Автореферат и диссертация по медицине (14.01.24) на тему:Разработка и экспериментальное исследование клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани

На правах рукописи

Пономарева Анна Сергеевна

РАЗРАБОТКА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КЛЕТОЧНО-ИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ

14.01.24 -трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2013

005543192

5 ДЕК 2013

005543192

Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова» Минздрава России

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Севастьянов Виктор Иванович

Официальные оппоненты:

Сергеева Наталья Сергеевна - доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией прогноза эффективности консервативной терапии опухолей ФГБУ «Московский НИИ онкологии им. П.А. Герцена» Минздрава России

Баграташвили Виктор Николаевич — доктор физико-математических наук, профессор, заведующий отделом лазерной атомно-молекулярной технологии ФГБУН «Институт проблем лазерных и информационных технологий» РАН

ФГБУ «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им.В.Н.Ореховича» РАМН

Защита диссертации состоится «24» декабря 2013 года в 15 часов на заседании диссертационного совета Д.208.055.01 при ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России по адресу: 123182, г. Москва, ул. Щукинская, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России.

Автореферат разослан «23» ноября 2013 г.

Ведущая организация:

Шаршаткин Алексей Вячеславович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Современные потребности в трансплантации существенно ограничиваются нехваткой донорских органов, и прогнозы указывают на то, что потребность в донорских органах и тканях будет только увеличиваться. Следовательно, актуальной остается задача разработки альтернативных способов компенсации или замены поврежденных или утраченных жизненно важных функций органов и тканей. Анализ последних работ в области трансплантологии и искусственных органов дает основание говорить о том, что ученые пока не пришли к формированию искусственной биосовместимой поверхности, аналогичной по своим свойствам естественным тканям организма. Исследователи также далеки от создания искусственных органов на основе только синтетических материалов с заданными и контролируемыми свойствами. В связи с этим в последние годы основной акцент сделан на использование технологий тканевой инженерии - междисциплинарной области исследований, которая включает разработку биоискусственных тканей и органов - материалов и систем, наделенных структурой и функцией биологических тканей (Atala A. et. al., 2008).

Одним из подходов к восстановлению трехмерной структуры ткани может быть формирование ее тканеинженерной конструкции (ТИК) на основе клеточно-инженерной конструкции (КИК), включающей в себя следующие компоненты:

- клетки, выделенные из эндогенных источников у пациента (аутологичные клетки) или от доноров (аллогенные клетки) и способные формировать функционирующий внеклеточный матрикс (ВКМ);

- подходящий биосовместимый биодеградируемый носитель (матрикс, каркас) для трансплантации клеток и временного биоискусственного матрикса;

- биоактивные молекулы (цитокины, факторы роста), которые оказывают биостимулирующее действие на клетки поврежденной ткани.

Лечение дефектов суставного хряща представляет собой сложную ортопедическую проблему, т.к. регенерация гиалинового хряща крайне незначительна. Отсутствие кровоснабжения и низкий уровень метаболизма из-за малого количества клеток в единице объема ткани приводят к тому, что полноценная репаративная регенерация хряща возможна лишь при небольших по площади повреждениях (Melero-Martin J. et. al., 2007). При обширных повреждениях хрящевой ткани (ХТ), сопровождающихся разрушением надхрящницы, регенерацию хрящевой ткани г^Ч/

•V у

опережает развитие грануляционной ткани в месте дефекта (Мазуров В.И., 2008). О4

Применение таких техник как стимуляция костного мозга, субхондральное просверливание кости, микропереломы и попытка закрытия дефекта надкостничными или перехондриальными трансплантатами не всегда приводит к приемлемым результатам (Деев Р.В., 2006). Несколько улучшило ситуацию применение аутохондротрансплантации. Однако этот метод так же не лишен недостатков, основные из которых травматичность биопсии здорового участка хряща, сложность культивирования хондроцитов и неполнота восстановления хрящевой ткани. В связи с этим в качестве альтернативы данному методу были рассмотрены варианты замены хондроцитов на мезенхимальные стромальные клетки (МСК), которые присутствуют во всех органах и тканях человеческого организма и обладают мультилинейным потенциалом дифференцировки в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях. Одним из перспективных источников МСК, благодаря простоте технологии выделения, достаточному выходу клеток и минимальной травматичное™ для пациента, является жировая ткань (Zuk P.A. et. al., 2001).

Применение подходов клеточной и тканевой инженерии, заключающихся в трансплантации МСК на матриксах-носителях, представляет собой перспективный способ лечения дефектов хряща с использованием функциональных тканевых заменителей. Основная цель применения матриксов - это доставка и удержание клеток в месте повреждения, а также обеспечение клеткам необходимого трехмерного окружения для формирования хрящевой ткани (Севастьянов В.И. и др., 2011).

Цель работы

Разработать и провести исследования в условиях in vitro и in vivo клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека.

Основные задачи работы

1. Отработать методики выделения и культивирования МСК из жировой ткани человека (ЖТч).

2. Исследовать параметры роста, провести анализ экспрессии поверхностных антигенов и кариотипический анализ полученных из ЖТч популяций МСК.

3. Подтвердить способность полученных из ЖТч культур МСК дифференцироваться в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях.

4. Разработать технологию культивирования МСК ЖТч на биополимерном гетерогенном гидрогеле в условиях in vitro.

5. Разработать и исследовать в условиях in vitro клеточно-инженерные конструкции на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и МСК ЖТч с различной степенью хондрогенной дифференцировки.

6. Исследовать биологическую безопасность выбранной клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани в экспериментальной модели подкожной имплантации в условиях in vivo.

7. Изучить морфологические изменения клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани в условиях in vitro и in vivo в экспериментальной модели подкожной имплантации.

Настоящая работа проводилась в соответствии с планом научных исследований ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» на 2009-2011 гг. по направлению «Разработка и внедрение клеточных трансплантационных технологий для лечения широкого круга патологий» и государственному заданию Минздрава на 2012-2014 гг. по теме НИР «Разработка и экспериментальное исследование тканеинженерной конструкции хряща» (регистр, номер 01201251421).

Научная новизна работы

1. Впервые показана способность биополимерного гетерогенного гидрогеля служить субстратом для культивирования, пролиферации и дифференцировки в хондрогенном направлении МСК ЖТч.

2. Исследовано влияние степени хондрогенной дифференцировки МСК ЖТч на возможность формирования в условиях in vitro ТИК хрящевой ткани из клеточно-инженерной конструкции, состоящей из биополимерного гетерогенного гидрогеля и МСК ЖТч.

3. Получены доказательства биологической безопасности разработанной КИК XT в условиях in vivo.

4. Впервые показана возможность формирования тканеинженерной конструкции XT при подкожной имплантации клеточно-инженероной конструкции хрящевой ткани на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и не дифференцированных МСК ЖТч.

Практическая значимость

Основным результатом работы является разработка лабораторных образцов КИК хрящевой ткани и экспериментальных основ нового высокотехнологического метода коррекции и лечения заболеваний периферических и/или центральных (позвоночных) суставов, включая:

- протокол культивирования МСК ЖТч на биополимерном гетерогенном гидрогеле;

- протокол получения КИК XT, состоящей из биополимерного гетерогенного гидрогеля, МСК ЖТч и индукционной хондрогенной среды;

- протоколы экспериментальных исследований КИК хрящевой ткани. Полученные результаты позволяют перейти к доклиническим исследованиям

функциональной эффективности разработанной КИК XT на экспериментальных моделях заболеваний периферических и/или центральных (позвоночных) суставов.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 49-й конференции МФТИ (г. Долгопрудный, 24-25 ноября, 2006 г.), Moscow-Bavarian Joint Advanced Student School (г. Зеленоград, 25 февраля - 5 марта, 2008 г.), Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (г. Москва, 21-26 сентября, 2009 г.), X и XII Китайско-Российском Симпозиуме «Новые материалы и технологии» (Китай, г. Дзясин, 20-24 октября, 2009 г., Китай, г. Куньмин, 18-21 ноября, 2013 г.), V Всероссийском съезде трансплантологов (г. Москва, 8-10 октября, 2010 г.), Ill, IV и V Всероссийской научно-практической конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (г. Москва, 25-28 октября, 2010 г., 24-27 октября, 2011 г., 17-22 ноября 2013 г.), Школе-конференции для молодых ученых «Клеточные технологии для регенеративной медицины» (г. Санкт-Петербург, 17-21 октября 2011 г.).

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 3 статьи в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья - в зарубежном журнале, 6 статей в сборниках научных трудов и одна глава в книге Биосовместимые материалы (учебное пособие) под ред. В.И. Севастьянова и М.П. Кирпичникова, МИА, М., 2011 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, 3 глав основного содержания, включая обзор литературы, методическую главу, результаты исследования и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 110 наименований, из них 25 российских и 85 иностранных. Диссертация, иллюстрирована 29 рисунками и 14 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в лаборатории тканевой инженерии и систем доставки ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И.Шумакова» Минздрава России.

Выделение и культивирование МСК из ЖТч

На основе методики, описанной Zuk P.A. et. al., 2001, была отработана и оптимизирована технология выделения и культивирования МСК из жировой ткани (подкожно-жировой клетчатки) человека. Образцы подкожно-жировой клетчатки получены от 30 здоровых доноров ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России (получено информированное согласие). ЖТч отмывали от крови фосфатным буфером с антибиотиками и механически измельчали до получения гомогенной массы, которую затем обрабатывали раствором коллагеназы Type IA (Sigma, # С98891, США) из расчета 600 ед/г ткани. Для выделения и культивирования МСК использовали ростовую среду (PC) для мезенхимальных стволовых клеток человека MesenPRO RS™ без глютамина, (Gibco® by Life Technologies™, США) с ростовыми добавками MesenPRO RS™ Growth Supplement и антибиотиками, сбалансированные солевые растворы (фосфатно-солевой буферный раствор, сбалансированный солевой раствор Хенкса). Культивирование проводили в стандартных условиях при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей (5 ± 1) % СОз. Анализ клеток проводили с помощью фазово-контрастной и световой микроскопии, при необходимости докрашивая клетки йодистым пропидием, кристаллическим фиолетовым или по Гимзе.

Исследование ростовых, цитогенетических и иммунофеиотипических характеристик популяций МСК, полученных из ЖТч

Для построения кривой роста использовали 10%-ный раствор витального реагента alamarBlue® (Invitrogen™, США). Процент восстановленного alamarBlue®

характеризует метаболическую активность клеток. После инкубации с красителем изменение поглощения среды регистрировали с помощью комбинированного ридера для микропланшет Synergy™2, модель SLFPA (Bio Тес Instruments Inc., США) на длинах волн 570 нм и 600 нм. В качестве контроля использовали ростовую среду без клеток с добавлением alamarBlue®. Для пересчета процента восстановленного красителя в количество клеток в лунке строили калибровочную кривую.

Для исследования колониеобразующей способности МСК ЖТч культивировали в ростовой среде в 6-ти - луночных планшетах при плотности посева 400-12,5 кл/см", полученной методом последовательных разведений.

Подготовку проб для цитогенетического анализа проводили по стандартной методике с использованием раствора колхицина. Хромосомные препараты визуализировали окрашиванием по Гимзе.

Для иммуноцитологической оценки суспензию МСК окрашивали мышиными моноклональными антителами против 13-ти поверхностных антигенов, меченных флюоресцеинизотиоционатом (ФИТС) или фикоэритрином (ФЭ). После этого клетки анализировали на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson, США) с помощью программы FACScan Reseach. Фенотип МСК ЖТч исследовали на протяжении 5 пассажей.

Исследование дифференцировочного потенциала МСК ЖТч

Способность МСК к дифференцировке в клетки мезодермального ряда и специфическое гистохимическое окрашивание проводили на 2-м или 3-м пассажах. Для индукции дифференцировки использовали коммерческие наборы StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit, StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit и StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit (Gibco® by Life Technologies™, США). Хондрогенную дифференцировку в услових in vitro осуществляли двумя способами: в монослое и в соответствии с инструкцией производителя в 3-D культуре методом «микросфер». Наличие дифференцировки подтверждали специфическим окрашиванием: масляным красным О в случае адиподифференцировки, ализариновым красным в случае остеодифференцировки, альциановым синим, по методу Маллори и антителами к коллагену II типа в случае хондродифференцировки.

Иммобилизация и культивирование МСК ЖТч в биополимерном гетерогенном гидрогеле

В качестве биодеградируемого матрикса использовали биополимерный гетерогенный гидрогель С0еро®ГЕЛЬ (производитель ЗАО «БИОМИР сервис», г. Краснознаменск, М.О., № ФСР 2012/13033 от 01.02.2012 г.). БГГ Сферо®ТЕПЪ изготовлен на основе компонентов внеклеточного матрикса тканей сельскохозяйственных животных, обладает высокими биосовместимыми и биостимулирующими свойствами и предназначен для замещения дефектов мягких тканей, включая применение в заместительной и регенеративной медицине (Перова

H.В. и др., 2003; Севастьянов В.И. и др., 2009, 2011, Шагидулин М.Ю. и др., 2012, 2013; Готье C.B. и др., 2013).

Было проведено 2 серии экспериментов по иммобилизации и культивированию МСК ЖТч на поверхности биополимерного гетерогенного гидрогеля в условиях in vitro:

I. Гистологическая оценка препаратов, полученных после посева различных количеств МСК ЖТч, 3 пассаж (1хЮб кл/мл, 2х106 кл/мл, 4><10б кл/мл гидрогеля) на БГТ через 3 и 7 суток культивирования.

2. Оценка пролиферативной активности МСК ЖТч, 3 пассаж на БГГ с использованием витального реагента prestoBlue® (Invitrogen, США), обновленной версией красителя alamarBlue® с аналогичным принципом действия, через 24, 48 и 72 ч после посева 2x106 кл/мл гидрогеля.

МСК ЖТч послойно смешивали с предварительно прогретым до 37°С биополимерным гетерогенным гидрогелем и инкубировали в PC в стандартных условиях. Замену среды проводили каждые 3 суток.

Определение оптимального состава КИК хрящевой ткани

Исследовали 3 различных варианта получения КИК хрящевой ткани. Вариант 1 : Преддифференцированные в хондрогенном направлении в течении 7 суток в монослое МСК ЖТч послойно смешивали с предварительно прогретым до 37°С биополимерным гетерогенным гидрогелем в концентрации 2х106 кл/мл матрикса. Вариант 2: Преддиференцированные в хондрогенном направлении методом «микросфер» МСК ЖТч смешивали с прогретым до 37°С биополимерным гетерогенным гидрогелем (20 микросфер/мл матрикса).

Вариант 3: Не дифференцированные МСК ЖТч послойно смешивали с биополимерным

гетерогенным гидрогелем в концентрации 2x106 кл/мл матрикса.

9

КИК ХТ культивировали в индукционной хондрогенной среде 14 и 28 суток при 37°С, во влажной атмосфере, содержащей (5±1)% ССЬ. Замену среды осуществляли каждые 3 суток. 3-й вариант клеточно-инженерной конструкции ХТ культивировали в тех же условиях до 42 суток.

Подкожная имплантация КИК хрящевой ткани

Клеточно-инженерные конструкции ХТ на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и не дифференцированных МСК ЖТч имплантировали подкожно 14-ти мышам-самцам линии DBA. Все животные были разделены на две группы: опытную (10 мышей) и контрольную (4 мыши). Контрольной группе имплантировали только БГГ без клеток. За сутки до имплантации всех мышей депрессировали иммуностатическим препаратом «Сандиммун» (Циклоспорин). В дальнейшем иммуносупрессию не проводили. Через 14 и 28 суток после имплантации животных выводили из эксперимента, а место имплантации вместе с имплантатом фиксировали в 10% растворе формалина и направляли на гистологическое исследование. Оценку состояния животных проводили в течение эксперимента по интегральным показателям (выживаемость, поведение и внешний вид, функциональное состояние, динамика массы тела, клинический и биохимический анализ крови).

Исследование КИК ХТ, полученных в условиях in vitro и in vivo, проводили с помощью гистологических и иммуногистохимических методов. Образцы фиксировали в 10% растворе формалина в течение 4 ч, промывали в проточной воде и обезвоживали в этаноле с восходящими концентрациями, обезжиривали в смеси абсолютного этанола с хлороформом или ксилолом и заливали в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм получали с помощью микротома Leica (модель RM 3255, Германия). Срезы депарафинировали и окрашивали гематоксилином и эозином, альциановым синим, по методу Маллори и антителами к коллагену II типа согласно стандартным методикам.

В выполнении отдельных этапов работы принимали участие сотрудники молекулярно-генетической лабораторией ГУЗ «Московского областного научно-исследовательского института акушерства и гинекологии», лаборатории трансплантационной иммунологии и лаборатории клеточной трансплантации ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И.Шумакова» Минздрава России, AHO «Института медико-биологических исследований и технологий».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Характеристики популяций МСК ЖТч

На основе методики, описанной Zuk P.A. et. al., 2001, была отработана технология выделения и культивирования МСК из ЖТч. Методика заключалась в сочетании механической и ферментативной дезагрегации образцов подкожно-жировой клетчатки (операционный материал) и была оптимизирована по следующим параметрам: время инкубации ткани с коллагеназой Type IA и количество циклов обработки. При использовании оптимизированной методики удалось повысить выход клеток с 70 до 300 тыс. клеток/гр. ткани при 95% жизнеспособности. Проведенные эксперименты с использованием в качестве источника МСК подкожно-жировой клетчатки 30 доноров показали воспроизводимость технологии.

На первых пассажах культуры МСК являются морфологически гомогенными по клеточному составу и представлены клетками веретеновидной или полигональной формы с небольшим количеством отростков (Рис. 1 А).

Пролиферативный потенциал МСК сохранялся как минимум до 9 пассажа. С увеличением числа пассажей рост культур существенно замедлялся. Начиная с 10 пассажа, наблюдали старение культур, появление вакуолизированных, полиплоидных и двухъядерных клеток, клеток на различных стадиях деструкции (Рис. 1 Б).

За один пассаж количество клеток в культуре увеличивалось в 2,5-3,0 раза. Продолжительность каждого пассажа составляла от 9 до 15 суток в зависимости от пролиферативной способности клеток.

Рисунок 1. Культура МСК ЖТч: А - 2 пассаж; Б - 10 пассаж. Окрашивание гематоксилином. Ув. X 200.

На 1-м, 2-м и 3-м пассажах строили кривые роста (Рис. 2). Из кривых роста видно, что пролиферативная способность культуры значительно снижается во втором пассаже и продолжает снижаться при дальнейшем культивировании. Время

цитогенерации составило 47 ч, 89 ч и 100 ч в первом, втором и третьем пассаже соответственно, среднее время удвоения популяции - 64 ч.

Цитогенетический анализ культуры на 2-м, 4-м и 7-м пассажах показал отсутствие анеуплоидии и структурных перестроек хромосом, кариотип клеток не меняется во время долгосрочного культивирования.

Способность культуры клеток образовывать колонии является одним из косвенных признаков "стволовости" выделенных клеток. Колонией считали клеточное образование с радиальным ростом, содержащее более 50 клеток. Эксперименты на клоногенность проводили 8 раз и только однажды были обнаружены колонии через 2 недели культивирования при различной плотности посева клеток во втором пассаже.

Иммуноцитофлюориметрический анализ показал, что МСК ЖТч имеют следующий фенотип: СОЮ+, СЭ13+, СИ29+, С034", С044+, СЭ45", С059+, СЭ7Г, С073+, СЭ90+, СОШ5+, СЭ133", НЬА-АВС+, что соответствует фенотипу мезенхимальных сгромальных клеток и сохраняют его в течение как минимум 5 пассажей (Таблица 1).

40000

35000

30000

| I

1*25000 о

я20000

о 6

«15000

Е

О

10000 5000 О

0123456789 10 11

Время, сутки

Рисунок 2. Кривые роста МСК ЖТч на 1-м, 2-м, и 3-м пассажах.

Таблица 1

Фенотип МСК, выделенных из ЖТч, на протяжении 1-5 пассажей*

1 (п=3) 2(п=4) 3 (п=3) 4(п=3) 5 (п=3)

СОЮ 58.9+28.1 65.7+20.8 55.0+21.5 67.5+12.3 76.2+11.5

СОІЗ 69.5+23.0 75.1 + 13.2 79.0+14.5 87.3+5.7 88.1+11.9

С029 83.9+12.9 78.8+19.7 81.4+18.7 92.6+6.4 94.2+2.2

СЭ34 5.7+4.3 3.8+2.8 1.2+0.5 2.8+2.4 2.3+1.6

СЭ44 87.8+9.3 88.8+13.1 81.0+17.8 95.4+0.8 91.9+3.5

СЭ45 2.4+1.7 1.3+1.0 0.8+0.8 3.1+0.8 1.6+0.6

СЭ59 94.4+7.7 91.6+13.6 82.2+16.9 97.4+0.3 93.9+3.7

СЭ71 2.8+1.1 9.9+13.4 3.3+2.4 2.7+0.6 6.4+4.8

СЭ73 н.о. н.о. н.о. 79.9" 77.0"

С090 85.6+13.3 78.4+18.8 81.8+15.6 90.3+5.2 85.9+1.7

СЭ105 88.2+11.4 88.5+16.6 82.5+14.9 97.6+2.2 96.1+4.1

СО 133 3.9+2.2 0.6" 1.2+0.4 2.2+0.1 1.5"

НЬА-АВС 81.2+7.8 87.2+19.2 72.7+18.3 91.7+7.3 83.3+3.7

± стандартное отклонение,

Данные представлены в виде среднего значения полученного для числа доноров п, указанных в скобках.

Данные представлены по одной культуре, н.о. - экспрессию антигена не определяли. Дифференцировочный потенциал МСК ЖТч

Способность МСК ЖТч к адипогенной дифференцировке изучали, индуцируя ее адипогенными факторами на 2-м и 3-м пассажах. Через 3 суток после добавления к культуре индукционной адипогенной среды в некоторых клетках появились первые жировые включения. При дальнейшем культивировании в дифференцировочной среде количество таких клеток нарастало, и к 14 суткам почти все клетки содержали жировые капли, становились крупными, распластанными.

Остеогенную дифференцировку МСК ЖТч проводили на 2-м пассаже в течение 28 суток. На начальных сроках инкубации клеток с дифференцировочной средой явных морфологических признаков дифференцировки в остеогенном направлении обнаружено не было. В дальнейшем, МСК группировались в плотные узелки. Наличие окрашенных ализариновым красным участков указывает на кальцификацию матрикса и подтверждает остеогенную дифференцировку клеток.

На рисунке 3 представлена культура МСК ЖТч через 7 суток хондрогенной дифференцировки в монослое. Было обнаружено, что при таких условиях культивирования, часть клеток претерпевает дегенеративные изменения и погибает (Рис. 3 А), часть остается жизнеспособными. Наблюдаются участки монослоя, которые в индукционной хондрогенной среде преобразуются в трехмерные структуры (Рис. 3 Б). В контроле МСК ЖТч представлены жизнеспособными фибробластоподобными клетками, трехмерных структур не образуется.

Рисунок 3. 7 суток хондрогенной дифференцировки МСК ЖТч в монослое, 2 пассаж. Окрашивание гематоксилином. Ув. X 200.

При хондрогенной дифференцировке МСК ЖТч в З-О культуре методом «микросфер», через 5 суток в индукционной среде МСК образовывали трехмерные структуры в виде непрозрачных «микросфер» диаметром ~ 1 мм. Гистологическая оценка полученных структур показала, что микросферы на 5 сутки дифференцировки имеют рыхлую неоформленную структуру и не дают специфического окрашивания по методу Маллори на коллаген и альциановым синим на гликозаминогликаны (ГАГ). Уже через 7 суток дифференцировки периферия каждой микросферы представлена I -2 слоями фибробластоподобных жизнеспособных клеток, появляются тонкие волокна коллагена и сине-зеленое окрашивание, характеризующее появление ГАГ во внеклеточном матриксе. Через 10 суток наблюдается прогрессивное врастание фибробластоподобных клеток внутрь микросфер и заполнение ими центральной части, заметное и явное увеличение коллагеновых волокон, а также ГАГ. Через 14 суток хондрогенной дифференцировки МСК ЖТч (Рис. 4 А) наблюдается прогрессивное образование ГАГ (Рис. 4 Б), коллагена (Рис. 4 В), в сферах появляются отдельные локусы, заполненные внеклеточным матриксом, синтезированном клетками, составляющими микросферу. Матрикс в поверхностной зоне представлен пучками коллагеновых волокон, расположенных параллельно поверхности микросферы, что характерно для нормальной хрящевой ткани. Иммуногистохимическое окрашивание антителами показало, что коллагеновые волокна в микросферах являются коллагеном II типа - основной тип коллагена хрящевой ткани (Рис. 4 Г).

А. ' ' шу - h швШШШКВШШЯЯШШШШ Б \ 1 i . * 1 'V - t ШХ.Ш:, &JBBL i «с. • • l • -

• в шя / V» \ .у. С ч' ■ ; ш*. •Ч-- Г Г Ж ШШШк V . 1 fc ^ЙЙШ^Г ' « Шш'

Рисунок 4. Хондрогенная дифференцировка МСК ЖТч в 3-D культуре (микросферы), 14 суток. А - окрашивание гематоксилином и эозином; Б - окрашивание альциановым синим на гликозаминогликаны (указано стрелками); В - окрашивание на коллаген гто методу Маллори (указано стрелками); Г - иммуногистохимическое окрашивание антителами к коллагену II типа (указано стрелками). Ув. X 200.

Иммобилизация и культивирование МСК ЖТч в гетерогенном биополимерном гидрогеле в условиях in vitro

Гистологическая оценка препаратов, полученных после посева различных количеств МСК ЖТч на БГГ Сферо®ГЕЛЪ через 3 суток культивирования показала, что при посеве 1 х 106 кл/мл гидрогеля прикрепленных жизнеспособных клеток в препаратах не наблюдается, при посеве 2x106 кл/мл, 4x106 кл/мл на гистологических препаратах визуализируются единичные фибробластоподобные жизнеспособные клетки, также присутствуют округлые вакуолизированные клетки на разных стадиях дегенерации. Через 7 суток культивирования адгезированные фибробластоподобные жизнеспособные МСК присутствуют во всех образцах, их количество увеличивается. Полученные данные позволяют сделать вывод, что не все клетки адгезируют на БГГ Сферо®ТЕЛЪ, адгезированные МСК ЖТч жизнеспособны и пролиферируют. Оптимальной концентрацией для посева была выбрана 2хЮ6 кл/мл.

В таблице 2 представлены значения, соответствующие процентам восстановленного реагента ргеэШВЬе®. Процент восстановленного ргез1оВ1ие® характеризует пролиферативную активность МСК.

Таблица 2

Значения метаболической активности МСК ЖТч в процессе культивирования в ___биополимерном гетерогенном гидрогеле Сферо®ГЕЛЬ

Образец 24 ч 48 ч 72 ч

Культур альный пластик, % 21,4 ± 1,2 30,2 ± 1,3 56,1 ±3,2

БГГ, % 20,4 ± 2,0 22,6 ±2,5 29,5 ±4,1

Из полученных данных видно, что через 24 ч культивирования пролиферативная активность МСК в БГГ сопоставима с культуральным пластиком. Через 48 ч и 72 ч пролиферативная активность МСК на поверхности культурального платика существенно выше, чем в БГГ, это можно объяснить тем, что часть клеток, как было показано в предыдущей серии экспериментов, не прикрепилась к матриксу. Через 48 ч и 72 ч в системе БГГ + МСК наблюдается положительная динамика, клетки жизнеспособны и пролиферируют на поверхности матрикса. Морфологические изменения КИК хрящевой ткани в условиях in vitro

В гистологических препаратах КИК XT, состоящей из преддифференцированных в хондрогенном направлении в течение 7 суток в монослое МСК ЖТч, смешанных с биополимерным гетерогенным гидрогелем (2x106 кл/мл геля), через 14 суток инкубации в хондрогенной среде наблюдали прорастание клеток в гель и образование волокнистого внеклеточного матрикса, присутствуют деструктивные изменения клеток. К 28-ми суткам культивирования КИК в данных условиях, наблюдали сфероидные образования, состоящие из клеток и внеклеточного матрикса, напоминающие микросферы. Однако на данном сроке в гистологических срезах отсутствуют жизнеспособные клеточные элементы, визуализируется грубодисперсный детрит.

В гистологических препаратах КИК XT, состоящей из преддиференцированных в хондрогенном направлении методом «микросфер» МСК ЖТч, помещенных в биополимерный гетерогенный гидрогель (20 микросфер/мл матрикса), через 28 суток хондрогенной дифференцировки отсутствуют жизнеспособные клеточные элементы, визуализируется грубодисперстный детрит. Несмотря на то, что при дифференцировке методом «микросфер» было показано, что МСК ЖТч продуцируют компоненты внеклеточного матрикса, характерные для хрящевой ткани, и количество

16

внеклеточного матрикса увеличивается во времени, культивирование в БІ Г' не привело к образованию жизнеспособных хряшеподобных структур.

Через 14 суток инкубации в хондрогенной среде КИК ХТ, состоящей из недифференцированных МСК ЖТч, смешанных с биополимерным гнтнрогннным гидрогелем в концентрации 2x106 кл/мл геля, через 14 суток наблюдали образование трехмерных структур размером ~ 6 мм. Результаты гистологической оценки полученных структур показали, что через 14 суток в толще биополимерного матрикса присутствуют клетки с различными морфологическими характеристиками: фибробластоподобные с вытянутым ядром и овальные с округлым ядром (Рис. 5 А), точно установить тип клеток затруднительно. Показано образование собственного внеклеточного матрикса, имеющего волокнистую структуру, коллагеновая природа которого подтверждается при специфическом окрашивании по методу Маллори (Рис. 5 Б). Через 28 суток количество клеток овальной формы с округлым ядром в срезах значительно увеличивается, клеточная популяция становится более однородной, встречаются хондробластоподобные клетки. Обнаружено заметное увеличение количества ВКМ, вырабатываемого клетками в процессе культивирования. Собственный внеклеточный матрикс имеет волокнистую структуру (Рис. 6 А, Б).

К сожалению, на сроках 14 и 28 суток нам не удалось выявить наличие коллагена II типа в полученных конструкциях, возможно вследствие недостаточного количества клеток или слишком малого времени дифференцировки.

К 42 суткам инкубации КИК ХТ в хондрогенной среде наблюдали продолжение увеличения клеточной массы, прорастание клеток в толщу БГГ и увеличение количества ВКМ, вырабатываемое клетками. Наблюдали спонтанное образование сфероподобных структур, сходных с микросферами, полученными из МСК ЖТч в ЗО-культуре (Рис. 6 В, Г). Окрашивание препаратов по методу Маллори показало наличие большого количества коллагеновых волокон в образцах (Рис. 7 А), гистохимическое окрашивание антителами к коллагену II типа демонстрирует наличие значительного количество коллагена именно этого типа (Рис. 7 Б). Присутствие специфичного сине-зеленого окрашивания ВКМ альциановым синим указывает на активный синтез ГАГ дифференцированными МСК ЖТч (Рис. 7 В). В некоторых препаратах обнаружены лакунообразные области - группы из нескольких клеток, окруженные ВКМ, напоминающие изогенные группы клеток нативного хряща (Рис. 7 Г).

А

м

Я ш

ш

\

>

\ Г

Л \

Рисунок 5. Формирование ТИК ХТ из КИК ХТ, состоящей из биополимерного гидрогеля Сферо®ГЕЛЬ и МСК ЖТ, 14 суток. А - окрашивание гематоксилином и эозином; Б - окрашивание по методу Маллори; 1 - МСК ЖТч, 2 - биополимерный гетерогенный гидрогель Сферо®ГЕЛЬ. Ув. х400.

Рисунок 6. Формирование ТИК ХТ из КИК ХТ, состоящей из биополимерного гидрогеля Сферо®ГЕЛЬ и МСК ЖТч: А - 28 суток хондрогенной дифференцировки. Окрашивание гематоксилином и эозином. Б - 28 суток хондрогенной дифференцировки. Окрашивание по методу Маллори. В, Г - 42 сутки хондрогенной дифференцировки. Окрашивание гематоксилином и эозином. Микросфероподобные структуры указаны стрелками; 1 - МСК ЖТч, 2 - биополимерный гетерогенный гидрогель Сферо®ГЕЛЬ. Ув. х200.

хондрогенной дифференцировки: А - окрашивание на коллаген по методу Маллори (указано стрелками), Б - иммуногистохимическое окрашивание антителами к коллагену человека II типа (показано стрелками), В - окрашивание альциановым синим на гликозаминогликаны (указано стрелками), Г - лакуноподобные структуры (изогенные группы клеток показаны стрелками), окрашивание гематоксилином и эозином. 1 - МСК ЖТч, 2 - биополимерный гетерогенный гидрогель Сферо®ГЕЛЬ. Ув. X 200.

Исходя из проведенных экспериментов, оптимальным составом и условиями формирования ТИК XT являются: хондрогенная дифференцировка МСК ЖТч в процессе культивирования в биополимерном гетерогенном матриксе при плотности посева 2x106 кл/мл матрикса. Показано, что образующиеся в процессе культивирования КИК XT трехмерные структуры, состоящие из дифференцированных в хондрогенном направлении МСК ЖТч, начинают продуцировать компоненты собственного внеклеточного матрикса. Формирование собственного ВКМ сопровождается резорбцией с постепенным замещением биополимерного гидрогелевого матрикса, что свидетельствует о начальных стадиях формирования ТИК XT в условиях in vitro.

Морфологические изменения КИК хрящевой ткани в условиях in vivo (экспериментальная модель подкожной имплантации)

На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Каких-либо отклонений в поведении (повышенной или пониженной активности) и состоянии мышей опытной группы по сравнению с контрольной группой не отмечено. Масса тела мышей, клинический и биохимический анализы крови на протяжении исследования значимо не отличалась между группами. Достоверных отличий как абсолютной, так и относительной массы внутренних органов мышей опытной группы от контрольной группы не выявлено ни через 14, ни через 28 суток после имплантации. Гистологическое исследование места имплантации показало отсутствие токсичности и туморогенности в обеих группах животных, что говорит о биологической безопасности КИК хрящевой ткани.

Через 14 суток после имплантации в гистологических препаратах, полученных в опытной группе, окрашивание по методу Маллори выявило тонкие коллагеновые волокна синего цвета, окружающие фрагменты биополимерного матрикса (Рис. 8 Б). При окрашивании срезов альциановым синим, удалось обнаружить лишь единичные локусы, демонстрирующие позитивную реакцию на ГАГ (Рис. 8 В).

Через 28 суток в препаратах опытной группы наблюдали более выраженную, по сравнению с предыдущим сроком наблюдения, резорбцию биополимерного гидрогеля с замещением его рубцовой тканью (Рис. 8, 9 А). Фрагменты геля окружены гетерогенной клеточной массой с явным преобладанием фибробластоподобных клеток, в некоторых участках формирующих соединительнотканную капсулу. Выявлено прогрессивное увеличение массы коллагеновых волокон (Рис. 9 Б) и локальное сине-зеленое окрашивание, характерное для ГАГ. В отдельных участках имплантата встречаются немногочисленные лакунообразные структуры, характерные для хрящевой ткани (Рис. 9 А). Можно предположить, что на более поздних сроках внеклеточный матрикс КИК ХТ постепенно заместит резорбирующийся биополимерный имплантат с образованием хрящевой ткани.

Рисунок 8. 14 суток подкожной имплантации КИК ХТ, состоящей из биополимерного гетерогенного гидрогеля и МСК ЖТч: А - окрашивание гематоксилином и эозином; Б -окрашивание на коллаген по методу Маллори (указано черными стрелками); В -окрашивание альциановым синим на гликозаминогликаны (указано черными стрелками). 1 - гетерогенная клеточная популяция, 2 - биополимерный гетерогенный гидрогель, капилляры указаны белыми стрелками. Ув. X 200.

Рисунок 9. 28 суток подкожной имплантации КИК ХТ, состоящей из биополимерного гетерогенного гидрогеля и МСК ЖТч: А - окрашивание гематоксилином и эозином (черными стрелками указаны лакунообразные структуры); Б - окрашивание на коллаген по методу Маллори (указано черными стрелками). 1 - гетерогенная клеточная популяция, 2 - биополимерный гетерогенный гидрогель, капилляры указаны белыми стрелками. Ув. X 200.

Заключение

В процессе работы оптимизирована методика получения МСК из ЖТч. Проведена полная характеристика полученных клеток: морфологическая, иммунофенотипическая, цитогенетическая характеристики, колониеобразующая способность, параметры роста и дифференцировочный потенциал в клетки мезодермального ряда (адипогенную, остеогенную и хондрогенную линии). В настоящей работе впервые использован биополимерный гетерогенный гидрогель Сферо®ТЕЛЪ в качестве матрикса для клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани. Показано, что БГГ Сферо®ГЕЛЬ способствует адгезии, пролиферации и хондрогенной дифференцировке МСК ЖТч при воздействии индукционной хондрогенной среды.

Исследованы три варианта получения КИК ХТ на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля Сферо® ГЕЛЬ и МСК ЖТч с различной степенью хондрогенной дифференцировки. При использовании для создания КИК ХТ преддиференцированных МСК в монослое или в «микросферах» не удается получить жизнеспособные тканеинженерные конструкции из-за большой гибели клеток в данных условиях. При непосредственной хондрогенной дифференцировке МСК ЖТч высокой плотности на поверхности биополимерного гетерогенного гидрогеля происходит синтез компонентов ВКМ, характерных для хрящевой ткани - ГАГ и коллагена II типа, а так же формирование лакуноподобных структур.

В экспериментальной модели подкожной имплантации мышам линии DAB доказано отсутствие токсичности и туморогенности разработанных КИК ХТ. Выявлены некоторые признаки формирования ТИК ХТ в месте имплантации клеточно-инженерной конструкцій в условиях in vivo.

выводы

1. Оптимизирована технология выделения и культивирования МСК из ЖТч. Особенностью метода является время инкубации ткани с коллагеназой Type IA и количество циклов обработки. При использовании данной методики удалось повысить выход клеток с 70 до 300 тыс. клеток/гр. ткани при 95% жизнеспособности.

2. Охарактеризованы морфологические, ростовые, цитогенетические и иммунофенотипические особенности полученных популяций клеток. Показано, что их фенотип соответствует фенотипу МСК, кариотип сохраняется при длительном культивировании.

3. Подтверждена способность полученных МСК к дифференцировке адиногенном, остеогенном и хондрогенном направлениях.

4. Исследованы три способа получения КИК хрящевой ткани на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и не дифференцированных МСК ЖТч, преддифференцированных в хондрогенном направлении в монослое или в микросферах.

5. Установлено, что оптимальными условиями формирования ТИК хрящевой ткани in vitro являются хондрогенная дифференцировка МСК ЖТч в процессе культивирования в биополимерном гетерогенном гидрогеле при плотности посева 2x106 кл/мл матрикса.

6. Для КИК хрящевой ткани на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и не дифференцированных МСК ЖТч к 42 суткам хондрогенной дифференцировки в условиях in vitro обнаружен синтез клетками коллагена II типа и ГАГ которые являются основными компонентами хрящевой ткани.

7. Доказана биологическая безопасность разработанной КИК хрящевой ткани в экспериментальной модели подкожной имплантации мышам-самцам линии DBA в условиях in vivo.

8. Выявлены некоторые признаки формирования ТИК хрящевой ткани в месте имплантации КИК XT на основе биополимерного гетерогенного гидрогеля и не дифференцированных МСК ЖТч в условиях in vivo. В гистологических препаратах наблюдали многочисленные коллагеновые волокна и локальное специфическое окрашивание, характерное для ГАГ. В отдельных участках среза имплантата встречались немногочисленные лакунообразные структуры, характерные для хрящевой ткани.

Практические рекомендации

1. Исследованные подходы к созданию клеточно-инженерной конструкции хрящевой ткани можно использовать для разработки КИК на основе других биополимерных матриксов и клеточных типов.

2. После проведения доклинических и клинических исследований разработанные КИК хрящевой ткани могут быть рекомендованы к применению в заместительной и регенеративной хирургии хрящевых тканей.

Список опубликованных научных работ по теме диссертации

1. Егорова В.А., Пономарева A.C., Богданова Н.Б., Абрамов В.Ю., Севастьянов В.И. Технология выделения и дифференцировки стволовых клеток из жировой ткани человека. Сборнике тезисов IV -го Всероссийского съезда по трансплантологии и искусственным органам, Москва, ноябрь 2008, с. 302.

2. Сургученко В.А., Пономарева A.C., Севастьянов В.И. Разработка методик дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани человека в миогенном и хондрогенном направлениях. Сборник тезисов «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования», 2009, с.49.

3. Егорова В.А., Пономарева A.C., Богданова Н.Б., Абрамов В.Ю., Севастьянов В.И. Характеристика фенотипа мезенхимальных стволовых клеток из жировой ткани человека методом проточной питометрип. Технологии живых систем, 2009, том 6, № 5, с. 40-46.

4. Surguchenko V.A, Ponomareva A.S., Bogdanova N.B., Abramov V.Yu., Sevastianov V.l. Characterization of human adipose-derived stem cells phenotype as potential cell material for hybrid organ construction. Rare metals, 2009, V. 28, pp.535-537.

5. Сургученко B.A., Пономарева A.C., Можейко Н.П., Ильинский И.М., Севастьянов В.И. Предифиренцированные мезенхимапьные фибробластоподобные стволовые клетки из жировой ткани человека для тканеинженерной конструкции хрящевой ткани. Сборник тезисов «Стволовые клетки и регенеративная медицина», 2010, с. 78.

6. Пономарева A.C., Сургученко В.А., Богданова Н.Б., Можейко Н.П., Севастьянов В.И. Исследование дифференцировочного потенциала мезенхимальных стромальиых клеток из жировой ткани человека. Вестник Саратовского государственного технического университета, 2011, 1 (53), Выпуск 2, с. 203-208.

7. Севастьянов В.И., Перова Н.В., Немец Е.А., Сургученко В.А., Пономарева A.C. Примеры экспериментально-клинического применения биосовместимых материалов в регенеративной медицине. В книге: Биосовместимые материалы (учебное пособие). Под ред. В.И. Севастьянова и М.П. Кирпичникова. Изд-во «МИА», М., 2011 г., Часть II, глава 3, с. 237-252.

8. Пономарева A.C., Сургученко В.А., Можейко Н.П., Ильинский И.М., Севастьянов В.И. Использование мезенхимальных стромальиых клеток жировой ткани человека и биополимерных матриксов для тканеинженерной конструкции хряща. Цитология, 2011,53(9), с. 743.

9. Сургученко В.А., Пономарева A.C., Кирсанова Л.А., Скалецкий H.H., Севастьянов В.И. Предварительные результаты исследований по созданию тканеинженерной конструкции хрящевой ткани. (Материалы VI Всероссийского съезда трансплантологов, Москва, 24-27 сентября 2012), Вестник трансплантологии и искусственных органов (Приложение), 2012, 14, с. 316.

10. Сургученко В.А., Пономарева A.C., Кирсанова Л.А., Бубенцова Г.Н., Скалецкий H.H., Севастьянов В.И. Формирование тканеинженерной конструкции хрящевой ткани в условиях in vitro. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2013, т. XV, №3, с. 66-72.

П.Перова Н.В, Сургученко В.А., Пономарева A.C., Севастьянов В.И. Гетерогенные биополимерные имплантаты в тканевой инженерии для регенеративной медицины. Сборник тезисов «Стволовые клетки и регенеративная медицина», 2013, с. 57.

Подписано в печать: 20.11.2013 Тираж: 100 экз. Заказ № 1060 Объем: 1,5 усл.п.л. Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru