Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Оптимизация системы подготовки производственных штаммов возбудителея туберкулеза для изготовления очищенного туберкулина для млекопитающих

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВОЛЬСТВИЮ И ЗАКУПКАМ

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-КОНТРОЛЬНЫЙ ИШТИ1УТ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

На правах рукописи

АУШТРОВА КАРИНА НОДАРОВНА

УДК 619:616.982.211-078

ОПТИМИЗАЦИЯ СИСТЕМЫ ПОДГОТОВКИ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ ВОЗВДШШ ТУБЕРКУЛЕЗА ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ ОЧИЩЕННОГО ТУБЕРКУЛИНА ДЛЯ МЛЕКОПИТАЩИХ

16.00.03 - ветеринарная гикробпологпя, вирусология, эпизоотология, шшэдогея а Еныунологпя

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кацдпдата ветеринарных наук

Москея - 1991

л9 ^ »» '

Работа выполнена в лаборатории контроля и стандартизации препаратов против туберкулеза, псевдо- и паратуберкулеза НГНКИ ветпрепаратов

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук

A.Н.ШАРОВ

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук

Н.П.ОВДИЕНКО (БИЭВ) кандидат ветеринарных наук

B.Ф.ЕШКО (ВНИИВС)

Ведущее учрездение - Украинский научно-исследовательский

институт экспериментальной ветеринарии (г.Харьков)

Защита диссертации состоится " лхиСл # 1991 года

в /з'^часов на заседании специализированного совета Д 120.85.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов Главного управления ветеринарии Государственной комиссии Совета Министров СССР ш продовольствии и закупкам го адресу:

123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, БПШИ.

С диссертацией южно ознакомиться в библиотеке НГНКИ.

Автореферат разослан

- -а^ра^д 199! года.

¡7

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Ю.А.КОЗЫРЕВ

-'1 . ' .

( I. ОВДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

I

1.1. Актуальность темы. Успех борьбы с туберкулезом животных определяется многими условиями, среди которых наиболее вая-[шм является тиательное проведение комплексных мероприятий, направленных, главным образом, на выявление и удаление из оздорзвли-ваешх стад больных аивотных, так как они являются основный юточншюм возбудителя болезни.

Для этой цели в качестве основного метода диагностики ту-5еркулеза применяют аллергический метод - туберкулиновую пробу.

В нашей стране дня диагностики туберкулеза'у илекопитащнх гспользуют туберкулин очищенный (ППЦ) для млекопитающих.

Известно, что качество туберкулина в большой степени влн-[ет на эффективность аллергической диагностика туберкулеза у яботенх. Технология получения ППД-Туберкулнна представляет со-ой слозпвй многостадийных процесс, каждый этап которого требует эиення тех или иных проблем. Разработка очищенного (ППД) тубер-улшт решила проблему активности препарата (зе1Ъегг, 1932, 934, 1955) и в настоящее время, в связи с широким распростране-аеи сенсибилизации швотшх атипичными микобактериямп, главным эказателем качества туберкулина стала его видовая специфичность, это рая ионе? зависеть от свойств производственных ттаююв воз-дателя туберкулеза (Б.А. Дянда-Гедлер, 1965; Р.Н.Родионова, 565, 1973; С1о^еа ег ей., 1971).

В соответствии с Инструкцией по изготовлению и контролю гберкулина очищенного (ШД) для млекопитающих" ЕГНКИ ветпрепа-иов каядие 4-5 лет пассирует культуру производственного штамма 13 будите ля туберкулеза через организм крупного рогатого скота высылает ее на биопреддриятие для изготовления туберкулина. 1 биопредприятии культуру поддергивают путей последовательных

пересевов яаздые 3 месяца ва картофельной среде Павловского и адаптируют к синтетической питательной среде (модифицированной среда Сотона).

Дня изготовления препарата используют культуры на синтети ческой питательной среде до четырнадцатой генерации. Если учитывать период адаптации культуры к этой среде, в процессе кото рой проводят 5-7 последовательных пересевов, количество генера пай достигает более 20. Наблюдения за производственными посевами на бибфабрпке показали, что через 12-14 последовательных пересевов культуры на синтетической среде появляются признаки диссоциации в виде увлажненности, рыхлости пленки, образования тягей, помутнения среды, что указывает на изменение свойств культуры. Эти изменения шгут отразиться на качестве туберкулина, на его видовой специфичности.

Научного обоснования возможности длительного поддержания культуры возбудителя туберкулеза без риска вызвать изменения ее свойств в литературе нет.

При изготовлении коммерческих серий очищенного туберкулзп на Курской биофабрике культуру возбудителя туберкулеза выращивают на синтетической питательной среде с ь-аспарагином, который закупается в зарубежных странах. Это создает значительные трудности экономического характера для производства и в целом для страны.

1.2. Цель и задачи исследования. Основной взлъю настоящез исследования является оптимизация системы подготовки производственного штамма возбудителя туберкулеза бычьего вида для изг< товления туберкулина.

Для достижения поставленной цели были определены слелущие основные задачи:

1. Изучить влияние количества пересевов на синтетической питательной среде на морфологические, куль тур альние, ферментативные свойства культуры, на ее вирулентность, сенсибилизирующие свойства и антигенную специфичность.

2. Определить зависимость накопления баньгасси, накопления белка, белкового состава культурадъной аидкосги от количества пересевов микобактерий туберкулеза на синтетической питательной среде.

3. Изучить влияние количества пересевов культур возбудителя туберкулеза ез. синтетической питательной среде на активность и видовую специфичность изготавливаемого из них туберкулина.

4. Отработать методику быстрой адаптации культуры к синтетической питательной среде.

5. Подобрать среду высушивания для шкобактернй туберкулеза, обеспечивающую наибольшую сохранность кивых клеток в процессе хранения:

- отработать методику получения го'лэгешой взвеса я определения в ней количества клеток;

- определить выживае:я>сть культуры при храпении в лиофзли-знрованнои виде.

6. Проверить эффективность использования лиофшшзированндй культуры, адаптированной к синтетической питательной среде, в

в производстве при изготовлении туберкулина.

7. Изготовить эталонную серию возбудителя туберкулеза бычьего вида птаима !Ь 8 в лиофилнзирозанноы виде для изготовления туберкулина.

' 8. Определить возможность использования аспарагина отечественного производства для изготовления туберкулина.

1.3. Научная новизна. Впервые изучено влияние многократных последовательных пересевов производственных штаммов возбудителя туберкулеза бычьего вида на Синтетической питательной среде на отдельные свойства культур и На качество изготавливаемого из них туберкулина. Установлено, что кмшчеотво пересевов не влияет на активность наготавливаемого туберкулина4 но с увеличением этого количества снижается видовая специфичность препарата.

Установлено стабилизирующее действие парофэсфата натрия ж Твина-80 на взвесь клеток микобактерий туберкулеза, а также относительная стабильность взвеси в дистиллированной воде.

1.4. Практическая значимость. Разработана и внедрена в производство оптимальная система подготовки производственных штаммов возбудителя туберкулеза бычьего вида для изготовления туберкулина, обеспечивающая стандартность используемой культуры. Способ подготовки культуры признен рационализаторским предложением.

Разработан способ стабилизации взвеси шкобактерий туберкулеза, что может быть использовано в научных исследованиях и в практической деятельности лабораторий.

Установлена пригодность применения 1,-аспарагина отечест-. венного производства.дая приготовления туберкулина.

Результаты исследований вошли в изменения и дополнения к "Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ШШ для млекопитающих", утвержденные Главным управлением ветеринарии Госагроцрома СССР 2.10.87 г., а также в проект новой "Инструкции по изготовлению к контролю туберкулина очищенного (1ВД) для млекопитающих".; Проект рассмотрен и одобрен на научно-техническом Совете Государственной, Курской биофабрики 14.II.89 г.

1.5. Апробация работа. Материалы диссертационной работы • доложены и получили положительную оценку:

на У1, УД и X конференциях иэлоднх ученых БГНКИ ветпрепаратов (1985, 1986, 1988);

- на конференции молодах ученых ЕНШТИШ (1985) ;

- на мезлабораторнсм совещании научных сотрудников БГНКИ ветпрепаратов (1990).

1.6. Публикации. По катерлалан диссертации опубляковаду 2 научные работы.

1.7. Объем работа,. Ддссертащш изложена па 158 странзитд машношсного текста и включает: введение, обзор литературу, собственный исследования, обсуждение полученных результатов, выводи, практические предложения, список литературы л прилоиг-ine. Работа иллюстрировала 21 таблицей s 14 рисунками. Список гдпользованнай латературу включает 293 источника, из них 114 ет гтасстращшх языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была проведена в 1985-1987 гг. в лаборатории контроля п стандартизации препаратов против туберкулеза, пара- л псевдотуберкулеза ЕГНКИ ветпрепаратов по заданию 03.I9.M, в лаборатории молекулярной биологии л биохимии EI3B, в опытном хозяйстве БГНКИ ветпрепаратов "Нанихшго", на Курской биофабрике и в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах. 1 В работе были использованы следующие питательные среди: синтетическая питательная среда Курской биофабрнки, среда Ле-венитейна-йенсена, среда Левенштейна-Йенсена с салициловым да.т-pr:ci,-j, картофельная среда Павловского, мясо-пептонкый агар,, йясо-пептошшй бульон.

' Были использованы юрские свинки массой 350-400 г в количестве 543 голов; кролики массой 2,5-3,0 кг в количестве 84 голов ; крупный рогатый скот неблагополучных по туберкулезу хозяйств в количестве 230 голов.

В работе были использованы штаммы возбудителя туберкулеза бычьего вида £ 8 и Vallée, применяемые в производстве при изготовлении очищенного туберкулина для шекопитагщих.

Ыорфологйю и тинкториальные свойства клеток изучали путем окраски мазков по Цшзд-Нильсену и просмотре в световом микроскопе в иммерсионной системе.

Культуральные особенности и скорость роста изучали на синтетической питательной среде Курской биофабршш, а также на среде Левзнштейна-Йенсена, кясо-пептонном агаре и мясо-пептон-ном бульоне.

Каталазную активность определяли по методике м.Таиоаамга (1966).

Для дифферент пики M.bovis от условно патогенных микобак-терий использовали тест с салициловым натрием (Методические указания по биохимической и бактериологической идентификации микобактерий, 1965).

Для получения стабильной взвеси культуры испытывали в качестве стабилизатора: 0,5^ и 1% растворы пирофосфата натрия, 1С#, 2С# и 25% растворы Твина-80, готовили взвесь на физиологическом растворе и дистиллированной воде. На KÎO определяли коэффициент пропускания исследуемых взвесей. Использовали кювету с расстоянием между рабочими гранями 10 да, при поглотителе I.

Для определения степени вирулентности культур исследуемых генераций проводили заражение морских свинок и кроликов в дозе 0,01 мг полувлажной массы культуры в I ыл физиологического рас-

гвора. О вирулентности изучаемой культуры судили по »екроскопи-ческой картине, наблюдаемой на вскрытии животных, убитых через Г месяц после заражения. Результаты учитывали по индексу пора-хенности внутренних органов (Е.Ф.Чернушенко с соавт., 1984).

Сенсибилизирующие свойства были изучены у культур всех исследованных генерашй. Морских свинок и кроликов, зараженных этими культурами, исследовали с применением контрольных серий ШД-туберкулина дам млекопитающих в дозе 40 ТВ и комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) в дозе 10 БД. Аллергены вводили внутрииожно юрским свинкам в бока слева и справа, ■фоликам в середине наружной поверхности каждого уха.

Реакцию на введение туберкулина учитывали через 24 часа и уценивали у юрских свинок по величине среднего диаметра папулы, >бразующейся в месте инъекции препарата, у кроликов - по велящие эритемы.

Микросерии туберкулина готовили в лабораторных условиях га культур I, У, X, ХУ, XX, ХХУ и XXX генераций штаммов * 8 ж 7еЛ1ев, шращенных на синтетической питательной среде, в соответствии ; "Инструкцией го изготовлению и контролю туберкулина очищенного [ЩД) для млекопитающих", утвержденной ГУВ Госагропрома СССР 30.12.85 г.

Готовили также серии туберкулина из культур, выращенных ш синтетической питательной среде с отечественным ь-аспараги-юм в производственных условиях (работа проводилась совместно ¡о специалистами Курской биофабриви В.Ы.Безгиным, Е.Н.Солодовым, }.Е.Козловым и В.А.Алехиным).

Накопление белка в культуральной жидкости и в готовом пре-шрате определяли по методу Лоура и методом рефрактометрии. Ука-

занный метод разработан на Курс вой биофабрике и применяется при изготовлении туберкулина.

Накопление бактериальной массы в культуральной жидкости определяли методом высушивания навески до постоянного веса.

Электрофорез в полиакрилашдном геле проводили по методике Л.А.Остерыана (1981) (работа проводилась совместно со с.н.с. ШЭВ Г.И.Устиновой).

Активность туберкулинов определяли на морских свинках-альбиносах, сенсибилизированных культурой ВДК, в сравнении с контрольной серией ППД-туберкулина для млекопитающих. Сравнительную активность туберкулина вырахали в процентах к активности контрольной серии препарата.

При проверке активности туберкулина на крупном рогатом скоте препарат вводили животным неблагополучного по туберкулезу хозяйств внутрикохно с одной стороны шеи в дозе 0,2 мг в объеме 0,2 ил растворителя. С другой стороны шеи вводили контрольную серию туберкулина в дозе 10000 МЕ/0,2 мл. Реакцию учитывали через 72 часа и оценивали ш утолщению кожной складки. Различие в проявлении реакции определ дли методом критерия знаков (И.П. Ашыаргн, А.А.Воробьев, 1962).

Видовую специфичность туберкулинов определяли на морских свинках-альбиносах, зараженных м. avium и Н.lntr ncellulare , в сравнении с контрольными сериями.

Для изготовления эталонной сера культуры из шташа £ 8 использовали расплодку, выращенную на среде Курской биофабрики в течение 15 дней. Для лиофялизашн культуры были использованы 1,5% раствор глютаыата натрия,сазарозо-хелатиновая среда и среда ШШ (разработанная с.н.с. П.Н.Рубченковым).

Концентрации жизнеспособных клеток определяли в исходной взвеси культуры (на стадии полуфабриката), сразу после высушивания из замороженного состояния и в разные сроки хранения (при разных температурах: 4, 20, 37, 45 °С).

Лиофшшзапию проводили на сублимационной установке ст-2 (ФРГ).

Экспериментальный материал подвергнут статистической обработке по И.П.Ашмарину, А.А.Воробьеву (1962), И.Т.Шевченко с со-авт. (1970) и Ю.К.Баюн (1988) с применением вычислительной техники (МК-52).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение культуральных, морфологических и ферментативных свойств культур

В иорфологичесгам отношении культуры птаммов JS 8 п Valles I и У генерации соответствовали классическим формам. Они представляли собой тонкие прямые пли изогнутые палочка средней длины (3,5 мкм) и толщины (0,4 мкм), встречались также некислотоустойчивые формы ыикобактерий. В мазках из культур 60-дневного возраста палочки были гораздо короче (2,5 мкм). Культуры У-Х генераций характеризовались полиморфными формами, попадались также дегенеративные формы, количество которых возрастало в последующих генерациях. В мазках из культур ХХ-ХХХ генераций преобладали в основном полиморфные формы. Палочки были гораздо короче (1,5-2,0 мкм). Кроме того, значительно возросло число некислотоустойчивых форм, количество которых достигало 2С# от общего числа клеток.

При посеве культур исследованных генераций на ША и ЫПБ рома, де наблюдалось, на среде Левенштейна-Йенсена через 2-3

недели ноявлшшь характерные колонии ыикобактерий. Колонии были патовые, цвета слоновой кости, сухие, крошковатые.

При культивировании на синтетической питательной среде Курской биофабрики культуры 1-ХУ генераций образовывали на поверхности среды нежную сухую складчатую пленку на 14-15 день культивирования, а культуры последующих генераций образовывали сплошную пленку на 10-12 день, но пленка становилась более грубой и толсто&. При пересеве такой пленки на синсреду- она. крошилась и тонула'. Кроме того, наблюдался рост "островками". От куска пересаженной грубой пленки образовался та кругу нехиый слой юлодых клеток. Такие посевы были неоднородными по внешнему виду щенки.

Каталазная активность у культур 15-дневного возраста не повышалась с увеличением количества генераций и снижалась у 60-дневных культур до 3-4 ш.

Наблюдения показали, что чувствительность исследуемых культур и салилидату натрия с увеличением числа генераций на синтетической питательной среде не изменилась. Роста на этой среда не было о I по XXX генерации.

3.2. Определение степени вирулентности культуры

При осмотре и патологоанатоыическоы исследовании морских свинок через месяц после заражения культурами I, У, X, ХУ, XX, ХХУ я XXX генераций во всех случаях наблюдались туберкулезные изменения во внутренних органах: у кроликов эти изменения были выражены несколько слабее.

При сравнительной оценке полученных результатов было установлено, что микобактерии туберкулеза бычьего вида штаммов № 8 и Yaii.ee в процессе многократных пересевов на синтетической

питательной среда сохраняют свою вирулентность для мэрских свинок и кроликов.

3.3. Испытание методов получения стабильной взвеси культуры

При отработке условий получения взвеси культуры, установлено стабилизирующее действие на взвесь меток 1$ раствора пи-рофэсфата натрия и 2Ъ% раствора Твина-80.

3.4. Сенсибилизирующие свойства культур и антигенная специфичность

При сравнительной оценке полученных результатов сенсибилизирующих свойств культур и видовой специфичности аллергии у зараженных животных установлено, что ыикобактеряи туберкулеза в процессе многократных пересевов на синтетической питательной среде сохраняют свою антигенную специфичность. Сенсибилизирую-. щие свойства культур, определяемые чувствительностью инфвдро-ванных животных к туберкулину ж интенсивностью реакции на препарат, не изменились. Видовая специфичность аллергии также не менялась: реакции у животных были выражена в большей степени на туберкулин, чем на КАМ.

3.5. Туберкулиногенные свойства культур разных генераций и качество туберкулинов, изготовленных из этих культур

В культурах I-JQCX генераций, выращенных в течение 60 дяей на синтетической питательной среда, можно отметить тенденцию к общему увеличению накопления бакмассы у штамгюв * 8 и Valise соответственно от 11,5 до 13,9 и от 9,4 до 12,7 г/л. Содержание

белка у культур обоих штаммов первоначально увеличивается, а затем резко снижается (рис.1, 2).

I У I и П ПУШ

ГЕНЕРАЦИЯ

I У X 21 XX ГХУ XXX ГЕНЕРАЦИЯ

Рис.1. Накопление белка в культур альном фильтрате иташа £ 8*

Рис.2. Накопление белка в культур альыом фильтрате штамма УаИее.

Для изучения физико-химических свойств туберкулинов, полученных из культур разных генераций, использовали электрофорез в ЛА ар, Туберкулины, полученные из культуральных фильтратов 1-Х генераций, по содержанию количества фракций не отличаются от -стандартной серии туберкулина. Белковый спектр туберкулинов Х-ХУ генераций идентичен, отклонения в подвижности гомологичных фракодй незначительны (± 0,03 мм). С увеличением количества генераций с XX до XXX количество фракций сокращается с 16-19 до 9-11.

3.6. Определение активности и видовой специфичности туберкулинов

Бшш изготовлены и исследованы туберкулины из культур штамма # 8.

Анализ показал, что на введение туберкулинов свинкам, сенсибилизированным и.ЪотПа, во всех случаях реагировало равное количество животных и препараты практически не отличаются по своей активности. Это говорит о том, что многократные пересевы культур на синтетической питательной среда не влияют на активность изготовленного из нее препарата. •

Как показано на рис. 3, относительная видовая специфичность туберкулинов из I и последупдих генераций культуры снижалась в сравнении с препаратами, изготовленными из культур I и У генераций. С увеличением числа генераций интенсивность реакции у гетерологично сенсибилизированных морских свинок на туберкулины, изготовленные из культур этих генераций, повышалась.

3.7. Определение качества туберкулина, изготовленного на среде с отечественным ь-аспарагином

В связи с налаживанием нового производства аспарагина в ШО "Еиолар", были проведены исследования по определению качества этого препарата в возможности использования его в биологической промышленности.

С этой целью на Курской биофабрике были изготовлены опытные серии туберкулина для млекопитающих на синтетической питательной среде с использованием аспарагина отечественного производства с проведением анализа на всех этапах приготовления препарата.

10|100 90 8180

70

60 50 40 30 20 1С

- исследовано

|- реагировали

1 I-

Л

интенсивность реакции в^к контролю

У X Л

Рио.З. Видовая специфичность туберкулинов на морских свинках, сенсибшшрованных Ы. аг1ии.

Контроль ППД птиц

При сравнении испытуемых серий по содержанию белка и накопления баккассн с туберкулинами, изготовленными на синсредо с зарубежным препаратом,' разницы обнаружено не было.

В таблице I представлен химический состав сухих очищенных туберкулинов разного производства.

Таблица I

Химический состав сухих очищенных туберкулинов разного производства

Наименование Содержание (.%)

туберкулина белов ;полпсаха- | :риды : нуклеиновые кислоты

Международный стандарт РТС-3 82,9 5,9 1,2

Медицинский стандарт гаы 72,6 15,0 3,7

ППД-туберкулин Курской биофабрики 73,4 2,1 1,3

Туберкулин ЕИЭВ 76,7 3,4 1,2

Испытуемый туберкулин 79,8 8.3 0,09

Сравнивая исштуеше серии туберкулина с другими аналогичными препаратами - международным стандартом ?и>-5, отечественным медицинским и ветеринарным, можно сделать вывод, что по химическому составу все они не имеют принципиальных отличий.

Проверка биологических свойств испытуемых серий туберкулина на интактннх морских свинках и здоровом крупном рогатом скоте показала, что препарат не обладает реактогеннши свойствами: при учете реакции у морских свинок через 24 часа и у крупного рогатого скота через 72 часа в месте внутрикозгаого введения туберкулина никаких изменений кожи не обнаружено.

Активность двенадцати проверенных серий по содержанию МЗ

туберкулина, определяемая еа сйлсибшшзировавных шрских свинках, была равна (51555 ± 2995)

При испытнанил ^йо^зпшаз ^ 230 головах больного туберкулезом крупного рогамга еяота установлено, что из двенадцати серий туберкулина, пзиомвденното -с применением отечественного Ь-аспарапша, восемь «грей -соответствовали по активности стан-* дартпой серии препарата ж четыре серии превосходили стандарт по интенсивности вызываемой ш реакции у больных штатных (р< Ъ%).

По количеству аивэтлых в группах, реагирующих на испытуе- . кыа и стандартную серж туберкулина, а такяе по интенсивности вызываемых ими реакций, статистически достоверной разницы не было (р> 0,05#); утолщение кожной складки достигало в среднем 7,8-11,2 ш.

Проверка видовой спедафичностп восьш испытуемых серий туберкулина в сравнении с туберкулином для птиц и КАЫ на морских •свинках-альбиносах, сенсибилизированных и. ь-/1ип и ы. 1п1;гаое:1.1и1охе

показала,' что интенсивность реакция у всех животных была более на

выракена аллергены, гомологичные виду зарааавдей культуры.

3,8. Разработка метода получения эталонной серии про-изводотаенного штамма возбудителя туберкулеза

Способы сохранения культуралышх, вирулентных, ишуноген-нкх ц других свойств микроорганизмов путем шдцерпаяия их на питательных средах далеко не совершенны, так как под влиянием искусственных условий существования культуры могут изменяться.

На биопредприятии культуру, полученную из БГНКИ, поддерживают путем пересева раз в три месяца на картофельной среде Павловского, адаптируют к синтетической питательной среде и гото- • влт из нее туберкулин.

В процесса пересевов на картофельной и синтетической среде свойства культуры меняются, что моает отразиться на качестве туберкулина, однако эти изменения обнаруживаются поздно.

Нашими исследованиями установлено, что после X генерации культуры на синтетической питательной среде снижается видовая специфичность туберкулина.

В связи с этим, для предупреждения нежелательных изменений культуры, была разработана методика получения эталонной серии производственного штамма возбудителя туберкулеза в лиофализиро-ваином виде, которая шлет быть использована на биопредприятии без предварительной адаптации культуры к синтетической питательной среде.

Первш этапом напих исследований в разработке методики получения эталонной серии производственного штамма возбудителя туберкулеза в лиофализироваяном виде было испытание ускоренной адаптации культуры к синтетической питательной среде. Для этого Зила сокращена существующая схема адаптации за счет исключения зяда промежуточных пересевов на зидкие картофельную в мясные штательнке среды; для посева на синтетическую питательную срё-(у использовали пленку культуры, выросшую на растворе глицерина гартофельной среды Павловского.

Следующим этапом разработки было приготовление гомогенной звеси культуры для последующей лиоф&лизации ее в ампулах.

Для лиодилизации культуры, как было упомянуто выше, были ;питаны три среды высушивания, в частности: раствор глю-а:лата натрия; сахарозо-желатиновая среда и среда ППМ.

После лиофилизавди отбирали по 3 ампулы с каждой средой ¿сушвания и проверяли процент вызивших клеток по отношению исходно.^' количеству клеток до ллофилизаши.

Данные приведены в таблице 2, из которой видно, что очень большой процент клеток погибает непосредственно теле лио^нли-зацни культуры. Культуры, лпофилизнрованные в сахарозо-лелати-новой среде и в растворе глютамата натрия, незначительно отличаются по количеству погибших клеток. Самый большой процент гибели приходится на культуру, лиофшгзироваыную на среде НЕМ. В а том случае после лиофшшзацди в еиенх осталось только 1,1% клеток.

Таблица 2

Количество жизнеспособных клеток после лиофишзацаи

Среда высушивания ;Количество .'клеток до :лиофнллзадш1 ;Количество .'клеток после :лио4ялизации ; Выжив а: е?гь

Глютамат натрия 305,7x10е 55,7x10е 25,4

Сахарозо-желатнновая 238,2x10е 66,5хЮ6 27,1

ПШ 241,0x10е 18,5x10е 7,7

Отшрание клеток происходит тшае в процессе хранения культуры" через 5 мае выдерзивания црп 4 °С. Количество пх на среде глютамата натрия снижалось в 6 раз.

Губительно действует- на клетки также повышенная температура хранения. В среде с г лат агатом натрия полное отшрание их наблюдалось при 45 °С через 2 кес, а при 37 °С - через 4 мес. Несколько большая выживаемость клеток при этих условиях наблюдалась при использовании сахарозо-желатиновой среди.

В то же время, через II мес хранения (срок наблюдения), в ампулах сохранялось достаточно большое количество живых клеток дня получения обильного роста культуры на картофельной среде Павловского.

Как следует из полученных данных, с учетом возможных ошибок определения, при хранении лиофплизированяой культуры происходит значительное отмирание клеток. Анализируя эти данные, . можно сказать, что и глютамат натрия, и сахарозо-желатиновая среда высушивания обладают приблизительно одинаковыми щшопро-тектортми свойствами. Следует отметить трудность определения выживаемости микобактерий туберкулеза, связанную со свойствами возбудителя.

3.9. Испытание эталонной серии при изготовлениии туберкулина в производственных условиях

В результате проведенной работы получена эталонная серия культуры производственного штамма возбудителя туберкулеза бычьего вида № 8, которая хранится в лиофиллзированном виде и для приготовления туберкулина на биопредприятии не требует дополнительной адаптации к синтетической питательной среде.

В соответствии с разработанной НТД, допускается применять для приготовления туберкулина культуру не более десятой генерации на синтетической питательной среде, затем требуется вновь брать ампулу лио^слизирОЕанной культура г готовить из нее мат-риксную расплодку.

Курская биофабрика,при производстве препарата использует только эталонную серию культуры, получаемую из ЕГНКИ, что в значительно!: мере способствует получению стандартных по своему качеству серий туберкулина.

ВЫВОДЫ

1. Многократные последовательные пересевы возбудителя туберкулеза бычьего вида на синтетической питательной среде

не влияют на сенсибилизирующие и вирулентные свойства культуры, накопление бактериальной массы в культуральном фильтрате и активность изготовленного туберкулина. .

После X генерации изменяются культуралыше, морфологические и тинкториалыше свойства культуры, снижается видовая специфичность туберкулина, изготовленного из этих культур.

Поме XX -генерации уменьшается накопление белка в культуральном фильтрате микобактерий, сокращается белковый спектр изготовленных из них туберкулинов.

2. Оптимизация системы подготовки производственных штаммов микобактерий туберкулеза бычьего шда при производстве туберкулина достигается предварительной адаптацией культуры к синтетической питательной среде и ее лиофилизацией. Для изготовления туберкулина моает быть использована культура не более X генерации на синтетической питательной среде.

3. 1л-аспарагин отечественного производства пригоден для выращивания культуры возбудителя туберкулеза бычьего вида с целью изготовления туберкулина.

41 Стабилизация взвеси клеток микобактерий достигается добавлением в суспензию 25% раствора Твина-80 или 1% раствора пирофосфата натрия, а также суспендирования культуры в дистиллированной воде.

5. При ¿сг/злизацаи микобактерий туберкулеза в качестве среды высушивания шгут быть использованы 1,5% раствор глют-амата натрия и сахарозо-желатиновая среда.

• . 21 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПЮТСШШ

На основании проведенных исследований разработана и внедрена оптимальная система подготовки производственных штаммов возбудителя туберкулеза бычьего вида для изготовления туберкулина, обеспечивающая стандартность используемой культуры. Способ подготовки культуры признан рационализаторским предложением. Экономический эффект от внедрения предложения составил 1511 руб.в год.

Для лиофилизацаи культуры возбудителя туберкулеза отобрана сахарозо-келатиновая среда высушивания и 1,5% раствор глютагата натрня, обеспечивающие наибольшую выживаемость микобактерий в процессе хранения культуры.

Разработан способ стабилизации взвеси культуры микобактерий туберкулеза, что может быть использовано в научных исследованиях и в практической деятельности лабораторий.

Результаты исследований вошли'в изменения и дополнения к "Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих", а также в проект новой "Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих".

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ауштрова К.Н. Влияние многократных пересевов м. Ъоу±з на синтетической питательной среде на свойства культуры // Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности.- 19ВЗ,- й 12.- С.9-11.

2. Ауштрова К.Н. Зависимость свойств возбудителя туберкулеза прк кпогократном пересеве // Контроль качества биологических ветеринарных препаратов.- 1986.- С.70-73.