Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Сравнительная характеристика серологических методов диагностики РИД и ИФА в системе оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота

■ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАГЧНО-ИССШОВАТЕЛЬСЮЙ ИНСТИТУТ ЭШШБШНТМЬНСЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р.Коваленко ' РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСЖОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

На правах рукописи

•арутшян Владимир Геворкович

сравнительная характеристика серояспгчесюа методов диагностики рид и ифа в системе, оздоровштшх мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота

16.00.02 — патология, онкология и морфология животных

Автореферат диссертации на ооисканиа ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1992

Работа выполнена в вентральном отделе лейкозов, сравнительной и экспериментальной онкологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.РЛСоваленко.

Научные руководители - доктор ветеринарных наук, профессор, . академик РАСХН В.П.Шишков; кандидат ветеринарных наук П.ДЛСолчиа.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Е.С.Ворониы;

кандидат ветеринарных, наук ИЛ^ШЗлонская

Ведущее учреждение: научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии*Сибири ж Дальнего Востока (НИИЭВС и ДВ) г'.Новосибирсх.

Защита диссертации состоится " " ______ 1992 г»

в "14й часов на заседании Специализированного Совета • Д.020.28.02 по защите диссертаций.на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЗЕ.

С диссертацией ложна ознакомиться в библиотеке ВИЭВ

Автореферат разослан " "__ 1922 г.-.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат ветеринарных наук

В.В.Амелина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ • Актуальность теш. Среда заболеваний сельскохозяйственных животных, характеризующихся злокачественным ростом, лейкозы по частоте проявления и тяжести течения занимают первое место.

Лейкоз крупного рогатого скота - хроническое инфекционное заболевание вызываемое вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) , протекающее вначале бессимптомно, а затем- проявляющееся персистентным лимфоцитозом в периферической крови и опухолевая! образованиями в кроветворных и других органах и тканях.

Заболевание широко распространено во многих странах мира с развитым молочным скотоводством, а также и на территории нашей страны»

Экономический ущерб причиняемый лейкозами, складывается из падежа; снижения продуктивности; утилизации туш и органов с опухолевым поражениями; недополучением молодняка; затрат на обезвреживание молока и нарушения племенной работы.

На оскова ВДКРС разработаны иммунологические метода диагностики по выявлению инфицированных ВЛКРС животных. В настоящее время, как за рубежом, так и в нашей стране, реакция иммуно,диффузии в геле агара (РИД) прочно вошла в ветеринарную практику в качества основного тоста серодиагностики лейкоза крупного рогатого скота. Однако, многие исследователи, отмечают, что из-за недостаточно высокой чувствительности РИД, на всегда удается выявить вирусспеци-фаческие антитела к ВЛКРС. Чаще всего они содержатся в низкой концентрации в -сыворотках, крови и секретах, молочной железы у инфицированных .ВЛКРС коров и нетелей в последние месяцы стельности. В то же время, применение РИД в качестве основного метода серодиагностики, сдерживает оздоровление неблагополучных по лейкозу и ВЛКРС инфекции хозяйств в более сжатые сроки.

Из вышеизложенного следует, что система противолейкозных мероприятий, которая основана на современных научных достижениях в области лейкозологии, в целях повышения ее эффективности, требует постоянного совершенствования. Поэтому, приоритетным направлением в этой системе являэтся разработка и совершенствование высокочувствительных. п специфичных методов, диагностики лейхоза и ВЛКРС инфекции.

Пель и задачи доследования, Основной целью исследования явилось сравнительное изучение чувствительности двух серологических методов РИД а имиуноферментпого анализа (МФА) по выявлении ВЛКРС

инфицированных животных в неблагополучных по лейкозу стадах крупного рогатого скота и определения места ИФА в системе оздоровительных мероприятий.

Для решения этой цели, необходимо решить следующие задачи:

1. Сравнить чувствительность РЩС и ИФА по выявлению вирус-специфических антител к ВЛКРС в сыворотках крови у животных из неблагополучных по лейкозу стад с учетом возраста и гематологических показателей ("лейкозного ключа"). '

2. В целях изучения инфекционности патологического материала отобранного от крупного рогатого скота, с.еропозитивного в ИФА, нб негативного в РИД, воспроизвести ВЛКРС инфекцию на овцах-реципи-

1 ентах.

3. В динамлке наблюдения за коровами, спонтанно инфицированными ВЛКРС и гематологически больными лейкозом, изучить взаиыо- . связь мевду титрами вирусспецифических антител к ВЖРС, в сыво- ' ротках крови и секретах молочной железы, о учетом физиологического состояния животных, периодов стельности и лактации.

4. В сравнительном аспекте изучить длительность колостраль-. ного иммунитета к ВЛКРС у телят из неблагополучных,по лейкозу ' стад с помощью методов РИД, и ИФА, а также определить частоту внутриутробной передачи ВЛКРС в группах коров - гематологически больных лейкозом и спонтанно инфицированных ВЛКРС.

5. Провести сравнительные исследования индивидуальными сборных проб пулов сывороток крови и молока с целью выявления антител к антигенам ВЛКРС.

6. Провести комплексные - гематологические и серологические исследования животных в неблагополучных по лейкозу н ВЛКРС инфекции стадах и определить место ИФА в системе противолейкозных оздо-•ровительных мероприятий.

Научная новизна. Впервые на большом, поголовье животных, в сравнительном аспекте изучена чувствительность РИД и ИФА по выявлению вирусспецифических. антител к ВЛКРС в неблагополучных по лейкозу стадах, с учетом возраста и гематологических, показателей.

В эксперименте на овцах-реципиентах воспроизведена ВЛКРС инфекция, патологическим материалом отобранным от донора,- крупного рогатого скота, серопозитивного в ИФА, но негативного в РИД.

В условиях производства изучена длительность колострального иммунитета и частота внутриутробной, передачи ВЛКРС у телят-потомков коров, спонтанно инфицированных ВЛКРС и гематологически боль--

ных лейкозом, по данным методов РИД и ИФА.

■ Определено место и значение ИФА в системе противолейкошшх оздоровительных мероприятий на разных этапах санации стад от лей-роза и ШКРС инфекции.

Практическая ценность работы. Результаты исследований могут быть использованы при проведении оздоровительных мероприятий в племенных и товарЬых хозяйствах, неблагополучных по лейкозу и ВЛКРС инфекции. Данные исследований вошли в "Программу профилактики и борьбы о лейкозами крупного рогатого скота в хозяйствах^ Калужской области на 1991 - 1995 годы", одобренную управлением продовольствия, закупок и государственных агропромышленных служб и ветеринарным отделом (г.Калуга, 1990 г.) .

Результаты исследований нашли практическое применение при проведении оздоровительных мероприятий в неблагополучных по лейкозу и ВЛКРС инфекции хозяйствах. Калужской и Тульской областей за период 1987 - 1390 гг.

Апробация работы. Основные, положения диссертационной работы доложены на конференциях молодых ученых во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (г.Москва, 1990 г.) , а также.на заседании Ученого совета ВИЭВ (1990 г.) и на межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (1992 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы три научные статьи и издано одно методическое указание.

Объем и структура работы.' Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, включает 19 таблиц и 12. рисунков, н состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов,, списка используемой литературы и приложения. Список литературы включает 334 источника, из которых. 241 иностранных авторов.

. собственные исследования.

Материалы и метопу Работа выполнена в 1987 - 1950 гг. в Митральном отделе лейкозов, сравнительной и экспериментальной жкологиж а Калужском отдела (ШЭВ) , а также в хозяйствах Ка-1ужской (СП1 "Ерыолино", Ш имени Цветова, £Щ. "Калужская")в Тульской (колхоз-племзавод ииенл В.И.Легаша, колхоз "Новая казнь" [ ГПЗ РЗыбжно") областей» . ; ■

Подопытные животные. 1. коровы - инфицированные ВЛКРС (1766 голов), гематологически больные лейкозом (?60 голов) и свободные от ВЛКРС (2900 голов); 2. молодняк - новорожденные ткдята до- а ■ после выпойки молозива (155 голов) , а также телята с 2-х. мес. до 2-х летнего возраста (2234 головы); 3. баранчики 10-12 мес» возраста - 20 голов.

Подопытные животные содержались в условиях "лейкозного изолятора" Калужского отдела ВИЭВ, а также в животноводческих помещениях товарных и племенных хозяйств.

Гематологические исследования крупного и мелкого рогатого скота проводили методами общепринятыми в гематологии. Кровь для исследования получали из яремной вены животных и использовали в нативном или стабилизированном антикоагулянтом виде. Подсчет лейкоцитов проводили при помощи электронного счетчика частиц типа ' "Культер-Каунтер" (франция) , в соответствии о наставлением по эксплуатации, а также с помощью счетной камеры с сеткой Горяева, путем подсчета лейкоцитов в 100 больших квадратах. Мазки крови, окрашивали по Романовскому - Гимза и Май - Грюнвальду, Результаты исследований оцэнивали по "лейкозному ключу" с учетом возраста животных.

Секреты молочной железы - молокб, сухостойный секрет и молозиво получали от коров путем выдаивания из четырех четвертей вы-, мени. Молочную сыворотку готовили по методу, предложенному У.Пал-лесен (1986 г.) , путем смешивания 10 мл молока с 50 мкл раствора сычужного фермента телят (1:10000) . Смесь инкубировали 1 час при температуре +37°С, а затем центрифугировали при скорости вращения ротора 2500 - 3000 об/мин. Полученную сыворотку-супернатант непосредственно использовали в серологических реакциях. Концентрацию иммуноглобулинив молока и сыворотки крови проводили методом осаждения иммуноглобулинов насыщенным раствором сульфата аммония»

Постановку реакции иммунодиффузии (РИД) и учет результатов исследования, с целью выявления преципитируицих антител, к <}р51 ВЛКРС в сыворотках крови и секретах маточной железы, проводили согласно наставления, прилагаемого к "Набору для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота", производимого Курской биофабрикой.

Постановку иммуноферментного анализа (ИФА) и учет результат исследования, с целью выявления антител к р24 ВЛКРС в сыворотках крови и секретах молочной железы, проводили согласно наставления,

прилагаемого к экспериментальной партии "Набора для выявления антител к ВЛКРС/В .сыворотках крови методом иммуноферментного анализа", разработанного и изготовленного в центральном отделе лейкозов,. сравнительной и экспериментальной онкологии ЕИЭВ.

Для постановки биопробы использовали баранчиков, которых, заражали нативной кровью донора - крупного рогатого скота в количестве 10 мл, путем внутрийрюшинного введения в паховую область. Мелкий рогатый скот исследовали серологически и гематологически как до- так и после заражения с интервалом в 2 недели в течение 4,5 мео.

Полученные результаты обработали статистическими методами, представленными в учебнике "Биометрия" Г.Ф.Лакин (1990 г.) , а достоверность данных оценивали по критерию Стъюдента.

Результаты исследований.

1. ■ Сравнительная чувствительность методов РИД и ИФА по вн-4: ■ явлению антител к ВЖРС в сыворотках крови, с учетом возраста животных и гематологических показателей.

Исследования проводили в хозяйствах Калужской и Тульской областей. В среднем в 6-и хозяйствах из числа исследованных животных (5370 голов) выявлено вирусоносителей: в РИД 24,0 + 12,5$ (1289 голов) , а в ИФА 32,9 ± 12,3% (1769 голов) . Фактически ИФА на 8,9^ или 480 голов выявил больше вирусоносителей ВЛКРС, чем метод РИД (Таблица 1») .

Дальнейшие исследования по изучению пораженности животных ВЛКРС проводили в возрастном аспекте (Таблица 2.) .

В группа молодняка исследовано больше животных (3072 головы 57,2£) , чем в группе коров (2298 голов 42,8$) .Однако количество инфицированных ВЛКРС коров й 4,5 и 4 раза превысило число таковых в груше молодняка, по данным ИД и ИФА соответственно.

В группе молодняка высокий процент антителоноситей к ВЛКРС отмечен среда телят 1-2 мес. возраста 16,7 и 24,3£, данным РЭД и ИФА, а в группе ксров среди животных 10 летнего и старших возрастов в Ю0£ случаев.

■ Сравнительно большое количество животных инфицированных ВЛКРС отмочено в возрастной группе коров 7 лет - 2С6 и 262 головы, данные РИД и ИФА, а относительно 'малое число - 14 голов срода хи-вотных старше Ю лет.

На Рис. 1 а 2 прсдотавлена возрастная динамика икфицираг л-

Таблица 1.

Результаты сраинлтольных серологических (ГИД и ИФА) и гематологических исследований крупного рогатого скота в неблагополучных по лесхозу и ВЛКРС инфекции стадах.

Название хозяйства Количество исследованных животных Результаты исследований

серология гематология

РИД ИФА Г. 5.л. Г.п.з.л

П | % и 1 % П % П 1 %

(Ж "Крмолино" 629 133 21,1 184 29,2 15 2,4 7 11,1

ОПХ "Калужская" 839 356 42,1 444 52,9 26 зд 9 1,1

ГПЗ им. Цветкова 136 29 21,3 44 32,3 1 0,7 -

ГПЗ "Зыбино" 1620 264 16,3 444 27,4 31 1,9 17 1,0

к/з им. В.И.Ленина 240 156 89,2 169 96,3 35 14,5 30 12,5

к/з "Ковал жизнь" 1906 351 18,4 484 25,2 36 1.9 15 0.8

ВСЕГО : 5370 1289 24.0 1769 32,9 144 3.9 78 2.5

Примечания: Г.Б.Л. - гематологически больные лейкозом яшвотные, г.п.з.л. - подозрительные в заболевании лейкозом.

Таблица 2.

Пораженностт» животных ВЛКРС инфекцией по возрастным группам.

Возрастные Процент Количество Результаты исследований

группы .ТЛБОТНЬ'х возрастной группы в структуре стада исследованных животных гад И 'ЗА

п * % п . *

до 1 мес 5,0 155 17 11,0 22 14,2

с 1 - 2 19,3 592 99 16,7 144 24,3

с 2 - 4 18,9 ' 580 62 10,7 108 18,6

с 4 - 6 18,6 572 42 7,3 78 13,6

с 6 -12 18,4 " 556 41 7,2 61 10,8

с 12 -24 19,8 607 64 •10,5 88 14,5

молодняк 100,0 3072 325 10,6 501 16,3

3,0 лот 19,0 437 94 21,5 127 29,1

4,0 19,3 443 126 28,4 171 38,6

5,0 16,1 371 149 40,2 204 55,0

6,0 17,9 409 181 44,2 257 62,8

7,0 15,0 •• 346 206 5015 262 75,7

8,0 9.7 223 141 63,2 178 79,8

9,0 1,5 .• 35 33 94,0 35 100,0

1.0,0 0,9 ■ 20' 20 100,0 20 100,0

'11,0 ' 0,6 . 14 14 100,0 14 100,0

копог.!; 100.0 2298 964 41.9 1268 55,2

копог,;; 100,0 . ¿¿9«_»Ь4

В С V, У 0 : 100,0_5370 1289 24.0 1769_22^9

30 20 10

0

Рпс. 1.

/о 100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

Д-4-

(. ч

Д

Условные обозначения: - результаты РИД ; ' П ТЗОЗуЛЬТаТЛ 1МЛ .

уТТ »-Л . ж»

0-1 1-2 2-4 4-6 6-12 12-24 изо Зависимость между возрастом молодняка и поракпшостъ ШЛСГС.

Г'1

гП

гЛ

л-

4.1

-I-

-II

1 I ' I

1 1

м

[ 1 ;. ,]

I. :< г з

Г '>

\ > г -I

! I

л..

3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 лет

0

Рис. 2. Зависимость мат.ду возрастом коров и пора-хешюстъго ШЖРС.

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

О

Рпс. 3.

К

м

»5.

Х-Ч.

1 2 3 4 5

Дянгилпка выявления ятфщировшшых- ВЛКРС яввотшах, . 'зативнкх в И'5Л, ро результатам РИД .

Примечания: | 1| - группа молодняка;

' Щщ - группа коров.

6 ;,!сс серопо-

ности животных ВЛКРС. В группе коров, между возрастом животных ж пораженностью ВЛКРС, установлена высокая корреляционная связь (й), по данным РОД НрИД-- 0,6, а ИФА Е^« 0,8 при уровне достоверности р= 0,001. Однако в группе молодняка, между данными признаками связь отсутствует, т.к. коэффициент корреляции равен нулю (Рис. 1).

В общей сложности было выявлено 480 животных (8,955) в возрасте от 1 мес до 9 лет, у которых сыворотки крови оказались се-ропозитивными в ИФА, но негативными в РИД, в том числе молодняка 176 (33,7/0 и коров 304 головы (63,3$) (Таблица 2).

Среди животных данной группы, сравнительно большое количество 127 голов (72,1$) выявлено в следующих возрастных группах молодняка: 1 - 2 (25,6%), 2-4 (26,1%) и 4 - 6 мес. (20,4$) . В группе коров 187 голов (61,5$) преобладают животные 5 (55 голов 18,1$) , 6 (76 голов 25,СЙ) и 7 лет (56 голов 18,45) .

Значительно меньше выявили среди новорожденных телят (5 голов 2,8$) и коров 9 лет (2 головы 0,6$) . В остальных группах молодняка: 6 - 12 и 12 - 24 мес. и коров:3, 4 и 8 лет отмечен умеренный процент инфицировакности животкых.ВЛКРС (11,5 и 13,6%) и(Ю,8; 14,3 и 12,3$) соответственно.

За животными данной группы (480. голов) установили серологический контроль, для определения промежутков времени, через которые данные ИФА совпали с результатами РИД (Рис. 3.) .

Ретроспкктивный анализ серологического контроля показал» что вирусспецифические антитела к ВЛКРС, были выявлены в группе молодняка методом РИД через: 1 мес. - у 35,2$ (62 головы) , 2 мес. -

- 72,7$ (128 голов) г 3 ыес. - 92,0$ (162 головы)-, 4 мес. - 99,4$ (175 голов) и 5, 6 мес. - в 100$ (176 голов) случаев.

В группе коров установили следующие интервалы времени: 1. мес»

- у 48,3$ (147 го-ов) , 2 мес. - 71,7$ (218 голов) , 3 мес - 92,13 (280 голов), а в 4Г 5 и 6 мес. - в 100$ (304 головы) случаев, •

7 положительно реагирующих в ИФА животных, за относительно короткий промежуток времени антитела к ВЛКРС выявили в РИД. в 100$ случаев у коров 9 лет (2 головы 0,6$) через 2 мае, и 3 мес. у новорожденных телят (5 голов 2,8$) .

При раститровке сывороток крови серопозитивных т.<утько в ИФА, без учета данных возраста животных,, титры антител, к ВЛКРС распределились в следующем диаяозоне: 5,3 - 130 (27,1$), 6,3 - 151 (31,4 и 7,3 1о§2 - 199 (41,5?) проб, что соответствует следующему разведению сывороток 1:40, 1:80 , и 1:160. При уровне титра антител в

ИФА свыше 7,3 lo<j2 (1:320) , метод РИД их выявлял.

•Согласно "лейкозного ключа" - 3,9 ± 1,8$ (144 головы) прлз-ншш гематологически больными (l группа) , а 2,5 ± 3,7;? (78 голов) подозрительными в заболевании лейкозом (П группа) .

В 1 группе, методами РИД,и ИФА, выявили равное количество инфицированных ВЖРС животных. - 144 головы (100^) , а во 3-ой --'75,6^ (59 голов) и 89,7,? (70 голов) соотвзтсгвешю.

Установлено, что количество инфицированных ВЛКРС животных, по данным РИД и ИФА, превысило в 8,9 и 12,3 раза число гематологически больных л в 16,5 и 22,7 раза, соответственно таковоо подозрительных в заболевании лейкозом .тавотных.

2. Воспроизведете .ВДКРС.инфекции на овцах-решстиентах.

• Дяя подтверждения наличия ВЛКРС в организме донора •- крупного рогатого скота, сыворотки крови которого оказались оеропозлтэт--ниет в ИФА, но негативными в РИД, а также для определения шйлк-ционности материала,-произвели экспериментальное зарглепко с:зеп-рсщпионтов. Зивотных заражали дативными пробами кро.-зн икф'щиро-ваюшх ВЛКРС коров, в количестве 10 мл путем внутри оршшгного введения в паховую область,

' Всех овец-реципиентов задействованных в эксперименте раздалц-ли па три группы в зависимости от исходного материала донороз:

1 груша - животные, которым инъицяровалз нативние пробы крова от коров-доноров, инфицированных.ВЛКРС серопозитив:-шх по данным ИФА, но негативных по результатам РИД - 10 голов, Да:шую группу разделила ра три подгруппы по титру антител к ВЛКРС: подгруппа А - титр <штател к ВЛКРС в крови 5,3 1од2 - 4 головы; подгруппа Б - титр' антител к ВЛКРС в крови 6,3 - 3 головы; подгруппа В'- титр антител к ВЛКРС в крови 7,3 logg - 3 голоеы:

П группа - животные, которым инъищгроваяи наганные пробы крови коров-доноровг серопозитивных. по данным РИД и USA - 5 голов;

И группа - животные, которым инъицяровали пробы крови от коров-доноров, серонегатявных по результатам РИД и И2А (контрольная .группа) - 5 голов. ' •

■ Овцы-рецепиенты до постановки опыта- были серонегативнымд в отпояанаа ВЛКРС до. данным. РИД и ИФА. Посла заражения животных не— следовали повторно через. 2 недели.

1. 20$. овац-рецгшзонтов из 1'группы, иммунологический отвот организма па введенный материал наступил, чораз 30 суток после за-

ражония по данным ИФА, а в РИД на 60-ый день 7 10$ животных. Более детальный анализ показал, что первоначально антитела к ПЛКРС были выявлены у тех животных, которым инъицировали натив-ные пробы кропи коров-доноров о тигром антител к ВЛКРС 7,3 1о^2 (подгруппа Б) . За прошедший период наблюдения (4,5 мео.) антитела к ВДКРС в оргаянзт овец-реципиентов были выявлены у животных 1 группы в ес$ случаев (9 голов) в том числе в подгруп-иа.с А (3 головы 15%) , Б (3 головы 100%) и В (з головы' 100%; . Исключение составило лишь одно животное из подгруппы А, которое, аа весь период наблюдения осталось интактным на введешшй материал, т.е. серокегативным по данным РИД и КФА. Необходимо отметить , что у трех животных из 1 группы {подгруппа А) антитела к ■ ВЛКРС проявились в более поздние сроки на 90 - 120-ые сутки поело заражения, в отличии от животных из других'подгрупп: В (60 суток) и Б (90 суток) по данным ГИД.

Во П группе у 60^ овец-реципиентов (3 головы_) вирусспевдфщ- • ческие антитела к ВЛКРС выявили на 15 сутки порле заражения по данным ИФА, а в РИД на 30-ые. Причем, антитела к ВЛКРС у животных П группы выявили в 100$ случаев (5 голов) , в ИФА на 30-ые, а е РИД на 60-ке сутки после заражения.

У животных Ш-ей группы, за прошедший период исследования 135 дней в сыворотках крови методами РИД и ИФА не установили присутствие антител к ВЛКРС." - '

Таким образом нами установлено, что титр антител к ВЛКРС является основным серологическим параметром, по которому можно судить об активном или пассивном состоянии вируса в организме инфицированного животного, а также о его инфекционности для гетерогенных животных. В то же время отмечено, что нативные пробы крови с титром антител к 1ЛКРС 7,3 1о^2 п выше (П группа) индуцируют гуморальный иммунный ответ в организме овец-реципиентов в более ран-шю сроки 15 и 30 дней по данным РИД и ИСА, нежели с низким титром антител 6,3 (60 - 90 сутки) и 5,3 1о^2 (90 - 12°) соответственно.

В процессе наблюдения за животными трех групп, характерных дои лейкоза изменений в периферической картине крови не наблюдали. Однако, на 15 и 30 сутки после заражения у большинства животных, видгао в ответ на заражение произошло раздражение лейкопоэза, что приеоло к незначительнрму повышению числа лейкоцитов, в основном зп счет сегментоядерных и папочкоядерных нейтрофилов. При этом по-

казатели крови у животных третьей группы, свободных от ВЛКРС остались без существенных изменений.

3. Изучение взаимосвязи между титрамч антител к а;ЖГ0 В-С^Р--ротках крови и секретах молочной этелсзы у коров, спонт-1^-но инйишгровэлных и гематологически большту ло^котом.

. Всех животных задействованных в данном опыте 45 голов разделили на три группы: .

1'группа - спонтанно инфицированные ВЛКРС коровы, о количеством лейкоцитов и лимфоцитов- в пределах физиологической нормы -15 голов;

П группа - гематологически больные лейкозом кизоткые о ко.и<-чеством лейкоцитов от 20,0 до 100,0 ткс/мкл при уровне лимфоцитов свыше 70$ - 15 голов;

Ш группа - коровы свободные от ВЛКРС - 15. голов.

На Рис. 4 и 5 представлены графические изображения титрот антител к ВЛКРС в.сыворотках, крови и секретах молочной желэзи у коров 1 и П групп. Среднюю арифметическую величину титра елтител к ВЛКРС определяли на основании табличных данных, а числовые значения представили в виде логарийлов с основанием 2 (1од2) •

Анализ результатов исследований показал, что титр вирусело-цифических антител к ВЛКРС в сыворотках крови животных подвержен периодическим колебаниям, что'связано с физиологическим состоят-ем организма. Так, у коров 1 группы уровень антител достиг следующих значений: в РИД 0 - 1 и в ИФА 5,3 - 8,3 1о§2» а во П группе О - 3 и 8,3 -.12,3 1о^2 соответственно.

При параллельном исследовании 195 проб сывороток крови в Р'.!Д и ИФА, отобранных для динамичного наблюдения (12 мое.) установлено, что у коров 1 группы выпадение серопозитивной реакции в Р!Щ оть.в-чено в 10,2$ (го проб) , а в ИФА - 2,й% ("5 проб) случаев. Прячем, изменение положительного результата на отрицательный наблюдали с различной кратностью проявления в РИД у 8 животных от 2-х до 4-х раз: в том числе у 5-и -*2 раза, 2-х - 3 раза, а у 1-го- 4 раза. Данное явление чаще всего наблюдали в периоды перед- и во время отела. Следует отметить, что в сухостойный'и молозившй периода в секретах молочной железы антитела к ВЛКРС выявляли методом РИД у всех яивотных 1 и П групп. Тогда как у большинства коров в лактационный период потодом РИД не выявили антител к ВЛКРС в 1 группе в 119 (В8,1£)и П-ой в 65-пробах (48,15?^. Причем, при параллельном исследовании материала в ИФА антитела к ВЛКРС обняру-щк

с\! сг

о

Отел

° В й

& 7

^ 5

Й 4 и 3

ч 1

ы

Отел Ш 1

■ - \

. ^---х---х- •

Р~ - -о---

. _ -о-

У

О

5

9 10 11 12 мес

Рис. Динамика титров антител к ВЛКРС в сыворотках крови и сек. ретах молочной железы у коров спонтанно инфицированных. .

Отел Отел.

10 11 12 мес

Рис. 5. Динамика титров антител к ВЛКРС в сыворотках крови н-секретах молочной железы у коров гематологически больных, лейкозом. Условные обозначения: 1 - молозивный период; '

П - лактационный период; Ш - сухостойный период.

х-х титр антител к ВЛКРС в сыворотке крови (РИД) ;

х - - х титр антител к ВЛКРС в сыворотке крови (ИФА) ;

о--е титр антител в ВЛКРС в секрете молочной-железы (РИД,

• о — о титр антител к ВЛКРС.в секрете молочной железы (ИФА,

как в сыворотках крови, так и в секретах молочной яелезы у коров 1 и П групп. С целью.определения зависимости маялу титрами антител к ВЛКРО в сыворотках крови и секре'тах молочной лелезы полученные результаты обработали статистически и определили следующие показатели:(а) - коэффициент корреляции и(У) - регрессии.

Для 123 пар офазцоз сывороток крови и молока исследованных • в ИФА (1 группа) при коэффициенте корреляции 0,4 и уровне достоверности р^= 0,001, получена прямая линейная регрессия • 0,34 х^ + 7,0, которая показывает значение титра антител в сыворотке крови при определенном титрз антител в сыворотке молока. Для коров П группы получены следупдие показатели при П2= 135, 0,6 и'р2= 0,001., а У2= 0,38 х2 + 8,7 соответственно. Между титрами антител к ВЛКРС в сыворотках молока ксследо-. ванных, в И5А и таковыми в сыворотках крови (ИЩ) , установили взаимосвязь, которую такяе выразили уравнением просто? линейной регрессии: для коров 1 группы Е^- 0,69; р^= 0,001; 7-| = 0,58х^ + 3,2, а для животных П группа К2= 0172; Р2= 0.001 и У2= 0,64х2 + 6,0.

Полученные данные (У^ и 7.^) показывает, что титр антител к ВШСРС в молоке установленный методом И5А в 10 и 64 раза выше данпого показателя в сыворотке крови установленного методом ГЗД, для животных 1 и Д групп.

Между титраяи антител к ВЛКРС в сыворотке крови и сухостой-пом секрете, а такяо в молозива установлена отрицательная корреляционная связь -0,17 и К2= -0,26 при уровре достоверности 0,05. Зависимость манду данными показателями определяли уравнешем простой линейной регрессии -0,16х^ + 5,8 и 72= -0,22x2 + 9,1. Следует отметить, что титр антител к ВЖРС в предаолозийе и молозиво в 3,9 и 2 раза'вкле одноименного показателя в сыворотке кровгг у коров 1 и П групп соответственно (Рис.4 и 5).

Из представленных результатов исследований следует, что у коров спонтагшо инфицированных л гематологически больных, лейкозом титр антител к ВЛКРС, в сыворотках крови и секретах молочной лелезы,'не является постоянной величиной, а подвертел периодическим колебаниям в зависимости от физиологического состояния организма.■ Прячем, в лактационный период связь мезду данными величина1®! пря-мопропорциояальная, т.к. показатель коэффициента корреляции боль-ив нуля (Е^= 0,4 и В£= 0,6) , а в сухостойный и молозивный периоды наоборот, связь обратнопропорциональная, т.к. коэффициент корреляции меньше пуля -0,17 и Е2=» -0,2б) .

4. Сравнительная характеристика чувствительности РИД и ИФА по выявлению антител к ВЛКРС в индивидуальных и сборные пробах пулах сывороток крови и молока. >

В неблагополучном по лейкозу молочном стаде, при уровне ин-фишрованности животных ВЛКРС в РИД 42,8 + 9,9$, а в ИФА 55,7 $ + 10,1$ огобралй 100 пар проб ¿крови и молока. В лабораторных условиях .отделили сыврротку крови и молока, а затем каждую пробу разделили на 2 части: одну оставили в цельном виде - проба "1Г, а.другую 10-ти кратно сконцентрировали - проба "К" (по методу У.Паллесен) . Приготовленный таким способом материал исследова- • ли в серологических реакциях РИД и ИФА.

Результаты исследований по изучению чувствительности РИД и ИФА расположили в убывающей последовательности, по наибольшему количеству выявленных серопозитявных проб:

1. ИФА с сывороткой крови - проба "К" - 59, "Ц" - 56;

2. ИФА с сывороткой молока - проба "К" - 54, "Ци - '44;

3. РИД с сывороткой крови - проба "К" - 54, "Ц" - 43;.

4. РИД с сывороткой молока - проба "К" - 15, "Ц" - 8$.

Таким образом установлено, что наибольшее количество серо-"

позитивных проб выявили методом ИФА при исследовании сывороток крови - 59 ("К") и 56 ("Ц") , а наименьшее - 15 (."К") и 8 ("Ц") методом РИД при исследовании сывороток Молока. Необходимо'отметить,' что метод РИД при исследовании сывороток крови выявил тй,-кое же количество серопозитивных проб, что и метод ИФА, только при исследовании .сывороток молока - 54 ("К") и 43 ("Ц") РИД, ; 54 ("К") у 44 ("Ц")в ИФА соответственно.

Сборные пробы сывороток крови и молока готовили путем механического смешивания в арифметической прогрессии одной серопо^и-тивной и нескольких серонегативных проб при коэффициенте разведения 1:5. Таким способом приготовили 11 образцов, в которых процент серопозитивной пробы находился в пределах от 2,0 до 50,0$ (Таблица 3 и'4) .

При исследовании в ИФА 11 пулов молока (проба "Д") антитела.к ВЛКРС выявили в образце 10, состоящем из 5 индивидуальных молочных сывороток, т.е. при условной инфицированности молочного стада - 20,0$. Применив метод "концентрации иммуноглобулинов" ("КИ") , нам удалось обнаружить антитела в пуле № 8 (проба "К"), состоящем из 15 проб. Фактически метод КИ повысил чувствительность ИФА в 3 раза, что позволило распознать антитела к ВЛКРС в проба

Таблица 3.

Результаты сравнительных исследований пулов молока методами

& Количество Количество Процент Результаты исследоЕ&чкй

п/п серопозитив-ных проб молока в пуле серонегатив-ных проб молока в пуле серопозитив- ННХ ГГП^Л '/О— РИД 7. 0 л

¿ША ¿1 МЧ^ КУ лока в пуле ..ЦП "К" "Ц" 1 "К"

1 1 49 . 2,0 - - -

2 I 44 2,2 - - -

3 • 1 39 2,5 - - -

4 1 34 2,8 - - - -

5 1 29' 3,3 - - - -

6 1 24 4,0 - - - -

7 1 19 5,0 - - -

8 1 14 6,7 - - - +

9 1 * 9 •10,0 - - ♦

10 1 ' 4 ' 20,0 - - + +

11 1 1 50,0 - + + +

Таблица 4

Результаты сравнительных исследований пулов сывороток кровл

методами РИД л ИФА по выявлении вярусспецифических антител.

Я Количество Количество Процент Результаты исследований

п/п • серопозитив-ных проб сывороток крови, в пуле серонегатив-кых проб сывороток крови в пуле серолозитив-ных проб сывороток крови в пуле РИД и 5 А

"Цл "К" "Ц" "К"

1 1 49 2,0 . - - -

2 1 44 2,2. - - - -

3 1 '39 2,5 - - - -

4 1 • - 34 2,8 - - - -

5 1 29 3,3 - +

6 1 24 4,0 - - - +

7 1 19 5,0 - - -

8 1 14 6,7 - - + +

9 1 9 10,0 - - + +

10 1 4 20,0 - + + +

11 1 1 • 50.0 + + + +

Примечания: "Ц" - сборная проба в цельном виде;

"К" - сборная проба 10-ти кратно сконцентрированная

Я 8 (инфицироэанность аула 6,7^) .

Метод Р/Д не выявил ш одного серопозитивного образца из числа (И проб "Ц") исследованных пулов. Однако метод КИ позво-; лил РИД обнаружить антитела к ВЛКРС ■ в пуле Л 11 (проба "К") , состоящем из 2-х проб (50,0$ инфицированности) . •

Аналогичные Исследования проводили с пулами сывороток крови (Таблица 4) . При этом, методом ИФА антитела к ВЛКРС выявили в пуле К 8 (проба "Ц") , состоящем из 15 проб. Метод КИ повысил чувствительность ИФА в 2 раза, что способствовало обнаружению сэропозитивного образца в пуле ,'Ь 5 (проба "К"), состоящем из 30 проб (инфицировенность пула 3,3^) .

При исследовании в РИД, антитела к ВЛКРС выявили Б пулах сывороток крови "Ц" и "К", состоящих из 2-х и 5-и образцов при ин-фицкрсванностк 50,0 и .20,0$ соответственно (Таблшда 4) .

5. Изучение длительности колострального иммунитета к ВЛКРС у телят в первый год жизни по результатам РИД и ИФА.

Всех телят задействованных в эксперименте (45 голов) по результатам серодиагностики -до- и после приема молозива разбили на следующие группы:

1 группа - телята-йотоыки коров, гематологически больных лейкозом, у которых как до-, так и после приема молозива в крови присутствовали антитела к ВЛКРС, по данным РИД и ИФА - 3 головы;

П группа - телята-потомки коров, спонтанно инфицированных ВЛКРС (13 голов) и гематологически больных лейкозом (12 голов)., • у которых в' крови отсутствовали антитела к ВЛКРС до приама молозива, по данным РИД и ИФА. После выпойки молозива в крови установили персистенцшо материнских-колостралышх антител, которые элиминировали из организма телят в разные периоды онтогенеза - 25 голов;

Ш группа - телята-потомки коров, спонтанно инфицированных ВЛКРС, у которых в крови методом РИД не выявили антитела к ВЛКРС как до-, так и после -приема молозива. Однако, при исследовании в ИФА сывороток крови этих же телят', отобранных после приема молозива, установили присутствие антител к ВЛКРС, которые элиминировали из организма в рашше сроки - 2 головы;

1У группа - телята-потомки коров, свободных от ВЛКРС, у которых в крови как до-, так к после приема молозива.отсутствовали антителу к ВЛКРС, по данным И1Д и ИФА - 15 голов.

За телятами П и Ш груш (27 голов) установили серологический . контроль, с целью определения периодов элиминации колостралышх антител к ВЛКРС (рис. 6.).

У потомков коров, спонтанно инфицированных BJEKPC, колостраль-ные антитела выявляли в хеченне 3-5 мес., а у телят-потомков коров, гематологически больных лейкозом до 7 - 9 мес. возраста. Индивидуальные и групповые исследования животных показали, что у потомков коров, спонтанно инфицированных ВЛКРС, колостралыше антитела по данным РИД элиминируют к 1 - 3 мес., а по результатам ИФА к 3 - 5.мес. возрасту. В то время как,у телят, которые происходят от коров, гематологически больных лейкозом (П группа) , материнские антитела циркулировали до 4 - 7 мес. и 5 - 9 мес. возраста по дан- ■ ным РИД и ИФА соответственно.

Как показали исследования, колостралыше антитела к ВЛКРС з организме телят-потомков коров I и П груш пр данным ИФА циркулируют на 2 - 3 мес. дольше, чем по результатам РИД.

5.1. Частота внутриутробной передачи ВЛКРС в неблагополучных по лейкозу и ВЛКРС инфекции стадах..

Результаты серологических исследований по изучению частоты внутриутробной передачи ВЛКРС среди новорожденных телят представлены в. таблице 5. •

Кал показачи исследования, в целом по стаду (140 голов) внутриутробную передачу ВЛКРС наблвдали в 10,7 ± 1,2% (15 голов) и 13,6 ± 1,6% (19 голов) случаев по данным РИД и ИФА, т.е. метод ИФА на 2,9% (4 головы) выявил больше серопозитивных телят, чем метод РИД. Более детальный анализ показал, что совладение серопозитивных результатов РИД и ИФА в 10С% случаев (12 голов) , отмечено среди телят-потомков коров, гематологически больных лейкозом, а титр варусспецифических антител в этих, пробах составил в РИД - О, а в ИФА 8,0 lo<j2.

При исследовании телят-потомков коров, спонтанно инфицированных ВЛКРС, метод РИД выявил 3 (2,12 ), а ИФА 7 животных (5$), внутриутробно инфицированных ВЛКРС. Отмечено, что серопозитивные в РИД и ИФА 3 пробы имели титр антител в РИД - 0, а в ИФА - 8,0 log2. В четырех серопозитивных только в ИФА сыворотках крови титр антител достиг следугщего уровня 6,0 (2) и 7,0 log2 (2 пробы) . Серологический контроль установленный за ИФА позитивными, но РИД нега- •. тивными телятами, позволил определить следуюте промежутки времени

2 (2)и 3 мес. (2 головы) , через которые эти животные стали также позитивными в ИД.

Таким образом установлено, что в'группе коров, спонтанно инфицированных ЗЛКРС (50 голов) , методом РИД выявили 3 (5$) , а ИФА 7 (11,7$)телят внутриутробно инфицированных ВЛКРС, т.е. в данной группе животных метод ИФА на 6,7$ или 4 головы выявил больше инфицированных особей, чем метод РИД. Эти данные свидетельствуют о том, что среди потомков коров, гематологически больных лейкозом, по данным РИД и ИФА в 2,4 и 1,3 раза чаще рождаются телята внутриутробно инфицированные ВЛКРС, нежели среда потомков коров, спонтанно инфицированных ВЛКРС (Таблица 5.) .

5.2. Методы выращивания молодняка крупного рогатого скота свободного от ВЛКРС в стадах неблагополучных по лейкозу п • ВЛКРС инЗтекшга. В четырех неблагополучных по лейкозу и ВЛКРС инфекции хозяй-. ствах при уровне инфицированности животных ВЛКРС 41,0 - 89,1 л 48,9 - 96,2$ по данным РИД и ИФА, было организовано специализированное выращивание молодняка с 2-х до 24 мес. возраста. В этих группах молодняка нами на протяжении 12 мес. проводились ежеквартальные серологические исследования. _

Ретроспективный анализ динамичных исследований 402 голов телят показал, что если в 2,0 - 2,5 мес. возрасте, катодами РИД ц ИФА выявили 11,7 (47 голов) и 13,7$ (55 голов) антителоноситслей, то в последующем в 5,0 - 5,5 мес. возрасте их количество снизилось до 3,8$ (15 голов) и 5,4$ (21 голова) . Из этого следует, что через 3 мес. у 8 (32 головы) и 8,4$ (34 головы) животных, по данным РИД и" ИФА антитела к ВЛКРС элиминировали из организма телят, в результате чего и произошло уменьшение количества животных-антктелоносителей.

Однако при 2-х последующих исследованиях этой же группы животных, количество телят антителоносителей увеличилось в 1,6 и 1,7 раза, по данным РИД и ИФА, ч;то отражает прогрессирующий рост ВЛКРС инфекции при совместном содержании телят инфицированных и свобод- . них от ВЛКРС. •

В связи с этим для.предотвращения распространения лейкоза.а, ВЛКРС инфекции при выращивании молодняка, нами были использованы , два принципиально разных способа, которые основывались на применение серологических методов РИД и ИФА,

Условные обозначения: х -- - х результаты ИД (1 группа);

х--х результаты ЯС'А (1 группа 1;

о - ■* о результаты РНЕ. (П групп?.); --« результаты К ЗА (И груша).

О 1 2 3 4 5 5 7 8 9 10 11 12 мое

' возраст .животных

Рис. 6. Элиминация колостралышх антител к ЗЛКРС у телят-потомков , коров, спонтанно шЕ^пциррванннх ВЖРС (1 группа) и гематологически больных лейкозом (П группа) .

Таблица 5.

. Частота внутриутробной передачи ВЛЕСРС з стадах крупного рогатого

Название Группа Метод Ро зультг ¡ты исследовшкй телят

. хозяйства коров-матерей исследования И гол ! к I гол П 'Г 0 |5,0 Гб,0 | 7,01871

ГПЗ "3" . - .1 РИД 25 1 4,0 1 . - -

1 Е5А 25 3 12,0 - 1 1 1

П РЩ 25 3 12,0 3 - . - -

Н ИФА 25 3 12,0 - - 3

(ИХ "К" 1. 1 РВД ' ИОА 15 15

п РЯД 15 3 20,0 3 - -

' п 1КА " 15 ■3 20,0 - - -. 3

к/з "Л" 1 Ш 20 2 10,0 о _ -

1 КЗА 20 4 20,0 - 1 1 2

п гад 40 6 15,0 6 - — *

• п ИФА 40 6 15,0 - - 6

ВСЕГО РИД 140 15 10,7 15 - „ _

И <5 А 140 19 13,6 - 2 2 15

1. Серологическому исследованию подвергали всех, новорожденных телят-потомков спонтанно инфицированных ВЛКРС и гематологически больных лейкозом коров, с целью исключения из стада особей внутриутробно инфицированных ВЛКРС. Серонегативных. телят, по данным РИД и ИФА,- выпаивали молозивом и молоком от коров-кормилиц, свободных. от ВЛКРС. В течение 6 мес. с интервалом в 2 мес.-, животных, телят подвергали серологическому контролю.

Результаты первичных исследований телят по изучению частоты внутриутробной передачи ВЛКРС, методами РИД и ИФА представлены в таблице 5. Нами установлено, что телят-вирусоносителей полностью удалось исключить из оздоравливаемого поголовья, по данным ИФА, посла второго исследования в 2-х мес. возрасте, т.к. по результатам трех последующих исследований прекратилось выделение животных-. ВЛКРС-носителей. Результаты ИФА нашли свое подтверждение в РИД спустя 4 мес. при достижении телятами 6 мес. возраста. *

Данный метод оздоровления хорошо зарекомендовал себя в 2-х хозяйствах, специализирующихся по разведению высокопродуктивных племенных животных черно-пестрой породы (ГПЗ "Зыбино" и колхоз-племза-вод имени В.И.Ленина) . Этот способ нацелен на ускоренную санацию стада молодняка'от ВЛКРС инфекция независимо от первоначального уровня.пораженности маточного погололья ВЛКРС.

• П. Другой способ применяли в стадах,крупного рогатого скота с высоким уровнем пораженности животных ВЛКРС (свыше 4055) , где новорожденных телят, выпаивали молозивом К молоком спонтанно инфици-• рованных ВЛКРС и гематологически больных лейкозом коров-матерей. Первое разделение молодняка провели по.сле поголовного серологического исследования животных, в 3-х мес. возрасте. По результатам исследований поголовье молодняка разделили на три группы:

1 группа - телята свободные от вирусспецифических и колостраль-ных антител.к ВЛКРС, по результатам РДД и ИФА - 79,6$;

П группа - телята свободные от антител к ВЛКРС, цо данным РИД, но серопозитивные по результатам ИФА - 3,0$;

Ш группа -*■ телята с колостральными и вирусспецифическими антителами к ВЛКРС, серопозитивные в РИД и ИФА - 17,45?.

За животными трех групп установили серологический контроль в . течение 12 мес. с интервалом 3 мес. Как показали исследования, в 1 группе прекратилось выделение животных-антителоносителей после . третьего исследования в 9 мвс. возрасте, а по результата;.! РИД в 15 мес. возрасте. Посте второго исследования животных П группы в б мес.

возрасте теллт повторно разделила. Серонегативпнх особей по данным ' ГИД и ИФА перевели-в 1 группу, а позитивно реагирующих хоты бы по одному из используемых методов в третью группу.

Таким образом к 9' мес. возрасту телят, на основе результатов РИД и ИФА, спустя-6 мес. после начала оздоровительных мероприятий было сформировано поголовье молодняка свободное от ВЛКРС инфекции. Через 6 мес. результаты ИФА были подтверждены данными РИД.'

Второй способ успешно использовали в молочно-товарных хозяйствах с высоким уровнем поражеяности животных ВЛКРС в маточном поголовье. При этом к 12 мес. возрасту было сформировано ремонтное поголовье молодняка свободное от ВЛКРС инфекции (ШХ "Калужская" и колхоз "Новая жизнь") . '

6. Применение ИФА в системе оздоровительных мероприятий при'лейкозе крупного рогатого скота "и ВЛКРС инфекиик.

Результаты сравнительных исследований- методов РИД и ИФА в системе оздоровительных мероприятий представлены на примере одного хозяйства неблагополучного по лейкозу и ВЛКРС инфекции.

В колхозе "Новая жизнь" Тульской области противолейкозные оздоровительные мероприятия проводятся с 1988 г. сотрудниками Калужского отдела ШЗВ старшим научным сотрудником И.Д.Колчиным, стар. кид лаборантом Е.А.Куренковой- под руководством профессора Г.А.Си-моняна соЕместнр с зооветеринарными специалистами хозяйства.

Противолейкозные мероприятия в хозяйстве начали проводить с выяснения эпизоотической ситуации по лейкозу и ретровирусной инфек-ЮТ путем проведения комплексных клинико-гематологических и серологических Сеид и ЙЗА) исследований. Важное значение имело установление взаимосвязи между заболеванием лейкозом и вирусной инфекцией, уточнения горизонтальной и вертикальной передачи ВЛКРС.

Комплексные исследования всего поголовья показали неодинаковую степень пораженностп животных на отдельных скотных дворах, а также коров и молодняка. Из 1906 исследованных животных выявили 36 С1,8$) больных, 15 (0,7$) подозрительных по заболеванию лейкозом и 351 (18,42) и 484 головы (25,2*) инфицированных ВЛКРС, по данным РИД в ИФА. Среди 1172 коров положительно реагировали по РИД 288 (24,5$), а в ИФА .349 голов (29,8$) ; изменения в крови, характерные для больных и подозрительных по заболеванию лейкозом 29 (2,4$ )*и 10 (0,8$) соответственно» Как видно, количество животных-антителоносителей к ор51 в 10 раз (РИД) , а к р24 ВЛКРС (ИФА) в 12 раз превысило -число

оолышх по крови. У гематологически положительных и подозрительных на лейкоз животных установлено в 100? случаев наличие Вирус-специфических антител в крови, по данным РИД и ИЗД. Степень по-ражешюсти молодняка ВЛКРС была значительно меньше. Из 734 голов молодняка 63 (8,6?3н 135 (18,4?) по данным РИД-я ИФА, были признаны инфицированными ВЛКРС 7 (0,9?) - больные к 5 (0,6?)- подозрительные по заболеванию лейкозом.

Оздоровление стада с умеренным (до 30?) поражением ВЛКРС при наличии нескольких изолированных ферм проводили в *еченне 1,5 — -2,0 лет, путем разделения животных на две обособленные группы (инфицированную и свободную от ВЛКРС ш лейкоза) .

После комплексных диагностических исследований положительно реагирунцих по, РИД (288 коров и 63 телшЛ и ИФА (349 коров и 135 телок) животных, среди которых 51 (14,5$) имели повышенные показатели крови, изолировали на неблагополучную ферму * 2 (молочного комплекса) . Остальное поголовье, свободное от лейкоза и ВЛКРС инфекции, сконцентрировали в трех коровниках.

Через полгода после разделения стада, из числа исследованных животных 2371 головы вновь выявили 5,5? (130) и 6,4$ (152. головы) инфицированных по данным РИД и ИФА, а больных, и подозрительных в заболевании лейкозом по 0,2? (5 голов) . Необходимо отметить, что в основном это животные, которые находились в инкубационной стадии развития заболевания,' не выявленные при первом исследовании и успевшие- заразить других. Число вновь выявленных коров и молодняка, инфицированных ВЛКРС, уменьшилось более чем в 3 и 4 раза, по данным РИД и ИФА, а с лимфоцитозом в крови практически сведено к нулю. Более существенные результаты получены через год после разделения стада. Полностью прекратилось выделение больных и подозрительных в заболевании лейкозом животных, а количество антителоно-сителей уменьшилось в 3 и 3,3 раза до отметки 1,9? (33) в РИД ж 1,9? (37 голов) в ИФА соответственно. •

При третьем исследовании, проведенном через 1,5 года, установили, что число положительно реагирующих животных значительно снизилось в РИД до 0,6?, а в ИФА 1,2?. К осени 1989 г. количество еи-тителоносителей по данным РИД уменьшилось до крайне малого значения 0,3?, а в ИФА до 0,6?. . •

Весной 1930 года, по данным РИД, прекратилось выделение вирусоносителей, в то время как, метод ИФА выявил 0,2^ положительно реагирующих животных. / .

Осенью этого же года полностью прекратилось выделение инфицированных ВЛКРС животных, как по данным РИД, так и ИФА.

О правильном выборе решения в отношении метода ИФА, в качестве альтернативного теста в системе противолейкозных оздоровительных мероприятий можно о уверенностью судить по результатам последующи исследований, которые показали, что все животные оздоравли-ваемого стада были свободны от ВЛКРС, т.е. серонегативнима- по данным РИД и ИФА. •

Следовательно метод ИФА на заключительном этапе оздоровительных мероприятий сыграл ключевую роль ло выявлению последних животных вирусоносителей, которые по результатам РИД оказались серонегя-тивнымя. Таким образом метод ИФА позволил на 6 — 12 мес. раньше выявить животных инфицированных ВЛКРС ж тем самым закрепить полное искоренение ретровирусной инфекции в оздоравливаемом-стаде.

ВЫВОДЫ

1. Метод ИФА на 1 - 5 мес. раньше ж на 8,9% больше выявляет животных, спонтанно инфицированных ВЛКРС, чем метод РИД.

2, В неблагополучных по лейкозу стадах, количество животных инфицированных ВЛКРС, по данным РИД и ИФА, в 10 и 13 раз превышает число таковых, гематологически больных лейкозом.

3'. Биопробой'на овцах-реципиентах в 90% случаев воспроизведена ВЛКРС инфекция патологическим материалом, отобранным от крупного рогатого скота серопознтивного в ИФА, но негативного в РИД. В эксперименте на овцах, вирусспецифические антитела к ВЛКРС методом ИФА выявлены на 45 - 60 дней раньше-, чем по данным РИД.

4. У коров, спонтанно инфицированных ВЛКРС и гематологически больных лейкозом", титр антител к ВЛКРС подвержен, периодическим колебаниям, как в сыворотках крови, так я в секретах молочной железы, что связано с физиологическим состоянием организма. Динамика исследований показала, что между титрами антител к ВЛКРС в сыворотках крови и секретах молочной железы установлена взаимосвязь, которая в лактационный период прямопропорциональная, а в сухостойный и молозивный - обратнопропорционалъная.

5. Метод ИФА выявляет антитела к ВЛКРС в сборных пробах сывороток крови и молока, состоящих из 15 л 5 образцов, при инфи-цированности пула 6,7 и 20,0% соответственно.

6. Метод "концентрации иммуноглобулинов" повышает чувствительность ИФА в 2 и 3 раза, что позволяет выявлять антитела к ВЛКРС в пулах" сывороток крови и молока состоящих из 30 (3,3^) я

15 (6,?£) образцов.

7. По данным ИФА колостральные-материнские антитела к ВЛКРС на 2 - 3 мео. дольше циркулируют в организме телят-потомков коров, спонтанно инфицированных ВЛКРС и гематологически больных лейкозом,

8. В группе коров, гематологически больных лейкозом, по данным РИД и ИФА в 2,4 и 1,3 раза чаще рождаются телята внутриутробно инфицированные ВЛКРС, чем среди потомков коров, спонтанно «н-фищгрованных ВЛКРС.

9. При одинаковой частоте диагностических исследований, метод ИФА на 6 - 12 мес. раньае, чем метод РИД, позволяет оздоровить стадо крупного рогатого скота от ВЛКРС инфекции.

' 10. Метод ИФА эффективен в качестве контрольного теста для определения "чистоты" диагностических исследований проводимых методом РИД.

•ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДМЕНИЯ

1. Результаты исследований использованы при-разработке "Программы профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в хозяйствах Калужской области на 1991 - 1935 годы", г.Калуга, 1990 г.

2. Результаты сравнительных серологических .РИД и ИФА и гематологических исследований были использованы при проведении оздоровительных противолейкозных мероприятий в ряде хозяйств Калужской и Тульской областей.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Р.Ф.Галеев, В.Г.Арутюнян. Технология культивирования клеток почки эмбриона овцы хронически инфицированных ВЛКРС для получения антигена с целью постановки реакции иммунодиффузии.//Информационный листок № 260 - 88, Калужской ЦНТИ, 1988 - 3 с.

2. П.Д.Колчан, В.Г.Арутюнян. Сравнительная эффективность методов РИД и ИФА при определении антител к ВЛКРС.//Теоретические

и практические вопросы ветеринарии. Тарту, 1990 г., С.112 - 114.

3. В.Г.Арутюнян. Присутствие антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) у телят в первые месяцы жизни.//Трудя ВИЭВ, т.70, Москва, 1990, С.39 - 43. (в печати) . ' .