеризующейся преобладанием слабоположительных и отсутствием гиперергических реакций на туберкулин. По пробе Манту 58,6%> детей утрачивают туберкулиновую чувствительность через 3 года, и 73,7% - через 7 лет. У детей с гипотрофией поствакцинальная аллергия развивается в 2,2 раза реже, в 2,8 раза чаще регистрируются отрицательные реакции на туберкулин (у 65%).

11.К предрасполагающим факторам развития гипотрофии 2-3 ст. тяжести относятся: проживание в сельской местности на территориях, где не доступна квалифицированная врачебная помощь; воспитание в семьях с низким уровнем дохода, с низким образовательным цензом родителей, с высокой долей факторов социального риска; возраст детей 1-4 месяца, 1 - 2 года; рождение от матерей с высоким пренатальным риском, экстрагенитальной патологией (чаще инфекционными заболеваниями и анемией) и осложненным течением беременности (чаще поздним гестозом ). Способствуют развитию гипотрофии дефекты питания (у 80% детей), инфекционные заболевания (у 74,4%). Преобладает постнатальная гипотрофия (55,6%) экзогенной этиологии (63,8%о). Клиническими особенностями течения гипотрофии является сочетание ее с поражением центральной нервной системы (93,8%), дисбактериозом кишечника (95,5%о), инфекционной патологией (75%), рахитом (64,4%), анемией (61,3%) и аллергическим синдромом (30,7%). 60,5% детей имеют нарушения в системе фагоцитарной защиты, с высокой долей недостаточности фагоцитоза (58,7%). 12.У детей с гипотрофией выявлены отклонения от физиологического механизма формирования противотуберкулезного иммунитета, свидетельствующие о преобладании гуморального ответа, специфического изменения ФАЛ крови и недостаточности клеточно-опосредованного иммунного ответа, что ставит под сомнение иммунологическую эффективность проведенной вакцинации БЦЖ у этой категории детей.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ

1. Педиатрический контроль за БЦЖ-вакцинным процессом у детей должен проводиться с учетом критериев его физиологического течения, для которого характерна кожная реакция с развитием инфильтрата через 1,5-4 мес., не превышающего 10 мм; пустулы - через 1,5 - 3 мес. (у 12,8%) детей); рубчика -через 2-5 мес.; отсутствие значимого увеличения регионарных лимфатических узлов (менее 1 см). Контроль за прививочной реакцией у детей с гипотрофией должен осуществляться с учетом особенностей ее течения: более поздним развитием прививочной кожной реакции (у 23,1%), более выраженным инфильтратом в начальный период (диаметр в 1,6 раза больше), более редкой пустуляцией инфильтрата (в 2 раза реже), более длительным, затяжным течением (стадия инфильтрата до 6 месяцев), с поздним формированием рубчика (до 7 месяцев), более частым увеличением подмышечных лимфатических узлов до 1 см (у 13,1% детей).

2. Для правильной интерпретации результатов пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л у детей необходимо учитывать особенности поствакцинальной аллергии, характерные для первых 3 лет с момента иммунизации БЦЖ. К ним относятся: наибольшие темпы нарастания и снижения туберкулиновой чувствительности через 2 года; наличие «виража» только в первые 2 года; низкие темпы погодового прироста чувствительности, не превышающие на третьем году 5 мм; нарастание чувствительности только при папуле менее 11 мм; снижение чувствительности через 1 год при папуле 12 мм и более; существенное возрастание отрицательных реакций и увеличение стабильно сохраняющейся туберкулиновой чувствительности через 3 года.

3. Детей с гипотрофией первых 4 месяцев жизни, имеющих сочетание кожной прививочной реакции в фазе инфильтрации с недостаточностью фагоцитоза и бактериемией, следует рассматривать как группу риска по осложненному течению БЦЖ-вакцинного процесса. О недостаточности фагоцитоза у них свидетельствует величина ИАФСТ, менее 0,7; о наличии субстанций БЦЖ в крови - величина ИСФэк более 1,5 или менее 0,6. С целью своевременной диагностики осложнений им рекомендуется ежемесячный контроль за кожной реакцией и состоянием регионарных лимфатических узлов до заживления кожного аффекта, и далее - ежеквартальный, в течение всего срока до периода реконвалесценции.

4. При отсутствии у детей прививочного рубчика и (или) наличии отрицательных результатов пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л для индивидуальной оценки противотуберкулезного иммунитета показано определение специфической адгезивной способности РОЛ крови с одновременным учетом величины ИСА и ИСРО. ИСА более 1,8 и ИСРО не менее 2,0 свидетельствуют об иммунной реакции и напряженном противотуберкулезном иммунитете.

5. .Дети с гипотрофией требуют контроля за иммунологической эффективностью вакцинации БЦЖ, с целью которой в комплекс обследования наряду с оценкой кожного рубчика, пробой Манту с 2 ТЕ ППД-Л, необходимо включать исследование специфической адгезии РОЛ крови, с оценкой ИСА и ИСРО. При сочетании отрицательной пробы Манту с величиной ИСА менее 1,8 и ИСРО менее 2,0 целесообразно решать вопрос об индивидуальных сроках ревакцинации БЦЖ у детей с гипотрофией в периоде реконвалесценции.

6. Определение специфического антителообразования в РНГА с оценкой ИСТ, выявляет гуморальный иммунный ответ и свидетельствует об активности специфического процесса, однако является малоинформативным тестом, так как повышение ИСТ выше 4,0 в отдаленные сроки определяется у малого количества вакцинированных детей (преимущественно в первый год). Более информативным для определения активности специфического процесса после вакцинации БЦЖ является исследование специфических изменений ФАЛ крови с использованием ИСФэаг> значения которого выше 1,5 свидетельствуют об активности процесса и наличии иммунной реакции.

7. С учетом полученных данных о неэффективности вакцинации БЦЖ у детей с гипотрофией 2-3 степени, и более частых случаях у них осложненного течения вакцинального процесса, это заболевание необходимо включить в перечень временных противопоказаний для вакцинации БЦЖ до полного выздоровления.

8. С учетом предрасполагающих и способствующих факторов развития тяжелых форм гипотрофии эффективность профилактических мероприятий могут обеспечить только совместные усилия медицинской, социальной служб, государственных административных органов по улучшению обслуживания, материального положения и социального статуса семей, имеющих детей раннего возраста.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За последние 10 лет отмечается негативная динамика в состоянии здоровья детей, характеризующаяся уменьшением числа детей 1-й группы здоровья, увеличением количества детей 3-й группы здоровья и преобладанием детей 2-й группы здоровья, с риском развития хронической патологии и функциональными нарушениями. Эта тенденция наблюдается во всех возрастных группах, начиная с периода новорожденности [28, 77, 80, 124, 154, 292]. Одновременно с ухудшением общей картины заболеваемости значительно осложнилась проблема туберкулеза у детей. Неблагоприятная эпидемиологическая ситуация складывается по туберкулезу среди детей не только в России, но и во всем мире. Заболеваемость туберкулезом детей в России с 1990 года увеличилась с 7,4 на 100 тысяч детского населения до 20,2 к 2005 году. Число впервые инфицированных за последние 10 лет увеличилось более чем в 2 раза [16, 18, 21, 292]. Наибольший рост заболеваемости и инфицированное™ наблюдается в возрасте 3-6 лет [18, 19, 21, 57, 115, 143, 248, 249]. В условиях современной эпидемиологической ситуации по туберкулезу, сочетающейся с негативными тенденциями в состоянии здоровья детей, требуется серьезная коррекция системы противотуберкулезных мероприятий среди детей, одним из важных направлений которой является усиление мероприятий по специфической профилактике туберкулеза у детей раннего и дошкольного возраста. Основным методом специфической профилактики туберкулеза у детей является вакцинация их в первые дни жизни вакциной БЦЖ или БЦЖ-М. До настоящего времени усиление мероприятий в этом направлении шло по пути увеличения охвата детей профилактическими прививками, который достиг оптимальных цифр - 95,9 - 98% [21, 57, 115, 143, 299]. Более того, среди заболевших туберкулезом детей до 94 - 96 % вакцинировано, в том числе 98% имеют рубчик оптимальной величины (не менее 4 мм) [115]. Но, несмотря на это, снижения инфицированности и заболеваемости туберкулезом детей дошкольного возраста не достигнуто. Такая ситуация требует пересмотра существующих принципов проведения профилактических мероприятий.

До настоящего времени специфическая иммунопрофилактика туберкулеза у детей проводится без иммунологического контроля за ее эффективностью. В то время как в отношении других прививок путем иммунологического контроля удалось повысить эффективность вакцинации за счет иммунопротекции, индивидуального подхода к вакцинации и др. у тех детей, у которых не было достигнуто защитного уровня специфического иммунитета [54, 101, 119, 120, 131, 141, 203, 210, 251, 276, 303]. Сдерживающим фактором в изучении иммунных аспектов противотуберкулезной вакцинации у детей с отклонениями в состоянии здоровья является отсутствие у педиатров объективных критериев оценки напряженности противотуберкулезного иммунитета. Несмотря на многолетние исследования по иммунологической перестройке организма ребенка, наступающей после внутрикожного введения вакцины БЦЖ [8, 74, 166, 222], и бесспорные доказательства эффективности специфической иммунопрофилактики туберкулеза, вопросы, связанные с индивидуальной оценкой напряженности противотуберкулезного иммунитета, разработаны только на экспериментальном материале [1, 8, 134, 136, 137]. У детей эта проблема остается открытой. Послепрививочный рубчик и туберкулиновая чувствительность как методы оценки эффективности проведенной противотуберкулезной вакцинации для индивидуальной оценки уровня противотуберкулезного иммунитета у детей имеют ограниченное применение, так как не имеют строгого параллелизма с состоянием резистентности против туберкулеза, особенно в отдаленные сроки после вакцинации [8, 40, 74, 166]. Клеточно-опосредованные иммунологические реакции, характеризующие состояние Т-клеточного звена иммунитета [8, 36, 52, 85], из-за трудности индивидуальной оценки результатов не позволили им «прижиться» в практической педиатрии. Поэтому проблема индивидуальной оценки иммунологической эффективности вакцинации БЦЖ у детей сегодня является актуальной. Решение проблемы индивидуальной оценки уровня противотуберкулезного иммунитета открывает перспективу для изучения формирования защитных реакций у детей с нарушениями в состоянии здоровья и детей групп риска по заболеваемости туберкулезом, что является основой нового направления в повышении эффективности иммунопрофилактики туберкулеза через индивидуальную тактику проведения вакцинации. На сегодня не только отсутствуют объективные тесты оценки индивидуального уровня противотуберкулезного иммунитета, но и критерии уровня защиты, так как для инфекций, в защите от которых ведущую роль играет клеточный иммунитет, они не разработаны.

Наше внимание привлекли методы диагностики, разработанные на кафедре патофизиологии ПГМА под руководством профессора В.Н. Каплина, основанные на выявлении ранних специфических реакций клеток крови (нейтрофилов, лимфоцитов) при инфекционных заболеваниях и вакцинации, показавших высокую чувствительность и специфичность в регистрации иммунного ответа [86, 94, 97, 102, 139, 142, 231, 278]. Привлекательность методов заключается еще и в том, что они технически не сложны, не требуют дополнительного оборудования, в них используются стандартные, выпускаемые серийно на производстве диагностикумы, реакции проводятся in vitro, оценка результатов унифицирована и имеет альтернативный характер, что позволяет осуществлять индивидуальный контроль за изучаемыми реакциями. Эти специфические реакции, характеризующие функциональное состояние фагоцитарного звена, клеточного и гуморального звеньев иммунитета в комплексе для контроля за течением БЦЖ-вакцинного процесса и формированием противотуберкулезного иммунитета у детей, не применялись.

Поэтому целыо настоящей работы стало изучение особенностей формирования противотуберкулезного иммунитета после вакцинации БЦЖ с применением прежде всего методов, характеризующих специфический иммунитет: определение специфических изменений ФАЛ крови, специфической адгезивной способности лимфоцитов крови и антителообразования. В первой части работы была поставлена задача изучить с применением этого комплекса специфических реакций сначала становление противотуберкулезного иммунитета на экспериментальной модели БЦЖ-вакцинного процесса, а затем только - в клинических условиях.

Было проведено 2 серии экспериментальных исследований, в которых использовали 13 кроликов породы шиншилла, иммунизированных внутрикожно вакциной БЦЖ в дозе 0,05 мг, отличающихся по зрелости: 7 взрослых (эксперимент №1) и 6 молодых животных (эксперимент №2). Проведение второго эксперимента было обусловлено необходимостью выявить возрастные особенности формирования противотуберкулезного иммунитета и более углубленно исследовать специфические показатели противотуберкулезного иммунитета. Второй эксперимент также помог решить некоторые методические приемы, в частности возможность использования в качестве контроля не собственные исходные показатели кроликов до вакцинации, а показатели других невакцинированных животных, обследуемых в один и тот же день с вакцинированными. У взрослых кроликов исследования проводились в течение 6 месяцев, у молодых - в течение 3-х месяцев после вакцинации в одинаковые с взрослыми кроликами сроки.

В комплекс обследования экспериментальных животных входило наблюдение за течением воспалительной реакции на месте введения вакцины БЦЖ, которое имело важное значение, так как давало информацию о функционировании иммунной системы. Кроме того известно, что кожная постпрививочная реакция генерирует и отражает процессы, направленные на борьбу с микобактериями вакцинного штамма в других органах и тканях организма, прежде всего в региональных лимфатических узлах, селезенке, в которых происходят интенсивные процессы размножения клонов лимфоцитов, специфичных антигенам БЦЖ, в результате чего формируется весь комплекс защитных реакций, направленных на элиминацию микобактерий туберкулеза в случае инфицирования, поэтому контроль за ее течением может использоваться для оценки иммунизирующего эффекта вакцины БЦЖ [166].

В результате экспериментального исследования, проведенного у 7 половозрелых и 6 молодых кроликов, установлено, что на месте введения вакцины БЦЖ появлялась кожная реакция, которая имела фазное течение и ограничивалась сроками: у половозрелых кроликов 7 сут.-З мес., у молодых 5 сут.-З мес. У половозрелых кроликов инфильтративно-экссудативная фаза стадия папулы, инфильтрата, пустулы) наблюдалась с 7 дня до 1 месяца, с развитием инфильтрата наибольшего диаметра через 2-3 недели (6,7 ± 0,5 мм) и образованием пустулы у 4-х из 7 кроликов (57%). Продуктивная фаза (рассасывание инфильтрата и формирование узелка) у большинства кроликов начиналась через 1 месяц, с нарастанием процесса к 1,5-2 месяцам, и сопровождалась достоверным уменьшением размеров кожного знака (4,0 ± 0,6, р<0,02). Фаза фиброза (внутрикожное уплотнение плоской или линейной формы), с 2-х месяцев, хорошо определяемая через 2,5 месяца у всех кроликов, через 3 месяца закончилась формированием рубчика (3,7 ± 0,3 мм). Через 4-5 месяцев существенных изменений со стороны кожного знака не установлено. Через 6 месяцев в единичном случае наблюдалось исчезновение кожного знака.

Наши данные согласуются с результатами других авторов [164, 222, 262,] установивших, что процессы иммуногенеза при БЦЖ-вакцинации носят волнообразный характер и имеют определенную фазовость: сначала появляются параспецифические реакции, которые сменяются специфическими морфологическими изменениями, постепенно замещающимися фибробластическими процессами. При этом максимум пролиферативных явлений, с которыми была связано формирование иммунитета, отмечалось через 3 недели после вакцинации [8]. Основываясь на исследованиях М.М. Авербаха и В.И. Литвинова [8], установивших связь иммуноморфологических процессов в органах вакцинированных морских свинок с развитием повышенной резистентности к заражению через 2 недели - 3-4 месяца после иммунизации, можно предположить, что наибольшую резистентность к туберкулезной инфекции вакцинированные взрослые кролики имели с 2-3 недель до 3 месяцев, в активный период кожной прививочной реакции.

Для течения кожной прививочной реакции у молодых кроликов было характерным раннее появление инфильтрации, протекающей более выраженно. В начальный период и в разгар инфильтративной фазы, который по срокам совпадал с взрослыми, а также на высоте продуктивной фазы диаметр кожного знака у молодых кроликов был достоверно больше (р<0,05). Пустуляция инфильтрата наблюдалась раньше (через 2 недели) и в 3 раза реже (у 16,7%), р<0,05). Фаза рассасывания и уплотнения наступала позднее, через 1 месяц она определялась только у 33% (у взрослых кроликов 85,7%). У молодых кроликов чаще, чем у взрослых, определялся рубчик менее 3 мм (33% и 0%, соответственно, р=0,000).

Таким образом, было выявлено влияние возраста на течение кожной воспалительной реакции в месте введения вакцины БЦЖ. Оно выражалось в усилении у молодых животных параспецифических реакций, которые появлялись у них раньше и сохранялись дольше. Можно также сказать о более низких функциональных возможностях клеток, участвующих в ограничении, локализации воспалительного очага, а также о более низкой их метаболической активности и резервных возможностях. Более позднее начало продуктивной фазы свидетельствовало и о запаздывании специфических реакций, протекающих менее интенсивно, чем у взрослых животных. Течение кожной прививочной реакции свидетельствовало о более низком иммунизирующем эффекте вакцины БЦЖ у молодых кроликов в сравнении с половозрелыми животными.

Одновременно с местной кожной реакцией у взрослых кроликов исследовался количественный и качественный состав лейкоцитов периферической венозной крови, который менялся в соответствии с развитием воспалительного процесса. Кровоток является той основной магистралью, по которой к месту воспаления транспортируются клетки иммунной системы, их гуморальные продукты. В кровь попадают регуляторные факторы и другие вещества, продуцирующие клетками иммунной системы, гормоны, определяющие общую регуляцию организма. Суммарно все эти факторы действуют на пролиферативную активность костного мозга и на лейкоциты крови, изменяя их физиологическую активность. Количественные и качественные изменения клеток крови происходят параллельно стадиям и течению воспалительной реакции, поэтому они дают возможность судить о ходе воспалительного процесса, о последовательности включения тех или иных иммунных механизмов. Подтверждением тому являлась выявленная в инфильтративную фазу (с 7 дня по 21 сутки) высокая прямая корреляционная связь между количеством лейкоцитов и диаметром папулы на месте введения вакцины (г=0,99, р=0,049), а также тенденция к высокой обратной связи между диаметром кожного знака и абсолютным содержанием лимфоцитов в крови в продуктивную фазу кожного процесса (с 1 мес. до 2,5 мес.), (r=0,93, р=0,06). Было установлено, что общее количество лейкоцитов в течение первых 3 недель после вакцинации существенно не менялось. В период выраженной экссудативно-воспалительной кожной реакции был характерен широкий диапазон колебания их количества. Лейкоцитоз выявлен только через 2 месяца. То, что для БЦЖ-вакцинного процесса характерен умеренный лейкоцитоз в крови, указывают и другие авторы (Н.Н Бобров, 1948.; Р.А. Каменская, 1965.; А.А. Ефимова, 1968).

Изменения в лейкоцитарной формуле у вакцинированных кроликов появились очень рано, и они касались прежде всего моноцитов. Колебания содержания моноцитов отражали их участие в процессах иммуногенеза. Они первыми отреагировали на вакцину в виде моноцитопенин (р<0,05) через 1 сутки, еще до развития кожного инфильтрата, которую можно объяснить мобилизацией этих клеток в очаг воспаления, регионарные лимфатические узлы и другие органы иммуногенеза. Одновременно с этим наблюдалась тенденция к снижению базофилов и лимфобластов. В дальнейшем количество моноцитов снижалось накануне смены фаз воспаления: в начале продуктивной фазы (через 1 мес.), при реактивации процесса (через 6 мес.), за счет мобилизации этих клеток в ткани. После чего возникала реакция в виде моноцитоза, который наблюдался при нарастающем инфильтративном (через 7 сут.) и продуктивном процессах, в период хорошо выраженных иммунных реакций (через 2 мес.). Это указывало на адекватную реакцию костного мозга на начавшийся специфический воспалительный процесс с участием макрофагов и их потреблением в очаге воспаления при нарастающем воспалительном процессе. Моноцитоз сменялся нормализацией их количества в крови в период 14-21 дня после вакцинации, в который отсутствовали существенные сдвиги в формуле крови. Это свидетельствовало об уравновешенности процессов потребления клеток в тканях и их синтеза при давно текущем воспалительном процессе, несмотря на максимально выраженный в этот период инфильтративно-экссудативный процесс в коже, в котором участвовали все клетки крови. Характерной была также динамика эозинофилов. Эозинофилия, выявленная одновременно с моноцитозом в начале фазы инфильтрации (через 5-7сут) и в конце продуктивной фазы (через 2 мес.), свидетельствовала о включении этих клеток в процессы иммуногенеза и развивающейся специфической сенсибилизации организма к субстанциям БЦЖ, идущей параллельно развитию реакциям иммунитета. Но наиболее стабильными были изменения количества лимфоцитов и нейтрофилов. В период развития специфических клеточных иммунных реакций между их относительными количествами выявлена высокая обратная корреляционная связь (г=0,95; р=0,000). Лимфоцитоз определялся с 1 месяца с наступлением продуктивной фазы и сохранялся после заживления кожного аффекта длительно до 6 месяцев. Наибольшая степень лимфоцитоза выявлена в конце продуктивной фазы кожной реакции и начале фиброза, через 2 и 2,5 месяца. Наряду с лимфоцитозом отмечалось волнообразное повышение в крови лимфобластов (через 2,5; 5; 6 мес.). Содержание нейтрофилов имело обратную динамику, снижение их в крови наблюдалось с 1 мес. до 4 мес., с наименьшим их количеством через 1 и 1,5 месяца, в продуктивную фазу кожного процесса. Данные изменения свидетельствовали об устойчивых процессах в иммунной системе, стабильных реакциях иммуногенеза, не закончившихся с заживлением кожного аффекта, а продолжающихся в других тканях (лимфатических узлах, селезенке и др.) длительно, до конца эксперимента. Об этом свидетельствуют и литературные данные, согласно которым иммуноморфологические процессы, продолжающиеся в других лимфатических узлах и органах иммуногенеза, происходят с некоторым запаздыванием по временным срокам, по сравнению с процессами в коже и регионарных лимфатических узлах. По данным разных авторов они продолжаются до 6 месяцев (А.Я. Фриденштейн, 1955), до 1 года (В.И. Пузик, 1966), с нормализацией через 8-12 месяцев с момента иммунизации [8, 222,]. Согласно литературным данным, эозинофилия, моноцитоз и лимфоцитоз - это те специфические изменения крови на вакцину

БЦЖ, которые отражают иммунологические процессы, связанные с развитием иммунитета и аллергии [74J.

Таким образом, воспалительную реакцию в коже на месте введения вакцины БЦЖ необходимо рассматривать как интегральный эффекторный механизм работы иммунной системы, с участием многочисленных компонентов, включающихся в ряд последовательно протекающих фаз воспаления. Каждая из этих фаз имела свои специфические особенности, определяемые в значительной степени миграцией из крови в определенном порядке и соотношении лейкоцитов разных типов и выбросом в кровоток из очага воспаления в соответствии с каждой фазой и характером процесса медиаторов и токсических продуктов, влияющих как на пролиферативную активность клеток костного мозга, так и на активность циркулирующих клеток, что в сумме определило сдвиги в клеточном составе лейкоцитов периферической крови. Поэтому оценка состава лейкоцитов крови, наряду с местной кожной реакцией, является еще одним критерием текущего иммунологического процесса.

Многочисленные исследования указывают на тесную взаимосвязь неспецифических механизмов противомикробной защиты и иммунитета [132, 152, 175, 176, 178, 233, 255]. Подтверждением тому является фагоцитарная функция нейтрофилов крови, занимающих особое место среди специфических и неспецифических форм защитных реакций [174, 204]. Большое значение ФАЛ определяется тем, что в деятельности фагоцитов фокусируется влияние большого числа клеточных и гуморальных факторов крови [33, 147, 302]. В свою очередь, фагоциты крови осуществляют многообразные регуляторные влияния на клетки иммунной системы [33, 66, 82, 147, 184] и тканевой метаболизм [31], играя важную роль в поддержании постоянства внутренней среды и выражая ее состояние. Со времени исследований И.И. Мечникова за фагоцитами крови признается решающее значение в защите организма от бактериальной инфекции [157]. Материалы современных исследований подтверждают большую информативность поглотительной способности нейтрофилов как показателя противомикробной резистентности [33, 65, 70, 145,

183, 233, 234, 266, 277, 279, 294, 298]. Учитывая все выше сказанное, у вакцинированных кроликов было проведено исследование ФАЛ крови, чтобы определить влияние вакцинации на систему естественной противомикробной защиты. Из всех известных методов исследования поглотительной функции лейкоцитов был использован наиболее информативный метод, разработанный на кафедре патофизиологии ПГМА под руководством профессора В.Н. Каплина при участии автора [93]. В данной методике определения ФАЛ крови трудности в интерпретации показателей фагоцитоза, обусловленные большой популяционной вариабельностью индивидуальных величин ФАЛ, зависящих от индивидуальных свойств организма и отсутствия унифицированных методов ее определения, были решены введением оценки ФАЛ по новому критерию -индексу активности фагоцитоза (ИАФ). Он совместил учет числа активных фагоцитов и интенсивность поглощения ОФ, в качестве которых использовали ФЭБ, что повысило чувствительность определения ФАЛ. Для унификации данного показателя были разработаны нормативы ИАФ, характерные для того или иного диапазона величин ФЧ, так называемые стандарты ИАФ для их оценки у обследуемых лиц. Контрольные значения ИСФст У людей были известны - 0,7 - 1,4. Однако у кроликов такие стандарты отсутствовали. Поэтому сначала была исследована ФАЛ крови у 18 невакцинированных кроликов с целью разработки для них стандартов ИАФ. В результате у кроликов, как и у людей, была выявлена отчетливая прямая линейная зависимость между ФЧ и ИАФ (0,93, р=0,006). Контрольные значения ИАФСТ у кроликов составили 0,5 - 1,7. При значениях ИАФСТ ниже 0,5, констатировали недостаточность фагоцитарной защиты, а выше 1,7 - активацию фагоцитоза. Исследование ФАЛ с ФЭБ проводили после прививки БЦЖ в те же сроки, что и исследование местной кожной реакции и лейкоцитов крови. Состояние фагоцитарной защиты оценивали путем определения поглотительной активности лейкоцитов с вычислением абсолютных показателей - ПФ, ФЧ (1-й способ оценки, традиционный) и относительного показателя - ИАФСТ (2-й способ оценки, модифицированный нами). При исследовании неспецифической ФАЛ крови, так же, как и при изучении динамики лейкоцитов крови, был установлен фазный характер изменений, идущий сначала параллельно фазам кожного процесса и регионарных лимфоузлах, а затем, по-видимому, фазам иммуногенеза в отдаленных лимфатических узлах и других органах. После вакцинации БЦЖ была выявлена активация фагоцитоза, имеющая двухволновый характер. Первая волна активации фагоцитоза наблюдалась через 7 суток с появлением кожного инфильтрата с наибольшей выраженностью через 3 недели, и продолжалась на протяжении инфильтративной и продуктивной фаз до 1,5 месяцев. Выявлена тесная прямая корреляция между средним уровнем ИАФСТ и средним диаметром кожного знака в этот период (г=0,85; р=0,02). В инфильтративную фазу такая связь определялась между индивидуальным уровенем ИАФСТ и диаметром инфильтрата (г=1,0, р=0,016). Угасание инфильтративной реакции с одновременным нарастанием пролиферативных процессов в продуктивную фазу сопровождались нормализацией активности фагоцитов через 2 месяца. Это свидетельствовало о том, что ИАФСТ отражает активность вакцинного процесса, его параспецифических реакций. Вторая волна активации ФАЛ, наблюдавшаяся с 3 до 5 месяцев, при уже зажившем кожном аффекте соответствовала процессам иммуногенеза во внутренних органах и была менее выраженной, чем начальная фаза, соответствующая инфильтративной фазе кожной реакции. Это свидетельствовало о реактивации вакцинного процесса и активирующем действии вакцины БЦЖ на систему фагоцитарной защиты. На всем протяжении изучаемого периода наблюдалась обратная связь в парах ФЧ - ИАФСТ (г=0,80, р=0,01). Нормализация показателей фагоцитоза произошла через 6 месяцев, что может свидетельствовать о переходе вакцинного процесса в неактивный и о завершении параспецифических реакций. Исследования показали, что ИАФСТ хорошо отражает индивидуальный уровень системы фагоцитарной защиты, при индивидуальной оценке которой были выявлены в основном 2 ее варианта: нормальное состояние и активация. Наибольшее число случаев с активацией фагоцитоза наблюдалось через 3-4 недели после прививки в фазу инфильтрации (83,3%-100%) и через 3 месяца в фазу фиброза (85,7%), а наибольшее число случаев с нормальными показателями ФАЛ - через 1,5-2,5 месяца в продуктивную фазу (71,4%).

То, что для БЦЖ-вакцинного процесса характерна определенная фазность процессов иммуногенеза, включающих как параспецифические так и специфические реакции, тесно взаимосвязанные друг с другом, с последовательным вовлечением лимфатических узлов, селезенки и в меньшей степени других органов, доказано работами многих ученых [8, 166, 222]. В этих же исследованиях было показано, что воспалительный процесс в органах иммуногенеза и отдаленных лимфоузлах протекает с меньшей интенсивностью, чем в коже и одновременно с ней в регионарных лимфоузлах. В отличие от ранее существующих работ, изучавших ФАЛ по показателям ПФ и ФЧ и нашедших их сниженными на фоне БЦЖ-вакцинного процесса [178], наши результаты показали обратное. Вакцина БЦЖ оказывала активирующее влияние на систему фагоцитарной защиты на протяжении инфильтративной и продуктивной фаз. Снижение фагоцитарной защиты возникало в единичных случаях кратковременно в начальный период фиброза (физиологическое истощение), после чего снова наблюдалась активация ФАЛ. Изменения неспецифического фагоцитоза по времени совпадали со специфическим изменением ФАЛ крови и в последующем сопровождали их. Корреляционной связи показателей ФАЛ и лейкоцитов крови не выявлено. Это лишний раз доказывает, что ИАФСТ - это интегральный показатель, фокусирующий на себе множественные регулирующие влияния крови, который является не только количественным показателем, а в большей мере - функциональным, отражающим активность вакцинного процесса и степень адекватности реакции системы противомикробной защиты на микробный стимул [96]. Нормализация этого показателя через 6 месяцев говорила о завершившихся параспецифических процессах, сопровождающих и тесно взаимосвязанных со специфическими реакциями.

Одновременно с исследованием состояния противомикробной защиты, установившим прямую зависимость изменений ИАФСХ от активности БЦЖ-вакцинного процесса и показавшим наряду с лейкоцитами крови длительный характер изменений, сохраняющихся и после завершения кожного процесса, были изучены реакции, отражающие становление специфического противотуберкулезного иммунитета. Изучение характера различных иммунных реакций, развивающихся при противотуберкулезной вакцинации, в экспериментальных условиях имеет более чем 80-летшою историю. До настоящего времени исследователи используют для этих целей классические иммунологические тесты, такие как РБТЛ, РТМЛ с ППД, отражающие состояние ГЗТ, и РИГА, РСК, характеризующие процесс специфического антителообразования. Однако ни одна из этих реакций не получила применения для индивидуального контроля за процессом становления поствакцинального противотуберкулезного иммунитета из-за широкого диапазона колебаний индивидуальных значений показателей, характерных для клеточных реакций, и отсутствия унификации оценки их результатов, а также малоинформативности серологических тестов. Оценка результатов выше указанных реакций ограничивалась путем сравнения средних значений опытной группы с таковыми контрольной. Поэтому поиск новых методов индивидуальной оценки иммунизирующего эффекта вакцины БЦЖ остается насущной проблемой. Нами был взят для этих целей комплекс методов «нетрадиционной» иммунологии, привлекающих своей простотой и высокой информативностью, а главное, позволяющих проводить индивидуальную количественную оценку результатов иммунных реакций [96]. Одним из методов, включенных в этот комплекс, был метод определения специфического изменения ФАЛ крови, позволяющий оценить роль фагоцитов в становлении протективного противотуберкулезного иммунитета [97]. Работ, в которых в экспериментальных условиях было бы исследовано специфическое изменение ФАЛ крови (их поглотительной способности) в динамике БЦЖ-вакцинного процесса с позиций развития специфического противотуберкулезного иммунитета, в доступной отечественной литературе мы не нашли. Выбор этого метода был обусловлен тем, что он позволял в иммунном организме отдифференцировать, с одной стороны, специфические и неспецифические изменения ФАЛ, благодаря введению в реакцию кроме специфического ОФ еще контрольного ОФ. С другой стороны, метод дал возможность определить специфические изменения, связанные с присутствием в крови самих микробных субстанций, и специфические изменения, связанные с обычным механизмом продуктиной фазы иммунной реакции, благодаря использованию 2-х типов ОФ - ЭД с комплексом АГ+АТ+ПСХ и антигенных ЭД.

В связи с тем, что исследование специфического изменения ФАЛ крови у кроликов проводилось впервые, сначала была изучена ФАЛ у 18 невакцинированных кроликов (8-взрослых и 10 молодых), для того, чтобы определить возможность применения у них данного метода, оценки специфических сдвигов ФАЛ по ИСФэаг и ИСФэк, а также для того, чтобы установить нормативные значения ИСФ для объектов разного типа у неиммунизированных кроликов, чтобы иметь возможность в последующем проводить индивидуальную оценку специфических изменений ФАЛ у кроликов после вакцинации.

В результате было установлено, что у кроликов также, как и у людей, существует высокая прямая корреляционная связь между фагоцитозом Эаг/туб и Эаг/диз (по ФЧ г=0,99, р<0,001) и фагоцитозом Эк/туб и Эк/диз (по ФЧ г=0,83, р<0,05), что позволило оценивать специфические изменения ФАЛ у них по ИСФэаг и ИСФэк. Были определены нормативные значения ИСФ для кроликов (0,2 - 2,0), которые не зависимо от возраста животных, выбранных ОФ и от времени исследования в двух экспериментах оказались одинаковыми, стабильными и могли использоваться как эталон для индивидуальной оценки специфических изменений ФАЛ у вакцинированных животных не только в рамках одного эксперимента, но и в разных экспериментах. Значения ИСФ выходящие за эти границы указывали на наличие специфических изменений ФАЛ крови: более низкие - на снижение ФАЛ, более высокие - на повышение ФАЛ.

Исследование специфического изменения ФАЛ крови с использованием антигенных и сложно-комплексных ОФ, в поствакцинальный период показало, что обе реакции имеют отношение к формированию противотуберкулезного иммунитета. Оба показателя реакций, как ИСФЭаг, так и ИСФЭк, выявляли специфические изменения фагоцитоза, начиная с инфильтративной фазы кожного процесса. Исследование специфических изменений ФАЛ крови у вакцинированных кроликов с учетом оценки ИСФ на оба ОФ (Эаг/туб и Эк/туб) позволило выявить специфическую реакцию фагоцитов, начиная с 5-х суток после вакцинации БЦЖ и заканчивая сроком наблюдения - 6 месяцев. Достоверных различий по частоте специфических изменений ФАЛ в поствакцинальный период между взрослыми и молодыми кроликами не установлено, кроме срока 5 дней, когда у молодых кроликов реакция выявлялась чаще за счет специфических изменений фагоцитоза Эк/туб. Фагоцитарный тест (с одновременным учетом результатов фагоцитоза Эаг/туб и Эк/туб) оказался высокоспецифичным и чувствительным как в период активного вакцинного процесса с 10 суток до 3 месяцев, выявляя специфические изменения ФАЛ у 100% (через 10 сут.) - 84,6%) (через 1 мес.) -75%> (через 3 мес.), так и через 6 месяцев, выявляя специфическую реакцию у 85,7% .

Исследование ФАЛ крови у иммунизированных животных с использованием специфических объектов разного типа (Эаг/туб и Эк/туб), позволило в ходе иммунологической перестройки охарактеризовать два процесса, идущих одновременно и взаимосвязанных друг с другом: процесс формирования иммунитета (критерием был ИСФэаг) и процесс персистенции вакцинных штаммов БЦЖ в организме (критерием был ИСФЭк). Примененный метод исследования позволил не только определить специфические изменения ФАЛ у вакцинированных кроликов, но и количественно оценить эти специфические сдвиги. Метод выявлял специфическую реакцию нейтрофилов при любом уровне фагоцитоза. Результаты исследования показали, что специфические изменения ФАЛ крови имели фазный характер как по интенсивности реакций, так и по частоте реагирующих. В отношении каждого из специфических ОФ была установлена своя закономерность динамики в иоствакцинальный период.

Специфическая реакция фагоцитов, выявляемая по ИСФэаг, отражала формирование противотуберкулезного иммунитета и проявлялась всегда повышением ФАЛ. Установлен двухволновый характер специфического повышения фагоцитоза Эаг/туб. Первая волна специфического повышения ФАЛ крови у иммунизированных кроликов отмечалась на протяжении всего активного периода кожного вакцинного процесса. Реакция имела индивидуальную динамику (начало, разгар, исчезновение), но общую тенденцию. Возникая не ранее 7 суток в фазу инфильтрации, достигала наибольшей выраженности через 10 - 21 день, превышая в 6 - 15 раз контрольную величину. Это совпадало с высокой интенсивностью воспалительного процесса и состояния активности микробного раздражителя (о чем свидетельствовало повышение в этот период значений ИСФЭк, начавшееся у отдельных животных через 5 дней после вакцинации, и, как известно, отражающего реакцию фагоцитов на непосредственный специфический стимул [96, 231]). Постепенное угасание реакции наблюдалось после 3 месяцев после образования рубчика. В активный период кожной прививочной реакции специфическое повышение ФАЛ (через 10 суток) выявлено у всех кроликов. Реакция сохранялась стабильно высокой до 2 месяцев, на протяжении фаз инфильтрации и продуктивной, снижаясь через 2,5-3 месяца, в фазу фиброза, выявляясь через 3 месяца у 87,5%. Реже реакция определяласьчерез 5 месяцев -у 28,6%) кроликов. Вторая волна менее интенсивного повышения фагоцитоза Эаг/туб наблюдалась через 6 месяцев после вакцинации у 57,1% кроликов при завершившемся кожном процессе, на фоне уже нормального состояния естественной фагоцитарной защиты (по ИАФСХ). Ее ' появление свидетельствовало о возобновлении активности специфических процессов в организме, протекающих уже с меньшей интенсивностью, чем в первые 3 месяца, стимуляцию которых могли поддерживать персистирующие в лимфоидной ткани микобактерии БЦЖ. В литературе есть данные о том, что при экспериментальном БЦЖ-вакцинном процессе типичные микобактерии высевались из лимфатических узлов у 50 % животных до 5 месяцев, a L- формы БЦЖ-до 1 года [1,8].

Механизм специфической активации ФАЛ при вакцинных и инфекционных процессах известен давно и объясняется эффектом опсонизации

ОФ специфическими антителами, синтез которых индуцируется антигенным воздействием [148, 152, 219, 359]. В основе опсонизации лежит наличие у нейтрофилов Fc- и СЗ- рецепторов. Именно через процесс опсонизации проявляется специфичность фагоцитоза нейтрофилов, существующая у всех млекопитающих. Показано, что резкое усиление фагоцитоза при опсонизации может достигаться и в том случае, если в сыворотке имеется хотя бы минимальное количество антител к ОФ. Специфический компонент опсонизации в организме усиливается другими неспецифическими факторами (комплементом, СРП, фибронектином и др). Кроме этого на поглотительную функцию нейтрофилов влияют не только АТ-опсонины, но и лимфокины сенсибилизированных лимфоцитов [209, 246, 302], которые могут усиливать ее в 1,5-4 раза и специфичность этому механизму придает антигениндуцированная направленность сенсибилизации [336]. Влияние на функции нейтрофилов иммунного ответа позволяет рассматривать часть его реакций как отражение иммунологических сдвигов в организме. Нейтрофил выступает в этих ситуациях активным эффектором иммунитета, так как взаимодействуя с AT он обеспечивает элиминацию АГ из крови. Доказательством тому было выявление в период формирования рубчика тесной прямой корреляционной связи между ИСФЭаг" диаметром кожного знака (г=0,87, р=0,05), а также между динамикой специфического повышения фагоцитоза Эаг/туб (величиной ИСФЭаг) и динамикой выраженности кожной реакции на месте введения вакцины (диаметром кожного знака ), r=0,87, р <0,01, которая, как известно по литературным данным, отражает иммуноморфологические процессы в органах иммуногенеза, связанные со становлением противотуберкулезного иммунитета [166]. На основании приведенных данных можно предположить, что установленное специфическое повышение фагоцитоза Эаг/туб у вакцинированных кроликов является интегральным показателем той части иммунологических сдвигов, которые составляют суть адаптивного противотуберкулезного иммунитета, эффекторным звеном которого является система фагоцитов [85].

О новой волне микробной стимуляции через 6 месяцев свидетельствовала и установленная нами динамика ИСФЭк, отражающего циркуляцию в крови субстанций БЦЖ, которая имела волнообразный и неустойчивый характер, тесно была связана с динамикой ИСФЭаг (г=0,66, р<0,05) и не имела статистически значимой связи с выраженностью кожной реакции. Первая волна специфической реакции соответствовала активному периоду кожного процесса, с 5-х суток до 3-х месяцев, и появление ее предшествовало развитию иммунной фагоцитарной реакции. Наибольшая ее выраженность была через 2-4 недели, в разгар фазы инфильтрации. Вторая волна установлена спустя 6 месяцев после иммунизации, уже при закончившемся кожном процессе. Реакция фагоцитов, выявляемая по ИСФэк, у большинства вакцинированных животных выражалась повышением ФАЛ. В отличие от реакции на «антигенный» ОФ, на этот ОФ в единичных случаях отмечалось угнетение ФАЛ, регистрируемое в ранние сроки после вакцинации (на 5 и 14 сутки) еще до формирования иммунной фагоцитарной реакции у этих кроликов. Как известно, механизм специфического изменения ФАЛ на этот ОФ имеет иной характер, отличный от опсоно-фагоцитарной реакции. Этот тип реакции фагоцитов индуцируется ирямыхм взаимодействием нейтрофилов с бактериальными субстанциями в момент их контакта и объясняется лиганд-рецепторным механизмом, специфическую направленность которому дает матричное преобразование расположения рецепторов на фагоцитах [96]. В последних исследованиях показано, что при туберкулезной инфекции активация циркулирующих нейтрофилов происходит за счет изменения в эксперессии таких рецепторов как CDllb и CD16 [314].

Это более древняя реакция, которая имеется и у беспозвоночных животных. Ее динамика определяется скоростью поступления микробных субстанций в кровь, длительностью их циркуляции в ней в той концентрацией, которая способна вызвать эту специфическую реакцию. Эта реакция развивается быстро, так как связана с высокой скоростью распространения и попаданием поверхностных структур БЦЖ в кровь, и угасаетет вместе с исчезновением микробного стимула, с нарастающими явлениями адсорбции микобактериальных субстанций на эритроцитах крови и других клеточных элементах тканей и устранением их из жидкой части крови [8J. Наводится реакция такими низкими концентрациями, которые недоступны определению в самых чувствительных серологических реакциях. Активация или угнетение фагоцитоза, а также выраженность реакции определяются силой стимула и уровнем ФАЛ в момент стимуляции. В эксперименте [89] установлено, что чаще реакция выявлялась при действии малых концентраций, на высокую концентрацию микробных субстанций в части исследований наблюдалось снижение фагоцитоза специфического объекта. Разный тип реагирования (повышение или снижение ФАЛ) обусловлен также различной чувствительностью и состоянием рецепторного аппарата нейтрофилов в момент микробного стимула. Поэтому угнетение ФАЛ, наблюдаемое у единичных животных, можно объяснить более выраженной бактериемией в эти сроки и, как результат чрезмерного микробного стимула на активированный фагоцит, вместо стимуляции фагоцитоза, получен эффект его угнетения. Из литературных данных известно, что в этот период в гемолизатах и гомогенатах определялись микобактерии и их антигены в высоких титрах, и даже высевались микобактерии из крови с 7-го по 20-й день после вакцинации [8]. Специфические изменения фагоцитоза Эк/туб наиболее постоянно выявлялись на протяжении всей фазы инфильтрации (через 2 недели у 91,7%, через 3 недели у 16,9%) и в период реактивации вакцинного процесса, через 6 месяцев (у 85,7%). В другие сроки реакция встречалась реже (до 2-х недель и после 1,5 месяцев в продуктивную фазу и фазу фиброза у 41,7%) и была менее выраженной. До 5-х суток и через 5 месяцев на высоте напряженности противотуберкулезного иммунитета, который, как установлено другими исследователями [8], наблюдается после заживления кожного аффекта, эта реакция не выявлена ни у одного вакцинированного. Повторное повышение ИСФэк через 6 месяцев, по величине не отличающегося от того, которое имели кролики в фазу инфильтрации кожного процесса, свидетельствовало о реактивации персистирующих штаммов бактерий. Этому способствовало, опираясь на литературные данные [8] и результаты наших исследований, снижение противотуберкулезного иммунитета, которое отмечалось в этот период. Результатом стимуляции иммуногенеза явилась новая волна специфического повышения фагоцитоза Эаг/туб, установленная через 6 месяцев и по величине менее интенсивная, чем определялась в период активного кожного процесса. Так как скорость распространения микобактериальных субстанций, барьерная функция регионарных лимфоузлов, сорбционная способность эритроцитов и других клеток крови, а также состояние рецепторного аппарата нейтрофилов у разных кроликов отличается строгой индивидуальностью, то и полученный результат исследования специфического изменения ФАЛ был неоднороден. Наличие специфической реакции фагоцитов в отношении обоих специфических объектов (Эаг/туб и Эк/туб) в отдаленный период от момента вакцинации свидетельствовало о наличии специфического иммунитета, поддерживаемого длительной персистенцией вакцинного штамма БЦЖ в организме вакцинированных животных. О длительной персистенции микобактерий вакцинного штамма в организме экспериментальных животных имеются многочисленные исследования. Эти сроки достигают, в зависимости от метода вакцинации и дозы, по данным одних авторов - 5-8 месяцев (Н.Л. Живаго, В.А. Любарский, 1923; А.И. Тогунова,1932,1955; Л.И. Нахимсон,1953; и др.), по другим - 12 месяцев и более (О.М. Бурькова,1955; Х.М. Розенберг,1959).