Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Симптоматика и патоморфология скрепи у овец при заражении эпизоотическим штаммом ВТ-91

На правах рукописи

САНДЖАЕВ ДОРДЖИ ДОРДЖИЕВИЧ

Симптоматика и патоморфология скрепи у овец при заражении эпизоотическим штаммом ВТ-91.

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных. 16.00.03- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 2005г.

Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко. (ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко) Научные руководители:

Кандидат биологических наук, Заслуженный ветврач Российской Федерации, лауреат Премии Совета Министров СССР, заведующий лабораторией физико-химических методов исследований и биотехнологии ВИЭВ Г. А. Надточей

Доктор ветеринарных наук, профессор, лауреат Премии Совета

Министров СССР

В. А. Шубин

Официальные оппоненты:

Заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветеринарных наук, профессор Юрий Дмитриевич Караваев (ВИЭВ). Доктор ветеринарных наук, профессор Геннадий Иванович Братин (МГУПБ).

Ведущая организация - МГАВМиБ им. К.И. Скрябина.

Защита диссертации состоится «/£Г»/^г&^Л^ 2003"г. в /4

часов на

заседании диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект 24,к.1, ВИЭВ. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко.

Автореферат разослан » 200-/Т\

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Н. П. Овдиенко

£ w j of з

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В последние два десятилетия пристальное внимание многих исследователей и общественности привлекают заразные губкообразные энцефалопатии. Это обусловлено рядом факторов. Во-первых возникновением в 1985 году эпизоотии губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота (ГЭ КРС) в Великобритании (Wells G.A.H., Scott A.C., Johnson С. 1987), которая к настоящему времени зарегистрирована в большинстве стран Европы, Канаде, Израиле и Японии. Эта инфекция нанесла колоссальный экономический ущерб Англии, Ирландии, Швейцарии и ряду других стран, но особое значение она приобрела с установлением факта заболевания ею людей (Brown Р., 1996., Collinge J. et al., 1996).

Первоисточником возникновения ГЭ КРС, по мнению специалистов Великобритании, явился возбудитель скрепи овец, попавший в корма коров с мясокостной мукой, в которой возбудитель скрепи был инактивирован не полностью.

Среди других причин, вызывающих интерес исследователей к губкообразным энцефалопатиям животных и человека являются необычные свойства их возбудителей, представляющих собой особый класс инфекционных агентов - прионы, которые кардинально отличаются от известных патогенных микроорганизмов. Прионы являются белками, кодируемыми геномом клетки. Патогенной изоформой нормальные прионы становятся после изменения конформационной структуры (Prusiner S.B. 1984).

На территории Российской Федерации ГЭ КРС не зарегистрирована. Но страна проводит импорт мясных продуктов и мяса из стран, где эта болезнь зарегистрирована, ввозит также племенной скот. Все это создает постоянную угрозу заноса болезни на территорию страны.

Кроме того на территории страны регистрируется скрепи овец, являющаяся прионной болезнью. Скрепи регистрировали (Шубин В.А., Суворов B.C., Караваев Ю.Д., Поляков В.Ф 1993).

ЭЙМко штаммь^'Г^

I с **

PK

возбудителя скрепи, циркулирующего в популяциях овец нашей страны, никто не изолировал и не изучал. В 1991 году в хозяйстве Тверской области от больной овцы был выделен штамм возбудителя скрепи (Надточей Г.А., Шубин В.А., 1998) ВТ-91 в виде суспензии ткани головного мозга. Штамм был пропассирован на овцах.

По данным литературы штаммы скрепи различаются по ряду биологических свойств: длительности инкубационного периода при заражении различных видов животных (Dickinson A.G., et al., 1972; Bruce M.E., 1993), степени вакуолизации нервной ткани, выраженности амилоидоза и др.

Исходя из вышеизложенного, изучение биологических свойств штаммов возбудителя скрепи, циркулирующих в популяции овец на территории России, является актуальной задачей и представляет значительный научный и практический интерес.

Цель и задачи исследований. Изучить некоторые биологические свойства штамма ВТ-91 скрепи овец в экспериментальных условиях.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- воспроизвести скрепи у овец при инфицировании их различными методами штаммом ВТ-91;

- изучить клиническую картину течения скрепи при заражении овец штаммом ВТ-91;

- изучить в сравнительном аспекте патологоанатомические и патолого-гистологические изменения у овец при инфицировании их штаммом ВТ-91 возбудителя скрепи с изменениями при естественной инфекции;

- изучить ультраструктуру продолговатого отдела головного мозга овец при экспериментальной инфекции штаммом ВТ-91 возбудителя скрепи в сравнительном аспекте с изменениями при естественной инфекции.

Научная новизна. Изучены инкубационный период, а также изменения клинических признаков з процессе развития болезни при экспериментальной скрепи у овец при заражении их различными методами отечественным штаммом ВТ-91. Получены данные об ультраструктурных и патогистологичес-ких изменениях в ЦНС больных овец, вызываемых штаммом ВТ-91.

Проведен сравнительный анализ полученных данных с ультраструктурными и гистологическими изменениями в тканях головного мозга овец, больных естественной скрепи.

На защиту выносятся следующие положения. 1. Некоторые биологические свойства штамма ВТ-91 возбудителя скрепи овец при взаимодействии его с естественными хозяевами: инкубационный период, клинический симптомокомплекс, патогистологические изменения в ЦНС. 2. Ультраструктурные и патогистологические изменения продолговатого мозга

при естественной и экспериментальной скрепи.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований

являются первичной характеристикой биологических свойств первого отечественного штамма возбудителя скрепи овец - ВТ-91, проявляемых в организме естественных хозяев.

Апробадия результатов исследования. Основные положения диссертационной работы доложены на Ученом Совете ВИЭВ при годовых отчетах в 1993-1995 гг, на V международном конгрессе «Человек и лекарство» 21-22 апреля 1998 г:, на межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, 21 марта 2005г.

Публикаиия результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.

Объем и структура диссертапии. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы. Материалы диссертации

иллюстрированы 1 таблицей и 38 рисунками. Список литературы включает 217 источников (29 отечественных и 188 зарубежных).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Материалы и методы.

Работа выполнена в 1992 - 1997 гг. в лаборатории физико-химических методов исследований и биотехнологии и секторе патоморфологки ВИЭВ по проекту 03. заданиям 04.03.Д Государственной научно-технической программы.

1.1. Животные неблагополучных стад по скрепи.

Базовыми хозяйствами для проведения наших исследований по изучению симптоматики и патоморфологических изменений у овец, больных скрепи в естественных условиях, были колхоз "Волга" Кимрского района Тверской области, (романовская порода), и экспериментальное хозяйство ВИЖ(а) "Клёново-Чагодаево" Подольского района Московской области, (порода финский ландрас). Животные экспериментального хозяйства "Клёново-Чагодаево" послужили также объектом для изучения ультраструктуры продолговатого мозга овец при скрепи.

Для колхоза "Волга" был характерен чрезвычайно высокий процент отхода (падёж и вынужденный убой больных животных) взрослого овцепоголо-вья от "болезни невыясненной этиологии, протекающей с симптомами поражения центральной нервной системы".

Наши исследования в колхозе "Волга" были проведены в 1992 году в период ликвидации овцепоголовья этого хозяйства из-за неблагополучия по скрепи. Всего нами было вскрыто из этого хозяйства на Кимрском мясокомбинате Тверской области семь овец. От всех животных, как подозреваемых в заболевании скрепи, был отобран патологический материал (головной мозг) для патологогистологического и электронно-микроскопического исследований.

Кроме указанных овец мы исследовали из этого же хозяйства гистологически патологический материал от 21 животного, в том числе от 12 из них электронно-микроскопически, переданный нам В.А. Шубиным и Г.А. Надто-чеем, собранный ими в 1990-1991 годах.

Диагноз на скрепи овец в экспериментальном хозяйстве ВИЖ(а) "Кленово -Чагодаево" был поставлен в 1997 году на основании клинико-эпизоотологи-ческого обследования овцепоголовья и результатов гистологического исследования В.А. Шубиным и Г.А. Надточеем с нашим участием.

Непосредственно нами было проведено клиническое обследование восьми выявленных больных овец с симптомами поражения центральной нервной системы. Четыре животных с выраженными симптомами поражения ЦНС были вскрыты в хозяйстве со взятием материала для гистологического и электронно-микроскопического исследований.

1.2. Экспериментально зараженные животные.

Биологические свойства штамма ВТ-91 возбудителя скрепи исследовали в экспериментах на овцах. Изучали клиническую картину, патогистологичес-кие изменения в различных отделах головного мозга, а также ультраструктурные изменения в продолговатом мозге. С этой целью было поставлено два опыта.

Первый опыт был проведен на базе Марийского отдела НИВИ НЗ России. Схема опыта. 21 ягненок 4-5 месячного возраста породы меринос разделили на четыре группы: три опытных и одна контрольная. Ягнят первых двух опытных групп (по шесть животных в каждой) заразили суспензией головного мозга, содержащей возбудитель скрепи: первой - внутривенно (5мл), второй - аллиментарно (выпаиванием 5 мл суспензии в 100 мл воды). Пять ягнят третьей опытной группы поставили для контактного заражения к ягнятам первой опытной группы. Четыре ягнёнка четвёртой группы не заражали и содержали изолированно от ягнят опытных групп.

Для заражения использовали 10%-ную суспензию гомогената тканей головного мозга овцы, зараженной возбудителем скрепи первого пассажа,

штаммом ВТ-91 (Надточей Г.А., Шубин В.А., 1998). Суспензию готовили на физиологическом растворе, содержащем 0,014% додецилсульфата натрия, перед использованием её выдерживали в кипящей водяной бане в течении 15 минут.

В течении первых трех месяцев из эксперимента выбыло 4 овцы по причине респираторных заболеваний. Эти животные были исключены из опыта.

Второй опыт. Был поставлен на опытной базе Вышневолоцкого отдела ВИЭВ в Вышневолоцком районе Тверской области. Шесть ягнят романовской породы в возрасте 9 месяцев заразили алиментарно путем выпаивания 20 мл суспензии головного мозга в 100 мл физиологического раствора. Суспензия для заражения была приготовлена из головного мозга больных скрепи овец № 0718- 1 группы и № 3102 -3 группы первого опыта. Возбудитель скрепи, содержащийся в головном мозге указанных животных, был сконцентрирован и частично очищен методом градиентного ультрацентрифугирования.

Суспензию (гомогенат) готовили по следующей схеме. Ткань головного мозга вначале растирали в ступке с нейтральным стеклом при комнатной температуре примерно как 20% концентрат. Отстаивали гомогенат 15 минут, надосадок, свободный от стекла, отсасывали и осветляли при 1000 об/мин в роторе ДжА-10.

Надосадок собирали, а осадок гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе. Гомогенат объединяли с первым надосадком и осветляли при 5000 об/мин в течении 20 минут. Собирали надосадок, а осадок уничтожали обработкой 20% гипохлорида натрия. Концентрирование возбудителя проводили осаждением в роторе тип 35 при 100000g в течении 180 минут через подушку из 25% раствора сахарозы в физиологическом растворе, забуферном фосфатами, pH 7,2 - 7,6.

Осадок после центрифугирования ресуспендировали в трисбуфере, pH 8,0, в объеме, равном 1/5 объема гомогената. Далее материал подвергли ультра-

центрифугированию в градиенте сахарозы (0-65 вес/об.) с 0,001% додецил-сульфата натрия при 110000£ в течении 3 часов. Собирали область градиента 35-45 сахарозы и общий объем доводили трисбуфером, рН 8,0, до 1/5 объема исходного гомогената. Материал разливали по 1 и 5 мл в пластиковые ампулы и хранили до использования при минус 85°С.

1.3. Схема отбора патматериала для исследования.

От всех подопытных животных для гистологического исследования отбирали кусочки всех паренхиматозных органов и лимфоидной ткани согласно общепринятым схемам отбора патологического материала для патогистологической диагностики.

Отбор материала для гистологического исследования проводили по схеме, указанной на рис.1. По этой же схеме отбирали пробы тканей мозга для электронной микроскопии, которые сразу же помещали в фиксирующую смесь.

Рис.1.

Схема взятия материала для гистологического и электронно-микроскопического исследования.

1.4. Фиксация, проводка, заливка, получение срезов материала для исследования.

Патологический материал вырезали согласно руководству «Электронная микроскопия для начинающих» Уикли Б (1975).

Для патогистологического исследования. Патологический материал вырезали согласно практическому руководству по патологогистологической технике С.С. Вайль (1934).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Естественная скрепи овец

При изучении естественной скрепи овец мы пользовались материалами собранными в двух хозяйствах: колхоз "Волга" Кимрского района Тверской области (романовская порода овец) и ОПХ ВИЖ(а) "Клёново-Чагодаево" Подольского района Московской области (овцы породы финский ландрас).

На момент начала нашей работы овцепоголовье хозяйства ликвидировалось и стадо имело чуть меньше 50 голов овец.

При интенсивном прогоне стада было отобрано семь животных которые в различной степени выраженности отставали от стада. При их внимательном клиническом обследовании хорошо выраженные симптомы поражения ЦНС были установлены у одной овцы. Она значительно сильнее отставала при прогоне стада от остальных животных. У неё отмечали выраженную атаксию: неуверенную шаткую походку, задняя часть туловища заметно отклонялась в сторону, больная овца при беге падала и поднималась с большим трудом. При проверке тактильной и болевой чувствительности кожных покровов тазовых и грудных конечностей отклонений замечено не было.

Из других симптомов обнаружили обвислость ушей, скрежет зубами, мышечную дрожь в области шеи и лопаток, дрожь головы.

Кожного зуда, являющегося основным симптомом при некоторых энзоотиях скрепи, и как следствие его, участков облысения, потертостей и погрызов кожи, у больной овцы не наблюдали.

Относительно сроков инкубационного периода, естественно, никаких предположений сделать было невозможно.

Во втором хозяйстве у всех обследованных нами овец, больных скрепи, обнаружили атаксию, выраженную в различной степени.

У четырёх животных из восьми исследованных, она проявлялась неуверенной походкой, выявленной нами при тщательном просмотре овец стада и при неоднократном их прогоне. Животные при беге всегда находилась в конце стада, хотя и не отставали от него. При этом, это был неединственный признак, указывающий на начало заболевания овец скрепи, они были настороженными и более пугливыми, при резком внезапном звуке вздрагивали.

У четырёх других овец атаксия была более сильно выражена. Походка овец была не только неуверенной, но иногда, особенно при беге, и не координированной. Нарушение координации движения было заметно уже при ходьбе: отмечали отклонения в стороны задней части туловища, обусловленные слабостью тазовых конечностей. Больные животные отставали от стада, спотыкались, особенно при беге, о неровности почвы, иногда падали.

У двух животных из четырёх, описанных выше, отмечали притупление инстинкта страха, обусловленное, по-видимому, физической слабостью организма. При попытке принуждённого прогона овцы, отбежав в сильно замедленном темпе несколько метров в сторону, останавливались. При этом мышцы конечностей, особенно тазовых, были напряжены.

У этих же животных отмечали дрожь мышц шеи, подгрудка и туловища, выявляемую в спокойном состоянии, и резко усиливающуюся при воздействии стрессов: при внезапных резких звуках, при попытке поймать их, при вынужденных прогонах животных. При этом дрожь мышц сохранялась в течение нескольких минут после снятия стресса (например, при остановке овец после прогона).

В спокойном состоянии животные могли подолгу стоять неподвижно, повернувшись головой к стене, чаще же подолгу лежали, при принуждении поднимались с трудом.

У некоторых животных отмечали скрежет зубами, особенно выявляемый при спокойном состоянии овец.

Тактильная и болевая чувствительность кожи туловища и конечностей была сохранена. Точно также были сохранены зрительный и слуховой рефлексы.

Участков облысения, потёртостей и погрызов кожного покрова не отмечали. Проба на зуд, проведённая нами, была отрицательной. Не наблюдали также обвислость ушей, являющейся одним из основных симптомов у овец романовской породы, больных скрепи.

Относительно сроков инкубационного периода можно только отметить, что он не более трех лет. Об этом свидетельствуют следующие данные. Стадо породы финский ландрас разводилось в хозяйстве в чистоте свыше 10 лет и случая скрепи не имело. Но за три года до данного исследования провели скрещивание овцематок с баранами романовской породы для увеличения плодности. Через 2,5 года после ввода баранов в стадо один из них пал с признаками поражения ЦНС.

2.2. Патологоанатомическая картина.

У животных из экспериментального хозяйства «Кленово-Чагодаево» при наружном осмотре у трех овец из четырех шерстный покров был взъерошен, шерсть с темноватым оттенком, у четвертой овцы шерстный покров не был взъерошен, но в области крупа и шеи были участки расчесов с небольшим отсутствием шерстного покрова. У всех четырех овец тущи были средней упитанности.

При вскрытии отмечали незначительные поражения средних долей легких, они были несколько увеличены в объеме и имели сероватый цвет, на разрезе были влажными. Отмечали отек жира в области почек, корковый слой был на разрезе темно-сероватого вдета.

Изменения лимфатических узлов, селезенки, печени и других органов и тканей не обнаруживали.

Что же касается семи овец колхоза «Волга» Кимрского района Тверской области то патологоанатомическая картина были схожа с животными из ОПХ «Кленово-Чагодаево».

2.3. Патоморфологические изменения.

Нами было вскрыто на Кимрском мясокомбинате семь овец из колхоза "Волга" Кимрского района Тверской области и непосредственно в хозяйстве четыре овцы из ОПХ ВИЖ(а) "Кленово-Чагодаево" Подольского района Московской области. Гистологически, кроме этих животных, исследовали также патологический материал от 21 овцы из колхоза "Волга" Кимрского района Тверской области, представленный нам профессором В.А. Шубиным.

Колхоз "В о л г а". Из этого хозяйства исследовали гистологически патологический материал от 28 овец, убитых в 1990-1992 годах. В том числе: от девяти животных в 1990 году, от 12 овец в 1991 и от семи животных в 1992 году. Основньми изменениями, имеющим диагностическое значение, была массовая вакуолизация нейронов, условно отнесенная по классификации В.А.Шубина (1995) к "специфическим" изменениям при скрепи.

Особенно массовой вакуолизация нейронов была в головном мозге овец, убитых в 1990 году. Количество их у восьми овец с положительным диагнозом на скрепи соответственно было 131, 235, 244, 114, 151, 142, 35, и 138 в 8 - 10 гистопрепаратах головного мозга с преимущественной локализацией в продолговатом мозге, варолиевом мосту, четверохолмии, мозжечке. Лишь от одного животного исследовали только четыре гистопрепарата головного мозга. Тем не менее, в них обнаружили 114 вакуолизированных нервных клеток. Такое большое количество вакуолизированных нейронов объясняется тем, что для исследования были отобраны овцы с выраженными симптомами поражения центральной нервной системы, до убоя длительное время содержавшиеся в хозяйстве.

Из 12 овец, убитых в 1991 году, изменения, характерные для скрепи, выявили у шести. Количество вакуолизированных нейронов, несмотря на исследование 12 гистопрепаратов из различных отделов (участков) головного мозга было значительно меньшим, чем в головном мозге животных, исследованных в 1990 году. В этом году хозяйство приступило к постоянной

и тщательной выбраковке и сдаче на мясокомбинат всех овеи, подозреваемых по клиническим признакам в заболевании скрепи, то есть больные животные, сдавались на мясокомбинат на более ранних стадиях развития болезни, чем и можно объяснить меньшее количество выявленных нами вакуолизированных нервных клеток в головном мозге.

Что касается семи овец, вскрытых нами в 1992 году, то это одна из небольших последних групп животных, оставшихся в хозяйстве, сдаваемых на мясокомбинат вследствие полной ликвидации овцеводства. Как указывалось выше, при описании симптоматики клинически заболевание скрепи было выражено только у одной овцы. У нее же при гистологическом исследовании обнаружили в головном мозге 23 вакуолизированных нейрона. Из оставшихся шести животных у двух нашли при исследовании 7-10 гистопрепаратов головного мозга соответственно шесть и две вакуолизированных нервных клетки.

Вакуолизированные нервные клетки чаще имели одну вакуоль округлой, реже овальной формы. Многокамерные вакуоли были обычно неправильной угловато прямоугольной, угловато -квадратной или округлой и овальной форм. Размеры поражённых нейронов или не изменены (обычно при мелких одиночных или множественных вакуолях) или увеличены (чаше при крупных многокамерных вакуолях). Сохранившиеся нейроплазма при наличии крупных вакуолей обычно оттеснена к одной из сторон нервной клетки, более уплотнена, нередко окрашена в более темные тона. На фоне темно окрашенной нейроплазмы можно различить обычно пикнотичное с неровными краями ядро. Ядрышко чаще не просматривается. С других сторон крупные вакуоли обычно прикасались к нейролемме, которая в дегенерированном нейроне. Встречались пейроны с одно и многокамерными вакуолями, занимающими всю площадь клетки. При этом нейролемма нередко была лизирована на значительных участках. "Неспецифические" дистрофические изменения нейронов характеризовались распылением нисслевского вещества, оттеснением ядра нейрона к периферии клетки,

интенсивным окрашиванием цитоплазмы и края клетки, сморщивании и очаговым лизис нейронов с интенсивным окрашиванием цитоплазмы клетки, а также пикноз ядер. Находили также в некоторых нейронах включения в нейроплазме. По структуре они имели мало выраженную зернистость и слабо окрашивались ацидофильными красками.

Вакуолизированные нейроны обычно находили в ядрах сетчатой формации, дорсальном ядре блуждающего нерва, в ядрах клиновидного пучка и тройничного нерва.

Варолиев мост. В варолиевом мосту находили те же изменения, что и в продолговатом мозге, но количество их было меньшим. Также обнаружили изменения нервных клеток - выявили нейроны с различным состоянием хроматофильного вещества: диффузное или частичное распыление, лизис, более интенсивное, реже более слабое окрашивание его основными анилиновыми красками, и ядер: смещение их к периферии, пикноморфность, набухание и частичный лизис.

Мозжечок. Вакуолизацию нейронов отмечали в зубчатом ядре мозжечка. Вакуоли были овальные, однокамерные, занимающие всё тело нейрона. Нейроплазма видна с сильно пикнотичным и деформированным ядром, или без него, чаще сохранялась с одной стороны клетки, выглядела гомогенной светло розовой, количество вакуолизированных нейронов от 3-х до 5 в одном гистопрепарате.

Находили нервные клетки в состоянии острого набухания, распылением и лизисом хроматофильного вещества, пикноморфностью.

Четверохолмие: В этом отделе головного мозга мы находили изменения в основном в ядрах, имеющих крупные нервные клетки. Вакуоли были округлой, округло-овальной формы, одно-, двух - и реже многокамерные, занимающие всю часть нервной клетки; были отмечены случаи, когда наблюдали и выпадение нейронов. Отмечали распыление и лизис хроматофильного вещества и ядер, с образованием клеток-теней, дистрофию нейронов.

В гипоталамусе находили большое количество вакуолизированных нейронов - до 42 в одном гистопрепарате, вакуоли были крупными однокамерными, занимали все тело нервной клетки, обнаружили также округлые пустоты в веществе мозга - выпадение нейрона, лизис хроматофильного вещества.

Спинной мозг. В спинном мозге также обнаружили вакуолизированные нейроны: в шейном отделе их количество варьировало от двух до пяти. Вакуоли чаше крупные одно - и двухкамерные.

Помимо вакуолизации отмечали острое набухание клеток, которое сопровождалось распылением и лизисом хроматофильного вещества, ядра в таких клетках красились более базофильно основными анилиновыми красками. Изменения локализовались в вентральных рогах.

3. Экспериментальная скрепи овец.

Фактические данные о сроках заболевания и падежа овец в опыте представлены в таблице 1.

Таблица 1. Данные о сроках заболевания и падежа овец

№ Инд.№ Метод

групп живот- заражения 1993г 1994г

ного Дата Дата Дата Дата

забоя падежа забоя падежа

1 3288 В\в 06.01 12.03 -

4579 - - 11.02 09.06

4670 01.05 21.11 - -

0718 24.08 03 10 - -

0739 А- - - 12.03 04.09

2 4546 0701 Алимекгарно 21.05 09.11 - -

0711 -V 12.12 - - 08.11

0765 12 12 - - 04.10

3 3102 Контакт 10.07 25.12 - -

3132 - - - -

4231 -V - - 10.01 22.07

4550 -V - - - -

7951 -V - - - -

4 3046 3369 б\н Контр -- -- - -

примечание: начало опыта (дата заражения)- 06.06.1992года.

Из таблицы видно, что первые клинические признаки поражения центральной нервной системы у овец первой группы, заражённых

внутривенно появились через 7-21 месяцев после заражения. Они характеризовались появлением беспокойства и пугливости. Животные по долгу стояли не двигаясь на одном месте, обычно повернувшись головой к стене. Позднее появились заметное дрожание головы и обвислость ушей, а затем нарушение координации движения. Походка стала неуверенной с раскачиванием крупа в стороны, спотыканием и падением при беге. Животные стали подолгу лежать, с трудом вставали. В терминальной стадии наступали парезы и параличи задних конечностей, аппетит сохранялся до терминальной стадии. Три овцы из пяти пали через 6 месяцев, две остальные через два и четыре месяца после начала появления клинических признаков болезни.

У животных второй группы первые симптомы поражения центральной нервной системы появились через 11 - 18 месяцев. В целом они были аналогичны таковым, как у овец первой группы. Отмечали пугливость, признаки ступора и тремор мышц головы. Животные пали через четыре, 10 и 11 месяцев после заражения.

Из пяти овец третьей группы, поставленных для контактного заражения к животным первой группы, заболели две овцы: через 13 и 20 месяцев после заражения. У заболевших овец отмечали пониженную активность, пугливость, плохое поедание корма, позднее - залёживание, животные поднимались с большим трудом, постепенно усиливалась тяжесть атаксии. Овцы пали через 5 и 6 месяцев после появления первых симптомов.

Во втором опыте из шести овец заболело три животных. Первые симптомы поражения ЦНС проявились 18-27 месяце. Клиническая картина ни чем не отличалась от первого опыта.

3.1. Патологоанатомические изменения.

При наружном осмотре у трех животных первой группы первого опыта было установлено, что шерстный покров взъерошен, шерсть с темным оттенком. Туши средней упитанности.

Хотя симптомы зуда при клиническом наблюдении не были отмечены, на боковых поверхностях имелись небольшие участки расчесов, а также незначительное отсутствие шерстного покрова в области шеи и крупа.

Из патологоанатомических изменений при вскрытии отмечали: студенистый отек жира по ходу коронарных борозд сердца у одного животного, у другого было отмечено незначительное поражение верхушечных и средних долей легких, они были несколько увеличены в объеме, имели серовато- синий цвет, на разрезе влажные, при надавливании из разрезанной ткани выделялась мутноватая жидкость. Отмечали также поражение почек: корковый слой был дрябловатый, сероватого цвета.

Двенадцатиперстная кишка имела сероватый цвет, на разрезе покрыта светлой слизью, в остальных отделах кишечника каких либо патологий при визуальном осмотре не было отмечено.

Изменения лимфатических узлов, селезенки, печени и других органов и тканей не обнаружили.

У трех заболевших овец второго опыта было отмечено незначительное увеличение лимфатических узлов средостения. Остальные лимфоузлы и ткани были в пределах физиологической нормы.

3.2. Патогистологические изменения при экспериментальной скрепи овец.

При гистологическом исследовании патологического материала основные изменения обнаружили в головном мозге экспериментально зараженных овец. Для них было характерное преобладание альтеративных изменений, свойственных скрепи: дистрофия нейронов, в том числе их вакуолизация. Изменения были аналогичными у животных обоих опытов и не зависели от способа заражения.

Продолговатый мозг. В этом отделе головного мозга альтеративные изменения характеризовались вакуолизацией и дистрофией нейронов. Общее количество вакуолизированных нейронов в 2-3-х гистопрепаратах в продолговатом мозге варьировало от 10 до 28.

Наиболее часто находили крупные, увеличенные в объеме или нормальной величины нервные клетки, содержащие в цитоплазме трехкамерную вакуоль. Типичным для альтеративных изменений, обусловленных агентом скрепи, были крупные и мелкие нервные клетки с вакуолями, занимающими все тело нейрона. Крупные вакуоли были одно - и многокамерные; имели округлую или овальную форму, а многокамерные округло-неправильную, округло вытянутую или неправильную форму.

Цитоплазма в нервных клетках, содержащих крупные вакуоли, или отсутствовала, или сохранялась в небольшом количестве, прижатой к одному из полюсов клетки, имела базофильную окраску, выраженную в различной степени. Ядро или отсутствовало, или было пикнотичным; обнаруживалось в остатках нередко повышенно базафильной нейроплазмы вблизи оболочки нейрона, оно было о1фуглоугловатой или неправильной формы, с неровными шероховатыми полями.

Кроме нейронов с крупными вакуолями обнаруживали нервные клетки с мелкими вакуолями, количество которых варьировало от одиночных до множественных, цитоплазма в нейронах с мелкими вакуолями была нормальной, или в состоянии дистрофии, чаще выражающейся лизисом хроматофильного вещества.

В нейронах с полной вакуолизацией цитоплазмы оболочки чаще хорошо различали. Лизис нейролеммы обычно отмечали в участках примыкающих к вакуоли. Наблюдали также выпадение нейронов.

Помимо вакуолизации выявили другие дистрофические изменения: острое набухание нейронов, диффузный или очаговый хроматолиз нисслевской зернистости, гиперхроматоз, иногда пикноморфность нервных клеток; ядра в таких нервных клетках были набухшими, в состоянии лизиса, или резко базофильными, пикноморфными, с неровными зубчатыми краями. Отложения амилоидозных бляшек не наблюдали.

Варолиев мост. В этом отделе ромбовидного мозга вакуолизированные нейроны также были установлены в количестве от трех до девяти в одном

гистопрепарате. По форме и размеру они были такими же, как и в продолговатом мозге, нередко отмечали выпадение нейронов. Находили нейроны с диффузным или очаговым распылением хроматофильного вещества. Ядра были набухшими, нередко располагались в периферической части клетки.

Мозжечок. Вакуолизированные нейроны находили в зубчатом ядре у трех животных в количестве от семи до двенадцати в одном гистопрепарате. Вакуоли были крупными одно и многокамерные, часто вакуоли занимали почти все или все тело нейрона.

Четверохолмие. Характерные изменения для скрепи находили в среднем мозге. Вакуолизация нейронов была найдена у одного животного в количестве от четырех до двенадцати нейронов в одном гистопрепарате. Вакуоли в нейронах были крупными, одно-двух, многокамерные, иногда наблюдали выпадение нейрона. Также наблюдали пикноморфность нейронов, перицеллюлярный отек, дистрофию нейронов в виде распыления и лизиса хроматофильного вещества.

Спинной мозг. Вакуолизированные нейроны находили в шейном, грудном отделе спинного мозга, количество вакуолизированных нейронов варьировало от одного до трех, вакуоли чаше крупные одно- и двух камерные. Помимо вакуолизации отмечали острое набухание клеток, которое сопровождалось распылением и лизисом хроматофильного вещества.

4. Ультраструктурные изменения в тканях продолговатого мозга овец, больных скрепи.

При электронно-микроскопическом исследовании тканей продолговатого мозга овец с естественной и экспериментальной скрепи, шт.ВТ-91, методом ультратонких срезов морфологические изменения выявили практически во всех клетках ЦНС на уровне органелл и их субструктур. Они были аналогичными как при естественной, так и экспериментальной инфекции. Они также не зависели от породы животных. Все исследованные материалы были взяты от животных в терминальной стадии болезни.

Морфологические изменения выражались прежде всего в массированной вакуолизации цитоплазмы и органоидов всех типов клеток, а также в нарушении их мембранного аппарата. Значительные разрывы цитоплазматических оболочек нейропиля, а также отростков нервных клеток затрудняет, а часто делает невозможным, дифференцирование профилей дендритов и немиелинизированных аксонов от отростков клеток нейроглии.

Цитоплазма нейропиля, аксонов и дендритов электронопрозрачна вследствие значительного разрежения цитоплазматического матрикса. В ней выявляются везикулы и вакуоли различных размеров с рыхлым содержимым или с отсутствием такового, причем везикулы и вакуоли чаще всего разделена значительными по площади участками электронопрозрачной цитоплазмы. В цитоплазме почти отсутствует шероховатый эндоплазматический ретикулум и свободные рибосомы. Микротрубочки и нейрофиламенты сохраняются лишь в небольших участках цитоплазмы. Митохондрии чаще имеют просветленный матрикс, реже плотный. Кристы митохондрий фрагментированы, оболочка часто имеет разрывы. В большинстве клеток в отдельных участках цитоплазмы в виде скоплений выявляются мультивезикулярные структуры.

Подавляющее число аксонов имеют сильно выраженные деструктивные изменения. Их цитоплазма разрежена, или представлена небольшими фрагментами конденсированного матрикса, а основная часть аксоплазмы представляет собой одну или несколько вакуолей. При наличии в аксоплазме митохондрий они в различной степени набухшие, кристы частично или полностью фрагментированы, митохондриальный матрикс разрежен, или отсутствует и тогда митохондрия представляет собой вакуоль. Часть аксонов сохраняет аксоплазму, в которой выявляются микротрубочки и нейрофиламенты. В некоторых аксонах аксоплазма имеет нормальную структуру с сохранением аксоплазмы. Однако во всех случаях миелиновая оболочка миелинизироанных аксонов имеет признаки различной степени деструкции, хотя аксоплазма находится в пределах морфологической нормы,

мембрана миелиновой оболочки в отдельных участках вздута. Чаще же миелиновые мембраны на значительных участках расслоены, вздуты и содержат вакуоли.

Оболочка дендритов часто имеет участки фрагментации. Цитоплазма их электронопрозрачна изрежена и почти не содержит цитоплазматического матрикса. При нахождении в них митохондрий они, как правило, имеют признаки деструктивных изменений. Их матрикс в значительной степени элиминирован, кристы в состоянии фрагментации, хотя оболочка может не иметь повреждений. В цитоплазме выявляются небольшие количества микротрубочек и нейрофиламентов.

В отдельных нейрональных клетках выявляются скопления тубуловезикулярных структур, иногда напоминающих паракристалическую упаковку. Их размеры колеблются в пределах 22-36 нм. Размеры и количество скоплений колеблются в плоскости среза от 1 до 3-4.

Анализ электроннограмм показал, что диаметр нейрофиламентов лежат в пределах 10,0 нм, а микротрубочек - 20,0-26,0 нм.

5. Выводы.

1. На основе экспериментальных данных получена характеристика биологических свойств отечественного штамма ВТ-91 патогенного приона скрепи, выделенного ранее от овец романовской породы.

2. Штамм ВТ-91 приона скрепи при внутривенном, алиментарном и контактном методах заражения вызывает у овец породы меринос типичную клиническую картину скрепи. Диагноз заболевания подтвержден гистологическим методом. Аналогичную болезнь в эксперименте штамм ВТ-91 вызывал у овец романовской породы при алиментарном методе заражения. Клиническая картина экспериментальной скрепи, вызываемой штаммом ВТ-91 у овец пород романовская и меринос была аналогичной клинической картине при естественной скрепи у овец романовская породы и породы финский ландрас.

3. Инкубационный период у овец меринос при внутривенном методе заражения составил 7-21, при алиментарном - 11-18, при контактном 13-20 месяцев от заражения "доноров патогена". У овец романовской породы при алиментарном введении возбудителя инкубационный период составлял 18-27 месяцев.

4. Патогистологические изменения, вызываемые у овец при экспериментальном заражении штаммом ВТ-91 приона скрепи, аналогичны патогистологиче-ским изменениям, выявляемым при естественной скрепи овец. Их характер не зависел ни от способа заражения животных, ни от их породы. Гистологические изменения затрагивали все области ЦНС, включая спинной мозг, принципиально их можно характеризовать как развитой нейрит в виде дистрофии нейронов с выраженной вакуолизацией.

5. Субмикроскопическая патология тканей продолговатого мозга овец с экспериментальной (шт. ВТ-91) и естественной скрепи выявлена во всех типах клеток ЦНС на уровне клеточных органелл и их субструктур. Альтерация характеризовалась массированной вакуолизацией цитоплазмы и всех органов (кроме ядер), а также деструктивными нарушениями мембранного аппарата органоидов, потерей цитоплазматического матрикса, формированием мультивезикулярных и тубуловезикулярных структур.

6. Практические предложения

1. Полученные в ходе проведенных исследований материалы по патолого-гистологическим, ультраструктурным изменениям, их локализации в продолговатом отделе головного мозга, клинико-морфологическому проявлению болезни необходимо учитывать при изучении скрепи овец, а также при диагностике этих болезней.

2. Методические рекомендации по выявлению прионов в культурах клеток иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных анти-PrPc/sc антител. Авторы: Л.П. Дьяконов, A.B. Дагданова, И.Л. Куликова, Т.В. Гальнбек, A.C. Симонова, В.А. Шубин, Д.Д. Санджаев.

Методические рекомендации рассмотрены и рекомендованы для издания на секции "Ветеринарная биотехнология" Отделения ветеринарии РАСХН 2¡декабря 2000 года. Протокол №4. Изданы РАСХН, М., 16.01.2002г. Юс.

7. Список опубликованных работ

1. В.А. Шубин, Г.А. Надточей, Д.Д. Санджаев. - Симптоматика и патомор-фологические изменения у овец, больных скрепи. г.Москва, «Человек и Лекарство», 21-22 апреля, 1998 г.

2. Д.Д. Санджаев.- Патогистологические изменения и выявления ассоциированных фибрилл в головном мозге овец, экспериментально зараженных возбудителем скрепи. Труды ВИЭВ им Я.Р. Коваленко, Том 72., г.Москва, 1999. стр.315.

3. B.C. Суворов, В.А. Шубин, Г.А. Надточей, К.П. Юров, Д.Д. Санджаев. -Патоморфологическая дифференциация прионных инфекций: Скрепи овец и губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, г. Москва, 2003 «Инфекционные и протозойные болезни сельскохозяйственных животных, рыб и пчел» Том 73. стр. 60-63.

4. В.А. Шубин, B.C. Суворов, В.Л. Кувшинов, Д.Д. Санджаев - Диагностика скрепи и висны овец. г. Москва, 2003 «Инфекционные и протозойные болезни сельскохозяйственных животных, рыб и пчел» Том 73. стр. 238.

Принято к исполнению 23/09/2005 Заказ № 1063

Исполнено 27/09/2005 Тираж: 90 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ru

РНБ Русский фонд

2007-4 7955

.л'

X

'г-ti ■ i líl»

Актуальность темы. В последние два десятилетия пристальное внимание многих исследователей и общественности привлекают заразные губкообразные энцефалопатии. Это обусловлено рядом факторов. Во-первых, возникновением в 1985 году эпизоотии губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота (ГЭ КРС) в Великобритании (Wells G.A.H., Scott A.C., Johnson С. 1987), которая к настоящему времени зарегистрирована в большинстве стран Европы, Канаде, Израиле и Японии. Эта инфекция нанесла колоссальный экономический ущерб Англии, Ирландии, Швейцарии и ряду других стран, но особое значение она приобрела с установлением факта поражения ею людей (Brown Р., 1996., Collinge J. et al., 1996). Первоисточником возникновения ГЭ КРС по мнению специалистов Великобритании явился возбудитель скрепи овец, попавший в корма коров с мясокостной мукой, в которой возбудитель скрепи был инактивирован не полностью.

Среди других причин, вызывающих интерес исследователей к губкообразным энцефалопатиям животных и человека, являются необычные свойства их возбудителей, представляющих собой особый класс инфекционных агентов - прионы, которые кардинально отличаются от известных патогенных микроорганизмов. Прионы являются белками, кодируемыми геномом клетки. Патогенной изоформой нормальные прионы становятся после изменения конформационной структуры их (Prusiner S.B. 1984).

На территории Российской Федерации ГЭ КРС не зарегистрирована.

Но страна проводит импорт мясных продуктов и мяса из стран, где эта болезнь зарегистрирована, ввозит также племенной скот. Все это создает постоянную угрозу заноса болезни на территорию страны.

Кроме того на территории страны регистрируется скрепи овец, являющаяся прионной болезнью. Скрепи регистрировали (Шубин В.А., Суворов B.C., Караваев Ю.Д., Поляков В.Ф., 1993). Некоторые авторы воспроизводили заболевание биопробой. Однако штаммы возбудителя скрепи, циркулирующего в популяциях овец нашей страны, никто не изолировал и не изучал. В 1991 году в хозяйстве Тверской области от больной овцы был выделен штамм возбудителя скрепи (Надточей Г.А., Шубин В.А., 1998) ВТ-91 в виде суспензии ткани головного мозга. Штамм был пропассирован на овцах.

По данным литературы штаммы скрепи различаются по ряду биологических свойств: длительности инкубационного периода при заражении различных видов животных (Dickinson A.G., et al., 1972; Bruce M.E., 1993) степени вакуолизации нервной ткани, выраженности амилоидоза и др.

Исходя из вышеизложенного, изучение биологических свойств штаммов возбудителя скрепи, циркулирующих в популяции овец на территории России, является актуальной задачей и представляет значительный научный и практический интерес.

Цель и задачи исследований. Изучить некоторые биологические свойства штамма ВТ-91 скрепи овец в экспериментальных условиях.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- воспроизвести скрепи у овец при инфицировании их различными методами штаммом ВТ-91;

- изучить клиническую картину течения скрепи при заражении овец штаммом ВТ-91;

- изучить в сравнительном аспекте патологоанатомические и патолого-гистологические изменения у овец при инфицировании их штаммом

ВТ-91 возбудителя скрепи с изменениями при естественной инфекции;

- изучить ультраструктуру продолговатого отдела головного мозга овец при экспериментальной инфекции штаммом ВТ-91 возбудителя скрепи в сравнительном аспекте с изменениями при естественной инфекции.

Тема диссертации является самостоятельным разделом комплексных исследований, проводимых в ВИЭВ по проекту 03. заданиям 04.03.Д Государственной научно-технической программы.

Научная новизна. Изучены инкубационный период, а также изменения клинических признаков в процессе развития болезни при экспериментальной скрепи у овец при заражении их различными методами отечественным штаммом ВТ-91. Получены данные об ультраструктурных и патогистологических изменениях в ЦНС больных овец, вызываемых штаммом ВТ-91. Проведен сравнительный анализ полученных данных с ультраструктурными и гистологическими изменениями в тканях головного мозга овец, больных естественной скрепи.

На защиту выносятся следующие положения. 1. Некоторые биологические свойства штамма ВТ-91 возбудителя скрепи овец при взаимодействии его с естественными хозяевами: инкубационный период, клинический симптомокомплекс, патогистологические изменения в ЦНС. 2. Ультраструктурные и патогистологические изменения продолговатого мозга при естественной и экспериментальной скрепи.

Практическая значимость. Результаты проведенных исследований являются первичной характеристикой биологических свойств первого отечественного штамма возбудителя скрепи овец - ВТ-91, проявляемых в организме естественных хозяев.

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы доложены на Ученом

Совете ВИЭВ при годовых отчетах в 1993-1995 гг, на V международном конгрессе «Человек и лекарство» 21-22 апреля

1998 г:, на межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ, 21 марта 2005г.

Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 1 таблицей и 38 рисунками. Список литературы включает 217 источников (29 отечественных и 188 зарубежных).

5. ВЫВОДЫ

1. На основе экспериментальных данных получена характеристика биологических свойств отечественного штамма ВТ-91 патогенного приона скрепи, выделенного ранее от овец романовской породы.

2. Штамм ВТ-91 приона скрепи при внутривенном, алиментарном и контактном методах заражения вызывает у овец породы меринос типичную клиническую картину скрепи. Диагноз заболевания подтвержден гистологическим методом. Аналогичную болезнь в эксперименте штамм ВТ-91 вызывал у овец романовской породы при алиментарном методе заражения. Клиническая картина экспериментальной скрепи, вызываемой штаммом ВТ-91 у овец пород романовская и меринос была аналогичной клинической картине при естественной скрепии у овец породы романовская и породы финский ландрас.

3. Инкубационный период у овец меринос при внутривенном методе заражения составил 7-21, при алиментарном - 11-18, при контактном 13-20 месяцев от заражения "доноров патогена". У овец романовской породы при алиментарном введении возбудителя инкубационный период составлял 18-27 месяцев.

4.Патогистологические изменения, вызываемые у овец при экспериментальном заражении штаммом ВТ-91 приона скрепи аналогичны патогистологическим изменениям, выявляемым при естественной скрепи овец. Их характер не зависел ни от способа заражения животных, ни от их породы. Гистологические изменения затрагивали все области ЦНС, включая спинной мозг, принципиально их можно характеризовать как развитой нейрит в виде дистрофии нейронов с выраженной вакуолизацией.

5. Субмикроскопическая патология тканей продолговатого мозга овец с экспериментальной (шт. ВТ-91) и естественной скрепи выявлена во всех типах клеток ЦНС на уровне клеточных органелл и их субструктур. Альтерация характеризовалась массированной вакуолизацией цитоплазмы и всех органов (кроме ядер), а также деструктивными нарушениями мембранного аппарата органоидов, потерей цитоплазматического матрикса, формированием мультивезикулярных и тубуловези-кулярных структур.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Полученные в ходе проведенных исследований материалы по патологогистологическим, ультраструктурным изменениям, их локализации в продолговатом отделе головного мозга, клинико-морфологическому проявлению болезни необходимо учитывать при изучении скрепи овец, а также при диагностике этих болезней.

2. Методические рекомендации по выявлению прионов в культурах клеток иммуноцитохимическим методом с использованием моноклональных анти- PrPc/sc антител. Авторы: Л.П. Дьяконов,

A.B. Дагданова, И.Л. Куликова, Т.В. Гальнбек, A.C. Симонова,

B.А. Шубин, Д.Д. Санджаев.

Методические рекомендации рассмотрены и рекомендованы для издания на секции "Ветеринарная биотехнология" Отделения ветеринарии РАСХН 21 декабря 2000 года. Протокол №4. Изданы РАСХН, М., 16.01.2002г. Юс.