Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Совершенствование методов иммунизации овец против бруцеллеза вакциной из штамма B. ABORTUS 19

На правах рукописи

_ £ f ПП /Г"О

рукин

Андрей Тихонович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИММУНИЗАЦИИ ОВЕЦ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА ВАКЦИННОЙ ИЗ ШТАММА В. ABORTUS 19

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ОМСК 1998

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте бруцеллеза и туберкулеза животных Сибирского отделения Российской академии сельскохозяйственных наук

Научный руководитель:

Научный консультант:

Доктор г.етеринарных наук ПК.Аракелян

Доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации: И.А.Косилов

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных паук, профессор Доктор ветеринарных наук

С.К.Димое И.П .Иикисриров

Ведущая организация - Институт ветеринарной медицины Омского государственного аграрного университета

Защита диссертации состоите;! 1993 г. в _час .на заседании Диссертационного сЫета К. ¡20.01.03 при

(656022, Россия, Алтайский край, г.Барнаул, ул. Новосибирская 34?., Алтайский агроуииверситет)

С диссертацией можно ознакомиться »• библиотеке Алтайского агроуниверситета

Автореферат разослан

1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук

СИ.Снигирев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последние годы в Российской Федерации были достигнуты значительные успехи в ликвидации бруцеллеза мелкого рогатого скота (А.Л.Иванов, 1996; В.М.Авилов, В.В.Селиверстов, В.Ф.Пылинин и др., 1997; П.К.Аракелян, 1997 и др.). Этому способствовало повсеместное внедрение в ветеринарную практику эффективной системы противоэпизоотических мероприятий, разработанных рядом ученых нашей страны (И.А.Косилов, 1961-1997гг.; О.Ю.Юсупов, 1986; В.А.Ромахов, 1992; К.В.Шумилов, 1996 и др.), а также республик Казахстан (Н.П.Иванов, 1981)и Кыргызстан (В.И.Ким, 1991).

В основу мероприятий положен технологичный для отрасли организационно-хозяйственный принцип постепенной замены неблагополучного поголовья (главным образом, овцематок) изолированно выращенным здоровым молодняком (ярками) на фоне напряженного и непрерывного на протяжении всего срока оздоровления и далее в течение двух лет иммунитета для предотвращения рецидивов инфекции. Перманентность напряженного иммунного фона достигается путем ежегодной реиммунизации маточного поголовья указанной вакциной без предварительно!« серологического исследования животных.

Невозможность применения диагностического исследования зотных после использования вакцин из агглютиногенных штаммов 19 ■или Рев-1, как и осуществления в целом эпизоотического контроля за иммунизированным поголовьем, связана с резко выраженными и дпительно сохраняющимися поствакцинальными реакциями (РА и РСК).

Вместе с тем указанная выше система может быть применена только в крупных овцеводческих хозяйствах, в которых имеется возможность замены неблагополучного поголовья по о тарам в целом.

В мелких общественных и фермерских хозяйствах, а также в частном секторе система оздоровления, основанная на разовой поотарной замене неблагополучного поголовья, невыполнима по экономическим, хозяйственным и организационным причинам.

В силу указанных обстоятельств с учетом проводимых реформ в агропромышленном комплексе арапы перед ветеринарной наукой возникла проблема усовершенствования схемы специфической профилактики бруцеллеза овец и коз, при которой бы представилась возможность создания прочного и перманентного иммунитета без поствакцинальных реакций, т.е. одновременной возможности осуществления эпизоотического контроля.

Указанная задача решалась тремя способами, а именно путем изыскания:

- инагглютиногенных вакцин, например, из штаммов В. melitensis Невский 12 (М.С.Абидджанов, 1967), B.abortus 45/20 (М.Абдылдаев, 1986);

- оптимальных схем иммунизации - за счет применения уменьшенных доз агглютиногенных вакцин (А.А.Султанов, 1984, 1986; А.М.Муминов, З.Б.Юсупова, 1986; С.Г.Бадалян, 1989; Н.П.Иванов, А.А.Султанов, Э.А.Хван, 1988 и др.) или различных способов их введения (пальпебрально - А.А.Иванов, 1992; конъюнетивально - Е.А.Брокик, 1991;, Е.А.Бровик, А.Н.Касьянов, 1991, аэрозольно - А.В.Селизанов, И.Г.Хасанов, 1983); Y^/"

- методов дифференциальной диагностики: применительно к. мелкому рогатому скоту - реакция аллергии (И.А.Косилов, 1960-1967).

К началу наших исследований (1992г.) ни'один из вышеуказанных способов не нашел официального применения в ветеринарной практике. ;

Таким образом, учитывая необходимость усовершенствования методов и способов специфической профилактики бруцеллеза мелкого рогатого скота в связи с изменением хозяйственных условий ведения отрасли мы посчитали целесообразным провести научные исследования в указанном направлении. /

ЦЕЛИ Н ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.Целыо настоящей работы явилось изыскание оптимальной схемы иммунизации овец против: бруцеллеза, позволяющей формировать напряженный и 'длительный' иммунитет с возможностью последующего осуществления эпизоотического контроля за привитыми животными.

В связи с этим были поставлены для разрешения следующие задачи: провести мониторинг, т.е. отслеживание изменений эпизоотического состояния страны по бруцеллезу овец, а также ретроспективный анализ эффективности проводимых мероприятий;

- изучить динамику поствакцинальных серологических реакций у овец при иммунизации их разным» методами ./вакциной '-.' из агодотиногекного штамма 19;

- исследовать состояние иммунитета у овец при разных схемах н методах применения указанной вакцины;

- изыскать метод дифференциации . поствакшшальньг; реакций от реакций инфекционной природы при бруцеллезе овец;

- разработать оптимальную схему специфической профилактики Овец против бруцеллеза с использованием агглютиногенной вакцины.

Научна« новизна. Получены новые данное' со особенностях иммуногенеза у овец при применении разных методов введения агглютиногенной ьакшшы из штамма B.abortus 19 (подкожно и коиъюнктивалыю) и различных доз (40 п 4 млрд м.к). При этом в сравнительном аспекте изучена напряженное! ь иммунитета в короткие и

отдаленные сроки после вакцинации, ревакцинации и при экспериментальном заражении вирулентной культурой B.melitensis.

Установлено значение конъюнктивалыюй и подкожной реиммунизации в разных дозах (40 и 4 млрд м.к.) на различном иммунном фоне в зависимости от дозы вакцины и метода первичной припиоки.

Получены оригинальные данные о динамике синтеза агглютининов и коыплементсвязывающих антител, их лерсистелции и угасании у овец, иммунизированных и реиммунизированных вакциной из штамма 19 конъюнктивально и подкожно в дозах 40 и 4 млрд м.к.

Впервые проведены исследования по изучению специфичности и чувствительности реакции иммунодиффузии (РИД) с О-полисахаридным антигеном в эксперименте на овцах интактных, первично иммунизированных и реиммунизированных разными методами (конъюнктивально, подкожно) и дозами вакцины из штамма 19 (40 и 4 млрд м.к.), а также искусственно инфицированных вирулентной культурой B.melitensis.

Установлены особенности структуры очагов бруцеллеза овец, сложившейся за последние годы (1991-1997) в результате организационно-хозяйственных и экономических преобразований в агропромышленном комплексе страны.

Практическая ценность. Установлена возможность и

Целесообразность использования конъюнктивального метода иммунизации и реиммунизации овец вакциной из штамма В.abortus 19 в дозе " 4 млрд м.к., при котором формируется иммунитет достаточной напряженности, равноценный прививке официальным методом (подкожно 40 млрд м.к.). При этом поствакцинальные РА и РСК выражены слабо и быстро угасают, что дает возможность осуществлять контроль за привитым поголовьем при карантинировании, купле-продаже, вводе-выводе, переформировании отар, эпизоотической характеристике, а также санитарной оценке отдельных жйвотных перед их убоем.

Реакция иммунодиффузии с О-полисахаридным антигеном (РИД с ОПС-антигеном), как метод дифференциальной диагностики бруцеллеза позволяет осуществлять эпизоотическую оценку отар овец после их прививки агглютииогенной вакциной из штамма 19 независимо от кратности, дозы и метода ее введения.

Внедрение. Основные материалы диссертационной работы использованы в нормативно-технических документах:

- Временное наставление по применению реакции иммунодиффузии с О-полисахаридным антигеном при диагностике бруцеллеза овец (утверждено ДВ МСХП РФ 11.01.96.);

- Временное наставление по применению вакцины живой сухой из штамма 19 бруцелла абортус конъюнктшшшп.ш методом при бруцеллезе

л

мелкого рогатого скота (одобрено решением ученого совета ВНИИБТЖ 8 оетября 1997 г., протокол №5 и представлено для утверждения в ДВ МСХПРФ).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:

-Координационных совещаниях но бруцеллезу и туберкулезу животных (г.Омск, ВНИИБТЖ) - 1994 и 1995 гг.;

-Ученых советах ВНИИБТЖ - 1994-1997 гг.;

-Научно-практической конференции "Основные научные исследования по проблемам туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных, профилактика и организация мероприятий по ликвидации болезней в регионе Сибири" (Новосибирск, 1995);

-Научной конференции "Паразиты и вызываемые ими болезни б Сибири" (Новосибирск, 1997).

Публикации, По материалам диссертации опубликовано А статьи, находится в печати - 1.

На защиту выносятся:

- оптимальная схема специфической профилактики бруцеллеза овен с использованием конъюнхтивалыюго метода иммунизации вакциной из штамма 19 в дозе 4 млрд м.к.;

- метод дифференциальной диагностики бруцеллеза овец, привитых ал лютиногенной вакциной аз штамма 19 с использованием РИД с О-ПС-антигеном.

Объем и структура диссертацш:. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста и состоит кз введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений.

Работа иллюстрирована 25 таблицами и 3 рисунками. Список литературы включает 257 источников, в том числе 58 - зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Материалы и методы исследовании. Работа выполнялась в 199? 1997 годах во Всероссийском научно-исследовательском институте бруцеллеза и туберкулеза животных, в хозяйствах и госветучреждсниах Омской, Курганской и Оренбургской областей.

Ретроспективную оценку эпизоотической ситуации по бруцеллезу овец, а также изучение эффективности проводимых прогивобруцгллезных мероприятий проводили на основании анализа эпизоотических данных. Источником информации по основные показателям нипоотического процесса (динамика неблагополучных пунктов, заболеваемость,

иммунизация вакцинами из штаммов В.abortus и B.meiitensis Rev-1) служили данные Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ, а дополнительными (методы, способы, схемы иммунизации, структура неблагополучных очагов, аборты, свежие случаи заболеваемости людей бруцеллезом, результаты бактериологического исследования и др.) -первичные документы ветеринарного учета и отчетности, материалы эпизоотического обследования хозяйств, областей (Омская, Новосибирская, Оренбургская, Курганская).

В поцессе разработки оптимальной схемы иммунизации овец против бруцеллеза вакциной из штамма ) 9 было поставлено 4 эксперимента на 161 овцематке. Иммунизацию, заражение животных в целях проверки иммунитета, отбор материала для бактериологических исследований, посевы на питательные среды, типизацию выделенных культур проводили по общепринятым методикам. Для заражения применяли

вирулентный штамм В. melitensis Н-102, полученный из ВГНКИ. Для иммунизации и реиммунизации животных использовали противобруцеллезную вакцину из штамма B.abortus 19.

Динамику угасания поствакцинальных реакций и специфичность РИД с ОПС-антигеном изучали в производственных условиях на 480 овцах, привитых подкожно (40 млрд м.к.) и конъюнктнвально (4 млрд м.к.).

. В качестве диагностических методов применяли: серологический (РА и PC К с официальным бруцеллезным антигеном, РИД с О-полисахаридным антигеном, изготовленным В.М.Чекишевым в ИЭВСиДВ) и бактериологический по общепринятым методикам.

Схема каждого эксперимента на овцах и методика их проведения подробно изложены в соответствующих разделах автореферата. Часть исследований, связанных с экспериментами на овцах, была проведена совместно с Г.С.Клочковым, Е.Б.Барабаиовой, В.В.Барабановой, Л.С.Эпельдимовым.

Автор выражает благодарность и признательность научным руководителям докторам ветеринарных наук, профессору, заслуженному деятелю науки Российской Федерации И.А.Косилову и старшему научному сотруднику П.К.Аракеляну, коллективу лаборатории, бруцеллеза мелкого рогатого скота ВНИИБТЖ, а также практическим ветеринарным специалистам за методическую и практическую помощь в проведении исследований и оформлении материалов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Анализ эпизоотической ситуации бруцеллеза мелкого рогатого скота ;

До 1954 года, когда в основе специальных методов борьбы с бруцеллезом животных лежала диагностика, эффективность противоэпизоотических мероприятий была крайне низкой. К этому сроку в стране числилось 1957 неблагополучных пунктов, заболело 233,3 тыс. овец, в изоляторах находилось на передержке 223,2 тыс. больных животных, зарегистрировано 5658 свежих случаев заболевания людей бруцеллезом.

В 1955-1960гг. в системе протнвобруцеллезных мероприятий начала широко использоваться специфическая профилактика с применением вакцины из штамма В. abortus 19. В основу метода специфической профилактики положен принцип разрыва эпизоотической цепи за счет формирования прочного и перманентного иммунитета у овцематок путем ежегодной ревакцинации. Оздоровление достигалось путем поотарной замены неблагополучного поголовья изолированно .вырешенными ярками. Указанная схема иммунизации показала высокий эпизоотологический эффект. За 20-летний период значительно улучшен:: эпизоотическая обстановка в стране: количество неблагополучных пунктов сократилось до 20, заболеваемость животных до 21,4 тыс., а людей - до 206 случаев.

Вместе с тем, в силу резко выраженной агглготиногенности штамма 19, которым ежегодно ревакцинировали все маточное поголовье, возникла проблема дифференциации поствакцинальных реакций. В связи с этим на протяжении последующих 10 лет (1979-1989) широко использовались иные схемы иммунизации с применением более иммуногсшюго, но также агглютиногенного штамма Рев-1: однократная приилвка ярок, ревакцинация овцематок с интервалом в два года. Целью внедрения данных схем являлось создание условий для проведения диагностических исследований привитых овец. Однако при этом напряженность иммунитета снижалась, что и послужило главной причиной ухудшения эпизоотического состояния в стране: количество неблагополучных пунктов увеличилось в два раза (с 20 до 44), а всего за последние 8 лет этого периода было выявлено 137 неблагополучных пунктов.

Учитывая низкую эффективность схемы применения вакцины из штамма Рев-1 ГУВ МСХ СССР в 1989 году прнннл решение вновь вернуться к использованию штамма 19. Эта мера уже в первые 6 лет попожительно отразилась на эпизоотическом состоянии страны: ¡¡a I июля 1997 года осталось всего 11 пунктов, заболело 480 животных.

Но вместе с тем, за указанный период существенно изменилась сама структура эпизоотичеких очагов. Бруцеллез овец в основном переместился в частный сектор. В отдельных областях (Оренбургская, Омская и др.) он составляет до 76%.

Кроме того, вследствие известных реформ в агропромышленном комплексе страны (ликвидация колхозов и совхозов, создание АО, фермерских хозяйств, крестьянских подворий) сложились неблагоприятные технологические условия в отрасли для осуществления принципа поотарной замены неблагополучного поголовья.

Эти обстоятельства и побудили ветеринарную науку к поиску новых подходов к решению проблемы специфической профилактики бруцеллеза овец.

2. Изучение эффективности копыонктнвальпого метода иммунизации спец против бруцеллеза вакциной из штамма 19

Этот вопрос изучался в двух аспектах: с позиции проявления поствакцинальных реакций при конъюнктивалыюй (в дозе 4 млрд м.к.) и подкожной (в дозе 40 млрд м.к.) иммунизации и с точки зрения Нормирования иммунитета у них.

2.1. Изучение иостпшсцпнальных серологических реакций у овец при копыо'пстинальпом методе введения вакцины

Поствакцинальные реакции изучали в сравнительном аспекте но трем показателям: количество реагирующих » РА и РСК, титры антител и сроки их персиСтеншш. Анализ приведенных, в таблицах I и 2 данных показывает, что все три показателя существенно отличаются по степени их выраженности в зависимости от дозы и метода введения вакцины. Так, за все сроки исследования в РА реагировало в первой группе 78 проб, а во второй - 538. При этом у овец, иммунизированных коныонктивалыю в дозе 4 млрд м.к., титры агглютининов были очень низкими - у 92,3% они составляли всего 25 МЕ (т.е. сомнительные). Наоборот, у иммунизированных подкожно 40 млрд м.к. количество реагирующих в РА с аналогичной концентрацией антител было в два раза меньше (45,5%). Что касается более высоких разкедений, то здесь различия еще более демонстративны: в ¡'А - 50 МЕ соответственно 3,8% и 42,2%; 100 МЕ -3,8% и 16.9%; 200 МЕ - 0,0% и 11,9% и 400 МЕ - 0,0% н 2,0%.

Аналогичная тенденция отмечена и в отношении РСК, где в подопытной ■ ругше (конъмнкшвалыю, 4 млрд м.к.) к разведении 1:5 было 73,2% проб, а н(1 шорой - только 29,2%, т.е. в 2,5 раза меньше. В ра(велении 1:10 резулы.иы почт одинаковые (2(>,Н"о и 25.3%). Но зато в

Таблица 1

ПостЕакцннальная РА (в ME) у овец, иммунизированных вакциной из штамма 19 разными методами в разных дозах

: Группе Реагк- : Сроки исследования Итого проб

1 (кол-ьо 1 жнвст- ромло : (дни)

! ных, |хармсте 15 30 60 90 120 150 180 270 360 Реаги- %

| рист.1 ровало

245 го>. Всего 4 29 и - - - 78 100

в т.ч.

4 млрд 25 3 25 - - - - - ■ - 72 92,4

м.к. 50 - 2 . - - . - - - 3 3,8

конъю- 100 1 2 - - - - - 3 3,8

нзптгаа- 200 - - 159 - - - ■ - - - 0

-ино

274 гол. Всего 20 .225 69 161 б 7 13 40 12 538 100

в т.ч.

40 млрд .25 4 51 63 79 5 2 10 17 8 245 ♦5,5

■ М.К. .50 1 87 19 55 1 3 13 4 227 42,2

под- 100 7 41 7 16 - - 8 - 91 16,9

кож- 200 6 38 1 11 - 2 - 64 И,9

но - 400 1 8 - • 11 2,0

800 - 0

Таблица 2

Поствакцинальная РСК (в титрах) у овец, иммунизированных вахциной из штамма 19 разными методами в разных дозах

Группа (кол-во живот-

Реагировало

Сроки исследования ' (дни)

Итого проб

ных, характе • рист.) : 15 зо 60 90 120 150 180 270 360 ! Реагц-|ровало %

245 гол Всего 1 25 7 8 - - - - 41 100

в т.ч.

4 млрд 5 - 20 6 4 - • - - - - 30 73,2

м.к.

£01ГЬ-

: юнкта- 10 1 5 1 4 - - - - И 26,8

вальао 20 • - - - - - - - - 0

274 гол. Всего 20 224 164 81 - 27 28 1 545 100

в т.ч.

40 млрд 5 4 28 44 43 • 19 21 - 159 29,2

я.к. 10 7 43 48 28 - 6 5 1 138 25,3

ПОД- 20 2 68 46 8 • - 2 - 126 23,1

кож- 40 7 51 18 1 1 - • 79 15,5

но 80 - 29 8 1 - - - - 38 7,0

I 160 - 5 - • - - - - 5 0,9

последующих, более высоких разведениях (от 1:20 до 1:160) отмечались реакции только у овец, имунизироваиных подкожно в дозе 40 млрд м.к.

Существенные различия и в длительности персистеиции антител: в подопытной группе они угасали через 90 дней, а в контрольной сохранялись у 2-17% до 360 дня (предельный срок наблюдений).

Что касается количественного соотношения РА и РСК, то здесь различий в группах не отмечено. Видимо, количественное превалирование РА над РСК является общим признаком для поствакцинальных реакций, независимо от дозы и метода введения вакшшьг.

Таким образом, в проявлении поствакцииальных реакций у животных, иммунизированных подкопаю и коньюпстивально, отмечаются четко выраженные различия в интенсивности антителообразования (количество реагирующих, титры антител, длительность их псрсистсниии) в пользу последнего.

2.2. Изучение иммунитета у овец при к-опыошсишяльпс.м методе введении иакцины

Иммунитет у овеа, привитых разными дозами и методами, проверялся в эксперименте путем искусственного заражения животных вирулентной культурой В. ;nciitcasis И-102 в 10-п кратной ИД. Сроки проверки иммунитета были разными - от 50 до 360 дней в зависимости от целен и задач каждого из 4-х поставленных опытов.

Опыт 1. Ставилась задача выяснить состояние иммунитета у овец, привитых разными методами и дозами . Для этого в первой группе (20 овцематок) животных прививапи конъюнктпцалыю в дозе 4 млрд м.к., а во второй (20 овцематок) - подкожно в дозе 40 млрд м.к. Контролем служили интактные животные (11 овцематок).

Заражение осуществляли через 5 месяцев после прививки (epos: совпадает с абортами в неблагополучных отарах), а убой животных для бактериологического исследования материала - через 30 дней после инфицирования. В течение этого периода овец исследовали в РА. и РСК на 7, 14, 30 дни после заражения.

В результате проведенных исследований установлено, что абсолютный иммунитет в жестких условиях эксперимента в обеих группах был примерно на одном уровне: 45,0% и 40,0%. Равным был и индекс инвазивности (ИИ) - соответственно 12,7 и 14,5. Вместе с тем, в контроле заразились все животные с высоким ИИ - 29,8

Опыт 2. Стопился с целью выяснить значение ревакцинации животных разными методами и дозами по иммунному фону, сформированному первичной подкожной прививкой в дозе 40 млрд м к

¡к

Схема опыта: первая группа (10 голов) - по указанному выше иммунному фону через 12 месяцев овцематок ревакцннировали конъюнктивально в дозе 4 млрд м.к. с проверкой иммунитета через 50 дней после ренммунизации. Вторая группа (10 голов) - при равных условиях овцематок ревакцннировали подкожно в дозе 40 млрд м.к. В третьей группе (10 голов) овцематок не ревакцннировали. Иммунитет у них проверяли через 360 дней после однократной прививки. Четвертая группа (6 голов) - контрольная.

В результате проведенных бактериологических исследований можно отметить, что реиммунизацмя через 12 месяцев после первичной прививки значительно повышает напряженность иммунитета (почти в два раза). Вместе с тем, как и в первом опыте, различий в характеристике иммунитета между группой первой (ммшонктивпльная реиммунизация в дозе 4 млрд м.к.) и второй (подкожная 'ревакцинация в дозе 40 млрд м.к.) не отмечено. В обеих группах иммунитет составлял 50% при ИИ соответственно 14,5 и 12,7, тогда как в третьей группе противостояли заражении; только 30% животных при ИИ 2-!,5. В контроле заболели все животные с ИИ - 33,3.

Опыт 3. В нем были продолжены исследования по выявлению оптимальных условий ревакцинации по следующей схеме. Первая ¡руппя (9 овцематок) .- первичная прививка 40 млрд м.к. подкожно с реиммушванией 4 млрд м к. коныоккгнвалыю. Вторая группа (9 овцематок) - первичная и повторная прививка в дозе 40 лярд м.к. подкожно. Третья группа (9 овцематок) - однократная прививка 40 млрд м.к. подкожно. Четвертая'группа (9 екцемзгок) - овец первично п поьгорно пр;;:.'.ивапп копъюпстипалыю в дозе 4.млрд м.к. Пятая группа (8 овцематок) - однократная прнвиска о лозе 4 млрд. м.к. конъюиктипально. Шестая группа (5 овцемато;;) • ¡сонтрольная.. Проверка иммунитета проводилась через 50 дней после.' реаакцинацни и 360 дней после однократной прививки.

. Результаты' опыта отражены в таблице 3, анализ которой показывает возможность и целесообразность использования конъюнкпталыюго метода прививки не' только при первичной иммунизации, но и прм ренммунизации. При этом иммунный фон от конъюнкпшалшего метода введения вакцины в лозе 4 м.трт .м.к.;',не повлиял отрицательно на. формирование' иммунитета. Абсолютный иммунитет в группах первой (подкожно 40 млрд м.к. + ко1П>юнктивалыгс 4 млрд м.к.) и четвертом (конъюнктквалыю 4 млрд м.к':<- ко1!1,;о1пстьвалыю 4 млрд м.к.) был равноценным - 77,8%, а ИИ в последней группе даже ниже: 6,0 и 4,0. Даже двукратная подкожная иммунизация (вторая труппа) не имела существенного преимущества но напряженноеш иммунитета - 38,9% при ИИ- 6.0

Таблица 3

Иммунитет

у овец, привитых разными методами вакциной из штамма 19 _

Группа животных Характеристика группы Количество животных Всего зара-илось Абсолютный иммунитет (%) Форма инфнцированносги Ипдекс инва зивиости

иммунный фон (метод, доза) реиммунизация через 12 хес. регао-. нарная железистая генерализован.

1 Подкожно Коиъюнктиваль- 9 2 77,8 1 1 ■ - . 6,0

; 40клрдк.к. но, 4 млрд м.к.

2 Подкожно Подкожно, 9 1 88,9 - . 1 5,0

40 .члрд м.к. 40млрдм.к.

3 Подкожно, - 9 ■3 «0,0 2 1 6.0

40 млрд м.к.

4 Конъюнхти- Коиъюнхтиваль- 9 2 ■щ 1 1 4,0

в&ияо, 4 млрд х.к во, 4 млрд мх

5 Конъюнкга- ■ 8 5 47,5 : 2 1 ' 2 , 12,5

вально, 4 млрд к.к.

6 К ОНТРОЛЬ 5 5 ' "■'■'■ 00,0 2 3 29,1

Естественно, что в группах третьей и пятой, где овец не речакцннировали, иммунитет был значительно слабее - соответственно 60,0 и 47,0%.

В контроле заразились все животные при высоком ИИ - 29,1.

Опыт 4. В нем решался вопрос о напряженности иммунитета у овец, первично привитых подкожно а дозе 40 млрд м.к, и реиммунизнрованных разными методами й дозами в более длительные сроки. Заражение животных проводили через 6 месяцев после ревакцинации. В первой группе (9 овцематок) животных первично прививали подкожно в дозе 40 млрд м.к. и реиммунизировали конъюнктивально в дозе 4 млрд м.к. Вторая группа (10 овцематок) - овец первично и повторно иммунизировали подкожно в дозе 40 млрд м.к. Третья группа - контрольная (5 иитактных животных).

В результате проведенных исследований установлено, что иммунитет в данном опыте через 6 месяцев после ревакцинации был невысоким без существенных различий между группами: соответственно 33,0% и 30,0% При ИИ 15,1 и 26,3. В контроле животные заболели бруцеллезом все с ИИ -30,9.

Особый /интерес с практической точки зрения представляют материалы по сравнительному изучению характера • проявления серологических реакций у интактных овец после прививки им вакцины разными методами и дозами и после зара-жечня их еирулгнтной культурой В. melitensis. Проведенный в данном аспекте анализ (таблицы !,2 и 4) показ.'!/.' характерные различии в проявления поствакцинальных и постинфекциоиных реакций, которые могут быть использованы при дифференциальной диагностике бруцеллеза.

Такими признаками являются:

-количественное соотношение РА и РСК. При поствакцинальных реакциях показатели РА в 2,3 - 3 раза превалируют над РСК, тогда как-после заражения эти показатели нивелируются; . .

- качественные показатели РА и РСК. Как это видно из таблиц 1 и 2 у здоровых животных после коныонктииальной прививки вакцины а дозе 4 млрд м.к. концентрация агглютининов даже в первые месяцы после вакцинации не превышает 100 МЕ. У иммунизированных подкожно в дозе 40 млрд м.к. в указанные сроки обнаруживаются реагирующие в РА в концентрации 200 МЕ - 400 МЕ. На этом уровне (200 МЕ) реакции сохраняются до 270 дня. Аналогичная закономерность обнаруживается и в отношении РСК. титр которой в нервом случае не превышает 1:10, тогда как после подкожной прививки он составляет 1:80 и даже 1:160. Сохраняется довольно длительно (180-270 дни) в разведениях 1:20 - 1:40.

п

Тсбллца 4

Серологические реакции у овец, иммунизированных вакциной из штамма 19, после заражения вирулентной культурой В.те1пепзв (в процентам)

лу* групп Прививка Колет ее -тво животных РА (МЕ) РСК (татр)

доза } метод (млрд, | м.к.) ; 25 50 100 | 200 •' ■ 1 400 | 800 1 5 10 20 40 80 160

1 4 ^йгиоаатим! 28 'льва ' 32,1 28,6 143 10,7 з,б ! з.б 1 1 25,0 25,0 32,1 7,1 3,6

2 40 ¡полхожво , 39 25,6 2&,2 17,9 15,4 1 2,6 - 2,6 25,6 41,0 25,6 25,1 -

3 ! 40+40 роА»ожда+ ¡29 амппп г 6,9 20,7 31,0 27,6 | 103 10,3 20,6 37,9 17Д 103 3,4

4 : 40+4 подкожа^ 23 ко«гиоах< 1 Шишо 1 25,0 32,1 17,2 14,9 | 3,6 1 - 10,7 393 25,0 10,7 10,7 *

5 4+4 1 ХОЗиОВХГШ! >9 ! ! ♦ ••! . 1 1 ховгыонзгткя; 333 11,1 • " - '22,2 44,4 22,2 11,1

Итого ¡ 134 ! (подопытные 1 ! хагдотные) [ I ( 23,1 26,1 18,6 15,7 4,5 ■ ' 0,7 6,7 283 32,1 20,9 7,5 1,5

6 | Контроль | 27 Г (интвктные | животные) ! 11,1 37,0 22,2 333 3,7 3,7 18.5 29,6 ... . ._ . 40,7 7,5

После заражения иммунизированных животных, независимо от дозы, кратности и метода введения вакцины, высокие титры антител (РА 200 МЕ и выше, РСК от 1:40 и выше) встречаются у значительного количества животных (от 10,7% до 32,1 %, а суммарно в 2-3 раза больше).

Характерно, что в подопытной группе, т.е. у ояец, привитых конъюнктивально в дозе 4 млрд м.к., максимальный титр РА 100 МЕ . регистрировался только в течение 30 дней, а РСК 1:10 - до 90 дня. При иммунизации полной дозой РА 200 МЕ и РСК 1:40 отмечались и по истечении даже 270 дней после прививки.

Следовательно, при конъюнктивально« прививке овец представляется возможным в определенные сроки после иммунизации судить о характере серологических реакций. По истечении уже 3-х месяцев о контакте с инфекционным началом свидетельствуют такие признаки, как количественное нивелирование показателей. РА и РСК и наличие реагирующих в РА в разведении не ниже 100 МЕ и РСК - в титре не ниже 1:20. По истечению 5 месяцез после прививки у животных, привитых конъюнктивально, полностью угасают поствакцинальные реакции. Натичие РА или РСК в обычных диагностических титрах свидетельствует об инфицировании животных.

У овец, привитых по наставлению, т.е. подкожно в дозе 40 млрд м.к., и РА, й РСК в довольно высоких титрах сохраняются длительное время (более года) и судить по серологическим реакциям об эпизоотическом статусе иммунизированных животных не представляется возможным.

Итогом проведенных исследований янляетея доказательство возможности и целесообразности использования конъюнктнвального метода вакцинации в дозе 4 млрд м.к., при которой у животных формируется иммунитет достаточной напряженности при слабо выраженной серопозитивности, что позволяет осуществлять эпизоотическую оценку привитого поголовья.

3. Изучение РИД с ОПС-антнгеном как метода дифференциальной диагностики

Проведенными в лаборатории исследованиями П. К. Ара геля на. Е.Б.Барабановой было показано, что у здоровых ннтлктных животных реакция иммунодиффузии с О-полисахаридным антигеном (РИД с О-ПС-антигеном) постоянно отрицательная, т.е. она является высоко специфичной. Вместе с тем, у овец, искусственно инфицированных в разных дозах, она возникала на 14-й день и сохранялась на протяжении всего опыта.

Кроме того, в производственных условиях отмечено, что у овец, иммунизированных вакцинами из штаммов В.аЬогпв 19 и В шеШег^ Рев-1 реакция сохраняется в течение 3-х месяцев.

Значение РИД в качестве метода дифференциальной диагностики у овец, привитых вакциной из штамма 19 и впоследствии зараженных, не изучено.

Нам представилась возможность в опытах по изучению иммунитета у овец, привитых разными методами и дозами, изучить РИД с О-ПСт антигеном в сравнении с РА и РСК под контролем бактериологического исследования материала от подопытных н контрольных животных. Эти данные приводятся в таблице 5.

Анализ материалов показал высокую специфичность и чувствительность метода дифференциации поствакцинальных реакций. Это наглядно видно из приведенных данных, которые показывают, что у здоровых интаетных овец РИД, как и РА и РСК, отрицательная. Вместе с тем у здоровых овец после прививки РА и РСК сохранились у 19 животных из 146 при отрицательной РИД. После заражения РА+ РСК была положительной у 100% контрольных животных, а РИД только у 19 из 27 или у 70,4%. Аналогичное соотношение и у иммунизированных овец: соответственно из 146 у 143 (97,7%) и у 70 (47,7%). Указанное соотношение сохраняется и у заразившихся животных, у которых в контрольной группе комплекс РА+РСК был у 100%, а РИД только у 70,4%. Соответственно у овсц-бруцеллоносителей подопытной группы РА+РСК были у 98,6% и РИД - у 62,8%

Таким образом, приведенные материалы подтверждают полученные ранее Аракеляном П.К. данные о том, что РИД является специфичной реакцией, но по своей чувствительности она уступает диагностическому комплексу РА+РСК, Вместе с тем, она отсутствует у здоровых овей, привитых вакциной из штамма 19 и по этому признаку может быть использована в целях дифференциации поствакцинальных реакций.

Приведенные выше материалы использованы при разработке Временного наставления по применению реакции иммунодиффузии с О-полисахаридным антигеном при диагностике бруцеллеза овец, утвержденного Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 11 января 1996 года, №13-7-2/503 .

4. Разработка оптимальной схемы иммунизации овец против бруцеллеза

На основании результатов проведенных исследований по сравнительному изучению эффективности применения вакцины из штамма

Таблица 5

Соотношение показателей РА + РСК.'и РИД в опытах по изучению иммунитета.

Группа аснвот-£Ш Коли -чес-тзо До заражения На 30 дгиь после заражения Резулм •лги бактериологических исследований

РА + РСК РИД РА+.РСК РИД Загизклось РА + РСК РИД

ЕО.ч-йО % : *:ол-во кол-во % кол-во %

Подопытные (таму-ааззро'зин -аые + . ■ ннф^цвро-ванке) 145 19 143 97,7 70 • 47,7 7£ 55,7 77 98,6 • • 49 ■ 62,8

Кодтроль 27 . 27 1С0 19" 70,4 27 юо'4 27 100 19. 70,4

19 на овцах в разных дозах (40 и 4 млрд м.к.) и при различных способах ее введения (подкожно и кснъюнктивалыю), а также данных по испытанию диагностической ценности РИД с О-ПС-антигеном, нами разработана принципиальная схема иммунизации овец против бруцеллеза вакциной из штамма 19.

Схема иммунизации дифференцирована по специальным мероприятиям в зависимости от;

- эпизоотической ситуации региона (область, край, район);

- форм собственности и размера хозяйства (поголовье).

4.1.Благополучные регионы; в случае выявления положительно реагирующих животных все неблагополучное поголовье овец сдают на убой.

4.2.Неблагополучные регионы: мероприятия дифференцируются в зависимости от принятой технологии в овцеводстве.

4.2.1.Крупные хозяйства, имеющие возможность . осуществлять поотарную замену неблагополучного ' поголовья изолированно выращенным молодняком.

Организац.чонн'о-хозлйстгенные мероприятия осуществляются по принципу, изложенному в Наставлении по применению вакцины из штамма 19, но при введении ее конъюнктивадьно в дозе 4 млрд м.к> Эпизоотический контроль проводится по косвенным показателям (аборты, заболеваемость людей и баранов), а также в случае необходимости оценки животных при карантинироогнии, вводе, выводе, купле,. продаже, переформировании отар, убое и др. по показателям РИД и срокам угасания РАиРСК. ..-■

4.2.2.Хозяйства с небольшим поголовьем овец, не имеющим возможности осуществлять поотарную замену неблагополучного поголовья изолированно выращенным здоровым молодняком.

Все пого]и,еье иммунизируют вакциной из штамма 19 а дозе 4 млрд м.к. конъюнктивально с ежегодной реиммунизацией на протяжении всего срока оздоровления и далее в течение 3-х лег для предотвращения рецидивов.

Снятие ограничений и эпизоотический контроль осуществляют с учетом косвенных показателей (аборты, заболеваемость дюдей и непривитых овец бруцеллезом) по результатам исследования привитых овец. Наличие РИД по истечению 3-х месяцев, или РА и РСК - 5-и месяцев ■после последней прививки свидетельствуют о неблагополучии отары (группы) по бруцеллезу.

выводы

1. Бруцеллез мелкого рогатого скота суля по эпидемиологическим данным до настоящего времени имеет серьезное энизоотологическое и хозяйственное значение в отдельных регионах Российской Федерации. При этом в связи с глубоким реформированием агропромышленного комплекса страны (расформирование колхозов и совхозов, создание акционерных обществ, фермерских хозяйств и расширение крестьянских подворий) изменяется и сруктура очагов бруцеллеза - перемещение в частный сектор (76%).

: 2. Схема иммунизация овец, регламентированная действующим .»наставлением по применению вакцины из штамма 19, эффективна п крупных овцеводческих хозяйствах, где имеются условия поотарной замены неблагополучного поголовья изолированно выращенным молодняком. При отсутствии указанных организационно - хозяйственных условий (особенно в частном секторе) результативность специфической профилактики с использованием агглютиногенной вакцины из штамма 19 снижается из-за невозможности осуществления эпизоотического контроля . за привиты» поголовьем вследствие длительного сохранения : поствакцинальных реакций.

3. Проблема, связанная с поствакшшалыюй • ссропозичиаиостью, може быть решена путем разработки оптимально!! схемы иммунизации овец с использованием агглютиногенной вакцины, обеспечивающей формирование иммунитета достаточной напряженности при слабо выраженных серологических реакциях или за счет использования падежных методов дифференциальной диагностики.

4. Оптимальной схемой иммунизации овец агглютиногенной вакциной из штамма 19 является коньюнктивальяый метол ее введения в

•дозе 4 ; млрд. м.к., обеспечивающий формирование иммунитета, равноценного при применении этой вакцины официальным методом (подкожно в дозе 40 млрд.м.к.) независимо от кратности иммунизации и иммунного фона. При этом лоствакцинальные реакции (РА и РСК) угасают через 5 месяцев после последней прививки.

5. Эпизоотическую оценку привитому поголовью овец вгкпинон из штамма 19 по оптимальной схеме можно осуществлять в более ранние сроки по характеру проявления поствакиинальных и постинфекнионнмх реакций/ учитывая ' количественные показатели: У здоровых вакцинированных овец но ис>сменим 3-х месяцев' в структуре поствакцинальных реакций ирсоодадзет РА над РСК а 2-3 раза При этом характерным чокаэаюлем иосп'.акшшальиыч реакций к указанному сроку является отсутствие РА и .РСК в высоких титрах («мотшпетвенно 10ОМ.К. и ! :20)

6.Реакция иммунодиффузии с О-полисахаридным антигеном (РИД с ; ОГ1С-антигсном) позволяет осуществлять эпизоотический контроль по

бруцеллезу за овцами, привитыми агглютииогениой вакциной из штамма 19 по истечению 3-х месяцев после иммунизации, независимо от кратности прививки, метода введения и лозы вакцины. Наличие положительной РИД к указанному сроку свидетельствует о неблагополучии отары по бруцеллезу. ' . .. ■ ■;

7.РИД с ОПС-антнгеном не может быть использована в качестве метода индивидуальной дифференциации реагирующих животных на вакцину или инфекцию при оздоровлении отар.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. "Временное наставление по применению реакции иммунодиффузии. с О-полисахаридным антигеном при. диагностике бруцеллеза овец" (утверждено ДВ МСХН РФ 11.01. 1996г.)

2."Временное наставление по применению вакцины живой сухой из штамма 19 бруцелла абортус конъюнктивальным методом при бруцеллезе мелкого рогатого скота" (одобрено решением ученою совета ВНИИБТЖ 9 октября 1997 года, протокол №6 и представлено для утверждения в ДВ МСХПРФ).

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации

ККосялов И.А.,' Аракелян 11.К., Клочков Г.С.; Рукин А.Т. Конъюнктивальный метод иммунизации овец вакциной из штамма 19 // (тез. докл. науч.-практнч. конф."Основные научные исследования по проблеме тубе, кулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных, профилактика и организация мероприятий по ликвидации болезней в регионе Смбири"-Новосибирск- 1995.-С. 101-102.

2.Рукин А.Т. Опыт применения конъюнктивального метода иммунизации овец против бруцеллеза '//Инф.' листок №!91>96 Омского центра науч.-техн. инф,-Омск,-1996.-2с.

3.Аракелян П.К.,: Барабанова Е.Б., Рукин А.Т. Использование вакцины В.аЬоПиБ 19 при бруцеллезе овен //Ветеринария - 1997.-№4,- С. 19,21.

4.Аракелян П.К., Рукин А.Т. Усовершенствование специфической профилактики бруцеллеза овен У/Тез. докл. второй науч. конф. Новосибирского отделения Паразитологнчесхого общества РАН "Паразиты и вызываемые ими болезни в Сиоири"-Иовосибирск.т1997>С.11-12.