Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка методов получения, культивирования и криоконсервирования хрящевых клеток и тканей.

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

Р Г ь ;

На правах рукопису

ГЕРУС ГАЛИНА БОРИСІВНА

РОЗРОБКА МЕТОДІВ ОДЕРЖАННЯ, КУЛЬТИВУВАННЯ Я КРІОКОНСЕРВУВАННЯ ХРЯЩОВИХ КЛІТИН ТА ТКАНИН

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія, вірусологія, ЄПІ30Т0Л0ГІЯ, МІКОЛОГІЯ і імунологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

/ : С

Харків - 1997

Робота виконана в Інституті експериментальної і клінічної е теринарної медицини УААН та Харківському науково-дослідна інституті ортопедії та травматології ім.проф. М.І.Ситенка

Наукові керівники: доктор ветеринарних наук, академік УААЇ

фукс Поліна Швлівна доктор біологічних наук, професор Дєдух Нінель Василівна

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук

Конариевський Константин Євгенович кандидат ветеринарних наук, доцент Руденко Анатолій Федорович

Провідна організація: Сумський сільскогосподарський інетиту

Мінсільгосппроду України, м. Суми

Захист дисертації відбудеться " 2, " иг1997 рс на засіданні спеціалізованної вченої ради Д 02.32.01 при Інетиту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адр сою: 310023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту експ риментальної і клінічної ветеринарної медицини (м. Харкі вул. Пушкінська, 83).

Автореферат розісланий " сЬЙ " 1997 року.

Вчений секретар спеціалізованної вченої ради л ■■')

доктор ветеринарних наук л / / / » .,, П Чечоткіна ЕП.

куґі Чііих

- 1 -

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми та ступінь дослідйєності тематики дисертації. За останній час досягнуто чималих успіхів у вивченні клітинних культур in vitro. Культури клітин застосовують при вирішенні таких проблем, як: канцерогенез, регенерація, взаємодія вірус-клітина, морфогенез, клітинне старіння, диференціювання і проліферація клітин, скринінг лікарських препаратів, оцінка чинності різноманітних алергенів та ін. Але до теперішнього часу не набули розповсюдження культури з хрящової тканини.

У зв'язку з цим, а також з поширенням різноманітних захворювань суглобів людини і тварин - бурсити [Berg Т. F. , 19923 артрити, викликані вірусними інфекціями [Härtung К. ,19913; деформуючі артрози - абє'ктом дослідження стала хрящова тканина. Проте ряд аспектів цієї проблемі не вирішений і залишається у полі зору фахівців.

При ушкодженні суглобового хряща розроблені методи трансплантації кістково-хрящовими тканинагяі, але на сьогоднішній день вони недосконалі у зв'язку з тим, що трансплантати часто виторгуються тканинами реціпієнта хазяїна. Лише поодинокі дослідження відбивають процеси перебудови хрящоеої тканини при заміщенні дефектів у хрящі фітальними або неонатальними мезенхімальними клітинами EHelbing, 1982]. Отримані позитивні результати у цьому напрямку потребують подальших досліджень.

Важливою проблемою, тісно пов’язаною з розробленням і впровадженням методів отримання і культивування клітин і тканин in vitro, є пошук надійних засобів їх тривалого зберігання.

З відомих засобів збереження клітинних культур найбільш ефективним є консервування їх у глибокозамороженому стані (-196°С)

[іфченко Т. Е , 1992; Стегній Б. Т., 1995], Проте [Білоконь

В. С. ,1997] показано, шр кожен етап процесу заморожування-розморожування (контакт клітин а кріопротектором у середовищі заморожування, процес заморожування-розморожування, середовище реконсер-вації) завдає деяких ушкодженні і може впливати на проліферативну спроможність розморожених клітин.

На підставі викладеного матеріалу можна заключите, щр накопичений до цього часу обсяг знань по культивуванню клітин і тканин суглобового хрящ достатньо великий. Проте не розроблена технологія отримання культури тканин із хрящових клітин, не вивчена спроможність мезенхімальних клітин диференціюватися в хрящові клітини в різноманітних умовах культивування, не проведений порівняльний аналіз особливостей культивування клітин залежно від віку реципієнта, не розроблені методики короткотермінового і тривалого зберігання отриманих культур клітин.

Мета роботи. Головна мета роботи - розробити методи одержання, культивування й кріоконсервування хрящових клітин та тканин.

Завдання досліджень

1. Розробити технологію одеражння культури високого ступеня щільності із мезенхімальних клітин зачатків кінцівок курячих ембріонів та ембріонів щурів і визначити умови, які сприяють диференціюванню мезенхімальних клітин у хондроцити.

2. Вивчити мождивості використання мезенхімальних клітин (зачатки кінцівок курячих ембріонів та ембріонів щурів), культивованих в агаровому гелі, для репаративної регенерації поверхневих дефектів суглобового хряща.

3. Розробити методику одержання і культивування фрагментів суглобового хряща на підложках із демінералізованої кісткової

- з -

ткании,. провести порівняльний аналіз з відомим методом культивування на плекеигласових платформах, визначити можливість використання даного типу культури для вивчення вірусів.

4. Вивчити життєздатність мезенхімальних клітин, одержаних із зачатків кінцівок курячих ембріонів та ембріонів шурів, в умовах низькотемпературного зберігання (-186°С) з різними кріопротекто-рами.

Теоретична і практична цінність дослідаєнь та їх наукова ковтана. Вперше в Україні розроблені методи культивування мезенхімальних хрящових клітин, отриманих з зачатків кінцівок курячих ембріонів та ембріонів білих шурів, а також запропоновані методи їх кріоконсервування (авторське свідоцтво N 3575604, від 30.04.1984).

Вперше запропоновано метод культивування хряшрвих фрагментів у підложках із демінералізованої кістки, який дає можливість отримати ріст клітин у хрящових експлантатах (авторське свідоцтво N 4652813/30-13, від 07.12.1990; 2 раціоналізаторські пропозиції N 901;902).

Виконана робота дає змогу:

- використовувати культури високого ступеня щільності (ме-зенхімальні клітини, які деференціотться в хондробласти та хонд-роцити) для регенерації дефектіз суглобового хрящ, що може знайти застосування в медичній практиці та клінічній ветеринарії;

- застосовувати органну культуру хрящової тканини, культивовану в підложках із демінералізованої кістки, як тест- систему при вивченні дії фармакологічних речовин;

- використовувати кріоконсервовані мезенхімальні клітини у віросології;

- застосовувати культуру високого ступеня щільності та органну культуру ембріонального хряща як тест-систему при вивченні вірусологічних питань.

Рівень реалізації та впровадження наукових розробок

Основні результати досліджень впровадженні в практику у вигляді: "Засобу культивування хрящових фрагментів" (авторське

свідоцтво N 4652813/30-13); запропоновано до впровадження кріоп-ротектор - "Я-океіетіл-гепта (оксіетілен) - морфолін як кріопро-тектор" (авторське свідоцтво N3575604); "Методу культивування суглобової тканини в підложці із демінералізованої кістки" (Рад. пропозиція N 901)"; "Системи для культивування суглобової тканини з дозованою подачею СО " (Рац. пропозиція N 902); "Методичних рекомендацій по кріоконсервуванни та цитологічному контролю якості клітинних культур та фрагментів тканини" (Харків, 1981. -27 с.

-УВДІЕВ).

Розроблені методи одеражння та культивування мезенхімальних клітин і фрагментів хрящової тканини впроваджені в розробках лабораторії патогісгоморфології ХНДІОТ по регенерації суглобових хрящів, а також по випробуванню дії герпес і тоговірусів на хрящові культури в лабораторії вірусології ІЄКВМ.

Апробація та публікації результатів наукових досліджень

Основні положення дисертаційної роботи були повідомлені на II Всесоюзній раді "Культивування клітин тварин та людей" (Пущи-но, 1985); на X Всесоюзному з'їзді анатомів, гістологів, ембріологів (Вінниця, 1986); на Всесоюзній науковій конференції "Гістогенез та регенерація" (Ленінград,1985); на Всесоюзному симпозіумі "Структура, функція та розвиток хрящ у нормі та патології" (Москва, 1985); на Всесоюзній конференції "Молекулярні та

функціональні механізми онтогенезу" (Харків, 1986); на Республіканській конференції молодих вчених УРСР (Харків, 1990); на конференції молодих вчених і спеціалістів України (Зйрків, 1992).

8а темою дисертації опубліковано 12 наукових праць.

Структура та обсяг дисертаційної роботи

Дисертаційна робота виконана на /Аг сторінках машинописного тексту, містить таблиць, 3 2, малюнкіЕ і складаєть-

ся в вступу, огляду літератури, власних матеріалів і методів досліджень та результатів досліджень, їх обговорення, висновків, практичних пропозицій та списка використаної літератури в 200 джерел, у тому числі 117 іноземних.

Особистий внесок дисертанта у розробку наукових тажваень,

ро виносяться на захист

Особистий внесок дисертанта полягає у самостійному виконанні всього обсягу експериментальної роботи, у проведенні дослідів по культивуванню мезенхімальних клітин та тканин суглобового хрящу; вірусологічних досліджень, статистичній обробці отриманих даних та їх оцінці.

На підставі аналізу результатів експериментів та співставленая їх з даними літератури дисертантом сформульовані такі положення, які виносяться на захист:

- технологія одержання та культивування ембріональної хрящово ї тканини й суглобового хряпр білих щурів різних вікових груп на плексігласових платформах та в демінералізованих кісткових підложах, а також вивчення дії герпес - і тоговірусів на ембріональні клітини;

- методика підбору ембріональних тканин для одержання зенхімальних клітин з послідуючим їх культивуванням на різно-

манітних підложках, одержання культури високого ступеня щільності та кріоконсервування мееенхімальних клітин;

- методика одержання повноцінного регенерата дефектів сугло-бовогу хряир кролів при заповненню їх мезенхімальними клітинами, які культивувалися в агарі.

ВЛАСНІ ДОСЛІДШШНЯ

Матеріали і методи. Робота виконана у лабораторії клітинних культур та вірусології Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, а також у лабораторії патоморфології та експериментальної патології науково-дослідного інституту ортопедії та травматології ім. проф. М. І. Ситєнка у період з 1981 до 1996 року.

У роботі використовувалися:

Тварини-, кролі породи Шиншила віком 1 рік - 10 голів; білі щури лінії Вістар віком 10 діб, 1, 3, 4, 6 і 12 місяців; ембріони курей різної доби розвитку: 4, 10, 18 і 20.

Віруси: штам інфекційного ринотрахеїту- пустульозного вуль-вовагиніту (ІРТ-ІПВ), "Молдавський" та вірусної діареї - хвороби слизових оболонок (ВД-Ж), польовий штам 25. Віруси пасажували на органній культурі хрящової тканини, яку одержували з 10 добових курячих ембріонів. Культури тканин вирощували на живильному середовищі 199 з додаванням 10% інактивованої сироватки крові великої рогатої худоби. Пеніцилін та стрептоміцин додавали з розрахунку по 100 і 50 ОД/мл, відповідно.

Кріопротентори: гліцерин, ДМСО, оксіетиленморфолін у концентраціях 2,5; 5; 10; 15%. Кріоконсервування мееенхімальних

клітин, одержаних від зачатків кінцівок курячих ембріонів (4 доби розвитку) по Haddhazy С. (1982), та ембріонів білік шурів (11 доби розвитку) [Дєдух Е В., 1986] проводили за розробленими мето-

дичними рекомендаціями [Красников Г. А., 1981].

Для досягнення поставленої мети було проведено три серії експериментів. У першій серії використовували культивування хрящових фрагментів на підложках із плексегласу на основі модифікованого методу ІржаноЕа С. Д. (1973) та на підложці із демінералізо-ваної кістки [Двдух К В. ,19903.

Суглобовий хрящ 1,3,6-місячних білих щурів знімали з ГОЛІВОК стегневих кісток, розсікали на шматочки 2x2 мм2і культивували на плексит ласових платформах з мі лі поровши фільтрами в чашках Петр і у живильному середовищі 199 з додаванням 10% сироватки великої рогатої худоби.

Суглобовий хрящ, 10- денних курячих ембріонів культивували таким же чином і додатково проводили зараження вірусами ІРТ-ІПВ "Молдавський", та польовим вірусом ВД-25. Наявність вірусів у клітинах дослід^али за допомогою методу імунофлюоресценції [Антонов Б. І., 1987] на основі методичних рекомендацій [Андреев

в. В., 1990].

У другій серії експерименту проводили культивування ме-зенхімальних клітин із зачатків кінцівок 300 курячих ембріонів і 420 ембріонів білих щурів. Суспензію клітин у вигляді п'яти капель наносили на поверхню покрівного скельця мікропіпеткою F-10 (2x1б5клітин в 0,1 мл середовищ на площу 0,25 см2). Культивування проводили при 3?вС, та 5% СО^у вологій камері в чашках Петрі з живильним середовищем 199 та 10% ембріональної телячої сиворотки. Додатково в середовище додавали 50 мкг/мл аскорбінової кислоти.

- 8 -

Живильне середовшцэ змінювали шрдобово.

Хондроцити культивували ва розробленою наші методикою на колагенових, желатинових підложках та в агаровому гелі. Остання використовувалася для регенерації суглобового хряпр. Для цього j суглобовому хрящі стегневих кісток 12 кролів (6-й - У ДОСЛІДНІЇ групі, 6-й - у контрольній) зубним бором (діаметр - Змм) робїш поверхневий дефект. У дослідній групі дефект заповнювали клітинною бластемою, яка росла в агарі на протязі 2 діб, а у контрольній групі - дефекти не заповнювалися. Результати досліді! спостерігали через 3 та 6 місяців.

В третій серії експериментів проводили кріоконсервування ме-зенхімальних клітин в підрахунком кількості живих та мертвш клітин до та після консервування, а також визначенням числа утворених вузликів у тканиному моношарі.

Для світової мікроскопії застосовуали стандартні методі гістологічної проводки. Вивчення препаратів проводили з використанням мікроскопа МБІ-б після фарбування зрізів (3-5 мкм) гематоксиліном та еозином, альціановим синімм [Пірс Є, 19683.

Статистичну обробку одержаних результатів проводили за допомогою комп'ютера IBM PC/AT з використанням програм ветеринарноі статистики.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДШЬ Культивування хрящових фрагментів на плексигласові« платформах

При гістологічних дослідженнях експлантатів, відібраних і

1-місячних білих щурів та культивованих на платформах із плексигласу, на 15 добу виявлена гіперплазія клітин у хрящі. Частині

клітин розташовувалася у капсулах, окремі клітини капсул не формували. При культивуванні фрагментів хряща, отриманних від 3-місячних білих щурів через 15 діб, щільність клітин була такою, як і у інтактних тварин. В крайових та глибоких відділах хряща визначалися клітини з великими гіперхромними ядрами і слабко ба-зофільною цитоплазмою. У гіпертрофованому хрящі визначені вогнища детриту, між лакунами знайдені невеличкі ділянки кісткової тканини. При культивуванні фрагментів суглобового хряща 12-місячних білих шурів, відмічено зниження клітинної щільності та появу КЛІТИН З ПІКНОТИЧНИМИ ядра!,®.

Встановлено, що фрагменти суглобового хряща, отримані з головок стегнових кісток білих турів різних вікових груп (молоді, зрілі та старі), можуть бути використані для культивування, але кінетика поведінки клітин у культурах тканин значно відрізняється. Незначна гіперплазія хондроцитів спостерігалася тільки в хря-првих фрагментах тварин одномісячного віку. У фрагментах хрящів б і 12-місячних тварин хондроцити зберігали життєздатніть.

З метою стимуляції проліферації хондроцитів наступним етапом роботи була розробка методу культивування суглобового хрящ на підложці із демінералізованої кістки, виходячи з положення, шр органічний матрикс кістки має виражені індуктивні властивості.

Культивування хрящових фрагментів на підяокіах із

демінералізованої кісткової тканини

При вивченні культур хрящових фрагментів, отриманих з голівок стегнових кісток 1-місячних шурів і висадженнях у підлож-ки із демінералізованої кісткової тканини, встановлено, що через 5 діб культивування збільшилося число хондробластичних клітин. Через 10 діб - відмічено апозиційний ріст хрящ за рахунок

проліферації недиференційованих клітин на його поверхні. Хондроб-ласти та хондроцити зберігали характерну структурну організацію. Черев 15 діб культивування в експлантатах виявлялося порушення позиційної специфічної організації, характерної для суглобового хрящ. Спостерігалася гіперплазія хрящових клітин по всій території фрагментів.

Таким чином, демінералівована кісткова шдложка сприяє не тільки збереженню життєздатності, а й вираженій гіперплазії хонд-роцит і б у хрящових експлантатах. На цей метод культивування отримане авторське свідоцтво (И 4552813/30-13).

Виходячи із одержаних даних, наступним об'єктом дослідження були проксимальні відділи стегнових кісток ембріонів курей, ЯКІ культивувалися на платформах із демінералізованої кісткової тканини. Встановлено, щр після 15 діб культивування у поверхневій та проміжній зонах суглобового хряшр, виявлялися Еогнища гіперплазії хондробластів, які характеризувалися підвищеною ¡цільністю мембранних органел у цитоплазмі та великими гіперхромними ядрами з розширеними порами.

Кісткова тканина після культивування зберігала свої морфологічні характеристики. Остеобласти розташовувалися на поверхні кісткових трабекул, мали великі розміри і асиметрично розташовані ядра, їх цитоплазма була різко базофільна.

В епіфізарному хрящі чітко виділялася зона росту, яка була пофарбована більш базофільно, ніж суглобовий хрящ. Території зони росту були заселені щільно розташованими хрящрвими клітинами різного ступеня зрілості з характерною структурною організацією.

Таким чином, фрагменти суглобового хряпр та тканини проксимального відділу стегнових кісток, культивовані у підложках із

демінералізованої кістки, на протязі 15 діб не тільки зберігали свою життєздатність, але й мали виражену гіперплазію хрящових клітин.

Дії вірусів на культуру хрящової тканини

Для вивчення дії вірусів інфекційного ринотрахеїту - пустульозного вудьвовагиніту (ірт-ІПВ) та вірусної діареї-хвороби слизових оболонок (ВД-ХС) у культуру хрящової тканини, (10 доба розвитку курячих ембріонів) культивовану протягом 1 доби, додавали по 1,5 мл вірусу ІРТ-ІПВ шт. "Молдавський" та вірусу ВД-ХС з

-525__ --ЛЬГ

титрами 10 ТДЦД і 10 'ТЦПД , відповідно. Через З доби культивування хрящові тканини знімали, промивали забуференим фізіологічним розчином (ЗФР pH = 7,4), розтирали в ступці, фільтрували, після чого краплі наносили на скельце, робили мазки та фарбували аа прямим методом РІФ (Андреев в.В. та інші, 1990).

Мазки вивчали в синьо-фіолетових променях люмінесцентного мікроскопу. В клітинах, заражених вірусами та пофарбованих специфічними ІРТ-ІПВ; ВД-ХС кон'югатами ФІТЦ, спостерігалося яскраво-зелене світіння в ядрі та цитоплазмі, а в контрольних препаратах з нормальною негативною ФІТЦ-кон'югатом великої рогатої худоби світіння не спостерігалося, клітини були темно-коричневого кольору.

Таким чином, проведені досліди показали, що хряшрва культура є чутливою до вірусів ІРТ-ІПВ і ВД-ХС.

Органні культури мають певні переваги у зв'язку г тим, що в них зберігається характерна для суглобового хряща взаємодія між клітинами і матриксом. Проте часто виникає необхідність, особливо при вивченні дії екзогенних факторів, простежити етапи диференціювання мезенхімальних клітин у хондробласти. Для досягнення

даної мети була розроблена методика культивування клітин у куль турі високого ступеня ЩІЛЬНОСТІ.

Культура високого ступеня цільності

При культивуванні ізольованих мезенхімальних клітин у виг ляді моношару на скельцях дослідники зіткнулися з труднощами пов'язаними з тим, щр хрящові клітини втрачали здатність до цито диференціювання і метаплазували у фібробластоподібні СМаппіп Т. К., 1967]. В зв'язку з цим нами розроблено метод культивували

клітин у культурі високого ступеня ЩІЛЬНОСТІ.

Культури, одержані із зачатків кінцівок курячих ембріонів

Для оцінки стану диференціювання мезенхімальних клітин ; культурі високого ступеня щільності були випробувані 3 концент

0 Ь А у

рації клітин - 2x10 , 2x10 , 2x10 . Клітинну суспензію (:

мікролітр) наносили на покрівні скельця (24x24) у вигляді 5 кра пель. Культивування проводили при температурі 37°С у вологій ка мері з 95% <^та 5% С0£. Стан клітин вивчали кожної доби - з пер шої до шостої.

При мікроскопічному дослідженні встановлено, шр через 1 і : доби різниці в організації культивованих клітин при концентраціях 2x10^ і 2x10*не було відмічено. Клітини розташовувалися по одинці, альціановий синій їх не фарбував. На 3,4 та 5 добу у випадку, коли мезенхімальна клітинна суспензія була висаджена : концентрації 2x1О2, клітини мали круглувату форму, було відмічені їх диференціювання у бік клітин фібробластичного ряду. Ме-зенхімальні клітини, висаджені в концентрації 2x10, утворювали н; 3,4,5 добу нєеєличкі (5-7), рідко розташовані вузлики, в яких ма до місце диференціювання клітин: мезенхімальні - хондробласто

подібні - хондроцити.

Через 1 і 2 доби у культурах клітин з концентрацією 2x10 було відмічено збільшення щільності клітин, але альціановий синій їх не фарбував. На 3 добу щільність клітин була значною - вони збиралися до купи (від 6 до 15) і утворювали вузлики, в яких виявлялося альціан позитивне фарбування. Це вказувало на появу в них гліковаміногліКанів. На 4 добу більшість вузликів мала солітарну форму, частина з них була об'єднана у більш великі колонії з вираженим альціан позитивним фарбування. Більша частина

клітин диферецшвалася у хондрогенному напрямку. На 5-6 добу

хрящове диференціювання було відмічене на всьому протязі культури, а в самих вузликах зростала ступінь зрілості хрящових клітин та матрикса.

Таким чином, для одержання диференціації мезенхімальних

клітин у хрящові, і формування хрящових агрегатів найбільш опти-

мальною концентрацією клітин є 2x10*в 0,1мл.

Наступний етап роботи був пов'язаний з одержанням культури високого ступеня щільності з мезенхімальними клітинами, які були виділені з зачатків кінцівок 11-денних ембріонів білих щурів.

Культури, одержані із зачатків кінцівок ембріонів білих щурів. У літературі ми не знайшли даних, які характеризували б такі культури. Метод отримання культури з мезенхімальними клітинами, зачатків кінцівок ембріонів білих шурів був розроблений нами вперше. Мезенхімальні клітини лімбів (зачатків кінцівок) шурів (за даними електронно-мікроскопічних досліджень) характеризувалися великими ядрами з пухкіш хроматином і невеликою за площею цитоплазмою. В цитоплазмі виявлялися поодинокі профілі гранулярного ендоплазматичного ретікулума, рибосоми та полі соми.

Виділені з лімбів мевенхімальні клітини висівали, як і в попередньому випадку, у концентрації 2x10 . Клітини культивували на протяві 6 діб і досліджували їх кожної доби. При мікроскопічному дослідженні встановлено, щр мевенхімальні клітини з зачатків кінцівок щурів також диференціювалися у хрящові. Не було відмічено різниці у кінетиці цього процесу порівняно з попередньою культурою.

Таким чином, культура клітин, отримана з лімбів плодів білих шурів, мала аналогічну тенденцію розвитку, як і культури клітин, отримані із зачатків кінцівок курячих ембріонів. Для одержання культур високого ступеня ЩІЛЬНОСТІ ІЗ клітин лімбів ембріонів білих шурів необхідно забирати їх на 11 добу розвитку ембріонів,

£

а виділені клітини висівати у щільності 2x10.

Культивування мезенхімальних клітин на колагеновій підлощі

та підложці із метилцелюлози

Як було показано нами у попередніх дослідженнях, суттєвий вплив на кріплення, ріст і диференціювання мезенхімальних клітин зачатків кінцівок курячих ембріонів та ембріонів щурів має субстрат демінералізованої кісткової тканини, органічний матрикс якої представлено колагеном. У зв'язку з цим на наступному етапі роботи наші був використаний нативний або денатурований колаген (желатина).

На оброблені желатиною поверхні чашок Петрі (60 мм) наносили суспензію мезенхімальних клітин, одержаних з лімбів ембріонів

* 2 А*

білих щурів у концентраціях 2x10 , 2x10 , 2x10 в 1 мл . Культивування проводили на протязі 5 діб. Встановлено, шр на третю добу клітини були об'єднані у вузлики при висіві їх у концентрації

ZzlOs. Через 5 діб відмічено збільшення числа клітин у вузликах. При використанні концентрації 2x10*та 2x10*на 3 добу відмічені лише подинокі скупчення клітин. Через 5 діб суттєвих змін по відношенню до попереднього строку спостереження не було визначено.

g

Культивування мезенхімальних клітин у концентрації 2x10 лімбів було проведено також на підложці із метилцелкшоан.

При мікроскопічному дослідженні таких культур відмічено, що більшість клітин через 5 діб мали форму хрящових, росли і розмножувалися на підложці. лЬндробласти мали гіпо- та гіперхромні ядра, які були оточені невеличкою бааофільною цитоплазмою. Між клітинами виявлявся матрикс, яскраво забарвлений альціановим синім.

Таким чином, колагенові підложи та підложи із метилцелюлози можуть бути використані при культивуванні мезенхімальних клітин, отриманих із зачатків кінцівок курячих ембріонів та ембріонів білих шурів. Такий метод культивування має перевагу перед культивуванням клітин на покрівних скельцях тому, що дозволяє одержати ріст клітин на більшій площі і, як наслідок, одержати більшу клітинну масу.

Відомі нам методи культивування (Klaus Е, 1991; Williams J., 1993, Shapiro F,1993) та розроблені наїли методи грунтувалися на одержанні культур, які при культивуванні покривають поверхню використаного субстрата. Наступним етапом роботи стала розробка методів культивування клітин, які б рослії в "об'ємному просторі". Для цієї мети був використаний агар.

Культивування мезенхімальних клітин у агаровому гелі

Суспензію клітин (кінцева концентрація 2х10£кл/мл) у середо-

вщі 199 перемішували з 0,6% агаром у співвідношенні 1:1 і наносили на підготовлену агарову підложку в 60 мм чашках Петрі. їїіслї застигання агару з клітинами на поверхню культури наносили 1,5-2 мл живильного середовища - 199, в якому знаходилося 202 ембріональної сироватки телят. Культивування проводили на протязі 14 діб.

При культивуванні мезенхімальних клітин в агарі їх скупчення було відмічено через 2 доби. З часом кількість клітинних колонії і клітин у колоніях збільшувалася. В третьої доби встановлено наявність хряшрвого диференціювання КЛІТИН. Їх КІЛЬКІСТЬ У КОЛОНІЯ} через 14 діб становила від 70 до 100. На протязі 2 тижнів культивування клітини зберігали життєздатність. Вони мали форму і структурну організацію, характерну для хрящових клітин.

Враховуючи, щр демінералізований кістковий матрикс стимулює проліферацію мезенхімальних клітин у хряшрві, у наступних експериментах, при культивуванні клітин у агаровому гелі, була використана підложка із демінералізованої кісткової тканини.

Культура клітин £ агарозному гелі, розташованих у_ підложка; із демінералізованої кістки. Суспензію хондроцитів змішували з рівним об'ємом 2% агарози, кінцева концентрація клітин 2x10^в З мл агарози. Потім клітини з агаром по 0,5 мл наносили на підложю із демінералізованої кістки і після застигання шару агарози е клітинами підложки вкладали у чашки Петрі з живильним середовище* 199 і 20% ембріональної телячої сироватки. Культивування проводили протягом 14 діб. При мікроскопічному дослідженні культур з період з 3 до 5 діб спостерігалося виражене диференціюванні клітин у хряшрві. Через 7 діб виявлялися локальні вогнища гіпер-лазії хрящових клітин, що свідчить про їх клонування. Окремі хря-

щові клітини висилялися з агару і заповнювали кісткові лакуни, де продовжували розмножуватись.

Дані проведених дослідів свідчать про те, що хрящрві клітини диференціювалися в умовах агарового геля в напрямку: ме-

зенхімальні - пре- і хондробласти - хондроцити. Необхідно відмітити, що при культивуванні клітин в агарові на підложках із демінералізованої кісткової тканини їх початкова концентрація може бути низькою (2x10*).

Використання клітинної бластеми для регенерації поверхневих

дефектів суглобового хряса

Показано, що через 3 місяці після операції у тварин контрольної групи в зоні дефекту виявлялися поля колагено-волокнистої тканини та клітинний детрит. Суглобовий хрящ біля дефекту - з узурами, з великими ділянками без хондроцитів, з вогнищами фібріляції матриксу. Через 6 місяців встановлено збільшення деструктивно- дистрофічних змін у суглобовому хрящі біля дефекту.

Зона дефекту у тварин дослідної групи через З місяці була виповнена гіаліновою хрящовою тканиною без вираженої характерної для суглобового хрящ позиційної специфічності. Матрикс хрящової тканин дефекту яскраво фарбувався альціановим синім. Через 6 місяців у дефекті виявлялися хондроцити та хондробласти різного ступеня зрілості, розташовані паралельно до поверхні дефекту. Поблизу зони дефекту не відмічено дистрофічних порушень структурної організації суглобового хрядр.

Таким чином, мезенхімальні клітини в агарогому гелі трансплантовані в поверхневий дефект суглобового хряшд сприяють репаративній регенерації зони дефекта гіаліновою хряшрвою тканиною з хондроцитами і хондробластами різного ступеню зрілості.

В літературі є дані по збереженню клітин при глибокому заморожуванні (-19^0) (Глушко Т. 0. ,1985; ЩрагоІ. І. 1989;). Наступни етап роботи був пов'язаний з дослідженням кріопротекторів, як могли б бути використані при кріоконсервуванні мезенхімальни клітин.

Вплив кріопротекторів на мезенхімалькі клітини при їх

заморожуванні та разморояуванні

У зв'язку з тим, щр дослідники зустрічаються з проблемо відстроченого культивування клітин, нами була проведена оцінк умов зберігання мезенхімальних клітин при контролі їх життєздат ності. Було досліджено 60 зразків мезенхімальних клітин з кріоп ротектроми ДМСО, оксіетилен-морфолін, гліцерин у концентрація 2,5; 5; 10 та 15% на протязі однієї доби кріоконсервування. Ді

кріопротекторів оцінювали за кількістю живих клітин, підраховани у камері Горяєва. Контролем служили клітини, які були витримані кріопротекторами у згаданих віщз концентраціях на протязі 15 х при 20-22°С.

Встановлено, щр після 15- хвилинної експозиції у середовищ кріопротекторів кількість живих клітин зменшувалася із вбільшен ням концентрації кріопротекторів. Найбільш вираженим зниженн, клітин було при використанні 15% окс і етилен-морфолі ну, а наймен шим - при використанні 2,5% ДМСО. .

При зберіганні клітин з кріопротекторами у замороженом; стані встановлено значне зниження (в 2-4 рази) числа живих кліти при використанні досліджуваних кріопротекторів у концентрація: 2,5; 5,0 та 15%. Найменша кількість живих клітин визначена пр;

зберіганні у 2,5% гліцерині, а найбільша (при аналізі концентрацій - 2,5; 5,0 та 15%) - при використанні 5% ДМСО.

Найбільш виражені кріопротекторні властивості проявлялися у досліджуваних кріопротекторів при концентрації 10%.

Розморожені мезенхімальні клітини, які зберігалися під захистом згаданих вище кріопротекторів у 10% концентрації, були висіяні на живильне середовище. Вони прикріплювались до скла і давали ріст у вигляді вузликів. Але при порівнянні швидкості утворення вузликів з контрольними культурами виявлена затримка на 2-3 доби.

Таким чином, мезенхімальні клітини, одержані з зачатків кінцівок курячих ембріонів та ембріонів щурів - кріолабільні, їх можна зберігати в умовах низьких темеператур з кріопротекорами.

ВИСНОВКИ

1. Розроблена технологія культивування фрагментів суглобового хряща одномісячних турів на підложах із демінералізованої кісткової тканини, використання якої забезпечує не тільки збереження життєздатності хрящових клітин на протязі 15 діб, але і їх виражену проліферацію, що суттєво відрізняє даний тіш культивування від культивування на плексигласових платформах. Хряшрва культура чутлива до вірусів: інфекційного ринотрахеїту-пустульозного вудьвовагиніту (ІРТ-ІПВ), штаму "Молдавський" та вірусної діареї - хвороби слизових оболонок (ВД-ХС), польового штаму 25.

2. Розроблена технологія отримання мезенхімальних клітин (зачатки кінцівок курячих ембріонів 4 доби розвитку та плодів білих щурів 11 доби розвитку) з метою одержання з них культур високого ступеня щільності. Оптимальною концентрацією клітин для одержання культур високого ступеню щільності є 2x1 СҐв 0,1 т в присутності 5% С02.

3. При культивуванні на підложах із колагена, метілцелюлови та агарового гелю клітин, одержаних із зачатків кінцівок куриних ембріонів та ембріонів щурів, їх проліферація та диференціровка

Є

встановлена при використанні меншої концентрації клітин 2x10 в 1

£

мл ніж при висіванні на скельця (2x10 в 0,1 мл). Це дозволяє одержати значно більший об'єм клітинної маси, ніж на скельцях.

4. Мезенхімальні клітини в агаровому гелі ("об'ємна культура") трансплантовані в поверхневий дефект суглобового хряща сприяють реларативній регенерації зони дефекта гіаліновою хрящовою тканиною з хондроцитами і хондробластами різного ступеню зрілості.

5. При вивченні дії кріопротекторів (ДМСО, гліцерин, окси-етілен-морфолін), які використовувалися для збереження мезенхімальних клітин при низьких температурах, встановлено, шр вивчені кріопротектори проявляли різні кріозахисні властивості. Максимальне число життєздатних клітин спостерігалося при застосуванні кріопротекторів у 10% концентрації. При цьому вірогідно значущих відмінностей у кількості життєздатних клітин не було зафіксовано.

6. При культивуванні мезенхімальних клітин після кріоконсер-вування (-196° С) на протязі однієї доби відмічено уповільнення кінетики формування хрящових вузликів при порівнянні з контролем. Якщо у контролі перші хрящові вузлики утворювалися на 2-3 добу культивування, то після кріоконсервування клітин - на 5-6 добу. Ці зміни мали зворотний характер і через три доби, коли у контролі відмічали зниження проліферативної активності клітин, у дослідних культурах щільність вогнищ хондрогенезу (хрящових вузликів) зростала і досягала значення контрольних культур. Це

свідчило про те, що кріоконсервування не призводить до незворот-них змін стану мезенхімальних клітин.

Практичні пропозиції

Основні результати впроваджені у практику в вигляді:

1. Способу кріоконсервування мезенхімальних хрящових клітин (авторське свідоцтво СРСР N 3575604, від 30.04.1984).

2. Методу культивування хрящових фрагментів у підложках із демінералізованої кістки, який дає можливість отримати ріст клітин у хрящових експлантатах (авторське свідоцтво N 4652813/30-13, ВІД 07.12.1990).

3. Методу культивування суглобової тканини на шдложці із демінералізованної кістки (Рац. пропозиція N 90122.01.1985, ХНДІОТ).

4. Системи для культивування суглобової тканини з дозованою подачею 00 (Рац. пропозиція N 902 22.01.1985, ХЕДІОТ).

5. Методичних рекомендацій по кріоконсервування) та цитологічному контролю якості клітинних культур і фрагментів тканини" (Харків, 1981. -27 с. -УНДІЕВ).

6. Результати дослдйень використовуються в учбовому процесі на факультетах ветеринарної медицини Харківського зооветеринарного інституту.

7. Можливість культивування хряшрвих клітин та тканин дозволяє пропонувати ці методи для широкого практичного застосування в хірургічній практиці з метою регенерації суглобових покриттів, а також у вірусологічних дослідах, що дасть можливість випробовувати тропність вірусів, мікоплазмів, бактерій до дії на хрящові клітини.

- 22 -

СЛИСОК POBIT, ОПУШИ КОВАНИХ ПО TEMI ДИСЕРТАЦИ

1. Методические рекомендации по криоконсервированию и цитологическому контролю качества культур клеток и фрагментов ткана Г. А. Красников, Е А. Наумова, В. С. Белоконь, П. Т. Берус, Б. Т. Стег-ний, Г. Б. Герус,О. П. Маркова. -Харьков, 1981. - 27 с. -(УНИИЗВ).

2. Хранение клеточных культур/ ЕС. Белоконь, Б. Т. Стегний,

П. А. Конозенко ДТ. Берус, Г. Б. Герус, Г. А. Красников// Ветеринария: Респ. межвед. тематич. науч. сб. - К., 1984. - Вып. 59. -

С. 76-79.

3. А. С. 1089090 СССР,МКИ -3 С 07 Д 295/08, А 01 N 1/02.

Ы-оксиэтил-гепта(оксиэтилен)-морфолин в качестве криопротектора/ ЛА.Ханина, Т. П. Линник, М. И. Щраго, В. И. Белоконь, П. Т. Берус,

Г. Б. Герус (СССР).- N 3575604; Заявлено 28.02.83; Опубл. 30. 04. 84,

Бюл. N 16. - 4 с.

4. Герус Г. Б., Панков Е. Я. Влияние гипотермии на метаболическую активность культуры клеток хондроцитов// Tes. докл. / Все-союз. конф. - Харьков, 1985. - С, 85.

5. Герус Г. Б. Культура хрящевой ткани высокой плотности -модель гистогенеза// Гистогенез и регенерация: Тез. докл. / Есесо-юз. науч. конф. , г. Ленинград, 13 марта 1985 г. - Л , 1985. - С. 28.

6. Герус Г. Б., Дедух Е В. Методы культивирования хркщевы:

клеток// Культивирование клеток животных и человека: Тез. докл. ¡

2-е Всесоюз. совещание, г. Пущино, 26-28 нояб. 1985 г.- Пущино, 1985.- С. 22-23.

7. Герус Г. Б., Дедух Е В. Методы культивирования хрящево!

ткани на подложке из деминерализованной кости: Рац. предложение.

N 901. 22.01.1985. XTODÍ0T. - Харьков, 1985,- 3 с.

8. Герус Г. Б., Дедух Е В.. Система для культивирования хрящэ-

вой ткани с дозированной подачей С02: Рац. предложение. N 902.

22.01.1985 г. ХШИОТ. - Харьков, 1985.- 3 с.

9. Герус Г. Б. Технология получения культуры высокой степени плотности из зачатков задних конечностей плодов крыс// Тез. докл. / 10-й Всесоюз. съезд анатомов, гистологов и эмбриологов,

г. Винница, 17-19 сент. 198В г. - Полтава, 1986.- С. 25.

10. Дедух Н. В., Малышкина С. В., Герус Г. Б. Гистогенез хрящевой ткани в условиях действия биологически активных веществ// Тев. докл. / 10-й Всесоюз. съезд анатомов, гистологов и эмбриологов, г. Винница, 17-19 сент. 1988 г. - Полтава, 1986. - С. 101.

11. Герус Г. Б. Влияние низких температур на культуру клеток хондроцитов// Метод, рекомендации по актуал. вопросам ветеринарии. - Харьков, 1990. - С. 28.

12. А. С. 1611931 СССР, МКИ 5 С 12 N5/00. Способ культивирования хрящевых фрагментов/ Г. Б. Герус, ЕВ. Дедух (СССР). -N4652813/30-13; Заявлено 19.01.89; Опубл. 07.12.90, Еюл N 45. -2с.

Герус Г. Б. Разработка методов получения, культивирования и криоконсервирования хрящевых клеток и тканей.

Диссертация в виде рукописи на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16. 00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН, Харьков, 1997 г.

Защищается 10 научных работ и 2 авторских свидетельства по разработке методов получения и культивирования мезенхимальных

клеток из зачатков конечностей куриных и крысиных эмбрионов. Оп ределено, что мезенхимальные клетки в агаровом геле могут быт: использованы при регенерации хряшэвой ткани. Фрагменты хрящэво: ткани могут быть культивированы на плексигласовых платформах и н. подложках из костной ткани. Обнаружена чувствительность эмбрно нальной хрящевой ткани к вирусам. Установлено, что мезенхимальни клетки криолабильны.

Gerus G. В. The development of the methods of receiving cultivation and cryoconservation of cartilage cells and tissues.

The thesis in the form of the manuscript for candidate'; degree in veterinary science on speciality 16.00.03 - veterinar microbiology, virology, epizootology, micology and immunology.

Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicin of UAAS, Kharkov, 1997.

10 scientific publications and 2 author's certificates o: the development of the methods of receiving and cultivation o: the mesenchymal cells from rudimentary extremities of chicken an rat's embryos are defended. It has been ascertained that th mesenchymal cells in the agar gel can be used for th regeneration of cartilage tissue. Cartilage tissue fragments ca be cultivated using plexiglass plate and lining from bone tissue, The embryonal cartilage tissue was found to be sensitive ti viruses. It has been established that mesenchymal cells an cryolabile.

Ключові слова: методи культивування, культура високого сту

пеня щільності, органна культура хряшрвої тканини, регенерації хрящ, віруси, кріоконсервація.