Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Сравнительная характеристика иммунологических методов диагностики инфекции ВЛКРС в системе противолейкозных мероприятий

-7" ОД

и-

На правах рукописи

ШУКЕЛЬ АНАТОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИИ ВЛКРС В СИСТЕМЕ ПРОТИВОЛЕЙКОЗНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Барнаул 1998

Работа выполнена в лаборатории ветеринарной онкологии и экологии ИЭВСиДВ СО РЛСХН

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты: Ведущее учреждение:

доктор ветеринарных наук В.В. ХРАМЦОВ

доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ П.Н. СМИРНОВ

доктор ветеринарных наук В.Г. ЛУНИЦЫН кандидат ветеринарных на^ В.В. РАЗУМОВСКАЯ

Новосибирский государственный аграрный университет

Защита диссертации состоится 17 июня ¡998 г. в 10 ч. на заседании диссертационного совета К 120.01.03 в Алтайском государственном аграрном университете по адресу: 656022, г. Барнаул, ул. Новосибирская, 34 "А".

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВМ АГАУ.

Автореферат разослан " о Д_ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

С.И. СНИГИРЕВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. С переводом аграрного сектора экономики страны на рыночные отношения ничуть не снизилась у ветеринарной практики потребность о научно обоснованных рекомендациях по эффективному оздоровлению стад от лейкоза крупного рогатого с к отд. Последнее возможно при наличии, прежде всего, высокочувствительных и специфических .методов (тест-систем) выявления инфицированных вирусом лейкоза (ВЛКРС) животных. Научный поиск в этом направлении может идти как по пути создания новых, так и совершенствования существующих методов диагностики. Кроме этого, конструирование эффективной комплексной программы оздоровления неблагополучных по лейкозу стад должно учитывать экологическую характеристику территорий, иммунологический статус популяций сельскохозяйственных животных, подвергаемых диагностическому обследованию на лейкозную инфекцию.

К сожалению, в рамках действующей Инструкции "О мероприятиях по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота" (М., 1989) очень сложно вести эффективную оздоровительную работу в стадах. Действующая инструкция представляет собой идеальную модель оздоровительной программы, но она не учитывает характеристик территорий и биологические особенности крупного рогатого скота оздоравливаемых стад. Последнее может вызывать объективную необходимость внесения обоснованных поправок в отдельные положения инструкции, не менее ее основной сути.

Все эти вопросы представляются актуальными для научного и практического решения в зоне Сибири, в том числе в Республике Саха (Якутия).

Связь работы с научными программами. Работа выполнена в рамках Государственной программы 0.69.05 "Лейкозы человека, сельскохозяйственных животных и птиц", № госрегистрации 01.83.0057603, шифр темы 06.01.Д.

С учетом изложенного была поставлена следующая цель исследований: провести ретроспективный анализ показателен распространения лейкоза и инфекции ВЛКРС в Республике Саха (Якутия), дать сравнительную оценку практической значимости РИД в агаре и тест-системы ИФА с антигеном ВЛКРС в общей системе протнволейкозных мероприятий, отработанной на отдельно взятом стаде Мирнинского района Якутии в относительно экологически неблагополучных услови-

ях. Провести поиск возможных естественных биологических резервуаров ВЛКРС в РС (Я). В соответствии с целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить распространение инфекции ВЛКРС и клинико-гематологическое проявление лейкоза крупного рогатого скота в Республике Саха (Якутия) за 1995-1997 гг.

2. Дать иммуноморфологическую оценку крупного рогатого скота разных, в экологическом отношении, территорий.

3. Определить частоту передачи ВЛКРС в системе "мать-плод" в хозяйствах с разной экологической ситуацией, а также в зависимости от степени компрометации коров к лейкозу.

4. Изучить, в сравнительном аспекте, чувствительность реакции иммунодиффузии (РИД) в геле агара и тест-системы иммунофермент-ной (ИФА) при выявлении вирусспецифических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке коров.

5. Повысить предел чувствительности РИД в агаровом геле для выявления инфекции ВЛКРС путем предварительной обработки испытуемых сывороток крови редуцирующим веществом 2-меркаптоэтанолом.

6. Провести исследование собак в РИД на ВЛКРС-носительство и экспериментальное инфицирование собак ВЛКРС-содержащим материалом для исключения их в качестве возможного естественного биологического резервуара ВЛКРС.

7. Разработать и реализовать в условиях Мирнинского улуса (на модели сельхозпредприятия "Новый") научно обоснованную систему оздоровления стад от лейкоза крупного рогатого скота.

Научная новизна. Продолжено ретроспективное изучение эпизоотологии лейкоза крупного рогатого скога в Республике Саха (Якутия).

Установлены количественные изменения (в сторону снижения) показателей иммунной системы у животных, длительное время содержащихся в экологически неблагополучной территории Мирнинского улуса РС (Я).

В условиях производства изучена частота внутриутробной передачи вируса лейкоза телятам, родившимся от коров-матерей, спонтанно инфицированных ВЛКРС.

Показана возможность повышения предела чувствительности РИД путем обработки испытуемой сыворотки крови животных редуцирующим веществом - 2 меркаптоэтанолом.

Установлено, что собаки в условиях РС (Я) не являются природным резервуаром ВЛКРС и не могут использоваться в качестве экспериментальной модели для воспроизведения ВЛКРС-ннфекции и лейкоза крупного рогатого скота.

На модели сельскохозяйственного предприятия КП "Новый" Мир-нинского улуса отработана эффективная научно обоснованная модель оздоровления стада от лейкоза с применением различных методов диагностики.

Практическая ценность. Результаты исследований использованы при разработке:

1. Научно обоснованной системы борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Республике Саха (Якутия) до 2000 г.;

2. Методических рекомендаций "Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов у крупного рогатого скота и его прогностическая значимость в динамике инфекционло-воспалительных процессов" (Новосибирск, 1997);

3. Решений главы администрации Мирнинского улуса "О неотложных мерах по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота".

Основные положении диссертации, выносимые на защиту:

1. Особенности распространения онкорнавирусной инфекции и лейкоза крупного рогатого скота в разрезе отдельных районов Республики Саха (Якутия).

2. Ксенобиотическая нагрузка на иммунокомпетентную систему крупного рогатого скота разных экологических территорий.

3. Частота передачи ВЛКРС телятам от коров-матерей с разной степенью компрометации к лейкозу, а также в зависимости от экологической ситуации территорий.

4. Результаты сравнительных исследований чувствительности реакции иммунодиффузии (РИД) в геле агара и тест-системы иммунофер-ментной (ИФА) при выявлении вирусспецифических (ВЛКРС) антител в сыворотке крови и молоке коров.

5. Материалы по экспериментальному инфицированию собак ВЛКРС.

6. Разработка и реализация в условиях Мирнинского улуса (на модели сельхозпредприятия "Новый" ) научно обоснованной системы оздоровления крупного рогатого скота от лейкоза.

Апробация работы. Результаты собственных исследований доложены на 4-х научно-практических конференциях (Новосибирск, 19941997), в том числе на 1 научной конференции Новосибирского отделе-

ния Паразитологического общества РАН "Паразиты и паразитарные болезни в Западной Сибири." (Новосибирск, 1996); Якутской республиканской научно-производственной конференции "Перспективные направления интегрирования экологических, эпидемиологических и эпи-зоотологических проблем в республике для совершенствования ветеринарного обслуживания" (Якутск, 1994); Международной конференции "Актуальные проблемы ветеринарии" (Барнаул, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах .машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и приложение. Список использованной литературы содержит библиографические сведения о 196 публикациях. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 1 рисунком.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Соискательская работа выполнялась в течение 1994-1998 гг.

Для изучения эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота в разрезе отдельных районов Якутии были использованы результаты серологических и гематологических исследований, проведенных сотрудниками отдела лейкозов ИЭВСиДВ СО РАСХН, НИЦ "Сиоонковет", материалы ветеринарной отчетности Департамента ветеринарии РС (Я), Якутской Республиканской ветеринарной лаборатории, а также данные, полученные в диагностическом отделе ветеринарной лаборатории Мирнинского района Якутии.

Гематологические исследования животных проводили в соответствии с Методическими указаниями по диагностике лейкоза крупного рогатого скота" (М., 1989).

Для серолошческой диагностики лейкоза крупного рогатого скота использовали реакцию иммунодиффузии (РИД ёр51) в геле агара.

На базе КП "Новый'' Мирнинского района изучали (методом сопоставления) взаимосвязь гематологического диагноза и уровня специфических антител против основных антигенов ВЛКРС.

Для определения природы специфических (к ВЛКРС) антител, а также с целью повышения предела чувствительности РИД использова-

ли обработку испытуемых сывороток крови редуцирующим веществом - 2-меркаптоэтанолом (2-МЭ) (П.Н. Смирнов, 1988).

В сравнительных исследованиях по диагностике ВЛКРС-инфекции использовали тест-систему ИФА, разработанную профессором В.М.Чекишевым. В общей сложности комплексному исследованию было подвергнуто 10 тыс. проб крови и молока крупного рогатого скота.

Особенности распространения инфекции ВЛКРС и клинико-гематологического проявления болезни в РС (Я) устанавливали путем определения относительных показателей: уровня инфицированное™ ВЛКРС и заболеваемости животных лейкозом, в процентах (С.И. Джу-пина, 1991).

Ксенобиотическую нагрузку на иммунную систему животных Мир-нинского улуса РС (Я) определяли, регистрируя уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) у крупного рогатого скота, количество форменных элементов крови, уровень гемоглобина и гематокрита. Последний фрагмент работы был выполнен на базе НИИ ветеринарной экологии ЯГСХА.

Для изучения частоты трансплацентарной передачи ВЛКРС (от матери - плоду) серологическому исследованию в РИД и ИФА (до выпойки первой порции молозива) было исследовано 123 новорожденных теленка. Работа выполнена в хозяйствах Мирнинского улуса РС (Я) и Новосибирской области.

Опыт по экспериментальному инфицированию собак ВЛКРС, а также биопроба на овцах выполнены на базе Мирнинской райветлабо-ратории.

Отработку модели оздоровления хозяйства от лейкоза крупного рогатого скота проводили в КП "Новый" Мирнинского района РС (Я).

Статистическую обработку, анализ и интерпретацию полученных данных выполняли с использованием персонального компьютера и стандартных программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Республике Саха (Якутия)

Среди инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, профилактика которых предусмотрена планом противоэпизооти-

ческих мероприятий в РС (Я), регистрируется и лейкоз крупного рогатого скота.

В результате принятия своевременных специальных и организационно-хозяйственных мер за последние годы удалось стабилизировать и даже заметно улучшить эпизоотическую ситуацию по лейкозу, однако, пока еще во многих хозяйствах продолжают регистрироваться случаи как инфекции ВЛКРС, так и клинико-гематологического проявления лейкоза.

Наиболее сложная эпизоотическая ситуация по инфекции ВЛКРС имеет место в Нерюнгринском, Татгинском, Ленском, Намеком и других улусах РС (Я). Высокий уровень инфицированности ВЛКРС (за анализируемый промежуток времени) был зарегистрирован в 1994 г. в Нерюнгринском районе -13%.

Результаты диагностических исследований на уровне хозяйств Мирнинского района (табл. 1) показали, что инфицированы животные ВЛКРС в данном районе в одном крупном хозяйстве - КП "Новый" (4,5 %). В других хозяйствах района показатели инфицированности незначительны. Среди животных, находящихся в частном пользовании поселков Алмазный, Мирный, Сюльдюкар, Арылах, случаи носитель-ства ВЛКРС не зарегистрированы.

Показатель заболеваемости скота лейкозом в РС (Я) остается относительно высоким в Амгинском, В-Вилюйском, Олекминском, Татгинском районах (по данным 1995 г.) и в Амгинском, М-Кангаласском, Намеком и Оймяконском районах (по данным 1996 г.). Высокий показатель заболеваемости на протяжение ряда лет остается пока в М-Кангаласском районе; низкий (по данным 1996 г.) - в Олекминском -1,1 %. В 26 районах случаи клинико-гематологического проявления лейкоза не зарегистрированы.

Относительно благополучная обстановка по инфекции ВЛКРС предопределила и объемы гематологических исследований животных на лейкоз. Такие исследования проводились только в трех хозяйствах Мирнинского улуса, при этом в 1994 г. в КП "Новый" было выявлено 3,0 % гематологически больных коров от числа инфицированных ВЛКРС, что представляло собой один из наиболее высоких показателей заболеваемости в республике. В 1996 г. этот показатель, за счет своевременной сдачи больного скота, понизился до 1,4 %.

Таблица 1

Динамика показателей серологического исследования крупного рогатого скота Мирнинского улуса РС (Я)

на лейкоз за 1993-1996 гг.

Хозяйства и 1993 г. 1994 г. 1995 г. 1996 г.

частный сектор (ч. с.) иссл. полож. % иссл. полож. % иссл. полож. % иссл. полож. %

гол. гол. гол. гол. гол. гол. гол. гол.

КП "Новый" 1690 77 4,5 3605 36 0,9 3267 64 1,9 7804 68 0,8

Чернышевский 48 1 2,0 86 1 1,1 83 99 - -

Мирнинский ТОК 220 2 0,9 - - - . .

Айхальский ТОК 63 3 4,7 63 70 48

п. Арылах (ч.с.) 44 - - 133 130 156

п Алмазный (ч с) 24 50 54 51

г. Мирный (ч.с.) . 19 18

п Сюльдюнар (ч с ) 38 40 39

п Тас-Юрях (ч.с.) 4 5 123 144

итого 2093 83 4,0 3980 37 0,9 3786 64 1,6 8359 68 0,8

По результатам исследований на бруцеллез за 1993-1997 гг. в Мир-нинском улусе было зарегистрировано только 3 случая (1993 г.) положительного реагирования, в том числе 2 - в КП "Новый" и 1 - в КП "Чернышевский".

Исследования на туберкулез и паратуберкулез крупного рогатого скота, проводимые в течение последних 5 лет, подтвердили полное благополучие расположенных на данной территории сельхозпредприятий по этим двум инфекциям.

Иммуноморфологические показатели у крупного рогатого скота разных, в экологическом отношении, территорий

Проведено сравнительное изучение морфологического состава периферической крови коров КП "Новый" Мирнинского района, КП "Хатассы" РС (Я) и ОПХ "Элитное" Новосибирской области, характеризующихся одной породной принадлежностью, но различающихся по эколого-географической характеристике территорий (табл. 2).

Таблица 2

Морфологический состав крови коров трех хозяйств (в сравнительном аспекте)

Район, насел. лейко- грану- лимфо- моно- эрит- гемог- гемато-

пункт циты лоциты циты циты роциты лобин крит

Мирнинский, М 7,32 1,96 4,63 1,15 4,14 14,4 19,2

КП "Новый"

РС(Я) ш 0,21 0,14 0,23 0,12 0,11 0,12 0,13

Якутский, М 10,42* 2,97* 4,85 2,68 5,23 8,16* 27,5*

"Хатассы"

РС (Я) т 0,34 0,12 0,24 0,13 0,09 0,08 0,30

Новое, обл., М 8,23 3,08* 3,68 1,60 6,00* 9,21* 28,05*

ОПХ

"Элитное" т 0,42 0,21 0,20 0,08 0,13 0,15 0,43

Примечание: * разница с КП "Новый" достоверна

Из таблицы видно, что содержание лейкоцитов крови у крупного рогатого скота Мирнинского района составляет 7,32±0,21 тыс/мкл. Достоверная разница по данной популяции клеток установлена с животными Якутского района -10,4±0,34 тыс/мкл.

Содержание гранулоцитарных клеток у животных Мирнинского района также было достоверно ниже, чем у коров Якутского и Новосибирского районов.

Из таблицы также видно, что при наименьшем показателе содержания эритроцитов коровы Мирчинского района отличались достоверно более высоким уровнем гемоглобина и гематокритным числом. Последнее указывает на преимущество их в окислительно-восстановительной функции крови. С другой стороны это может свидетельствовать о возможном образовании у животных КП "Новый", так называемых, аномальных форм гемоглобина, не выполняющего его основных функций (Л И. Иржак, 1985), при негативном воздействии на организм эндо - экзогенных факторов, в том числе техногенного происхождения.

Наиболее существенной была разница по показателю гематокрита (соотношение концентрации эритроцитов к объему плазмы крови). Низкий показатель гематокрита характеризует пониженную адгезивную активность клеток - низкую активность специфического взаимодействия клеток на уровне мембран (Н.У. Базанова и соавт., 1987).

Следующий показатель, который был использован нами при определении степени экологической нагрузки на ИКС крупного рогатого скота Мирнинского района, - это концентрация циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) (табл. 3).

Таблица 3

Содержание ЦИК в сыворотке крови животных разных экологических территорий *

Наименование хозяйств Кол-бэ ж-х Уровень ЦИК, в усл. ед.

3% р-р ПЭГ 4% р-р ПЭГ

КП Новый" Мирнинского района РС (Я) (опыт) 70 92 ±9 143 ± 16

с. Крестях Сунтарского района РС(Я) (контроль) 20 56 ± 1* 103 ±9*

ОПХ "Элитное" Новосибирского района (контроль) 24 43 ±4* 91 ±8*

* разница с показателями Мирнинского района достоверна

Наиболее низкий уровень ЦИК выявлен в сыворотке крови животных Новосибирского района - 43 и 91 усл. ед. Далее следует Сунтар-ский улус - 56+7 и 103,9 усл.ед.

При сопоставлении экологической характеристики территорий, на которой содержатся животные сравниваемых групп, просматривается тенденция увеличения концентрации циркулирующих иммунных комплексов в тех административно-географических зонах, где экологическая (в том числе ксенобиотической природы) нагрузка максимальна. К числу таких территорий следует отнести Мирнинский район, где концентрация ЦИК достигала 143±16 усл. ед. и значительно превышала соответствующий показатель животных двух других территорий. Показатели относительной нормы ЦИК, разработанные в ИЭВСиДВ СО РАСХН (С И. Логинов и соавт., 1997) позволяют использовать этот критерий в панели уже имеющихся других тестов для функциональной оценки иммунной системы животных.

Определение (в РИД н ИФА) частоты трансплацентарной передачи ВЛКРС телятам от матерей с разной степенью компрометации к лейкозу в экологически неравнозначных территориях

Результаты исследований показали, что пренатальная передача ВЛКРС от спонтанно инфицированных и гематологически больных матерей достигает 8,0 и 16,6 % - соответственно, однако, частота внутриутробной передачи вируса плоду в сравниваемых популяциях была неравнозначной (табл. 4).

Уровень пренатального заражения вирусом лейкоза (по результатам РИД) телят от инфицированных коров-матерей составил 6,3 % - по хозяйствам Новосибирской области и 4,0 % - по хозяйствам Мирнинского района.

Значительно выше частота трансплацентарной передачи ВЛКРС телятам была от коров в гематологической стадии болезни. По хозяйствам Новосибирской области и Мирнинского улуса она составила 13,3 и 9,5 %, соответственно (по данным РИД), 16,6 и 13,6% - по данным ИФА.

Таким образом, вероятность передачи вируса зависит от стадии развития у коров лейкозного процесса (A.C. Опанасюк, П.Н. Смирнов, 1989).

Таблица 4

Частота пренатальной передачи ВЛКРС телятам от коров-матерей, имеющих разную степень компрометации к лейкозу и содержащихся в неравнозначных экологических условиях

Статус Количество исследованных:

коров- серологически - в РИД в тест-системе ИФА

матерей всего, выявлено % всего, выявлено %

голов РИД (+) голов РИД(+)

Хозяйства Новосибирской области

Инфицированные 47 3 6,3 50 4 8,0

ВЛКРС

Хозяйства Мирпииского района

25 1 4,0 25 2 8,0

Хозяйства Новосибирской области

Гематологически 30 4 13,3 30 5 16,6

больные лейкозом *

Хозяйства Мирпииского района

21 2 9,5 22 3 13,6

* - больные лейкозом животные по результатам трехкратных гематологических исследований

Изучая возможные пути передачи ВЛКРС, мы предприняли, на относительно небольшом материале, попытку продолжить работу, начатую в Якутии Т.Д. Каратаевой (1995), касающуюся экспериментального изучения устойчивости разных видов животных к вирусу лейкоза крупного рогатого скота, а также поиска биологических объектов, кроме крупного рогатого скота, в которых возможно переживание ВЛКРС. Эксперименты на гетерологичных животных связаны и с возможностью использования в последующем удобной и экономичной биологической модели, так как крупный рогатый скот (по сравнению с лабораторными животными, а та:-~же овцами и свиньями) является позднеспелым и дорогостоящим видом.

В табл. 5 представлены результаты гематологических и серологических исследований собак, находящихся в условиях эксперимента, до заражения. Данные гематологических исследований (табл. 5) свиде-

тельствуют о том, что у одного животного (инв. № 14) имел место кратковременный (в течение 7 дней) лейкоцитоз и абсолютный лимфо-цитоз, вероятно, как реактивная реакция на чужеродный антиген. В последующем показатели крови стабилизировались, достигнув первоначальных значений. У остальных животных картина крови, а также показатели гемоглобина и гематокрита оставались, при небольшой вариабельности, в пределах физиологической нормы.

Исследования сыворотки крови животных в РИД и ИФА на ВЛКРС-инфекцию показали отрицательный результат.

Таблица 5

Диламика показателей крови у собак после инокулирования им ВЛКРС-содержащего материала

№ Лейко- Лимфо- Грану- Моно- Эрит- Гемог- Гематонрнт, РИД ИФА

ж-х циты, циты, лоцнты, циты, роциты, лобин, %

тыс/мкл % % % млн/мкл Г /О

I исследование

12 8,9 53 1,7 1,4 4,9 13,0 8,6 - -

13 8,9 60 1,9 1,6 4,4 11,0 6,1 - -

14 8,2 68 2,0 2,7 5,5 12,7 7,9 - -

15 9,1 48 1,6 2,0 7,2 14,8 6,0 - -

И исследование

12 9,3 50 1,9 1,0 5,6 12,4 8,2 - -

13 8,7 64 2,0 1,7 4,9 11,7 6.1 - -

14 13,1 70 1,9 2,6 4,8 12,2 6,6 - -

15 9,9 51 1,2 2,4 6.5 13,0 5,2 - -

Ш исследование

12 8,7 52 1,3 2,0 5,8 11,6 9,2 - -

13 8,0 60 2,2 1,9 4,6 10,8 7,1 - -

14 10,2 67 2,3 2,4 5,0 13,2 7,3 - -

15 9,1 48 1,6 2,0 7,2 14,8 6,0 - -

IV исследование

12 7,9 49 2,0 1,8 5,3 10,2 8,7 - -

13 8,3 62 1,9 2,2 4,5 10,2 7,8 - -

14 9,0 61 1,7 2,2 4,5 12,7 8,0 - -

15 8,7 50 1,9 1,9 6,9 13,1 6,2 - -

V исследование

12 8,5 41 1,4 2,0 4,9 10,6 7,9 - -

13 8,0 60 1,4 1,3 4,0 11,6 7,7 - -

14 9,4 60 1,8 1,9 4,3 11,9 8,3 - -

15 8,0 52 1,6 2,2 5,6 12,0 7,3 - -

Групповая бнопроба па овце, поставленная по завершении опыта, также была отрицательной.

Таким образом, из результатов эксперимента следует, что в течение всего срока наблюдений, используя три наиболее чувствительных метода прижизненной диагностики лейкоза, нам не удалось воспроизвести экспериментальный вариант инфекции ВЛКРС на собаках. Данный опыт позволяет резюмировать, что собаки не могут служить лабораторной моделью экспериментальной ВЛКРС-инфекшш и высказать предположение о том, что плотоядные, по-видимому, не служили естественным биологическим резервуаром ВЛКРС-инфекции.

Результаты сравнительного анализа реагирования крупного рогатого скота разных возрастных групп в РИД с глнконроте-ндным ^р51) и полипептндным (р24) антигенами ВЛКРС

При проведении серологических исследований крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Саха (Якутия), а также выборочных исследований животных сельхозпредприятий Новосибирской области мы выявляли животных, реагирующих как на Бр51-, так и на р24-антчгены ВЛКРС (соответственно одна или две линии преципитации). Данные о реагировании коров при первичном исследовании стад представлены в таблице 6.

Таблица 6

Результаты исследования коров в РИД с антигенами ВЛКРС

Наименование Иссле- Реагировало в РИД с антигенами ВЛКРС:

хозяйств довано й>51, р24, % реагирующих с р24 от

голов голов. голов, числа всех реагирующих на

% % №51

АОЗТ 216 117 1 0,8

"Лебедевское" 54,2 0,5

АОЗТ "Пашинский" 287 134 3 2,2

46,7 1,0

Эксперим. хоз-во 284 148 2 1,3

СО РАН 52,1 0,7

КП "Новый" 200 8 1 12,5

4,0 1,5

Как видно из таблицы 6, во всех хозяйствах выявлялась значительная доля животных, реагирующих на два антигена. Наиболее высокие показатели реагирования скота на §р51 антиген ВЛКРС имели место в АОЗТ "Лебедевское" - 54,2%; экспериментальном хозяйстве СО РАН -52,1% и АОЗТ "Пашинский" - 46,7%.

В этих же хозяйствах нами было проведено исследование по поиску взаимосвязи уровня антител §р51 и р24 и гематологическими проявлениями лейкоза. Данные этих исследований представлены в таблице 7.

Таблица 7

Результаты гематологических и серологических исследований коров на лейкоз

Наименование Всего Выявлено гема- Реагировало в РИД с антигенами

хозяйств иссл., тологически ВЛКРС

голов больных РР51 р24

всего %ог всего %от всего %ог

голов иссл. голов иссл. голов иссл.

Эксп. хоз-во 127 2 1,5 64 50,3 55 43,3

СО РАН

АОЗТ 1179 98 8,3 770 65,3 406 34,4

"Пашинский"

АОЗТ 194 21 10,8 150 77,3 61 34,5

"Лебедевское"

КП "Новый'' 97 9 9,2 5 5,1 34 35,0

У подавляющего большинства животных-антителоносителей к р24-антигену при клиническом исследовании, выявлены признаки, характерные для лейкоза (увеличение лимфатических узлов, реже экзоф-тальмия).

Один из основных выводов, из добытых нами данных, и состоит в том, что у гематологически больных коров средние показатели уровня антител обеих специфичностей (причем особенно анти-р24) значительно превышают таковые гематологически отрицательных, но являющихся ВЛКРС-носителями. Не исключено, что регистрация антитело-носятельства к антигенам ВЛКРС ^р51 и р24) одновременно у гематологически отрицательных коров может являться результатом развития у них той или иной стадии лейкозного процесса в алейкемической форме.

Анализ результатов проведенного исследования подтверждает и дополняет данные других авторов относительно сопряжения у инфицированных животных антителоносительства к р24 антигену ВЛКРС с клиническим и патоморфологическим проявлениями лейкоза.

Использование 2-меркаптоэтапола для повышении предела чувствительности РИД и определения природы специфических (к ВЛКРС) антител

По результатам предварительных исследований было установлено, что у животных-носителей ВЛКРС, с картиной крови характерной для лейкозной патологии, значительно чаще регистрируются антитела класса ^ в (табл. 8).

27-ми животным из хозяйств № 1 и 5, по результатам трехкратных гематологических исследований, был поставлен диагноз "лейкоз". У 25-ти из них гуморальный иммунный ответ к ВЛКРС антигену был представлен ^О-антителами.

В хозяйстве № 3 из 13-ти положительно реагирующих в РИД животных только у одной коровы было получено гематологическое подтверждение лейкоза, у 12-ти коров тестировали инфекцию ВЛКРС.

Таблица 8

Дифференциация антител к ВЛКРС постановкой в РИД сывороток крови, обработанных 2-МЭ

Номер Иссле- Выявлено положительно реагирующих Природа антител

хозяйств довано в

РИД с нативной сыво- с обработанной 2- 18М 1§0

роткой МЭ

голов I % голов I %

1 446 13 2,9 15 3,3 2 13

2 198 1 0,5 14 7,3 14 -

3 210 8 3,8 13 6.2 12 1

4 160 33 20,7 35 21,8 18 17

5 14 14 "100,0 14 100.0 2 12

В хозяйстве № 4 регистрировали случаи как носительства ВЛКРС, так и клинико-гематологического проявления болезни.

Таким образом, развитие спонтанной инфекции ВЛКРС, вероятнее всего, сопровождается синтезом антител типа ^М, однако, далее, в

процессе манифестации ВЛКРС и проявления клинико-геыатологических симптомов болезни, происходит "переключение" на синтез антител, обладающих, по мнению ряда исследователей, блокирующим эффектом (Н.В. Николаева и соавт., 1981; П Н. Смирнов, 1987). Механизм такого переключения, к сожалению, пока не ясен.

По результатам исследований также было установлено, что предварительная обработка испытуемых сывороток крови редуцирующим веществом 2-меркаптоэтанолом, повышает чувствительность РИД в агаровом геле и способствует (дополнительно на 2 %) выявлению инфицированных животных с низким титром антител к ВЛКРС (табл. 9).

Таблица 9

Чувствительность РИД при диагностике инфекции ВЛКРС при использовании редуцирующего вещества 2-МЭ (при сопоставлении с контролем)

Номер Исследовано Выявлено почожительно реагирующих

хозяй- в РИД, голов с нативнон сывороткой с обработанной 2-МЭ

ства

голов 1 % голов | %

1 120 7 5,8 12 7,5

2 171 23 13,4 27 15,7

3 100 7 7,0 7 7,0

4 91 10 10,9 10 9,8

5 36 4 11,1 4 11,1

6 370 106 28,6 111 30,0

7 10 7 70,0 8 80,0

8 47 5 10,6 6 10,6

Всего: 936 169 18,0 187 19,9

Диагностическая ценность (в сравнительном аспекте) РИД н тест-системы ИФА при выявлении антител к ВЛКРС в сыворотке

крови и молоке

В 1995 г. была предпринята первая попытка адаптировать тест-систему ИФА в хозяйствах Якутии (Н.В. Попова, 1997). Следует отметить, что в экстремальных условиях, в которых приходится работать специалистам ветеринарной службы республики, возможность использования тест-системы ИФА, особенно с молоком, является чрезвычайно актуальной и, к сожалению, до сих пор пока нерешенной проблемой.

Продолженные нами в этом направлении диагностические исследования показали относительно сопоставимые результаты при сравнении их в РИД и ИФА (табл. 10).

Таблица 10

Сопоставление результатов исследований, полученных при постановке РИД(§р51) и тест - системы ИФА с сывороткой крови коров из неблагополучных по лейкозу хозяйств

Хозяйства Кол-во иссл. ж-х Результаты исслед( РИД звания сыворотки в ИФА

кол-во (+) 1 % кол-во (+) | %

КП "Новый" 630 20 3,1 36 5,7

КП Якутское 362 28 7,7 31 8,5

ПЗ "Пашинский" 327 64 19,5 68 20,7

Всего: 1319 112 8,4 135 10,2

Из табл. 10 видно, что при исследовании 1319 голов крупного рогатого скота в РИД было выявлено 112 (8,4 %) животных-носителей ВЛКРС, тогда как в ИФА - 135 гол., что составило, соответственно -10,2 %. Наиболее результативным использование ИФА было в КП "Новый", где удалось (дополнительно к РИД) выявить 16 животных, латентных носителей вируса лейкоза. Причем, это при относительно невысокой инфицированное™ стада ВЛКРС. Своевременное удаление их, как источника инфекции, из стада позволило сократить сроки оздоровления хозяйств от лейкоза, последнее подтверждено результатами, представленными в следующем разделе автореферата.

Второе преимущество, которое выгодно отличает тест - систему ИФА, - это характеристики, определяющие ее как экспрссс-метод диагностики. Прежде всего, это относительно короткое время постановки и возможность спектрофотометрического (автоматизированного) учета результатов. Однако, при параллельном проведении иммунологических исследований сыворотки крови одних и тех же животных мы выявили и недостаток ИФА, о котором упоминают в своих работах многие исследователи - случаи неспецифического реагирования компонентов реакции или, так называемые, "фоновые" реакции (В.Г. Арутюнян, 1992; Р.З. Файзулин, 1995; В.В. Храмцов, 1995; Н.В. Попова, 1998; и др.). Аналогичные данные получены и в наших исследованиях (табл. 11).

Таблица 11

Сопоставление результатов исследований сыворотки крови коров в РИД и ИФА

№ Хозяйства Число РИД+ РИД- РИД- РИД+

эксп. m проб ИФА+ ИФА+ ИФА- ИФА-

89 1 51 2 2 47 -

72 2 171 66 10 93 2

123 3 21 10 - 11 -

124 4 210 100 12 83 1

125 5 186 1 - 185 -

126 6 27 1 - 26 -

127 7 158 5 - 153 -

113 8 94 - - 94 -

123 9 93 - - 93 -

10 173 32 - 140 1

Всего проб: 868 217 24 925 4

Учитывая, что специфические антитела к BJIKPC можно выявлять с помощью ИФА не только в сыворотке крови, но и в других биологических жидкостях и компонентах, в частности, молозиве, молоке, назальных секретах, слюне, моче, сперме (J.E. Butler, 1986), мы провели исследование молока коров, представляющее наибольший практический интерес (табл. 12).

Таблица 12

Результаты сопоставления данных, полученных при постановке РИД(§р51) и ИФА с сывороткой крови и молоком коров неблагополучных по лейкозу хозяйств

Хозяйства Кол-во Результаты исследования в

иссл. РИД с сывороткой ИФА с молоком

голов кол-во (+) 1 % кол-во (+) | %

КП "Новый" 630 20 3,1 18 2,8

ПЗ "Пашинский" 327 64 19,5 60 18,3

КП "Якутское" 362 28 7,7 23 6,3

Всего 1319 112 8,4 101 7,6

Полученные при исследовании молока данные согласуются с результатами выполненных ранее работ. При использовании молока тест-

система ИФА уступает или проявляет чувствительность, равную РИД. Тем не менее, этот вариант предпочтительнее для ветеринарной практики.

Разработка н реализация в условиях Мирнинского района (на примере КП Новый") научно обоснованной системы оздоровления стада от лейкоза крупного рогатого скота

Хозяйство благополучно по таким инфекционным заболеваниям как туберкулез, бруцеллез, некробактериоз и др.

По результатам выборочных ( до 5% от стада) копрологических исследований регистрировали случаи стронгилоидоза.

При первом (1993 г.) серологическом исследовании животных КП "Новый" на лейкоз было выявлено 4,5% коров, инфицированных вирусом лейкоза.

По результатам первичного гематологического исследования из 73 РИД-положительных животных у 3-х (4,0 %) подтвердили гематологическую стадию болезни.

В 1993 г. совместно с сотрудниками ИЭВСиДВ СО РАСХН мы разработали комплексную научно обоснованную программу противолей-козных мероприятий, которая включала качественную диагностику (в РИД и ИФА), конкретный перечень специальных и организационно-хозяйственных мероприятий, объемы и кратность исследований животных на лейкоз, механизм взаимодействия специалистов ветеринарной службы Управления ветеринарии Мирнинского района, ветеринарной лаборатории и сотрудников отдела ветеринарной онкологии и экологии ИЭВСиДВ (рис. 1).

Работа проводилась по согласованию с Департаментом ветеринарии МСХиП РС (Я) и при непосредственной курации начальника департамента, кандидата вет. наук Т.Д. Каратаевой.

С учетом эпизоотической ситуации по лейкозу, для КП "Новый" был принят один из вариантов оздоровления, предусматривающий разовую сдачу животных, инфицированных ВЛКРС, независимо от возраста, физиологического состояния и хозяйственной ценности.

В таблице 13 приведена динамика оздоровления стад КП "Новый" (по результатам диагностических исследований сывороток крови, обработанных 2-меркаптоэтанолом, в РИД и сывороток крови в тест-системе ИФА).

Районная ветеринарная лаборатория

I!

Диагностика -РИДар51; - РИД р24; - РИД (2-МЭ); - ИФА

ВетслужбаКП |-

Управление ветеринарии Мирнинского района

стажировка специалистов, обеспечение диагностику-мом и оборудованием, отработка варианта _оздоровления_

КП "Новый" Мирнинского района

II

Администрация КП

Зоотехническая служба КП

забор крови для исследования, перемещение жи-вогньгх, ветобработки

автотранспорт, стройматериалы, отдельные технологические доводки

мечение и таврение животных, формирование гуртов

Рис. 1. Структурные компоненты программы организации оздоровительно-профилактической работы по лейкозу крупного рогатого скота, на примере КП "Новый" РС (Я).

Таким образом, комплексный подход к решению проблемы лейкоза в рамках отдельно взятого сельхозпредприятия позволил нам остановить дальнейшее распространение инфекции ВЛКРС, улучшить эпизоотическую ситуацию, а в последующем полностью оздоровить хозяйство от лейкоза крупного рогатого скота.

Результаты применения тест-системы ИФА, на сравнительно представительном поголовье и в течение длительного времени, показали, что метод позволяет, практически на всех этапах исследования, выявлять дополнительно к РИД до 3 % животных-носителей ВЛКРС. Кроме того, первый отрицательный результат по стаду был получен нами так же в ИФА (во II кв. 1996 г.).

Таблица 13

Результаты сравнительных, в РИД и ИФА, диагностических исследований на лейкоз в КП "Новый" Мирнинского район? в динамике оздоровит ельных мероприятий

Сроки исследований Исследовано в РИД Исследовано в ИФА

(годы) всего, животных выявлено РИД (+) % всего, животных выявлено ИФА (+) %

1993 529 25 4,7 не исследовали

1 кв. 1994 472 21 4,4 312 24 7,6

2кв. 1995 297 12 3,3 290 14 4.8

Зкв. 1995 470 14 3,0 246 8 3,2

1 кв. 1996 959 19 1,9 287 6 2,0

2 кв.1996 1068 .9 0,8 110

4 кв.1996 687 1 0,1 235 1 0,4

1 кв.1997 874 236

4 кв.1997 643 -

Все животные, положительно реагирующие в РИД и ИФА, своевременно переводились в группу откорма, что позволило исключить источник возбудителя и, таким образом, непосредственные и опосредованные факторы передачи вируса лейкоза.

В соответствии с действующей инструкцией "О мероприятиях по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота" (М„ 1989) было получено 2 отрицательных результата исследований всего поголовья в РИД с ёр51 антигеном ВЛКРС (с интервалом 3 мес ). Затем, на основании акта эпизоотического обследования, специальным постановлением главного госветинспектора Мирнинского района КП "Новый" было объявлено благополучным по лейкозу крупного рогатого скога

выводы

1.3а анализируемый период (1993-1997 гг.) эпизоотическая ситуация в сельхозпредприятиях Мирнинского района Республики Саха (Якутия) характеризовалась благополучием по бруцеллезу, туберкулезу, паратуберкулезу, некробактериозу и неблагополучием по лейкозу крупного рогатого скота.

2. В результате разработки и последующей реализации научно обоснованной программы борьбы с лейкозом крупного рогатого скота показатель инфицнрованности животных вирусом лейкоза в РС (Я) снизился с 1,79 (в 1994 г.) до 0,7 % (в 1996 г.), в том числе в Мирнинском районе с 4,0 до 0,8 %. Это достигнуто благодаря выполнению поэтапно!'; целенаправленной работы ветеринарно-зоотехническои службы и администрации территорий (в рамках республиканской противолей-козной программы, утвержденной МСХиП РС (Я).

3. Крупный рогатый скот Мирнинского района РС (Я), характеризующегося весьма сложной экологической ситуацией, имеет свои им-муноморфологические особенности: сравнительно более низкую продукцию (по абсолютному содержанию в крови) лейкоцитов, в том числе гранулоцитов, и низкий показатель гематокрита; высокий показатель циркулирующих в крови иммунных комплексов. Последнее отражает экологическую нагрузку на организм животных данной территории.

4. Выявлена зависимость между частотой пренатальной передачи ВЛКРС (в системе мать-плод) и эколого-географическими особенностями территорий: в Мирнинском районе РС (Я) внутриутробное заражение плодов серопозитивных коров составило 4 %, в пригороде Новосибирска - 6 %. Установлена более высокая частота (до 9 %) передачи ВЛКРС плоду от гематологически больных лейкозом коров-матерей.

5. В условиях Республики Саха (Якутия) бродячие собаки не являются естественным резервуаром ВЛКРС и не могут служить гетероло-шчной лабораторной моделью для экспериментального (ВЛКРС-индуцированного) лейкоза крупного рогатого скота.

6. Установлена взаимосвязь между регистрацией сывороточных антител к р24 антигену ВЛКРС в высоком титре (в тест-системе РИД с §р51 антигеном) и гематологической стадией лейкозного процесса у взрослого крупного рогатого скота в стационарно неблагополучных по лейкозу популяциях.

7. Постановка РИД в агаровом геле с §р51 антигеном ВЛКРС с сыворотками крови, предварительно обработанными детергентом 2-

меркаптоэтанолом, повышает чувствительность реакции в среднем на 2%.

8. Тест-система ИФА с §р51 антигеном в непрямом варианте обладает высокой чувствительностью, в сравнении с РИД в агаровом геле, может использоваться при исследовании проб крови и молока. Наибольшую практическую ценность использование тест-системы ИФА представляет на завершающей стадии оздоровления инфицированных ВЛКРС стад.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны и предложены для практического использования:

1. Научно обоснованная система борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Республике Саха (Якутия) до 2000 г.

2. Методические рекомендации "Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов у крупного рогатого скота и его прогностическая значимость в динамике инфекционно-воспалительных процессов". Рассмотрены и рекомендованы к изданию Ученым советом ЮВ-СиДВ СО РАСХН (протокол № / от 13.11.97 г.) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 7 от 17.11.97 г.).

3. Результаты комплексного изучения особенностей эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота и научно обоснованные предложения использованы при разработке постановления Главы администрации Мирнинского улуса "О неотложных мерах по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота" (№ 341 от 30 июня 1993 г.).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

ГШукель A.A., Храмцов В.В. Использование метода провокации ППД туберкулином для выявления животных, латентных носителей вируса лейкоза крупного рогатого скота // Тез. докл. науч. конф. Пара-зитологического общества РАН. - Новосибирск, 1997. - С. 138-140.

2. Шукель A.A. Использование ивомека для снятия иммуносупрес-сивного действия паразитозов у крупного рогатого скота // Тез. докл.

науч. копф., посвященной 50-летню Алтайской НИВС. - Барнаул, 1997. - С. 46-47.

3. Шукель A.A. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Мирнинском улусе Республики Саха (Якутия) // Сб. науч. тр. / РАСХН. Сиб. огд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 1996. - С. 42-45.

4. Научно обоснованная система борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Республике Саха (Якутия) на 1995-2000 гг. (Утверждена НТС МСХиП PC (Я). - Якутск, 1995.

5. Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов у крупного рогатого скота и его прогностическая значимость в динамике инфекционно-воспалительных процессов: Метод, рекомендации / С И. Логинов, А.Н. Трунов, П.Н. Смирнов, В.В. Храмцов, A.A. Шукель, Т А. Агаркова, В.А. Апалькин // РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. -Новосибирск, 1997. - 10 с.