Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Вопросы эпизоотологии, патогенеза и профилактика лейкоза крупного рогатого скота в Республике Беларусь

%

АКАДЕМИЯ АГРАРНЫХ НАУК РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ БЕЛОРУССКИЙ НАУЧНО ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ИМ. С. Е ЕЫШЕЛЕССКОГО

Б ОЛ

и , На правах рукописи

ЧЕРНЯК Владимир Васильевич

УДК 619: 616-006. 446: 578. 828.11: 636. 22/29

ВОПРОСЫ ЭПИЗООТОЛОГИИ, ПАТОГЕНЕЗА И ПРОФИЛАКТИКА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В РЕСПУБЛИКЕ БЕЛАРУСЬ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, миколэгия и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученоп степени кандидата ветеринарных наук

Минск, 1994

Работа выполнена на кафедре ветеринарноной микробиологии : вирусологии Витебской государственной академии ветеринарной медицины и лаборатории лейкозов Белорусского научно-исследовательской института экспериментальной ветеринарии им. С. Н. Вышелесского

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессо]

Смирнова Н. И. ; доктор ветеринарных наук, профессор, член-кор

респондент ААН РБ Лемеш В. М.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук

Шашенько А. С.; кандидат ветеринарных наук Зелютков Ю. Г.

Ведущее предприятие - Гродненский сельскохозяйственный

институт

Защита диссертации состоится " "/У " J>il¿$/V>_I99jr. i

/Vе часов на заседании специализированного совета Д 020.47.01 i Белорусском научно-исследовательском институте экспериментально( ветеринарии им. С. Н. Вышелесского (223020, Минская обл. , Мински( р-н, д. Кунцевщина, ул. С. Н. Вышелесского - 1, БелНШЭВ)

О диссертацией можно ознакомится в библиотеке Белорусскогс научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарш им. С. Н. Вышелесского

Автореферат разослан " У " 1994г.

Учений секретарь специализированного совета

доктор доормнзриих наук, прс-'-ссор.. Л-пшик Б. Я

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема лейкоза у человека 1 животных существует, с прошлого столетия. Лейкоз у человека впер-зые описан в 1845 году R. Virchow, а первые случаи лейкоза у круп-юго рогатого скота подробно описал в 1876 году О. S i edairgrotzky цит. по ЕМ.Лемеш с соавт., 1987). В дальнейшем многие поколения гченых стремились открыть первопричину этой болезни. Изучение эти-)л0гии, усовершенствование методов диагностики, изыскание средств i путей профилактики, разработка и внедрение современных систем 5орьбы при лейкозе, крупного рогатого скота являются наиболее важными проблемами, стоящими перед, ветеринарной наукой и практикой во ;сех странах мира, в т.ч. и Республике Беларусь.

В настоящее время установлено, что осноеным этиологическим актором лейкоза.крупного рогатого скота является онковирус типа О Р. а! кукайн с соавт.,. 1974; 1982; М. К Парфанович с соавт., 1979; l Ф. Валихов с соавт., 1980; J. М. Miller et. al. , 1969; 1976; 1980; 982; M.J. Van der .Maaten et al. , 1974; A. A. Ressang et al., 1978; i. Lieberman et al., 1979., M. Mammerickx et al., 1986). Изучена то структура, "■• химические, биологические, иммунологические 'войства, найден метод .культивирования в лабораторных и промышлен-¡ых условиях (Р. А. Кукайн с соавт., .1974; 1982; J.M. Miller et al. , 969; 1974; 1980).

Однако до того, как была однозначно установлена этиологи-¡еская роль ВЖРС при лейкозе, в организме больных лейкозом яивот-:ых выявляли присутствие различной патогенной и не патогенной мик-юфлоры (.R А. Бархударян, 1973; R М. Азизов, 1974; Ф. Б. Фалкина с оат., 1982).

На необходимость глубокого исследования взаимоотношений онко-ирусов о другими вирусами и бактериями указывают Г. Г. Миллер 1980), ЕЫАпатенко с соавт. (1988), D.H.Roberts et al.(l988).

. Обнаружение антител у инфицированных ВЛКРС животных t Р. А. Ку-айн с соавт., 1976; 1982;. В. М. Лемеш с соавт., 1985; 1987) и пособность колостральнор передачи их от матери потомству t, R Цуцу-злский с соавт., 1986) дает основание для изучения возможности епользования колостральных антител в профилактике лейкоза.

Цельи задачи исследований. Цель нашей аботы - изуч1ггь влияние ассоциации вируса лейкоза и бактерий на ечение онковирусной инфекции и изыскать средства профилактики

лейкоза.

В сеязн с этим бьши поставлены следующее задачи:

1. Определить степень распространения ВЛКРС е стадах общест венного и личного скота на территории Республики Беларусь.

2. Изучить микробную обсемененность животных, больных лейко зом, провести идентификацию и дать характеристику выделенных штаы мов бактерий.

3. Определить наличие ассоциации ЕЛКРС с микроорганизмами выделенными от больного лейкозом крупного рогатого скота.

4. Изучить влияние бактерий, ассоциированных с ВЛКРС, на те чение экспериментальной онковирусной инфекции у животных. ■

5. Изучить возможность использования специфического .молозйе ного иммуноглобулина для пассивной иммунизации телят против ВЛКРС

Научная новизна. Впервые установлена возможное! ассоциации ВЛКРС и бактерий, изучено'течение экспериментальной ок ковирусной инфекции у кроликов и ягнят при обработке их ассоциащ ей ВЛКРС и бактерий, разработан метод■иммунопрофилактики лейкоза новорожденных телят путем использования специфического молозивног иммуноглобулина.

Практическая .ценность--работы. Прага ческая ценность выполненной работы заключается в изучении эпизос тологической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота на терр* тории Республики Беларусь; в усовершенствовании метода получен! антигенов ЕЛКРС и бактерий, ассоциированных с этим- вирусом, ДJ иммунологической диагностики при лейкозе (РИД, РА, РИГА) и испол! зовании последней в изучении ассоциации ВЛКРС и бактерий; в разрг ботке способа получения специфического молозивного иммуноглобулш и использования его в широкой практике для профилактики лейкоза телят.

Внедрение; Данные НИР (совершенствование иммунодиш ностики при лейкозе крупного рогатого скота) одобрены президиуме Витебского областного правления НТО сельского хозяйства для■ вне; рения в ветеринарную практику 20.02.86 т., протокол N 2. Подгото] лено три рационализаторских предложения, издан один информационш листок. По итогам НИР (вопросы эпизоотологии," патогенеза и проф! лактика лейкоза крупного рогатого скота в Республике- Беларусь) и< дано два инфирмационных листка.. Разработан специфический молози] ньз'1 иммуноглобулин для. профилактики лейкоза у новорожденных теля1: (Рассмотрен и одобрен НТО Госагропрома БССР. 18.12. 89 г.., проток;

N 3). Материалы НИР использованы в разработке "Инструкции по борьбе с лейкозом крупного рсгатого скота в Республике Беларусь" (Утверждена ГУВ Минсельхозпрода Республики Беларусь 6.11.91 г.; и "Методических .указаний по диагностике лейкоза крупного рогатого скота в Республике Беларусь" (Утверждены ГУВ Минсельхозпрода Республики Беларусь 22.0?. 93 г. ;.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференциях: Витебского ветеринарного института (, 1983; 1984; 19S5J; "Научно-исследовательская работа Еузов - народному хозяйству" i Витебск, 1985); "Иммунология и иммунотерапия' лейкозов человека и животных" (.Ташкент, 19843; "Проблемы научного обеспечения животноводства Молдавии" (.Кишинев, 1990); "Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка сельскохозяйственных жиеотных" (.Минск, 1990).

П у б л и к а ц и и. Основные положения диссертации опубликованы в десяти научных статьях.

Обьем и структура д и с с е р т а ц .и и. Материалы диссертации изложены-на 23? страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, заключение, еыеоды, практические предложения, список литературы и приложение. Работа иллюстрирована S5 таблицами и 39 рисункаш. Описок литературы включает 130 отечественных и 94 зарубежных публикаций.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материал и методы

Исследуемый м а т е р и а л. В работе использовали: бактериальные культуры 25 видов из музея кафедры ветеринарной микробиологии и вирусологии Витебского ветеринарного института и полученные из Всесоюзной коллекции микроорганизмов института , физиологии и биохимии микроорганизмов АН СССР, а также бактерии,' выделенные от больных лейкозом коров; патологический материал от ягнят, инфицированных ВЛКРС; исследуемые сыворотки крови (.20855 проб) от крупного рогатого скота из неблагополучных по лейкозу хозяйств Республики Беларусь; диагностические сыворотки против вирусов и бактерий различных видов,, экспериментальные сыворотки к gp-69 и р-24 антигенам ЁЛКРС и Вас. subtil is, полученные путем гипериммунизации кроликов; специфические сыворотки и вирусные антигены 'gp-69 и р-24, (производства: института микробиологии им. Кирхенш-тейна АН Латв. CCF; ЕИЗБ; ]Курской и.Покровской биофабрик; ЕелКИИЭВ

- б -

им. 0. ЕВышелесского); животных - кролики (76) в возрасте 8-10 месяцев, белые мыши (228), ягнята в возрасте 1,5-2 месяца (16), телята в возрасте от рождения до года 1897).

Методы. При бактериологическом исследовании микроорга-. низмы выделяли из свежего материала, взятого после убоя коров, больных лейкозом. Диагноз подтвержден клинико-гематологическим и патоморфологическим методами. Микробиологические исследования проводили согласно общепринятым методам (. Е И. Смирнова с соавт., 1979).

Вирусологические исследования проводили с использованием культуры клеток ДМ и ПЭК на 5-6 пассаж (к этому времени• культура клеток была достаточно адаптирована к питательной среде, морфологически однородна; in vitro. "В культуре клеток осуществляли накопление вирусов, изучали вирусоносительство у бактерий.

Иммунологическими методами выявляли противовирусные (.к ВЛКРС) и противобактериальные антитела в сыворотке крови, изучали возможность ассоциации BJIKPC и бактерий и ее влияние, на течение инфекции ВЛКРС. С этой целью применяли РА (В.М.Никитин, 1977), РИФ (В.М.Никитин, 1977), РИД (O.ûuchterlony, 1967),' РРИД (J.MahciM et al., 1064), РИГА (J.Jandl, R.Simmons, 1957).

Влияние ассоциации ВЛКРС и бактерий на течение начальной стадии инфекции вируса лейкоза проводили с использованием кроликов и ягнят.

Кроликам: первой группы (5 голов) вводили культуру Вас. subtilis (штамм выделен от больного лейкозом крупного рогатого скота и ассоциирован с ВЛКРС) и ВЛКРС; второй группы (4 головы) вводили только ВЛКРС; третьей труппы (3 головы) вводили Вал. subtilis (выделенный штамм); кролики четвертой группы (3 головы) служили контролем. '

Аналогично опыт поставлен и на 16 ягнятах (Срок опыта в течение 144 суток).

Кролики и ягнята периодически подвергались клиническому, гематологическому и иммунологическому обследованию. В крови подопытных животных определяли . количество леикоцитов,. лейкограмму (И.М. Беляков , 1975), антитела к Вас. subtilis (РА, РИГА), ВЛКРС (РИД, РИГА). Проводили количественное определение у ягнят иммуноглобулинов классов G, M, A (J. Mancini et al., 1964; В. М.Жавненко, А. Ф. Могиленко, 1984). #

По истечении 144 суток после введения ВЛКРС ягнята были убиты

• _

с целью проведения патоморфологичесютх исследований.

Специфический молозивный иммуноглобулин получали по В. Е. Иванову с соавт. (1982, 1986). Иммуноглобулин проверяли на специфичность и активность (по РИД с антигенами ВЛКРС), стерильность (путем посева- на Микр о б ко ло г иче с кие среды), безвредность (на кроликах и белых мышах).

Испытание эффективности специфического молозивнсго иммуноглобулина проводили йа телятах. Во всех сериях опытов телятам опытных групп вводили иммуноглобулин знтерально с молозивом матери в дозе 4,0 мл на 1 кг живой массы теленка, в первые 36 часов жизни. Телятам контрольных групп выпаивали только молозиво матери.

У телят определяли количество лейкоцитов в крови, лейкограм-му, в сыворотке крови - наличие антител к ВЖРС и уровень иммуноглобулинов класса б, М, А.- В лейкоцитах периферической крови определяли наличие антигенов ВЛКРС. В этих целях использовались теже методы, что и при исследовании кроликов и ягнят.

Статистическую обработку результатов исследований осуществляли в соответствии с методическими указаниями, разработанными на кафедре патологической анатомии Витебского ветеринарного института и по методу 3. Г. Олейника и А. И. Канюка (1979).

Экономическую эффективность проводимых диагностических исследований и использования специфического молозивного иммуноглобулина для профилактики лейкоза определяли в соответствии с "Методикой определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий", утвержденной ГУВ Министерства сельского хозяйства СССР в 1984 году.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Распространение лейкоза крупного рогатого скота в Республике Беларусь

.В Республике Беларусь иммуно-серологический метод диагностики (РИД), позволяющий выявить животных на более ранней стадии развития лейкоза( т.е.- на стадии инфекции ВЛКРС) начал применяться повсеместно с 1989года. .

Естественно, возникла настоящая необходимость развернутого изучения эпизоотологической ситуации по лейкозу в республике. Нами использованы современные, рекомендации, разработанные в научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока. (С. II Джупина, 1991, А. Г. Незавитин, 1992).

Для характеристики интенсивности и экстенсивности эпизоотоло-

гического процесса при лейкозе крупного рогатого скота нами определялись следующие показатели: а) инфицированность - процентное отношение количества сероположительных животных к общему количеству животных; б) интенсивность инфицированное«! - то же к количеству обследованных жиеотных; в; заболеваемость - процентное отношение количества гематологически положительных животных к общему количеству животных; г) интенсивность заболеваемости - то же к количеству гематологически обследованных животных; д) очаговость - отношение количества сероположительных жиеотных к количеству неблагополучных хозяйсте; з) показатель неблагополучия - процентное отношение количества неблагополучных хозяйств к общему количеству . хозяйств; к; уровень диагностики - процентное отношение количества серологически обследованных животных к общему количеству животных; онкозаболеваемость - процентное отношение количества лейкйзных туш, выявленных на мясокомбинатах к общему количеству гематологически обследованных животных; интенсивность онкозаболеваемости -процентное отношение количества выявленных лейкоаных туш на мясокомбинатах к общему количестиву сероположительных животных. -

Результаты исследований эпизоотической ситуации по лейкозу в Республике Беларусь свидетельствуют, что интенсивность инфициро-ванности крупного рогатого скота была наиболее' высокой как в целом по республике, так и в областях в 1989 и 1990 годах. 5то можно объяснить не столько распространением инфекции, сколько уточнением истинной ситуации по лейкозу, связанной с использованием в качестве основного метода реакции иммунодиффузии (РИД).

В последние годы отмечается стабилизация этого показателя . и обшдя тенденция к его снижению. . .

Обращает внимание прямо пропорциональная зависимость снижения показателя интенсивности инфйцированпости жиеотных.ВЛКРС с показателем уровня диагностики. Так например в Витебской области показатель уровня диагностики к 1992 году увеличился более чем в 5 раз за счет многократного обследования в течение года Есего . поголовья и удаления, инфицированных ВЛКРС животных, что обусловило соответственно снижение показателя инфицированности животных более чем в два раза.

Таким образом, если судить об эпизоотической ситуации по лейкозу только по показателю интенсивности инфицированности животных ВЛКРС (как это существует в официальной отчетности), то положение обнадеживающее. '

В тоже время анализ показателя общей инфицированности поголовья вирусом лейкоза (который не учитывается в ветеринарной отчетности), свидетельствует о постоянном его росте как во всех областях (кроме Могилевской), так и в целом по республике. Этот факт можно обьянить тем, что в любом хозяйстве общее поголоЕье крупного рогатого скота (всех возрастных групп) как правило в течение года меняется незначительно. Серологическому исследованию подвергается преимущественно молочное стадо (.телки, нетели, коровы) и инфицированные ВЛКРС животные переводятся в группу откорма или в отдельную сероположительную группу. Чаще всего эти группы животных в дальнейшем серологическим'методом не исследуются, а исследуются гематологическими методами поэтому при определении показателя общей инфицированности следует учитывать количество всех сероположи-тельных животных, находящихся в хозяйстве и тем самым показатель общей инфицированности животных ВЛКРС должен быть основным критерием уровня организационно-хозяйственных противолейкозных мероприятий и оценки эпизоотологической ситуации по лейкозу.

Анализ показателей общей заболеваемости животных лейкозом и ее интенсивности показывает значительный их рост по сравнению с 1989 гсдом. Это явление вполне закономерно, так как гематологическому обследованию подвергаются только заведомо инфицированные ВЛКРС животные. В настоящее время гематологические исследования целесообразно проводить только в хозяйствах с высокой интенсивностью инфицированости скота ВЛКРС (свыше 10%), -а также при невозможности единовременной замены такого поголовья для предотвращения развития опухолевых изменений.

Показатели общей онкозаболеваемости и ее интенсивности следует оценивать как спорадические, которые не имеют существенного значения для оценки эпизоотологической ситуации по лейкозу.

Такие показатели экстенсивности эпизоотологического процесса как очаговость, неблагополучие, напряженность эпизоотической ситуации следует в значительной мере считать субъективными, поскольку они основаны на регистрации имеющихся и новых неблагополучных по лейкозу хозяйств (с наложением в установленном порядке ограничений). Так, если на начало 1993 года лейкоз крупного рогатого скота в Беларусии зарегистрирован в 97,7% хозяйств, то официально неблагополучными из них числилось только й,4%.

Таким образом, ситуация по лейкозу, крупного рогатого скота в Республике Беларусь в 1989-1990 годах характеризовалась увеличени--

ем большинства показателей интенсивности и экстенсивности эпизоотического процесса, что обусловлено не столько распространением болезни, сколько внедрением серологического метода ранней диагностики лейкоза, позволившего уточнить истинное положение. .

Таким образом, для оценки эпизоотической ситуации по лейкозу оптимальными являются показатели общей инфицированности и уровня диагностики, которые целесообразно включить в государственную ветеринарную отчетность, поскольку они позволяют достаточно объективно судить об уровне проведения противолейкозных мероприятий.

2.2.2. Характеристика микрофлоры, выделенной от больных лейкозом коров

При бактериологическом исследовании патологического материала от больных лейкозом коров выделены бактериальные культуры, которые адаптированы к обычным и специальным питательным средам и длительное время культивировались на них и были идентифицированы.

Как показали проведенные нами исследования общая обсеменен-ность микрофлорой внутренних органов (печени, сердца, легких,;по-чек , селезенки, лимфатических узлов) у больных лейкозом коров была довольно высокой до 90% исследуемых случаев.

Из селезенки и лимфатических узлов постоянно выделяли микроорганизмы, которые имели свойства, характерные для Вас. subtilis (50% случаев), Вас. mesentericus (30% случаев), Вас. rmgaterium (20% случаев), Sreptococcus mastitidis • (30% случаев), Staphylococous epidermitis (30% случаев), Escherichia.coli (50% случаев).

Все штаммы выделенных микроорганизмов имели характерные для вида свойства (с незначительными отклонениями).

В 30% случаев из селезенки и лимфатических узлов больных лейкозом коров были выделены очень мелкие полиморфные микроорганизмы, для которых были характерны следующие свойства: микроорганизмы культивировались только на специальных питательных средах с добавлением сыворотки крови, обладали очень низкой биохимической активностью, не вызывали гемолиз эритроцитов, были не патогенны для лабораторных животных. По своим морфологическим, и культур'альным свойствам эти микроорганизмы сходны с. L-формой бактерий.

Патогенными для лабораторных животных были некоторые выделенные штаммы Вас. subtilis, Вас. mesentericus, Escherichia coli.

При микробиологическом исследовании органов и тканей здоровых коров аналогичная микрофлора была выделена у 10% животных.

Таким образом, проведенные микробиологические исследования патологического материала, взятого от больного лейкозом крупного рогатого скота, позеолили в 90% случаев выделить и идентифицировать бактериальную флору, при этом у здоровых коров аналогичная микрофлора выделена у 1ÛX животных.

Наличие различной бактериальной флоры в организме животных, инфицированных ВЖРС и имеющих изменения в крови, органах и тканях, характерные для лейкоза, предполагает возможность взаимодействия ВЖРС и бактерий и влияние бактериальной флоры на течение инфекции ВЛКРС и лейкозного процесса.

2.2.3. Ассоциация ВЛКРС с микроорганизмами, выделенными от больного лейкозом крупного рогатого скота

При изучении возможности ассоциации ВЛКРС с бактериями использовали 12 штаммов микроорганизмов, выделенных от больного лейкозом крупного рогатого скота.

Морфологические изменения, установленные в культуре клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) и диплоидныфс клеток эмбриона человека С интенсивное деление и размножение клеток монослоя, округление и образование многоядерных клеток - синцитиев), характерные для присутствия ВЛКРС, позволили предположить наличие ассоциации этого вируса и бактерий в случае с Вас. mesentericus, Вас. subtilis, Вас. се reus, а также с атипичными формами бактерий.

Обнаружение ВЛКРС в культуре клеток проводили с помощью иммунологических реакций РИД и РИФ.

Специфическая люминесценция (наличие антигенов ВЛКРС) диплоидных клеток эмбриона.человека (ДМ) и ПЭК наблюдалась при инфицировании материалом, приготовленным из Вас. mesentericus, Вас. subtilis, Вас. согеиз и атипичных форм бактерий. Свечение отмечалось как в перинуклёарной зоне, так и по периферии цитоплазмы.

Полоса преципитации в РИД (наличие антигенов ВЛКРС) установлена при использовании антигенов, приготовленных из культуральной жидкости клеточного монослоя ПЭК, инфицированного материалом из бактерий, выделенных от больных лейкозом коров: Вас. mesentericus, Вас. subtilis, Вас. cereus, атипичных форм бактерий. Это указывает на возможность существования определенной взаимосвязи RTKPC с бактериями в организме коров, инфицированных этим вирусом, причем она сохраняется довольно продолжительное время (до 45 суток; срок исследования), в искусственных условиях культивирования бактерий на питательной среде при температуре +37оО, а также при сохранении

микробных культур, в условиях холодильника при +40С.

С целью выявления ассоциации бактерий с ВЛКРС нами были использованы иммунологические реакции: РА, РИФ, РИД, РРИД, РНГА. При этом установлено, что микроорганизмы, выделенные от больных лейкозом коров, реагируют с сыворотками к антигенам ВЛКРС в высоких титрах, что указывает на наличие определенной связи (.предположительно по типу адсорбции) между ВЛКРС и микроорганизмами. Наиболее выражена эта связь у ВЛКРС и Вас. subtilis.

В процессе дальнейшего изучения ассоциации ВЛКРС и Вас.. subtilis с помощью иммунологических методов использовали сыворотки крови от крупного рогатого скота из неблагополучных по лейкозу хозяйств.

Сыворотки крови исследовали в РА с антигенами Вас. subtilis (интактный и выделенный штаммы) и параллельно в РНГА с антигенами ВЛКРС и Вас. subtilis (интактный и выделенный штаммы).

В результате проведенных исследований установлено, что антитела в высоком титре к выделенному от больных лейкозом коров штамму Вас. subtilis наиболее часто выделяются у животных, инфицированных ВЛКРС - 42,1-63,87. (РА) и 69,6-83,4% (РНГА). и больных. (по гематологическим показателям) лейкозом - 64,2-68,0% (РА) и 69,8-88,4% (РНГА). Антитела к интактному штамму Вас. subtilis выявлены в высоком титре у значительно меньшего количества как здоровых, так и инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом животных -11,6-12,2% (РА) и 13,7-14,3% (РНГА), что свидетельствует о возможности с помощью серологических реакций (РА, РНГА) при использовании микробного антигена Вас. subtilis (приготовленного из ассоциированного в ВЛКРС штамма) выявлять ассоциацию ВЛКРС и микроорганизмов.

2.2. 4. Экспериментальное воспроизведение инфекции ЕЩСРС у кроликов и ягнят, обработанных культурой Вас. subtilis, ассоциированной с ВЛКРС

В связи с присутствием бактериальной микрофлоры в • организме крупного рогатого скота при лейкозе и возможности ассоциации ВЛКРС с некоторыми бактериями, естественно, существует вопрос о влиянии последней на возникновение и течение экспериментальной инфекции ВЛКРС. .'.'"■

Для опытов (схема которых приведена ЕЬ'ше) использовали кроликов и ягнят.

ÎÎL'H введении кроликам одновременно ВЛКРГ я ассоциированной о

ВЛКРС культуры Вас. subtilis (первая группа) у четырех из пяти антитела к ВЛКРС выявлены в РИД на 30-50 сутки. У трех кроликов из четырех, которым вводили только ВЛКРС(вторая группа), антитела к вирусу были обнаружены в более поздний срок, т. е. на 50-60 сутки. Антитела к gp-69 антигену ЕТКРС в РИД были выявлены на 30-е сутки у одного кролика из трех (третья группа), которым вводили ассоциированную с ВЛКРС культуру Вас. subtilis, но в дальнейшем реакция была отрицательной.

Максимальный титр антител к ВЛКРС в сыворотке крови кроликов первой группы был выявлен в РИГА на 60 сутки (5,8+0,42 log2, Р<0,05), к Вас. subtilis в РИГА (6,6+0,57 log2, Р<0,05) и в РА (6,0+1,03 log2, Р<0,05) на 60 сутки после инфицирования. У кроликов второй группы максимальный титр антител к ВЛКРС был выявлен в РИГА (5,25+0,29 iog2, Р<0,05) и в РА (5,25+0,29 log2, Р<0,05) на 60 сутки. .

У кроликов третьей группы, которых инфицировали ассоциированной с ЕТКРС культурой Вас. subtilis, максимальный титр антител к ВЛКРС в РИГА. (5,33+0,47 .log2, Р<0,05) был выявлен на 10 сутки после повторного введения культуры. К ассоциированной с ВЛКРС культуре Вас. subtilis антитела в максимальном титре выявлялись в РИГА (6,0+0,71 log2, Р<0,05) и РА (5,66+0,41 log2, Р<0,05) на 10 сутки после повторного введения. Затем титр как в РИГА, так и в РА к ВЛКРС и Вас. subtilis постепенно снижался.

У кроликов четвертой группы антитела к вышеуказанным антигенам в РИД не обнаруживались и увеличения титра этих антител в РА и РЦГА не отмечалось.

Полученные результаты показывают, что введение ассоциированной с ВЛКРС бактериальной культуры способствует развитию инфекции ВЛКРС у кроликов в более ранние сроки, при этом иммунный ответ более выражен, чем при инфицировании кроликов только ВЛКРС или ассоциированной с ВЛКРС культурой Вас. subtilis. Последнее, поводимому, связано с тем, что происходит сочетанное действие ВЛКРС, находящегося в ассоциации с бактериальной культурой, и ВЛКРС, полученного в культуре клеток FLK.

Дальнейшее изучение влияния ассоциации ВЛКРС и бактерий на течение лейкозной инфекции изучали на ягнятах.

Комплекс проведенных иммунологических, гематологических, па-томорфологических исследований позволил установить, что иммунный ответ у ягнят на ВЕедееке вируссодерхзщего материала (асооцииро-

ванной с ВЛКРС культуры Вас. subtilis и ВЛКРС) был более выражен, чем у ягнят, которые инфицировались только ВЛКРС или ассоциированной с ВЛКРС бактериальной культурой, так как антитела к ВЛКРС в РИГА выявлялись в более высоких титрах. Кроме того у ягнят, инфицированных ассоциированной культурой и ВЛКРС антитела к ВЛКРС обнаруживались в РИД в более ранние сроки, чем у ягнят второй группы. Возрастание титра антител к ВЛКРС у ягнят, получавших только ассоциированную с ВЛКРС бактериальную культуру, свидетельствует, повидимому, что происходит адсорбция ВЛКРС на бактериальных клетках. Заслуживает внимания и тот факт, что антитела сыворотки крови ягнят, получавших только бактериальную культуру, реагировали с антигенами ВЛКРС и наоборот антитела сыворотки крови ягнят, инфицированных только ВЛКРС реагировали с антигенами, приготовленными из культуры Вас. subtilis. Специфичность антител, т.е. их антивирусная природа, доказывается тем, что концентрация их повышается после заражения ягнят первой группы ВЛКРС, в это же время у ягнят' второй группы наблюдалось увеличение титра антител к бактериальному антигену, приготовленному из ассоциированной с ВЛКРС культуры Вас. subtilis, при введении им ВЛКРС. •

При анатомическом исследовании в органах и тканях ягнят, инфицированных как бактериальной культурой ассоциированной с ВЛКРС и ВЛКРС, так и инфицированных только ВЛКРС и бактериальной культурой, ассоциированной с ВЛКРС,. характерных для.лейкоза макроскопических изменений не отмечалось. Однако, при гистологическом исследовании в паренхиматозных гемопоэтических органах у ягнят первой, второй и третьей групп обнаруживали выраженную гиперплазию клеток СФМ типичную для активного иммунного ртвета. При этом у ягнят первой группы вышеуказанные изменения были более выражены, чем у ягнят второй и третьей групп. "

Однако, наличие иммунного ответа не препятствовало развитию инфекции ВЛКРС у ягнят первой и второй групп, так как у них постоянно выявлялись антитела к ВЛКРС и у некоторых особей были обнаружены с помощью РРИД антигены ВЛКРС в сыворотке крови, а с помощью РИФ выявлялись антигены ВЛКРС в лимфоцитах.

Полученные данные проведенной научно-исследовательской работы дают основание предположить, что ассоциация ' ВЛКРС с бактериями способствует сохранению ВЛКРС как во внешней среде, • так и в организме животных. Способность длительного существования в ассоциации ВЛКРС с бактериями в какой-то мере объясняет длительное сохранение

очагов инфекции ВЛКРС. '

2.2.5. Получение специфического молозивного иммуноглобулина и экспериментальное изучение его профилактической эффективности при лейкозе

Исходным Иатеркалом для приготовления специфического молозивного иммуноглобулина служило .свежевыделенкое (в течение двух суток,) или замороженное (срок хранения 6 месяцев) молозиво первых трех удоев. Донорами служили сероположительные на лейкоз коровы с нормальной картиной крови, отрицательно реагирующие на туберкулез и бруцеллез. Для исследований использовали молозиво с титром антител к ВЛКРС не менее 3,0 log2 и более, определяемый в РИД.

Осаждение иммуноглобулиновой фракции из молозивной сыворотки проводили путем добавления, полиэтиленгликоля (ГБЭГа-бООО) до 10% концентрации.

В работе использовали стерильный безвредный препарат, содержащий ' антитела к ВЛКРС в титре 4 log2.

При серологическом исследовании новорожденных телят (. до приема молозива) и их матерей было установлено, что от коров сероположительных на лейкоз рождаются телята как свободные от ВЛКРС, так и инфицированные ВЛКРС внутриутробно. У сероположительных на лейкоз коров в молозиве обнаруживали антитела ' (колостральные) к ВЛКРС, титр которых колебался от 1,0 до 6,0 log2 (по РИД). При этом были выделены три группы телят: свободные от инфекции ВЛКРС и имеющие колостральные антитела; телята инфицированные ВЛКРС и имеющие антитела; свободные от инфекции ВЛКРС и не имеющие антител.

В целях испытания иммуноглобулинов молозива для создания пассивного иммунитета.у новорожденных телят были сформированы три группы: первая - от сероотрицательных коров-матерей' и свободные от инфекции ВЛКРС; вторая - от сероположительных матерей и свободные от инфекции ВЛКРС; третья - инфицированные ВЛКРС внутриутробно. Телятам всех трех групп выпаивали специфический молозивный иммуноглобулин.

. Выпоенный телятам иммуноглобулин, содержащий антитела к ВЛКРС в повышенных.титрах, сразу же после рождения, позволяет создать пассивный иммунитет.

У телят от сероположительных матерей и свободных от инфекции ВЛКРС в среднем титр антител к ВЛКРС после выпойки препарата (через. 30 суток) был равен 4,85+0,11 log2, а у телят от сероотрицательных матерей - был ниже и равнялся 3,2. log2. Повышенный титр

антител у телят от сероположительных матерей обьясняется тем, что они получали противовирусные антитела с молозивом матери и препаратом, а телята от сероотрицательных матерей только с иммуноглобулином.

У телят, инфицированных внутриутробно ВЛКРС, антитела выявлялись при рождении в титрах 2,66+0,36 log2, а затем после выпойки молозива и препарата титр их повысился до 5,33+0,23 log2 и они выявлялись у двух животных из шести нами исследованных до 6-ти месячного возраста. Антигены ВЛКРС выявлялись в 6-ти месячном возрасте у трех телят (РИФ).

После применения препарата у теллт всех групп не наблюдалось сушэственного увеличения количества лейкоцитов и лимфоцитов в крови. Только в группе телят, инфицированных ВЛКРС, выявлялось повышенное содержание лимфоцитов как при рождении, так и в . течение первых трех месяцев жизни.

Уровень иммуноглобулинов G, М, А в сыворотке крови после введения препарата увеличился у телят Есех групп и постепенно возрастал к 6-ти месячному возрасту, но у телят инфицированных ВЛКРС был значительно еыою, чем у телят свободных от ВЛКРС.

Таким образом, применение специфического молозявного иммуноглобулина позволяет создать у телят пассивный (колостральный) иммунитет к ВЛКРС сразу же после рождения, который сохраняется в течение нескольких месяцев. Обращает на себя внимание тот факт, что у телят инфицированных при рождении, в более поздние сроки с помощью таких реакций как РИД и РИФ не удавалось выявить антитела и антигены ВЛКРС. Эти результаты дают основание предположить, что воз-можйо освобождение телят от инфекции ВЛКРС. Однако, , это предположение требует дальнейшего изучения С применением более совершенны)! методов исследований.

Использование с профилактической целью специфического моло-зивного иммуноглобулина при лейкозе позволяет снизить количестве инфицированных ВЛКРС телят на 75-80% по сравнению с контролем.

3. .ВЫВОДЫ

1. Лейкоз крупного рогатого скота широко распространен i Республике Беларусь, и зарегистрирован в 97,7% хозяйств, отлича ющихся преимущественно интенсивностью инфицированности животны вирусом лейкоза с устойчивой тенденцией к ее снижению.

2. Наиболее достоверным критерием оценки эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота являются показатели общей инфицированности и заболеваемости, которые позволяют более объективно судить об эффективности противолейкозных мероприятий, проводимых в хозяйствах.

3. У больных лейкозом животных бактериологически выделяются чаще Есего Вас. subtilis, Вас. mesenterlcus, Escherichia coli патогенные для лабораторных животных, а также Вас. cereus, Вас. megaterium, Streptococcus mastitidis, Staphylococcus epldermitis, атипичные Форш бактерий.

4. Выявлена.ассоциация ВЛКРО с бактериями Вас. rresentericus, Вас. subtilis, Вас. cereus, Streptococcus mastitidis, Staphylococcus epidermitis, Escherichia coli, атипичными формами бактерий.

5. Использование антигена из культуры Вас. subtilis (.наделенной от больных лейкозом коров) в общепринятых серологических реакциях (.РИД, РА, РИГА) позволяет определить в. стадах частоту ассоциации ВЛКРС с бактериями.

6. Ассоциированная с ВЛКРО культура Вас. subtilis, введенная кроликам и ягнятам, предварительно, до заражения ВЛКРС, способствует возникновению инфекции вируса лейкоза в более ранние сроки.

7. От больных лейкозом коров рождается до 2üs телят, инфицированных ВЛКРС в пренатальный период, что является одним из фзкто-ров распространения этой болезни. Уровень колостральных антител к ВЛКРС у телят от серопозитивных коров снижается с трехмесячного возраста до исчезновения к пяти - шестимесячному возрасту.

8. Специфический молозивный иммуноглобулин обеспечивает не только снижение инфицирования ВЛКРС телят на 80?.. но и одновременно способствует уменьсению количества желудочно-кишечных заболеваний на 10-202, а респираторных - на Ю-25Х.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Использование реакции агглютинации с бактериальным антигеном в целях совершенствования диагностики лейкоза крупного рогатого скота. (. Информационный листок N 9-86, Витебский межотраслевой центр научно-технической информации и пропаганды, 1986 г.).

2. Специфический молозивный иммуноглобулин для профилактики лейкоза у новорожденных телят. (.Рассмотрен и одобрен НТС Госагроп-рома БССР 18.12. 39 г., Протокол N 3).

3. Специфический молозивный иммуноглобулин для профилактик лейкоза у новорожденных телят. (Информационный листок N.149, Б ВНИИТЭИагропром, 1990 г.).

4. Оздоровление крупного рогатого скота от лейкоза. (Информа ционный листок N 076, БФ ВНИИТЭИагропром, 1992 г.).

5. Инструкция по борьбе с лейкозом крупногЬ рогатого скота хозяйствах Республики Беларусь. (Утверждена ГУВ Минсельхозпрод Республики Беларусь 6.11.91 г.).

6. Методические указания по диагностике лейкоза крупного ро гатого скота в Республике Беларусь. (Утверждена ГУВ Минсельхозпро да Республики Беларусь 22.07. 93 г.).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жавненко В. М., Черняк Е В. Циркуляция антигенов, антител иммунных комплексов в сыворотке крови коров, больных лейкозами / Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных. Ташкент 1984. - С. 49-50.

2. Черняк К В. Персистенция вируса лейкоза крупного рогатог скота в бактериях // Вест1 АН БССР. Сер. с.-г. навук. - 1985.-г.- с. Ю4-Ю6.

3. Черняк Е Е Иммуногенез у ягнят, инфицированных вирусе лейкоза крупного рогатого скота на фоне предварительной иммуниза ции бактериальным антигеном // Рукопись деп. во НИИТЭИС 06.12.1985. N 500/21 ВО Деп.

4. Смирнова Е И., Черняк В. Е Бактериальные антигены в имм> нодиагностике лейкоза крупного рогатого скота // Вест1 АН БСС1 Сер. с.-г. навук -1985.- N 1.- С. 111-113.

5. Черняк В. В. Использование реакции агглютинации с бактер! альным антигеном для диагностики лейкоза, крупного рогатого скот //Информационный листок. Витебский межотраслевой территориальш центр научно-технической информации и пропаганды, 1986.

6. Черняк В. В. Специфический молозивный иммуноглобулин д.1 профилактики лейкоза у новорожденных телят //Икформационш листок. БФ ВНИИТЭИагропром, 1990.

7. Лемеш ЕМ., Черняк В.Е, Иванов ЕЕ. Молозивный иммуноглс булин для профилактики инфекционных заболеваний у новорожденш телят // Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка сельскс хозяйственных .животных. Тез. докл. , республ. научн. -пройзвд,, конф. Минск. -1090. -0. 37.

8. л?м?и в. л, Черняк к В., минисян В; Г. Коррекция пассивно!

иммунитета у новорожденных телят при лейкозе // Проблемы научного обеспечения животноводства Молдавии. Тез. докл. конф. - Кишинев, 1990,- С. 143.

9. Дрогун А. Г. , Русинович А. А. , Черняк В. В., Щуринова С. А., Холод А. А. , Буров А. М. Оздоровление крупного рогатого скота от лейкоза // Информационный листок. БФ ВНИИТЭИагропром, 1992.

10. Лемеш ЕМ., Черняк В. а , Шуринова С. А. , Дрогун А. Г., Холоп А. А. Получение и выращивание телят - основное направление борьбы с лейкозом // Технология и выращивания здорового молодняка сельскохозяйственных животных и рыбопосадочного материала. -Минск. - 1993.- С. 105-106.'