Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Оптимизация системы подготовки производственных штаммов возбудителя туберкулеза при изготовлении очищенного туберкулина для млекопитающих

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОШССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТШЮ И ЗАК7ПКАМ

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-КОНТРОЛЬНЫЙ ИШТИТУТ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

АУШТРОВА КАРИНА НОДАРОВНА

УДК 619:616.982.211-078

ОПТИМИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ ПОДГОТОВКИ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ 1УЕЕЕОТЕЗА ПИ ИЗГОТОВЛЕНИИ ОТИЦЕНЮГО ТУБЕРКУЛИНА ДЛЯ ШЕКОШГГАШЩ

16.00.03 - ветеринарная шщробиологпя, вирусология, ЭПИЗООТОЛОГИЯ, ШГОЛОГЕЯ н нкаунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

На права! рукописи

Москва - 1991

Работа выголнена в лаборатории контроля и стандартизации препаратов против туберкулеза, псевдо- и паратуберкулеза НГНКИ ветпрепаратов

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук

A.Н.ШАРОВ

Официальные оппонента: доктор ветеринарных наук

Н.П.ОЙДИЕНКО (БИЭВ) кандидат ветеринарных наук

B.Ф.ЕШКО (ВНИИВС)

Ведущее 'учреждение - Украинский научно-исследовательский

институт экспериментальной ветеринарии (г.Харьков)

Защита диссертации состоится * *_1991 года

в_часов на заседании специализированного совета Д 120.85.01

по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзной ордена Трудового Красного Знамени государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов Главного управления ветеринарии Государственной комиссии Совета Министров СССР го продовольствию и закупкам го адресу:

123022. Москва, Звенигородское шоссе, 5, НГНКИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НГНКИ.

Автореферат разослан "_"__1991 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Ю.А.КОЗЫРЕВ

I. ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность теш. Успех борьбы с туберкулезом живот-их определяется многими условиями, среди которых наиболее валим является тщательное проведение комплексных мероприятий, на-равленных, главным образом, на выявление я удаленпе из оздоравлн-аемых стад больных аивотных, так как они являются основный зточником возбудителя болезни.

Для этой цела в качестве основного метода диагностики ту-;ркулеза применяют аллергический метод - туберкулиновую пробу.

В нашей стране для диагностики туберкулеза у ылекопитащих ¡пользуют туберкулин очищенный (1ВД) для ылекопитавдих.

Известно, что качество туберкулина в большой степени влн-1Т на эффективность аллергической диагностики туберкулеза у зогаых. Технология получения ППД-Туберкулина представляет сой сложный многостадийных процесс, каждый этап которого требует шения тех или иных проблем. Разработка очищенного (ППД) тубер-лпна решила проблем активности препарата (зе1Ъвгг, 1932, 34, 1955) и в настоящее время, в связи с широкий распространен сенсибилизации животных атипичными шшобактерияип, главным казателем качества туберкулина стала его видовая специфичность, го рая ыояет зависеть от свойств производственных штаммов воз-оителя туберкулеза (Б.А. Лянда-Геллер, 1965; Р.Н.Родионова, 55, 1973; С1о^ва et в1., 1971).

В соответствии с Инструкцией по изготовлению и контролю 5еркулина очищенного (ППД) для млекопитающих" ВГНКИ ветпрепа-■ов каждые 4-5 лет пассирует культуру производственного шташа :будителя туберкулеза через организм крупного рогатого скота шсы&^ет ее на биопредприятие для изготовления туберкулина, биопредприятии культуру поддергивают путем последовательных

пересевов каждые 3 месяца на картофельной среде Павловского и адаптирует к синтетической питательной среде (нодаЗицированно: среда Сотона).

Дня изготовления препарата используют культуры на синтет: ческой питательной среде до четырнадцатой генерации. Если учи тывать период адаптации культуры к этой среде, в процессе кот рой проводят 5-7 последовательных пересевов, количество генер ций достигает более 20. Наблюдения за производственными посевами на бибфабрике показали, что через 12-14 последовательных пересевов культуры на синтетической среде появляются признаки диссоциации в виде увлажненности, рыхлости пленки, образовали тягей, помутнения среды, что указывает на изменение свойств культуры. Эти изменения шгут отразиться на качестве туберкулина, на его видовой специфичности.

Научного обоснования возможности длительного поддержания культуры возбудителя туберкулеза без риска вызвать изменения ее свойств в литературе нет.

При изготовлении коммерческих серий очищенного туберкули на Курской биофабрике культуру возбудителя туберкулеза вырапца вают на синтетической питательной среде с ъ-аспарагином, кото рый закупается в зарубежных странах. Это создает значительные трудности экономического характера для производства и в целок для страны.

1.2. Цель и задачи исследования. Основной целью настояще исследования является оптимизация системы подготовки произвол ственного штамма возбудителя туберкулеза бычьего вида для изг товления туберкулина.

Ддя достижения поставленной цели были определены следующие основные задачи:

1. Изучить влияние количества пересевов на синтетической питательной среде па морфологические, культуралыше, ферментативные свойства культуры, на ее вирулентность, сенсибилизирующие свойства и антигенную спевд<|ичность.

2. Определить зависимость накопления бшиассы, накопления белка, белкового состава культуральпой пщяога от количества пересевов иикобактерий туберкулеза на синтетической питательной среде.

3. Изучить влияние количества пересевов культур возбудителя туберкулеза па синтетической питательной среде па активность и видовую спецаЗдчность изготавливаемого из них туберкулина.

4. Отработать иетодаку быстрой адаптации культуры к синтетической питательной среде.

5. Подобрать среду высушивания для глгкобактерий туберкулеза, сбеспечпвапцуз наибольшую сохранность гивнх клеток в процессе хранения:

- отработать методику получения готагенкой взвеси и определения в ней количества клеток;

- определить выживаемость культуры при хранении в лиофзли-зярованноы виде.

6. Проверить эффективность использования лнофилизированной культуры, адаптированной к синтетической питательной среде, в

в производстве при изготовлении туберкулина.

7. Изготовить эталонную серию возбудителя туберкулеза бычьего вида штамма й 8 в лнофилпзированнои виде для изготовления ■туберкулина.

' 8, Определить возможность использования аспарагина отечественного цроизводства для изготовления туберкулина.

1.3. Научная новизна. Впервые изучено влияние многократных последовательных пересевов производственных штаммов возбудителя туберкулеза бычьего вида иа синтетической питательной среде на отдельные свойства культур в на «йчество изготавливаемого ив них туберкулина. Установлено, что кэлмество пересевов не влияет на активность изготавливаемого «уберйузиаа* но с увеличением этого количества снижается видовая специфичность препарата.

Установлено стабилизирующее действие шрофосфата натрия и Твина-80 на взвесь клеток микобактерий туберкулеза, а также относительная стабильность взвеси в дистиллированной воде.

1.4. Практическая значимость. Разработана и внедрена в производство оптимальная система подготовки производственных штаммов возбудителя туберкулеза бычьего вида для изготовления туберкулина, обеспечивапцая стандартность используемой культуры. Способ подготовки культуры признан рационализаторским предиогением.

Разработан способ стабилизации взвеси шкобактерий туберкулеза, что монет быть использовано в научных исследованиях и в практической деятельности лабораторий.

Установлена пригодность применения Ь-аспарагина отечественного производства.для приготовления туберкулина.

Результаты исследований вошш в изменения и дополнения к "Инструкции,оэ изготовлении и контроле туберкулина очищенного (ППД) для шекопитавдих", утвержденные Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР 2.10.87 г., а таете в проект новой "Инструкции по изготовлению е контроло туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих". Проект рассмотрен и одобрен на научно-техническом Совете Государственной, Курской биофабрики 14.II.89 г.

1.5. Апробация работа. Материалы диссертационной работы до доге нн и получили положительную оценку:

на У1, 7П и X конференциях шлоднг ученых ВГНКИ ветпрзпа-ратов (1985, 1986, 1988);

- на конференции молодых ученнх ВНИИТИШ (1985);

- на меалаборагорном совещании научных сотрудников ВГНКИ вэтпрепаратов (1990).

1.6. Публикации. По материала« диссертации опублидоваду 2 научные работы.

1.7. Объем работы. Диссертация изложена па 158 страпдсях глалэнописного текста и включает: введение, обзор литературу, юбственяыз исследования, обсуддение полученных результатов, завода, практические предложения, список лигературц л пригоге»-злэ. Работа пллюсгрнровеца 21 табдоцеЗ з 14 pncyiœaïa. Сшзсок :с.тгользованноЗ литературу включает 293 источника, из них 114 ет тпссгркшнх языках.

2. МАТЕИШШ И ГЛЕТОДЫ КССЛЕЛОВАНИй

Работа была проведана в 1985-198? гг. в лаборатории конт-;оля п стандартизации препаратов против туберкулеза, пара- а ;севдотуберкулеза ВГНКИ ветпрепаратов го заданию 03.I9.LI, в да>-ораторлз мзлекулярной биологии и биохимии БИЭВ, в опытном хо-яйстве ВГНКИ ветпрепаратов "Манихино", на Курсгой биофабрике в неблагополучных ш туберкулезу хозяйствах.

В работе были использованы следупцие питательные среды: шзтетическая питательная среда Курской биофабрснш, среда Ле-енштейна-Пенсена, среда Левештейна-Йенсена с салшдаовцу д&т-гогл, картофельная среда Павловского, мясо-пентонный атдр,, шсо-ептондай бульон.

- Бшш использованы юрские свинки массой 350-400 г в количестве 543 голов; ролики массой 2,5-3,0 кг в количестве 84 голов ; крупный рогатый скот неблагополучных по туберкулезу хозяйств в количестве 230 голов.

В работе были использованы штаммы возбудителя туберкулеза бычьего вида гё 8 и Уа11ее, применяемые в производстве при изготовлении очищенного туберкулина для млекопитающих.

Морфологию и тинкториадьные свойства клеток изучали путем окраски мазков по Цшш-Нильсену и просмотре в световом микроскопе в иммерсионной система.

Культуралъные особенности и скорость роста изучали на синтетической питательной среде Курской биофабрики, а таете на среде Левенштейна-Йенсена, гасо-пептонноы агаре и шсо-пептон-ном бульоне.

Каталазную активность определяли го методике и.Таиселтга (1966).

Для дифференциации и.Ъот1о от условно патогенных микобак-терий использовали тест с салициловым натрием (Методические указания по биохимической и бактериологической идентификации макобактерий, 1965).

Для получения стабильной взвеси культуры испытывали в качестве стабилизатора: 0,5% и 1% растворы пирофосфата натрия, 10%, 20% и 2Ь% растворы Твина-80, готовили взвесь на физиологическом растворе и дистиллированной воде. На КФО определяли коэффициент пропускания исследуемых взвесей. Использовали кювету с расстоянием между рабочими гранями 10 ш, при поглотителе I.

Для определения степени вирулентности культур исследуемых генераций проводили заражение морских свинок и кроликов в дозе 0,01 мг голувлахной массы культуры в I мл физиологического рас-

зора. О вирулентности изучаемой культуры судили по гакроскопи-гской картине, наблюдаемой на вскрытии животных, убитых через месяц после заражения. Результаты учитывали да индексу пора-¡нности внутренних органов (Е.Ф.Чернушенко с со авт., 1984).

Сенсибилизирующие свойства были изучены у культур всех ис-шдованных генераций. Ыорских свинок и кроликов, зараженных ими культурами, исследовали с применением контрольных серий Щ-туберкулина для илекопитающих в дозе 40 ТЕ и комплексного иергена из атипичных микобактерий (КАИ) в дозе 10 ЕД. Аллер-!Еы вводили внутрикожно юрским свинкам в бока слева и справа, юликам в середине наружной поверхности каждого уха.

Реакцию на введение туберкулина учитывали через 24 часа и [енивали у юрских свинок ш величине среднего диаметра папулы, ¡разующейся в месте инъекции препарата, у кроликов - ш вели-не эритемы.

Никросерии туберкулина готовили в лабораторных условиях культур I, У, X, ХУ, XX, Ш и XXX генераций штакмэв № 8 ^аЦев, ращенных на синтетической питательной среде, в соответствии "Инструкцией да изготовлению и контролю туберкулина очищенного ЦД) для млекопитающих", утвержденной ГУВ Госагропрома СССР .12.85 г.

Готовили также серии туберкулина из культур, выращенных синтетической питательной среде с отечественным ь-аспараги-м в производственных условиях (работа проводилась совместно специалистами Курской биофабрика В.М.Безгиным, Е.Н.Солодовым, Б.Козловым и В.А.Алехиным).

Накопление белка в культуральной жидкости я в готовом пре-рате определяли ш методу Лоури и методом рефрактометрии. Ука-

заниыЗ метод разработан на Курской биофабрике и применяется при изготовлении туберкулина.

Накопление бактериальной массы в культуральной жидкости определяли методом высушивания навески до постоянного веса.

Электрофорез в полиакриламидном геле проводили го методике Л.А.Остермана (1981) (работа проводилась совместно со с.н.с. ВИЭВ Г.И.Устиновой).

Активность туберкулиаов определяли на морских свинках-альбиносах, сенсибилизированных культурой НД, в сравнении с контрольной серией ППД-туберкулина для млекопитающих. Сравнительную активность туберкулина выражали в процентах к активности контрольной серии препарата.

При проверке активности туберкулина на крупном рогатом скоте препарат вводили животным неблагопэ лучного по туберкулезу хозяйств внутривожно с одной стороны шеи в дозе 0,2 мг в объеме 0,2 мл растворителя. С другой стороны шеи вводили контрольную серию туберкулина в дозе 10000 ЫЕ/0,2 мл. Реакцию учитывали через 72 часа в оценивали го утолщению кохной складки. Различие в проявлении реакции определяли методом критерия знаков (И.П. Ашмарин, А.А.Воробьев, 1962).

Видовую специфичность туберкулинов определяли на юрских свинках-альбиносах, зараженных М.avium и Н.intrazellulare , в сравнении с контрольными сериями.

Для изготовления эталонной серии культуры хз шташа И 8 использовали расплодку, выращенную ва среде Курской биофабрики в течение 15 дней. Для лиоЗялизапии культуры были использованы 1,5% раствор глютамаха натрия, сахарозо-желатиновая среда и среда ППМ (разработанная с.н.с. П.Н.Рубченковым).

Концентрацию жизнеспособных клеток определяли в исходной взвеси культуры (на стадии полуфабриката), сразу после высушивания из замороженного состояния и в разные сроки хранения (при разйых температурах: 4, 20, 37, 45 °С).

Лиофилизащю проводили на сублимавдонной установке ат-2 (ФРГ).

Экспериментальный материал подвергнут статистической обработке по И.П.Ашмарину, А.А.Воробьеву (1962), И.Т.Шевченко с со-авт. (1970) и Ю.К.Баюн (1988) с применением вычислительной техники (МК-52).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение культуральных, морфологических и ферментативных свойств культур

В шрфологичесгом отношении культуры штаммов & 8 и УаНаа I п У генерации соответствовали классическим формам. Они представляли собой тонкие прямые или изогнутые палочки средней .цтя (3,5 мкн) и толщины (0,4 ыкм), встречались таете некислотоус-гойчивые формы микобактерий. В мазках из культур 60-дневного возраста палочки были гораздо короче (2,5 мен). Культуры 7-1 генераций характеризовались полиморфными формами, попадались гакаэ дегенеративные формы, количество которых возрастало в последующих генерациях. В пазках из культур ХХ-ХХХ генераций пре-збладалп в основном полиморфные формы. Палочки были гораздо короче (1,5-2,0 мкм). Кроме того, значительно возросло число не-шслотоустойчивых форы, количество которых достигало 20$ от >бщего числа клеток.

При посеве культур исследованных генераций на ША и ЫПБ юста р° наблюдалось, на среде Левенштейна-Йенсена через 2-3

недели появлялиь характерные колонии микобактерий. Колонии бшш матовые, цвета слоновой кости, сухие, крошковатые.

При культивировании на синтетической питательной среде Курской биофабрики культуры I-ХУ генераций образовывали на поверхности среды нежную сухую складчатую пленку на 14-15 день культивирования, а культура последующих генераций образовывали сплошную пленку на 10-12 день, но пленка становилась более грубой и толстой. При пересеве такой пленки на синсреду- она. крошилась и тонула'. Кроме того, наблюдался рост "островками". От куска пересаженной грубой пленки образовался ш кругу нежный слой мэлодых клеток. Такие посевы были неоднородными по внешнему виду пленки.

Каталагная активность у культур 15-дневного возраста не повышалась с увеличением количества генеравдй ж снижалась у 60-дневных культур до 3-4 ш.

Наблюдения показали, что чувствительность исследуемых культур к салипдлату натрия с увеличением числа генераций на синтетической питательной среде не изменилась. Роста на этой среде ве было о I по XXX генерации.

3.2. Определение степени вирулентности культуры

При осмотре и патологоанатомическом исследовании морских свинок через месяц после заражения культурам I, У, X, ХУ, XX, ХХУ я XXX генераций во всех случаях наблюдались туберкулезные изменения во внутренних органах: у кроликов эти изменения бшш выражены несколько слабее.

При сравнительной оценке излученных результатов было уста иовлево, что микобактерва туберкулеза бычьего вида штатов JS 8 и Vaiiee в процессе многократных пересевов на синтетической

питательной среде сохраняют свою вирулентность дня юрских свинок Е кроликов.

3.3. Испытание методов получения стабильной взвеси культуры

При отработке условий получения взвеси культуры, установлено стабилизирующее действие на взвесь клеток 1% раствора хш-рофосфата натрия и 25% раствора Твина-80.

3.4. Сенсибилизирующие свойства культур и антигенная специфичность

При сравнительной оценке полученных результатов сенсибилизирующих свойств культур и видовой специфичности аллергии у зараженных животных установлено, что шкобактерин туберкулеза в процессе многократных пересевов на синтетической питательной среде сохраняют свою антигенную специфичность. Сенсибилизирую-. щие свойства культур, определяемые чувствительностью инфицированных животных к туберкулину в интенсивностью реакции на препарат, не изменились. Видовая специфичность аллергии также ве менялась: реакции у животных бшш выражена в большей степени на туберкулин, чем на КАМ.

3.5. Туберкузшногешшз свойства культур р>азЕых генераций и качество туберкулинов, изготовленных из этих культур

В культурах Х-2ХХ генераций, выращенных в течение 60 дней на синтетической питательной среде, южно отметать тенденцию к обзему увеличению накопления бахшсси у птаммов 5 8а 7а11ос соответственно от 11,5 до 13,9 а от 9,4 до 12,7 г/л. Содероыше

белка у культур обоих штаммов первоначально увеличивается, а затем резко снижается (рис.1, 2).

I У X ЗУ XX ОТ ИХ

ГЕНЕРАЦИЯ

I У X ХУ XX ХХУ XXX

ГЕНЕРАЦИЯ

Рис.1. Накопление белка в куль- Рис.2. Накопление белка в куль-

Дпя изучения физико-химических свойств туберкулинов, полученных из культур разных генеращй, использовали электрофорез в ШАГ. Тубэркулшш, полученные из культуральных ф1льтратов 1-Х генераций, ш содержанию количества фракций не отличаются от стандартной серии туберкулина. Белковый спектр туберкулинов Х-ХУ генеращй идентичен, отклонения в подвижности гомологичных фракций незначительны (± 0,03 ил). С увеличением количества генераций о XX до XXX количество фракций сокращается с 16-19 до 3-П.

туральном фильтрате штамма £ 8.

туральном фильтрате шташа УеЦее.

3.6. Определение активности и видовой специфичности туберкулинов

Была изготовлены и исследованы туберкулина из культур штамма Л 8.

Анализ гоказал, что на введение туберкулинов свинкам, сенсибилизированным и. Ъот1з, во всех случаях реагировало равное количество животных и препараты практически не отличаются по своей активности. Это говорит о том, что многократные пересевы культур на синтетической питательной среда не влияют на активность изготовленного из нее препарата.

Как гоказаяо на рис. 3, относительная видовая специфичность туберкулинов из X и последующих генераций культуры снизалась в сравнении с препаратами, изготовленными из культур I и 1 генераций. С увеличением числа генераций интенсивность реакции у гетерологичво сенсибилизированных шрских свинок на ту-Зеркулинн, изготовленные из культур этих генераций, повышалась.

3.7. Определение качества туберкулина, изготовленного на среда с отечественным ь-аспарагином

В связи с налаживанием нового производства аспарагина в ПО "Еиолар", были проведены исследования по определению качества этого препарата и возможности использования его в биологи-еской промышленности.

С этой целью на Курской биофабрике были изготовлены опитые серии туберкулина для млекопитающих на синтетической пита-ельной среде с использованием аспарагина отечественного произ-эдства с проведением анализа на всех этапах приготовления пре-арата.

- интенсивность реакции в %% к контролю

Рис.3. Видовая специфичность туберкулинов на морских свинках, сенсибшшрованных н. ау1ии.

Шт

Шм»,

>>

II 11

Контроль ППД птиц

ы

■

При сравнении испытуемых серий по содержанию белка и накопления бакмассы с туберкулинаш, изготовленными на синероде с зарубежным препаратом,' разницы обнаружено не было.

В таблице I представлен химический состав сухих очищенных туберкулинов разного производства.

Таблица I

Химический состав сухих очищенных туберкулинов разного производства

Наименование Содержание {%)

туберкулина белов ¡полисаха- ; Гриды нуклеиновые кислоты

Международный стандарт pjd-з 82,9 5,9 1.2

Медицинский стандарт Pro-L 72, S 16,0 3,7

ППД-туберкулин Курской биофабрики 73,4 2,1 1,3

Туберкулин ECB 76,7 3,4 1,2

Испытуемый туберкулин 79,8 8,3 0,09

Сравнивая испытуемые серии туберкулина с другими аналогичными препаратами - международным стандартом рго-э, отечественным медицинским и ветеринарным, можно сделать вывод, что по химическому составу все они не имеют принципиальных отличий.

Проверка биологических свойств испытуемых серий туберкулина аа интактных морских свинках и здоровом крупном рогатом скоте показала, что препарат не обладает реактогенныыи свойствами: при рчете реакции у морских свинок через 24 часа и у крупного рогатого скота через 72 часа в месте внутрикожпого введения туберку-шна никаких изменений кош не обнаружено.

Активность двенадцати проверенных серий по содержания ;,Е

туберкулина, определяемая ш севсийализированннх шрскшс свинках, была равиа <51555 + 29S5) Ш.

При испытнашш тубераршноз на 230 головах больного туберкулезом крупного рогатого сжота установлено, что из двенадцати серий туберкулина, иасртовлйшоро с ¡применением отечественного L-аспарагина, восемь <csja£ .соответствовали по активности стан-1 дартной серии препарата ж четыре серии превосходили стандарт по интенсивности вызнвакзй зши реакции у больных животных (р< Ъ%).

Ло количеств/ гивотлых в группах, реагирующих на испытуе- . ше е стандартную -серии зуберкулина, а также по интенсивности вызываемых иш реакций, статистически достоверной разнили не было (р> 0,05?); утолщение кожной складка достигало в среднем 7,8-11,2 мл.

Проверка впдовой специфичности восьми испытуемых серий туберкулина в сравнении с туберкулином для птиц и KAU на морских •сванках-аяьбпносех, сенсибилизированных II. aviua а ü.iatraceliular

показала,' что интенсивность реакции у всех нивотшх была более на

вырадена аллергены, гомологичные виду заражающей культуры.

3,8. Разработка метода получения эталонной серди производственного штампа возбудителя туберкулеза

Способы сохранения культуралышх, вирулентных, ишуноген-нкх и других свойств микроорганизмов путем поддержания их на питательных средах далеко не совершенны, так как под влиянием искусственных условий существования культуры могут изменяться.

На биопредприятии культуру, полученную из ЕГНКИ, поддерживают путем пересева раз в три месяца на картофельной среде Павловского, адапт'/.руэт к синтетической питательной среде и готовят из нее туберкулин.

В процессе пересевов на картофельной и синтетической среде свойства культуры меняются, что может отразиться на качестве губеркулина, однако эти изменения обнаруживаются поздно.

Нашими исследованиями установлено, что после X генерации гультуры на синтетической питательной среде снижается видовая шеци^ичность туберкулина.

В связи с этим, для предупреаденпя нежелательных изменений ультуры, была разработана методика получения эталонной серии роизводственного штамма возбудителя туберкулеза в лиофилизиро-

анном виде, которая тжег быть использована на биопредприятии »

эз предварительной адаптации культура к синтетической питатель-эй среде.

Первым этапом напггх исследований в разработке методики поучения эталонной серии производственного штамма возбудителя ту-¡ркулеза в лиофиллзпрованном виде было испытание ускоренной [аптадяи культуры к синтетической питательной среде. Для этого ла сокращена существующая схема адалталзи за счет исключения да промежуточных пересевов на жидкие картофельную и мясные тательнке среды; для посева на синтетическую питательную срё-использовали пленку культуры, выросшую на растворе глицерина рто^ельной среды Павловского.

Следующим этапом разработки было приготовление гомогенной )еси культуры для последующей лио^ализащи ее в-ампулах.

Для лио&илизации культуры,, как было упомянуто выше, были итаны три среды высушивания, в частности:-.1,5? раствор глю-ата натрия; сахарозо-желатиновая среда и среда' ППМ.

После лио^илизании отбирали по 3 ампулы с яаждой средой' ушивания и проверяли процент выгивших клеток по отношению зходноуу количеству клеток до лнофклизадаи. -

Данные приведены в таблице 2, из которой видно, что очень большой процент клеток погибает непосредственно после диофили-зацян культуры. Культуры, лиофилизнрованные в сахарозо-желати-новой среде и в растворе глютамата натрия, незначительно отличается ш количеству погибших клеток. Самый большой процент гибели приходится на культуру, лиофилизированную на среде ППМ. В этом случае после лиофшшзащш в живых осталось только 1,1% клеток.

Таблица 2

Количество жизнеспособных клеток после лиофилизации

Среда высушивания ¡Количество :клеток до :лаофщшзацшх ¡Количество .'клеток после даофшшзацаи ; Выжва-.; е^ть

Глютамаг натрия 306,7x10е 55,7x10е 25,4

Сахарозо-желатиновая 238,2x10® 66,5x10е 27,1

ттш 241,0x10е 18,5x10е 7,7

Отмирание клеток происходит такие в процессе хранения культуры через 5 мае выдергивания при 4 °С. Количество их на среде глютшата натрая снижалось в 6 раз.

Губительно действует на клетки также повышенная температура хранение. В среде с глатыгатои натрия полное отмирание их наблюдалось ври 45 °С через 2 нес, а при 37 °С - через 4 мес. Несколько большая выживаемость клеток при этих условиях наблюдалась при использовании осхарозо-аелатиновой среды.

В то же время, через II мес хранения (срок наблюдения), в ампулах сохранялось достаточно большое количество живых клеток для получения обильного роста культуры на картофельной среде Павловского.

Кал следует из полученных данных, с учетом возможных ошибок определения, при хранении лиоЗилизированной культуры происходит значительное отмирание клеток. Анализируя эти данные, . можно сказать-, что и глютамаг натрия, и сахарозо-желатиновая среда высушивания обладают приблизительно одинаковыми криоцро-текторнмги свойствами. Следует отметить трудность определения выживаемости гликобактерий туберкулеза, связанную со свойствами возбудителя.

3.9. Испытание эталонной серии при изготовлении! туберкулина в производственных условиях

В результате проведенной работы получена эталонная серия культуры производственного шташа возбудителя туберкулеза бычьего вида Я 8, которая хранится в лиофилизированном виде и для приготовления туберкулина на биопредприятии не требует дополнительной адаптации к синтетической питательной среде.

В соответствии с разработанной ИТД, допускается применять для приготовления туберкулина культуру не более десятой генерации на синтетической питательной среде, затем требуется вновь брать ампулу лло$илизированно2 культура и готовить из нее мат-риксную расплодку.

Курская биофабрика при производстве препарата использует только эталонную серию культуры, получаемую из ЕМКИ, что в значительное мере способствует получению стандартных да своему качеству сери»; туберкулина.

выводы

1. Многократные последовательные пересевы возбудителя туберкулеза бычьего вида на синтетической питательной среде

не влияют на сенсибилизирующие и вирулентные свойства культуры, накопление бактериальной массы в кудьтуральном фильтрате и активность изготовленного туберкулина.

После X генерации изменяются культуральные, морфологические и тинкториалыше свойства культуры, снижается видовая специфичность туберкулина, изготовленного из этих культур.

После XX генерации уменьшается накопление белка в культу-ральном фильтрате микобактерий, сокращается белковый спектр изготовленных из них туберкуодшов.

2. Оптимизация системы подготовки производственных штаммов микобактерий туберкулеза' бычьего шда при производстве туберкулина достигается предварительной адаптацией культуры к синтетической питательной среде и ее лио^лизацией. Для изготовления туберкулина молет быть использована культура не более X генерации на синтетической питательной среде.

3. ь-аспарагин отечественного производства цригоден для выращивания культуры возбудителя туберкулеза бычьего вида с целью изготовления туберкулина.

4. Стабилизация взвеси клеток микобактерий достигается добавлением в суспензию 25% раствора Твина-80 или 1% раствора пнрофосфата натрия, а также суспендгрования культуры в дистиллированной воде.

5. При шл. ¡злизации микобактерий туберкулеза в качестве среды высушивания могут быть использовапы раствор глит-амата натрия и сахарозо-желатиновая среда.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПВДЩОШИЯ

На основанш проведенных исследований разработана и внедрена оптимальная система подготовки производственных штаммов возбудителя туберкулеза бычьего вида для изготовления туберкулина, обеспечивающая стандартность используемой культуры. Способ подготовки культуры признан рационализаторским предложением. Экономический эффект от внедрения предложения составил 1511 руб.в год.

Для лиофилизахии культуры возбудителя туберкулеза отобрана сахарозо-желатиновая среда высушивания и 1,5% раствор глютамата натрия, обеспечивающие наибольшую выживаемость микобактерий в процессе хранения культуры.

Разработан способ стабилизации взвеси культуры ьмкобакте-рий туберкулеза, что может быть использовано в научных исследованиях и в практической деятельности лабораторий.

Результаты исследований вошли в изменения и дополнения к "Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих", а также в проект новой "Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих".

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕЛЗ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ауштрова К.Н. Влияние многократных пересевов и.Ъот1з

[а синтетической питательной среде на свойства культуры // Павловой научно-производственный опыт в биологической проышлен-ости.- 1983.- № 12.- С.9-11.

2. Ауштрова К.Н. Зависимость свойств возбудителя туберку-еза при ююгократном пересеве // Контроль качества бпологи-2сш:х вг.терлнарных препаратов.- 1966,- С.70-73.