Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Совершенствование методов изготовления и контроля туберкулина очищенного (ППД) для птиц



На правах рукописи

БЕЗГИНА НАТАЛЬЯ ВЯЧЕСЛАВОВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И КОНТРОЛЯ ТУБЕРКУЛИНА ОЧИЩЕННОГО (ППД) ДЛЯ ПТИЦ

16 00 03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

□03171488 Щелково - 2008

003171488

Работа выполнена на кафедре биотехнологии, микробиологии и ВСЭ ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И И Иванова» и на ФГУП «Курская биофабрика»

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Козлов Владимир Егорович

Официальные оппоненты, доктор ветеринарных наук, профессор

Белоусов Василий Иванович

доктор биологических наук Букова Наталья Константиновна

Ведущая организация ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский институт лчспериментальной ветеринарии им Я Р Коваленко» РАСХН, г Москва

Защита диссертации состоится 6 июня 2008 г в 20 часов на заседании диссертационного совета Д 006 069 01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, п Биокомбината, ВНИТИБП

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП

Автореферат разослан 5 мая 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета^-^т^—г7

кандидат биологических наук ___Фролов ЮД

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Туберкулез животных составляет большой удельный вес в инфекционной патологии, причиняя значительный экономический ущерб сельскому хозяйству Международный ветеринарный кодекс МЭБ определяет туберкулез как заболевание, требующее обязательного декларирования Борьба с этим зооантропонозным заболеванием имеет не только экономическое, но и социально-гигиеническое и эпидемиологическое значение (Смольянинов Ю И , 2005, Акылбекова К Т , 2006) Именно поэтому наряду с мероприятиями в системе здравоохранения Федеральным Законом РФ №77 - ФЗ от 18 06 2001 «О предупреждении распространения туберкулеза в Российской Федерации» предусмотрена необходимость своевременного выявления больных туберкулезом сельскохозяйственных животных

В последнее время все большее внимание уделяется заболеваниям, вызванным нетуберкулезными микобактериями — микобактериозам (Огген Т Ф , 1999, Phillips М , von Rein С , 2001, Новожилова И А, 2004) В многочисленных исследованиях показано, что в условиях иммунодефицитных состояний М avium является одним из основных инфекционных агентов, определяющих развитие патологии (Griffith D , 1997, Han X , Tarrand J , 2005) Кроме того, микобактерии птичьего вида вызывают микобактериозы, которые поражают грызунов, свиней и приматов Клиника течения этих заболеваний сходна с туберкулезом

Успех борьбы с туберкулезом определяется многими факторами, важнейшим из которых является своевременное проведение диагностических мероприятий, направленных на выявление и удаление из оздоравливаемых стад больных животных, представляющих собой основной источник возбудителя болезни (Шаров А Н , 1989, Авилов В М , Овдиенко Н П , 1997) В настоящее время наиболее важным и широко применяемым прижизненным методом исследования на туберкулез является аллергическая проба с использованием туберкулиновых препаратов, вызывающих у инфицированных животных реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)

Качество аллергодиагностикумов зависит от используемой технологии изготовления препаратов и методов их контроля Применяемая до настоящего времени технология изготовления туберкулина (ППД) для птиц была разработана на Курской биофабрике более 30 лет назад Успехи в технологии очистки белков, а также развитие методов контроля и стандартизации биопрепаратов поставили вопрос о необходимости усовершенствования существующей технологии

Федеральный Закон РФ № 184-ФЗ «О техническом регулировании» от 27 12 2002 и последовавшие постановления Правительства РФ, направленные на его эффективную реализацию, потребовали проведения обязательной стандартизации выпускаемых биологических препаратов и унификации методов контроля с общепринятыми международными требованиями Дей-

ствующий в настоящее время в нашей стране нормативный документ ГОСТ 23881-79 «Туберкулин сухой очищенный (ППД) для птиц Технические условия», разработанный 30 лет назад, отличается от аналогичных документов, принятых Европейским Союзом и не позволяет осуществлять контроль препарата в соответствии с международными требованиями

Внедрение современных технологических процессов при изготовлении туберкулина очищенного (ППД) для птиц и разработка нормативных документов, определяющих качество аллергена в соответствии с требованиями МЭБ (OIE Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004) и Европейской Фармакопеи (European Pharmacopoeia, 2002), крайне перспективно при решении задач выпуска отечественного диагностикума, не уступающего по качественным характеристикам зарубежным аналогам

Целью исследования являлось совершенствование технологических этапов изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц с применением мембранных методов, разработка нормативной документации для контроля и выпуска препарата в соответствии с международными требованиями

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1 Разработать методы мембранного фракционирования и очистки белков туберкулина очищенного (ППД) для птиц и изучить иммунобиологические свойства белковых фракций препарата

2 Провести сравнительный анализ выхода белков туберкулина очищенного (ППД) для птиц на различных производственных этапах его изготовления при использовании мембранных методов фракционирования и существующей технологии

3 Определить оптимальную концентрацию белка в растворе туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении и изучить стабильность жидкой формы диагностикума

4 Разработать нормативную документацию на туберкулин очищенный (ППД) для птиц, соответствующую международным требованиям

5 Провести сравнительное изучение активности и специфичности отечественного туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении, изготовленного в соответствии с международными требованиями, и туберкулинов зарубежных фирм - изготовителей

Научная новизна. Разработан комплекс промышленных методов для производства туберкулина очищенного (ППД) для птиц, позволяющий снизить содержание балластных антигенов в препарате и повысить выход целевого продукта

Впервые определено, что антигены туберкулина очищенного (ППД) для птиц с молекулярной массой более 300 кДа обусловливают высокий уровень реактогенности препарата

Впервые установлено, что оптимальное значение концентрации ТХУ для полного осаждения специфичных и активных белков туберкулина из культуральной жидкости М avium, составляет - 8 %

Практическая значимость.

1 Предложена технология изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц с применением методов мембранного фракционирования

2 В соответствии с международными требованиями разработана и утверждена нормативная документация для изготовления и контроля туберкулина очищенного (ППД) для птиц

3 Согласно разработанной нормативной документации, гармонизированной с требованиями МЭБ изготовлен и откалиброван относительно Первого международного стандарта на (ППД) микобактериальный птичий туберкулин отечественный эталонный образец туберкулина очищенного (ППД) для птиц

4 С применением предложенной технологии изготовлено две серии туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении Отечественный препарат, выпущенный в соответствии с международными требованиями, по качественным характеристикам не отличался от зарубежных аналогов

На защиту выносятся следующие положения:

1 Комплекс методов для изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении, позволяющий повысить эффективность производственного процесса и качественные характеристики препарата

2 Результаты исследований туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении и эталонного образца туберкулина очищенного (ППД) для птиц, выполненные с применением нормативных документов, разработанных в соответствии с международными требованиями, предъявляемыми к качеству аллергенов для диагностики туберкулеза

Апробация работы. Основные положения и выводы диссертационной работы были доложены и обсуждены на

- Международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России — г Курск, 21-22 сентября 2006 г

- Всероссийской научно-практической конференции «Региональные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса» — г Курск, 20-22 марта 2007 г

- Научно-техническом совете ФГУП «Курская биофабрика» 12 февраля 2008 г

Публикации результатов работы. По материалам диссертации опубликовано 1 научные статьи

Объем и С1 руктура диссертации. Работа изложена на 157 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 23 таблицами, 12 рисунками Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические рекомендации, список литературы и приложения Список используемой литературы включает 194 источника, из них 89 отечественных и 105 иностранных

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Материалы и методы

Работа выполнена в период с 2003 по 2008 гг согласно рабочим программам и планам внедренческих работ в научных и производственных подразделениях ФГУП «Курская биофабрика - фирма «БИОК» и на кафедре биотехнологии, микробиологии и ВСЭ ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И И Иванова» Схема исследований представлена на рисунке 1

В работе использовали производственный штамм микобактерий М avium № 2282 Для проведения исследований использовали образец Первого международного стандарта на (ППД) микобактериальный птичий туберкулин, предоставленный Национальным институтом биологических стандартов и контроля (NIBS, Великобритания) и отечественные эталонные серии туберкулина очищенного (ППД) для птиц

В работе исследовали опытные и коммерческие серии туберкулина очищенного (ППД) для птиц и фракции туберкулина, полученные на этапах изготовления, как по традиционной технологии, так и с применением метода мембранного фракционирования При сравнительных испытаниях в качестве аналогов применяли образцы туберкулинов, изготовленных зарубежными производителями «Ш-Lelystad» (Нидерланды), «Bioveta» (Чехия)

Для осаждения белков культуральной жидкости М avium использовали трихлоруксусную кислоту (ТХУ) и сульфат аммония

Концентрацию белка в исследуемых пробах определяли по методу Къель-даля (ГОСТ 23881-79) и методом фотоэлектрокалориметрии (кювета 10,08 мм, светофильтр зеленый - 540 нм)

Содержание полисахаридов в пробах определяли методом Хагердорна-Иепсена (Шамахмудов Ш Ш , 1966)

Количественное содержание липидов определяли согласно методике Aronson (Модель Л М , 1958)

Определение сухого остатка, органических и неорганических веществ проводили весовым методом (Колесов С Г , 1970)

Гель-хроматографическое разделение антигенов проводили на колонках размером 1,05440 см, заполненных ультрагелем АсА 34 Для обнаружения и количественной оценки ширины и амплитуды белкового пика использовали УФ-детектор («2238 Uvicord S II», «LKB», Швеция) Регистрацию проводили двухканальным самописцем («2210 Recorder», «LKB», Швеция) Сбор фракций осуществляли с применением коллектора фракций («2070 Ultrorac II», «LKB», Швеция)

При фильтрации растворов тубпротеина использовали шихтные фильтр-пластины марки «Ф» и «СФ», микрофильтрационные мембраны с размером пор 0,2 мкм и ультрафильтрационные модули с мембранами, имеющими номинально отсекаемую молекулярную массу (НОММ) от 3 до 300 кДа

4

Рисунок 1 — Общая схема исследования

В опытах использовали следующих лабораторных животных

— морских свинок-альбиносов или с белым окрасом на боках весом не менее 400 г - 240 голов, распределенных в группы по принципу аналогов (условия содержания, стандартный кормовой рацион, возраст, вес - разброс в группах по исходной массе не превышал ±10 %),

- кур породы ломанн-браун возраста 1,0 - 1,5 года - 60 голов Исследования биологических показателей туберкулинов проводили в

соответствии с методами, изложенными в ГОСТ 23881-79 «Туберкулин сухой очищенный (ППД) для птиц Технические условия» и в Стандарте организации СТО 00482909-0011-2006 «Туберкулин очищенный (ППД) для птиц Технические условия» Биологическую активность туберкулина очищенного (ППД) для птиц определяли на морских свинках, сенсибилизированных микобактериями штамма М avium Специфичность — на морских свинках, сенсибилизированных микобактсриями штамма М bovis Реактогенность туберкулина очищенного (ППД) для птиц и его фракций оценивали на здоровых морских свинках

Статистическую обработку данных экспериментов проводили, используя стандартные методы (Ашмарин И П , 1962, Плохинский Н А , 1980, Лакин Г Ф , 1990, Фрадкин В А , 1990)

2. Результаты исследований

2 1 Совершенствование методов изготовления туберкулина очищенного

(ППД) для птиц

2 11 Разработка мембранных методов очистки белков

В целях повышения эффективности производства туберкулина (ППД) для птиц были проведены исследования по внедрению в технологию изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц мембранных процессов ультрафильтрационного фракционирования белков туберкулина, микрофильтрации культуральной жидкости М avium, диафильтрации и мембранной стерилизующей фильтрации концентрата белков туберкулина (ППД) для птиц

Предварительно с использованием метода гель-хроматографии был изучен фракционный состав белков туберкулина очищенного (ППД) для птиц Результаты экспериментов представлены на рисунке 2

Установлено, что в состав туберкулина входят две фракции белков, отличающиеся по молекулярной массе высокомолекулярная фракция, соответствующая первому пику, элюирующемуся в «свободном» объеме колонки, и фракция белков, составляющая основное содержание белков туберкулина, элюирующаяся во втором пике Учитывая значительную разницу в молекулярной массе белков, соответствующих первому и второму пикам хроматограммы, мы сделали предположение о возможности использования для разделения фракций мембранного метода

6

Рисунок 2 — Хроматограммы фракции туберкулина, полученных при мембранном разделении белков препарата на колонке с ультрагелем АсА 34 А — концентрат белков туберкулина, Б — фильтрат концентрата после фракционирования на мембране с НОММ < 300 кДа, В — ретентат концентрата белков туберкулина после фракционирования на мембране с НОММ > 300 кДа

На ультрафильтрационной кассетной установке с мембранами, имеющими НОММ 300 кДа было получено две фракции фильтра г, содержащий белки с молекулярной массой менее 300 кДа, и ретентат, в котором при гель-фильтрационном анализе в высокой концентрации были обнаружены белки с молекулярной массой более 300 кДа и примесь белков с молекулярной массой менее 300 кДа, легко удаляемых методом диафильтрации

• Таблица 1 - Оценка реактогености фракций туберкулина очищенного

(ППД) для птиц, полученных с применением мембранных методов

Доза введения фракции белков туберкулина с молекулярной массой более 300 кДа, мг Доза введения туберкулина (ППД) для птиц, содержащего белки с

Номер животного молекулярной массой менее 300 кДа,

мг

0,10* 0,01 0,10* 0,01

Диаметр кожной реакции ГЗТ у морских свинок (мм)

1 12,0 0 7,0 0

2 9,5 4,5 0 0

3 9,0 0 0 0

4 12,5 6,5 11,5 0

5 5,5 0 0 0

6 10,0 0 0 0

Примечание * при расчете по методу критерия знаков разница значении реакции на дозу 0,10 мг достоверна (р = 0,95)

При анализе иммунобиологических свойств полученных фракций установлено, что фракция туберкулина, содержащая антигены с молекулярной массой более 300 кДа, обладала достоверно более высокой реактогенностыо по сравнению с фракцией, в состав которой входили низкомолекулярные белки В таблице 1 представлены результаты эксперимента по оценке реакто-гености фракций туберкулина очищенного (ППД) для птиц, полученных с применением мембранных методов

Проведенные эксперименты позволили сделать вывод об эффективности использования метода мембранного фракционирования белков туберкулина очищенного (ППД) для птиц для удаления из препарата реактогенной высокомолекулярной фракции Кроме того, внедрение метода мембранного фракционирования обеспечило возможность стандартизации белков туберкулина по верхней границе молекулярной массы (300 кДа)

Значительные потери белка в процессе изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц установлены на одном из первоначальных этапов очистки препарата - осветляющей фильтрации культуральной жидкости В целях снижения потерь целевого продукта нами были проведены эксперименты по осветлению культуральной жидкости на керамических мембранных фильтрах с размером пор 0,2 мкм Эффективность этапа фильтрации оценивали по содержанию белка в фильтрате Результаты сравнительных экспериментов представлены в таблице 2

Таблица 2 - Сравнение результативности фильтрации культуральной жидкости на керамических мембранных фильтрах и на шихтных фильтр-пластинах

Применяемый фильтр Выход белка в фильтрате, % от исходного Среднее значение (% от исходного)

Керамическая мембрана (0,2 мкм) 91,0 94,9 ± 2,0*

96,0

97,7

Шихтные фильтр-пластины («Ф») 80,5 80,3 ± 1,3*

78,0

82,4

Примечание * разница средних значений достоверна (р = 0,95)

Как видно из данных, представленных в таблице 2, фильтрация на керамических мембранах дает возможность снизить потери белка и соответственно повысить выход на данном этапе примерно на 20%

Еще один этап, где мы применили метод мембранной технологии — процесс обессоливания концентрата белка туберкулина В традиционной технологии удаление сульфата аммония из концентрата белка туберкулина очищенного (ППД) для птиц осуществлялось с использованием длительного процес-

са (48 часов) диализа в проточной во,д;е через целлофановые оболочки Для оценки мембран, необходимых при проведении диафильтрации, мы провели эксперименты по определению селективности мембран с НОММ 3 и 10 кДа Установлено, что потери белка при использовании мембран с НОММ 10 кДа составляли 10% Мембраны с НОММ 3 кДа имели более высокую селективность по белкам туберкулина и потери продукта при их применении составили 2% Для дальнейшего применения в технологии изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц использовали мембраны с НОММ 3 кДа

Внедрение метода диафильтрации в производстве туберкулина (ППД) для птиц позволило значительно сократить длительность процесса обессоли-вания белка (до 6 часов), снизить расход воды и стандартизовать аллерген по нижней границе молекулярной массы — 3 кДа

Финишный этап технологии изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц — это стерилизующая фильтрация обессоленного концентрата белка В традиционной технологии данный этап осуществлялся методом тупиковой фильтрации на шихтных фильтрах марки «СФ» Простая замена фильтр-пластин мембранными фильтрами приводила к снижению производительности процесса фильтрации и даже к полной блокировке мембран в результате эффекта концентрационной поляризации Проблема мембранной стерилизующей фильтрации белков туберкулина очищенного (ППД) для птиц была решена за счет внедрения этапа предварительной фильтрации раствора белка на ультрафильтрационных мембранах с НОММ 300 кДа, осуществляемой в тангенциальном потоке В таблице 3 отражены результаты оценки потерь белка при двух сравниваемых методах стерилизующей фильтрации

Таблица 3 - Потери белка на этапе стерилизующей фильтрации

я я и к я о н 2 ° £ м о. Номер Концентрат белка до фильтрации Концентрат белка после фильтрации Потери белка

= гз в* и 5 О" В с к о X о Н опыта объем, 3 Д\г концентрация, г/дм3 Всего белка, г объем, дм3 концентрация, г/ дм3 Всего белка, г По каждому опыту, % Среднее значение, %

с* >ч К я « 1 24,0 11,4 273,6 30,0 7,1 213,7 22,15 24,8 ± 2,8*

и га с-2 3 о Е 2 § и £ 2 30,0 7,1 213,7 32,0 5,1 164,0 23,0

3 13,0 6,7 87,1 14,0 4,4 61,6 29,3

к л ^ о 1 2,0 11,4 22,8 4,0 5,0 20,0 12,3 11,3 + 2,0*

5 1 ^ и и ° О, я в 2 15,0 3,0 45,0 15,5 2,7 41,6 7,5

^ и ь 3 14,5 2,7 39,1 14,0 2,4 33,6 14,1

Примечание* разница достоверна (р = 0,95)

9

После фракционирования концентрата белков туберкулина очищенного (ППД) для птиц на ультрафильтрационных мембранах с НОММ 300 кДа и удаления высокомолекулярной фракции потери белка непосредственно при стерилизующей фильтрации на мембранах с порами 0,2 мкм были практически исключены Общие потери белка при использовании мембранной фильтрации туберкулина с учетом этапа предварительного ультрафильтрационного фракционирования были в два раза ниже (10 — 13%) по сравнению с потерями белка при фильтрации на шихтных фильтрах (22 — 27%) Таким образом, внедрение мембранных методов в технологию изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц позволило стандартизовать белки аллергена по молекулярной массе (от 3 до 300 кДа), повысить выход продукта, сократить длительность процесса очистки белков туберкулина очищенного (ППД) для птиц и исключить использование шихтных фильтров

2.1.2 Оценка выхода белка туберкулина на этапе осаждения культуральной жидкости ТХУ

При совершенствовании технологии изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц нами были проведены исследования по определению оптимальной концентрации ТХУ, необходимой для осаждения белков туберкулина из культуральной жидкости М avium

130 -I

120 -

110 -

100 -

90

5 8 10

Концентрация ТХУ, %

Рисунок 3 — Количество осаждаемого белка в зависимости от концентрации ТХУ в растворе

Установлено, что применение предусмотренной в традиционной технологии концентрации ТХУ 5% не позволяет провести полное осаждение белков культуральной жидкости На рисунке 3 показана зависимость количества

осаждаемого белка культуральной жидкости М avium от концентрации ТХУ в растворе

Повышение концентрации ТХУ с 5% до 8 - 10% позволяет выделить из культуральной жидкости дополнительное количество белка, и таким образом повысить выход туберкулопротеина на данном этапе технологии на 15 - 20% Учитывая тот факт, что не установлено значимых различий в выходе продукта при осаждении белков культуральной жидкости в интервале концентрации ТХУ от 8% до 10%, оптимальной концентрацией ТХУ для осаждения белков культуральной жидкости М avium может служить концентрация, равная 8%

2.1.3 Разработка технологии изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении

Важным вопросом процесса изготовления современного, конкурентоспособного аллергодиагностикума является форма выпуска препарата В международной практике для диагностики туберкулеза используются, в основном, аллергены, выпускаемые в жидкой форме, стандартизованные по содержанию международных единиц активности В целях выпуска отечественного туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении мы провели исследования по подбору оптимальной концентрации белка в препарате и стабильности готового препарата Номинальное значение активности стандартного раствора туберкулина очищенного (ППД) для птиц, изготавливаемого в странах ЕС, составляет 20000 — 28000 МЕ/см3 С учетом этого, мы провели эксперименты по определению оптимального содержания белка в растворе туберкулина в стандартном разведении, соответствующего заданному интервалу активности Результаты опытов представлены в таблице 4

Таблица 4 - Соотношение показателей концентрации белка туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении и его удельной активности

Номер опыта Концентрация белка, мг/см3 Удельная активность, МЕ/см3

1 0,4 18000

2 0,5 20000

3 0,6 28000

4 0,7 35000

На основании данных, представленных в таблице 4, можно сделать вывод, что требуемая удельная активность отечественного препарата будет соответствовать содержанию белка 0,5-0,6 мг/см3

Ддя оценки стабильности образцов стандартного раствора туберкулина очищенного (ППД) для птиц препарат подвергали испытанию методом «ускоренного старения» при температуре 37 °С Содержание белка и биологическую активность определяли до хранения и в процессе хранения через 60 и 120 суток Результаты опыта представлены в таблице 5

Таблица 5 - Показатели концентрации белка туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении и его активности в процессе хранения при температуре 37 °С

Серия туберкулина Содержание белка, мг/см3 Удельная активность, ' МЕ/см3

Исходное значение После 60 суток хранения После 120 суток хранения Исходное значение После 60 суток хранения После 120 суток хранения

14 0,31 0,32 0,31 14500 15000 15000

3 0,41 0,40 0,40 15500 15000 15000

5 0,56 0,52 0,57 26000 27000 26000

5а 0,82 0,83 0,82 48000 49000 48000

Установлено, что концентрация белка туберкулопротеина и его биологическая активность стабильно сохраняются в процессе хранения при 37 "С в течение заданного периода наблюдения (120 суток), что соответствует 28 месяцам хранения при 8°С

Таким образом, стабильность отечественного туберкулина в стандартном разведении соответствует сроку хранения, предусмотренному Руководством МЭБ для аллергенов, изготавливаемых в жидкой форме, — 2 года

В результате проведенных исследовании предложена технологическая схема изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц (рисунок 4), использование которой позволяет суммарно повысить выход конечного продукта на 50% и осуществлять выпуск туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении Она включает следующие модернизированные нами этапы осветляющую фильтрацию на керамических мембранных фильтрах с размером пор 0,2 мкм, осаждение белка из культуральной жидкости ТХУ в концентрации 8%, обессоливанис концентрата белка после переосаждения сульфатом аммония на ультрафильтрационных мембранах с НОММ 3 кДа, удаление высокомолекулярной фракции из обессоленного концентрата белков туберкулина на ультрафильтрационных мембранах с НОММ 300 кДа, мембранную стерилизующую финишную фильтрацию концентрата белков туберкулина, изготовление раствора туберкулина в стандартном разведении

Рисунок 4 - Технологическая схема изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении

2.2 Совершенствование методов контроля туберкулина очищенного (ППД)

для птиц

Качество биопрепаратов зависит не только от испочьзуемых при их производстве технологических методов, но и от стандартов, применяемых для контроля показателей готовой продукции Действующий ГОСТ 23881-79 «Туберкулин сухой очищенный (ППД) для птиц Технические условия» на данный момент в значительной степени отличается от международных нормативных документов, определяющих качественные характеристики аллергенов (Руководство МЭБ, Европейская Фармакопея) Для выпуска в ветеринарную практику современного конкурентоспособного аллергодиагности-кума нами был разработан нормативный документ — Стандарт организации

«Туберкулин очищенный (ППД) для птиц. Технические условия» (СТО 00482909-0011-2006), гармонизированный с требованиями действующих международных нормативных документов. В данный документ по сравнению с ГОСТ 23881-79 внесены изменения, повышающие требования к следующим качественным показателям аллергена: специфичность, активность, стерильность, токсичность, специфическая безвредность. Кроме того, новый отечественный стандарт предусматривает выпуск не только сухого туберкулина очищенного (ППД) для птиц, но и туберкулина в форме раствора в стандартном разведении.

При определении активности туберкулина очищенного (ППД) для птиц СТО 00482909-0011-2006 предусматривает расчёт, основанный на полулогарифмической зависимости диаметра ответной реакции от величины дозы аллергена, тогда как при использовании ГОСТ 23881-79 для расчётов применяли формулу прямой зависимости диаметра ответной реакции от введённой дозы туберкулина.

На рисунке 5 представлены границы разброса активности туберкулина, предусмотренные сравниваемыми нормативными документами для соответствующих методов расчета.

Допустимые границы активности туберкулина, установленные и рассчитанные по методике ГОСТ 23881-79

Допустимые границы активности туберкулина, рассчитанные по методике

ГОСТ 23881-79, соответствующие границам, установленным Руководством МЭБ

Допустимые границы активности туберкулина, установленные и рассчитанные по методике Руководства МЭБ

Рисунок 5 - Предусмотренные ГОСТ 23881-79 и СТО 00482909-0011-2006 допустимые границы активности туберкулина (ППД) для птиц, рассчитанные по методикам ГОСТ 23881-79 и Руководства МЭБ

Так как зависимость — «логарифм дозы введения туберкулина» — «диаметр реакции ГЗТ» точнее отражает соотношение данных показателей по сравнению с прямой зависимостью, ее применение значительно повышает точность метода расчета активности аллергена Следует отметить, что в международных документах и в СТО 00482909-0011-2006 допустимый разброс активности туберкулина (ППД) для птиц составляет -25% — +33%, тогда! как в ГОСТ 23881-79 допускается разброс + 20% Интервалу активности 37500 — 66500 МЕ, предусмотренному документами МЭБ, соответствуют только те значения активности туберкулина очищенного (ППД) для птиц, которые в случае применения метода расчета, указанного в ГОСТ 23881-79, отличаются от среднего уровня анализируемого показателя не более чем на 4% Активность коммерческих серий препарата, отличающаяся от активности эталонной серии, при расчете по методу ГОСТ более чем на 4%, уже не соответствует требованиям МЭБ Таким образом, допустимый разброс значений активности препарата за счет использования полулогарифмического метода расчета величины данного показателя реально снижается с 20% до 4%, то есть в пять раз, что обеспечивает возможность выпуска более стандартного по показателю активности диагностикума

В СТО 00482909-0011-2006 внесено еще одно дополнительное требование к методике определения активности — оценка величины среднеквадратичного отклонения результатов опыта Это позволяет ограничить предельный разброс значений эксперимента и таким образом снизить ошибку метода Стандарт организации устанавливает допустимые границы эксперимента в пределах от 50% до 200% при р = 0,95 Данный показатель очень важен для оценки достоверности полученных результатов, так как косвенно характеризует состояние лабораторных животных, используемых в опыте, уровень их сенсибилизации, точность введения туберкулина и способа оценки реакции ГЗТ

Необходимым условием выпуска качественных аллергодиагностикумов является их соответствие действующим международным стандартным образцам Международные нормативные документы рекомендуют странам, в которых производят туберкулины, разрабатывать и калибровать по отношению к международному стандарту национальные стандарты аллергенов для определения активности коммерческих серий препаратов В соответствии с этим на ФГУП «Курская биофабрика» был разработан дополнительный Стандарт организации СТО 00482909-0014-2006 «Стандарт туберкулина очищенного (ППД) для птиц (эталонный образец) Технические условия»

Важным требованием СТО 00482909-0014-2006 является обязательный контроль эталонной серии туберкулина относительно принятого МЭБ Первого международного стандарта на (ППД) микобактериальный птичий туберкулин Согласно международным требованиям к стандартным образцам эталонная серия аллергена должна быть расфасована в ампулы и запаяна под вакуумом — это требование также внесено в СТО 00482909-0014-2006 Указанные требования снижают вероятность ошибки, возникающей за счет

снижения активности эталонной серии при длительном хранении в пени-циллиновых флаконах

Применение в качестве контроля образца Первого международного стандарта на (ППД) микобактериальный птичий туберкулин позволило установить снижение активности предыдущей контрольной серии туберкулина очищенного (ППД) для птиц № 12, изготовленной в соответствии с ГОСТ 23881-79 и расфасованной во флаконы При стандартизации туберкулина очищенного (ППД) для птиц в 2003 году в комиссионных испытаниях относительно Первого Международного стандарта на (ППД) микобактериальный птичий туберкулин была установлена активность серии № 12, она составила 500000 МЕ во флаконе

В таблице 6 представлены результаты комиссионных испытаний контрольной серии туберкулина очищенного (ППД) для птиц № 12 относительно Первого международного стандарта на (ППД) микобактериальный птичий туберкулин, выполненных в 2003-2007 гг

Таблица 6 — Оценка активности контрольной серии туберкулина очищенного (ППД) для птиц №12

Дата Добавлено растворителя во флакон, см3 Активность, МЕ/см3 Содержание МЕ во флаконе Относительная активность Я и доверительный интервал (р = 0,95)

2003 год 10 50000 500000 1,01 (68 -146) %

2007 год 10 38000 380000 0,76 (71-140)%

Из данных таблицы б видно, что если при стандартизации туберкулина очищенного (ППД) для птиц в 2003 г в комиссионных испытаниях относительно Первого Международного стандарта на (ППД) микобактериальный птичий туберкулин была установлена активность серии № 12 — 500000 МЕ во флаконе, то в опытах по оценке активности серии № 12 относительно Первого Международного стандарта на (ППД) микобактериальный птичий туберкулин, проведенных в 2007 году, содержание единиц активности в одном флаконе составило 380000 МЕ То есть при хранении лиофилизирован-ного туберкулина контрольной серии во флаконах его активность в течение четырех лет снизилась на 20 — 25 %

Еще одна причина возникновения возможных ошибок при определении активности туберкулинов, заложенная в требованиях ГОСТ 23881-79, — тит-рация новой контрольной серии по отношению к активности, предшествовавшей контрольной серии Такой подход может сопровождаться постепенным накоплением ошибки В целях исключения указанных недостатков разработанный нами стандарт организации СТО 00482909-0014-2006 предус-

матриваст важные нововведения выбор эталонной серии не из производственных серий, а ее отдельное изготовление, расфасовка препарата в ампулы и запайка их под вакуумом, определение активности эталонного образца только по сравнению с Первым международным стандартом на (ППД) ми-кобактериальный птичий туберкулин

На ФГУП «Курская биофабрика» согласно требованиям СТО 00482909-0014-2006 «Стандарт туберкулина очищенного (ППД) для птиц (эталонный образец) Технические условия» с применением методов мембранной технологии была изготовлена новая эталонная серия туберкулина очищенного (ППД) для птиц № 13а Препарат расфасован в ампулы, сублимирован и запаян под вакуумом

Оценку активности эталонного образца проводили по отношению к Первому международному стандарту на (ППД) микобактериальный птичий туберкулин

Относительная активность (II) эталонного образца туберкулина очищенного (ППД) для птиц серии № 13а составила 1,02 при доверительных границах эксперимента 63 - 158% Согласно требованиям СТО 00482909-0014-2006 «Стандарт туберкулина очищенного (ППД) для птиц (эталонный образец) Технические условия» величина Я при определении активности эталонных серий должна быть равна 1,0 ± 0,2 при доверительных границах эксперимента 50% — 200% (р=0,95). На рисунке 6 представлены прямые титрации эталонной серии туберкулина очищенного (ППД) для птиц № 13а и Первого международного стандарта на (ППД) микобактериальный птичий туберкулин

ф Эталонная серия ту бс р к ул и н а ( П П Д ) для птиц серия 13а

Первый международный стандарт на (ППД) микобактериальный птичий ту беркулкм

I д Р

0,7

Рисунок 6 — Зависимость диаметров ответных реакции ГЗТ от логарифмов доз введения Первого международного стандарта на (ППД) микобактериальный птичий туберкулин и эталонной серии туберкулина (ППД)

для птиц № 13а

Совпадение прямых титрации указывает на равенство величины активности сравниваемых образцов аллергенов

Согласно результатам комиссионного испытания в одной ампуле эталонного образца туберкулина очищенного (ППД) для птиц серии № 13а, изготовленной 11 10 2007 г, содержится 190000 МЕ

Таким образом, в соответствии с требованиями международной нормативной документации для контроля коммерческих серий туберкулина очищенного (ППД) для птиц изготовлена и проконтролирована относительно Первого международного стандарта на (ППД) микобактсриальный птичий туберкулин новая эталонная серия № 13а

2 3 Сравнительное изучение биологических свойств отечественного туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении и туберкулинов зарубежных фирм изготовителей

Для оценки качества аллергена, выпущенного согласно нормативной документации, разработанной в соответствии с международными требованиями, нами были проведены работы по сравнительной оценке опытных серий туберкулинов (ППД) для птиц, изготовленных ФГУП «Курская биофабрика», и туберкулинов, выпускаемых другими европейскими производителями Эксперименты по оценке активности и специфичности проводили на морских свинках В таблице 7 и на рисунке 7 представлены результаты сравнительных испытаний активности туберкулинов

Таблица 7 - Показатели активности туберкулинов (ППД) для птиц, изготовленных различными производителями

Производитель туберкулина Наименование препарата Заявленная активность, МЕ/см3 Результат контроля активности исследуемых образцов, МЕ/см3

«Ш-Ье1уз1ас1», Нидерланды Туберкулин Аушге 2000 20000 19000

«Вюу^а» Чехия Туберкулин АуциЬа! 28000 28000 18000

Курская биофабрика, Россия Туберкулин очищенный (ППД) для птиц 25000 22000

Как видно из представленных данных, активность отечественного туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении, изго-

товленного из расчета содержания единиц активности Первого международного стандарта на (ППД) микобактериальный птичий туберкулин - 25000 МЕ в 1 см3, соответствовала допустимым границам варьирования величины относительной активности аллергена Я, установленным Руководством МЭБ и Европейской Фармакопеей - 75% — 133%.

При оценке специфичности сравниваемых образцов данный показатель для аллергена, изготовленного на ФГУП «Курская биофабрика» составил 1,3% при максимально допустимом значении 10%, что подтвердило высокое качество отечественного туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении.

Таким образом, гармонизация нормативных документов, определяющих показатели качества туберкулина очищенного (ППД) для птиц, с требованиями международных документов и усовершенствование методик контроля аллергодиагностикума позволили обеспечить выпуск туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении, не уступающего по качественным характеристикам препаратам, выпускаемым за рубежом.

14 1......................................................

1.3 - I

^12- Допустимые границы относительной

£ активности туберкулина

| (ППД) для птиц согласно 11Д

I 0,9 ...................

5 0,8 ¡Ш-Ш* - V

10.7 Т.....Н---Т................-

I 0,6

| 0,5

I °'4

оГ 0,3 о 7

ол

О - -I-- --- -

«ГО - Ье^асЬ «В1оуе1а» Курская

Нидерланды Чехия биофабрика

Допустимые границы относительной активности туберкулина (ППД) для птиц согласно НД

М!

1! I

Рисунок 7 - Оценка активности туберкулинов (ППД) для птиц в стандартном разведении, изготовленных различными производителями

выводы

1 Разработанная технология изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц обеспечивает суммарное повышение выхода препарата (на 40-50 %) по сравнению с выходом доз аллергена при существующей технологии

2 Применение методов мембранного фракционирования белков культу-ральной жидкости М avium позволяет за счет снижения содержания в туберкулине (ППД) для птиц балластных антигенов снизить реактогенность аллергена

3 Использование методов мембранной фильтрации при очистке белков туберкулина очищенного (ППД) для птиц обеспечивает возможность стандартизации белков препарата по молекулярной массе в интервале от 3 до 300 кДа

4 Применение 8% концентрации раствора ТХУ при осаждении туберку-лопротеина из культуральной жидкости М avium позволяет увеличить выход препарата на 15 - 20%

5 Установлена оптимальная величина концентрации белка в отечественном препарате туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении (0,5 — 0,6 мг/см3), соответствующая активности препарата, принятой международными нормативными документами, продемонстрирована стабильность жидкой формы диагностикума при хранении

6 В соответствии с международными требованиями разработана и утверждена нормативная документация для изготовления и контроля туберкулина очищенного (ППД) для птиц, позволяющая обеспечить ветеринарную практику препаратом с допустимым разбросом активности, сниженным в пять раз по сравнению с разбросом активности аллергена, выпускаемого согласно требований ГОСТ 23881-79

7 Внедрение мембранных методов в технологию изготовления туберкулина (ППД) для птиц позволило повысить экологическую безопасность производства за счет исключения из технологии шихтных фильтров, снизить потребление и сброс воды

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты исследований отражены в утвержденной нормативно технической документации

- Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0014-2006 Стандарт туберкулина очищенного (ППД) для птиц (эталонный образец) Технические условия, согласованный ФГУ ВГНКИ 05 06 2006 г ,

- Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0011-2006 Туберкулин очищенный (ППД) для птиц Технические условия, утвержденный Россельхознадзором 03 04 2007 г ,

- Инструкция по применению туберкулина сухого очищенного (ПГТД) для птиц (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика), утвержденная Россельхознадзором 03 04 2006 г , per номер ПВР-1-3 0/00425,

- Инструкция по применению туберкулина очищенного (ППД) для птиц , стандартный раствор (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика), утвержденная Россельхознадзором 03 04 2007 г , per номер ПВР 1-2 5/01620,

- Временная инструкция по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для птиц, утверждена генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика» 11 апреля 2007 г

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Безгина, Н В Изготовление туберкулина ППД для птиц в стандартном разведении с применением методов мембранной технологии / Безгина Н В , Ничвеева Л Д , Суханов В П , Козлов BE// Материалы международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России, 21-22 сентября 2006 г - Курск - 2006 - С 98-100

2 Безгина, Н В Оценка качественных показателей туберкулина ППД для птиц в стандартном разведении / Безгина Н В , Ничвеева Л Д , Козлов BE// Материалы международной юбилейной научно-практическои конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России, 21-22 сентября 2006 г - Курск -2006 - С 93-98

3 Безгина, Н В Оценка стабильности туберкулина ППД для птиц в стандартном разведении / Безгина Н В // Ветеринария — 2007 — № 8 — С 6-9

4 Безгина, Н В Применение методов мембранного фракционирования для повышения качественных показателей аллергенов применяемых при диагностике туберкулеза / Безгина Н В // Ветеринарная патология — 2008 - № 1 - С 15-17

Формат 60x84'/1б Бумага офсетная Печать офсетная Уел п л 1,28 Тираж 120 экз Заказ 3204

Отпечатано в МУП «Курская городская типография», г Курск, ул Ленина, 77

Актуальность работы. Туберкулез животных составляет большой удельный вес в инфекционной патологии, причиняя значительный экономический ущерб сельскому хозяйству. Международный ветеринарный кодекс МЭБ определяет туберкулез как заболевание, требующее обязательного декларирования. Борьба с этим зооантропонозным заболеванием имеет не только экономическое, но и социально-гигиеническое и эпидемиологическое значение [23,71]. Необходимость своевременного выявления больных туберкулезом сельскохозяйственных животных предусмотрена Федеральным Законом РФ №77 - ФЗ от 18.06.2001 «О предупреждении распространения туберкулеза в Российской Федерации», наряду с мероприятиями в системе здравоохранения.

В последнее время все большее внимание уделяется заболеваниям^ вызванным нетуберкулезными микобактериями — микобактериозам. В многочисленных исследованиях показано, что в условиях иммунодефицитных состояний М. avium является одним из основных инфекционных агентов, определяющих развитие патологии [39]. Кроме того, микобактерии птичьего вида вызывают микобактериозы, которые поражают грызунов, свиней и приматов. Клиника течения этих заболеваний сходна с туберкулезом. Успех борьбы с туберкулезом определяется многими факторами, важнейшим из которых является своевременное проведение диагностических мероприятий, направленных на выявление и удаление из оздоравливаемых стад больных животных, представляющих собой основной источник возбудителя болезни [51, 83, 89]. В настоящее время наиболее важным и широко применяемым прижизненным методом исследования на туберкулез является аллергический метод с использованием туберкулиновых препаратов, вызывающих у инфицированных животных реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

В международной практике для диагностики туберкулеза человека и животных используются, в основном, туберкулины, выпускаемые в жидкой форме, стандартизованные по содержанию международных единиц активности.

В Российской Федерации для диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных применяют туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих и туберкулин очищенный (ППД) для птиц. Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих выпускается в виде стандартного раствора, что соответствует форме выпуска туберкулинов, применяемых в странах Европейского Союза. Туберкулин очищенный (ППД) для птиц, согласно ГОСТ 23881-79, изготавливается в сублимированном виде с прилагаемым к нему растворителем. Растворение сухого туберкулина в условиях хозяйства не всегда обеспечивает соответствие стандартной дозы используемого препарата, что может приводить к искажению результатов реакции ГЗТ; кроме того, в условиях животноводческих помещений возможна контаминация препарата посторонней микрофлорой.

В то же время вхождение России во Всемирную Торговую Организацию (ВТО) требует обязательной стандартизации выпускаемых биологических препаратов и унификации методов контроля с общепринятыми международными требованиями. В связи с этим, наряду с вопросом изменения формы выпуска туберкулина очищенного (ППД) для птиц, возникла необходимость гармонизации технических требований к аллергодиагностикуму. Действующий в настоящее время в нашей стране нормативный документ ГОСТ 23881-79 «Туберкулин сухой очищенный (ППД) для птиц», разработанный 30 лет назад, отличается от аналогичных документов, принятых Европейским Союзом и международными организациями (OIE Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals. Fifth Edition, 2004, European Pharmacopoeia, Fourth Edition, 2002).

Вместе с тем, изменение требований к туберкулину очищенному (ППД) для птиц в стандартном разведении требует модернизации технологии его изготовления, применения валидируемых процессов. Для решения данной проблемы наиболее перспективны методы мембранной технологии. При исключении применения химических реагентов и протекая в щадящих условиях, мембранные методы позволяют внедрять современные технологические приемы очистки белка, а также в значительной степени решать проблемы экологической безопасности производства.

Таким образом, внедрение современных технологических процессов при изготовлении туберкулина очищенного (ППД) для птиц и разработка нормативных документов, определяющих качество аллергена в соответствии с требованиями МЭБ [164] и ЕФ [112], крайне перспективно при решении задач выпуска отечественного диагностикума, не уступающего по качественным характеристикам зарубежным аналогам.

Целью исследования являлось совершенствование технологических этапов изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц с применением мембранных методов, разработка нормативной документации для контроля и выпуска препарата в соответствии с международными требованиями.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Разработать методы мембранного фракционирования и очистки белков туберкулина очищенного (ППД) для птиц и изучить иммунобиологические свойства белковых фракций препарата.

2. Провести сравнительный анализ выхода белков туберкулина очищенного (ППД) для птиц на различных производственных этапах его изготовления при использовании мембранных методов фракционирования и существующей технологии.

3. Определить оптимальную концентрацию белка в растворе туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении и изучить стабильность жидкой формы диагностикума.

4. Разработать нормативную документацию на туберкулин очищенный (ППД) для птиц, соответствующую международным требованиям.

5. Провести сравнительное изучение активности и специфичности отечественного туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении, изготовленного в соответствии с международными требованиями, и туберкулинов зарубежных фирм-изготовителей.

Научная новизна. Разработан комплекс промышленных методов для производства туберкулина очищенного (ППД) для птиц, позволяющий снизить содержание балластных антигенов в препарате и повысить выход целевого продукта.

Впервые определено, что антигены туберкулина очищенного (ППД) для птиц с молекулярной массой более 300 кДа обусловливают высокий уровень реактогенности препарата.

Впервые установлено, что оптимальное значение концентрации ТХУ для полного осаждения специфичных и активных белков туберкулина из культуральной жидкости М. avium составляет 8%.

Практическая значимость.

1. Предложена технология изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц с применением методов мембранного фракционирования.

2. В соответствии с международными требованиями разработана и утверждена нормативная документация для изготовления и контроля туберкулина очищенного (ППД) для птиц.

3. Согласно разработанной нормативной документации, гармонизированной с требованиями МЭБ, изготовлен и откалиброван относительно Первого международного стандарта на (ППД) микобактериальный птичий туберкулин отечественный эталонный образец туберкулина очищенного (ППД) для птиц.

4. С применением предложенной технологии изготовлено две серии туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении. Отечественный препарат, выпущенный в соответствии с международными требованиями, по качественным характеристикам не отличался от зарубежных аналогов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Комплекс методов для изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении, позволяющий повысить эффективность производственного процесса и качественные характеристики препарата.

2. Результаты исследований туберкулина очищенного (ППД) для птиц и эталонного образца туберкулина очищенного (ППД) для птиц, выполненные с применением нормативных документов, разработанных в соответствии с международными требованиями, предъявляемыми к качеству аллергенов для диагностики туберкулеза.

Апробация работы. Основные положения и выводы диссертационной работы были доложены и обсуждены на:

- Международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 110-летию Курской биофабрики и агробиологической промышленности России — г. Курск, 21-22 сентября 2006 г.

- Всероссийской научно-практической конференции «Региональные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса» — г. Курск, 20-22 марта 2007 г.

- Научно-техническом совете ФГУП «Курская биофабрика» 12 февраля 2008 г.

Публикации результатов работы. По материалам диссертации опубликовано 4 научные статьи.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 157 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 23 таблицами, 12 рисунками. Диссертационная работа включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Список используемой литературы включает 194 источника, из них 89 отечественных и 105 иностранных.

выводы

1. Разработанная технология изготовления туберкулина очищенного (ППД) для птиц обеспечивает суммарное повышение выхода препарата (на 4050%) по сравнению с выходом доз аллергена при существующей технологии.

2. Применение методов мембранного фракционирования белков культуральной жидкости М. avium позволяет за счёт снижения содержания в туберкулине (ППД) для птиц балластных антигенов снизить реактогенность аллергена.

3. Использование методов мембранной фильтрации при очистке белков туберкулина очищенного (ППД) для птиц обеспечивает возможность стандартизации белков препарата по молекулярной массе в интервале от 3 до 300 кДа.

4. Применение 8% концентрации раствора ТХУ при осаждении туберкулопротеина из культуральной жидкости М. avium позволяет увеличить выход препарата на 15 — 20 %.

5. Установлена оптимальная величина концентрации ' белка в ч отечественном препарате туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном разведении (0,5 - 0,6 мг/см3), соответствующая активности препарата, принятой международными нормативными документами; продемонстрирована стабильность жидкой формы диагностикума при хранении.

6. В соответствии с международными требованиями разработана и утверждена нормативная документация для изготовления и контроля туберкулина очищенного (ППД) для птиц, позволяющая обеспечить ветеринарную практику препаратом с допустимым разбросом активности, сниженным в пять раз по сравнению с разбросом активности аллергена, выпускаемого согласно требованиям ГОСТ 23881-79.

7. Внедрение мембранных методов в технологию изготовления туберкулина (ППД) для птиц позволило повысить экологическую безопасность производства за счёт исключения из технологии шихтных фильтров, снизить потребление и сброс воды.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты исследований отражены в утвержденной нормативно-технической документации:

- Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0014-2006 Стандарт туберкулина очищенного (ППД) для птиц (эталонный образец) Технические условия, согласованный ФГУ ВГНКИ 05.06.2006 г.;

- Стандарт ФГУП «Курская биофабрика» СТО 00482909-0011-2006 Туберкулин очищенный (ППД) для птиц Технические условия, утвержденный Россельхознадзором 03.04.2007 г.;

- Инструкция по применению туберкулина сухого очищенного (ППД) для птиц (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика — фирма «БИОК»), утвержденная Россельхознадзором 03.04.2006 г., per. номер ПВР-1-3.0/00425;

- Инструкция по применению туберкулина очищенного (ППД) для птиц, стандартный раствор (Организация-производитель ФГУП «Курская биофабрика — фирма «БИОК»), утвержденная Россельхознадзором 03.04.2007 г., per. номер ПВР 1-2.5/01620;

- Временная инструкция по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для птиц, утвержденая генеральным директором ФГУП «Курская биофабрика — фирма «БИОК» 11 апреля 2007 г.