Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Изучение биосовместимости и возможности применения аутологичного хрящевого эквивалента в офтальмологии

/ у

На правах рукописи

Канукова Тамара Альбертовна

Изучение биосовместимости и возможности применения аутологичного хрящевого эквивалента в офтальмологии (экспериментальное исследование).

14.01.07 - Глазные болезни

03.03.04-Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 5 КАР 2015

005560894

Москва - 2015

005560894

Работа выполнена в ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца» Минздрава России (директор -Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Нероев Владимир Владимирович); ФГБУН «Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова» Российской академии наук (директор - доктор биологических наук, профессор Озернюк Николай Дмитриевич). Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Гуидорова Роза Александровна кандидат биологических наук Киселева Екатерина Владимировна Официальные оппоненты:

Борзенок Сергей Анатольевич - доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН, руководитель Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. С.Н. Федорова» Минздрава России

Краснов Михаил Сергеевич - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Лаборатории физиологически активных биополимеров ФГБУН «ИНЭОС им. А.Н. Несмеянова» Российской академии наук Ведущая организация: ФГБНУ «Научно-исследовательский институт глазных болезней»

Защита диссертации состоится «14» апреля 2015г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.208.042.01 при ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца» Минздрава России (105062, Москва, ул. Садовая-Черногрязская,14/19) С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней имени Гельмгольца» Минздрава России( 105062, Москва, ул. Садовая-Черногрязская, 14/19)

Автореферат разослан «_»_2015года.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Филатова И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Лечение ожоговой травмы занимает особое место среди всех травматических повреждений органа зрения. На сегодняшний день доля глазной ожоговой травмы достигает 38,4% от всех повреждений глаз. [Гундорова P.A., 1996, 2000; Либман Е.С., 2000; Макаров П.В., 2003; Нероев В.В., 2006; Кваша О.И., 2003, 2006; Бойко Э.В., Чурашов СВ. с соавт., 2007; Чернетский И.С., 2009; Kernodle D.S., Kaiser A.B., 1995; Sharma S., Saffra N.A., 2003].

По данным различных авторов до 87,8% пострадавших составляют люди трудоспособного возраста и у каждого четвертого последствия травмы ведут к инвалидизации, что и обусловливает медико-социальную и экономическую значимость данной проблемы в офтальмопатологии [Макаров П.Г., и др. 1977; Либман Е.С., Шахова Е.В., 2006, 2007]. Наиболее тяжелую для терапии группу пациентов составляют пострадавшие от химических ожогов, в исходе которых формируются грубые сосудистые бельма.

Несмотря на активное развитие микрохирургической техники, для пациентов с тяжелыми ожоговыми бельмами 4-5 категории (по классификации Филатова В.П. и Бушмич Д.Г., 1947) единственным оптико-реконструктивным методом является метод кератопротезирования. Однако и сегодня процент отторжения кератопротезов остается достаточно высоким и достигает 75% [Гундорова РА., 1979; Пучковская НА., Якименко CA., 1978; Калинников Ю.Ю., 2005; Castroviejo R., Cardona Н., de Voe, 1983]. Большинству авторов после имплантации кератопротезов в клинической практике так и не удалось справиться с такими осложнениями, как протрузия импланта, врастание эпителия в переднюю камеру, лизис адгезивного вещества и с самым грозным и специфическим осложнением - асептическим некрозом роговой оболочки [Hicks C.R. и др., 1997; Marchi V., 1994]. Эти осложнения значительно снижают прочность соединения кератопротеза с тканями глаза вплоть до распада всей конструкции, поэтому поиск новых биоматериалов и методик для повышения

функциональных результатов данного вида лечения является крайне востребованным.

Степень разработанности темы. Особый интерес для усиления прочностных свойств ожогового бельма представляет хрящевая ткань. Являясь разновидностью соединительной ткани, она выполняет опорную функцию в организме. Протеогликаны хрящевой ткани имеют способность ускорять процессы регенерации, а сама ткань, будучи бессосудистым образованием, устойчива к васкуляризации.

Еще в работах Ченцовой Е.В (1996) было предложено применять аутохондрокератопластику при послойной кератопластике для лечения последствий ожогов роговицы. По данным автора данная методика позволяла значительно снизить степень васкуляризации роговицы при ожогах. Позже Чернетский И.С. (2009) в своей работе показал высокие результаты при предварительном укреплении бельма аутохрящем ушной раковины, но столкнулся с такими трудностями, как дефицит аутохрящевой ткани, в результате чего отсутствовала возможность формировать хондрокомплексы большего диаметра (9-12мм), которые имеют больший потенциал к приживлению.

Однако использование свежевыделенных собственных тканей имеет ряд серьезных недостатков - адаптация пересаженной ткани к неестественному биологическому окружению, физиологический стресс трансплантируемых тканей, частая невозможность получения аутотрансплантата заданных параметров - толщины, формы, радиуса кривизны и т.д. Данную проблему можно преодолеть с помощью тканеинженерных конструкций хрящевой ткани, которые представляют собой аутологичного или аллогенного происхождения хондроциты или мезенхимальные мультипотентные стромальные клетки, дифференцированные в хондрогенном направлении и нанесенные на биосовместимый носитель или заключенные в него.

Таким образом, актуальность и перспективность разработки тканеинженерной конструкции (ТИК; аутологичного хрящевого эквивалента)

для применения в реконструктивной хирургии глаза, в частности для усиления прочностных свойств тканей глаза, не вызывает сомнений и представляет интерес как для фундаментальной физиологии, так и для практической медицины.

ЦЕЛЬ: исследовать биосовместимость аутологичного хрящевого эквивалента (АХЭ) с тканями глаза и возможность его применения в офтальмологии при травматических повреждениях органа зрения.

Для реализации указанной цели были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1.Изучить необходимость использования аутологичных хрящевых эквивалентов при посттравматической патологии глаза по данным Отдела травматологии, реконструктивной хирургии и глазного протезирования ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России.

2.Исследовать в эксперименте реакцию склеры и окружающих тканей на эписклеральную трансплантацию аутологичного хрящевого эквивалента.

3.Исследовать в эксперименте биосовместимость аутологичного хрящевого эквивалента при посттравматической патологии придаточного аппарата глаза.

4.Исследовать в эксперименте переносимость и биосовместимость трансплантированного хрящевого эквивалента при посттравматической патологии роговицы.

5.Определить физические параметры модели аутологичного хрящевого эквивалента для укрепления ожогового бельма роговицы.

Научная новизна

1.Впервые в экспериментальном исследовании произведена трансплантация аутологичного хрящевого эквивалента в роговицу животного (кролики).

Клинически и морфологически показана его переносимость и биосовместимость с роговичной тканью животного.

2.Впервые произведена трансплантация тканеинженерного аутологичного хрящевого эквивалента в субтеноново пространство и собственную соединительную ткань животных. Произведено морфологическое исследование данных структур после трансплантации тканеинженерной конструкции.

3 Впервые показана возможность формирования с помощью хирургической методики субтотального роговично-хрящевого комплекса, включающего роговичную ткань реципиента и аутологичный хрящевой эквивалент

4.Впервые в эксперименте на животных показана возможность и доказано изменение морфологических и структурных характеристик ожогового бельма после трансплантации тканеинженерного аутологичного хрящевого эквивалента.

Теоретическая и практическая значимость

1Ла основании изучения архивного материала установлены основные недостатки укрепления ожогового бельма аутохрящем из уха по данным Отдела травматологии, реконструктивной хирургии и глазного протезирования МНИИ ГБ им. Гельмшльца.

2.Выявлены особенности влияния структур глазного яблока (роговица, соединительная ткань-склера, ухо) на состояние аутологичного хрящевого эквивалента после его трансплантации. Полученные результаты могут стать основой для дальнейших исследований в данной области.

3.Оптимизирован комплекс физических параметров тканеинженерного аутологичного хрящевого эквивалента (форма, толщина, диаметр, количество клеток) для укрепления ожогового бельма.

б

4.Разработан способ укрепления ожогового бельма с помощью тканеинженерной конструкции, состоящей из хондроцитов, помещенных в коллагеновый гель (Приоритетная справка на патент РФ №2014127131 от 3.07.2014г.).

Методология п методы исследования

Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне экспериментального исследования с использованием клинических, инструментальных и морфологических методов.

Положения, выносимые па защиту

1.Тканеинженерный хрящевой эквивалент, представленный культивированными клетками хряща, помещенными в коллагеновый гель, может быть трансплантирован в различные структуры глаза животного: в строму роговицы, эписклерально и подкожно в области собственной хрящевой ткани.

2.Возможна трансплантация тканеинженерного аутологичного хрящевого эквивалента в смоделированное ожоговое бельмо 4-5категорий (бмесяцев формирования бельма) с его полным приживлением и выполнением каркасных функций.

Степепь достоверности п апробация результатов работы Степень достоверности проведённых исследований определяется достаточным объёмом выборки исследований. Работа выполнена с использованием современных методов обследования. Сформулированные в диссертации выводы и положения аргументированы и логически вытекают из результатов многоуровневого анализа.

Основные положения диссертации и результаты проведенных исследований доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: V, VI Российский общенациональный офтальмологический форум «РООФ-2012, 2013» (Москва, 2012-13гг); Международный конгресс по травме глаза «1SOT-2012, 2014» (Джайпур,Индия,2012г; Дуборвник, Хорватия,2014г); XII Всероссийская научная конференция с международным участием «Федоровские чтения» (Москва, 2014); межотделенческая конференция ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца (Москва, 2014).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 в журналах, рецензируемых ВАК РФ. Подана заявка на патент РФ «Способ подготовки ожогового бельма роговицы к кератопротезированию», авторы: Гундорова P.A., Ченцова ЕВ., Макаров П.В., Киселева Е.В., Капитонов ЮА., Канукова ТА. (Приоритетная справка №2014127131 от 3.07.2014г).

Структура и объем диссертации

Работа содержит 130 страниц компьютерного текста; иллюстрирована 13 таблицами, 30 фотографиями, 3 диаграммами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Список использованной литературы включает 232 источника, из них 119 отечественных и 114 иностранных.

Работа выполнена на базе ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» под руководством д.м.н., профессора Гундоровой P.A. в Отделе травматологии, реконструктивной хирургии и глазного протезирования (руководитель - д.м.н., проф. Ченцова Е.В.) и в ФГБУН «Институт биологии развитии им. Н.К. Кольцова» РАН под руководством к.б.н. Киселевой Е.В в Лаборатории клеточной пролиферации (руководитель - д.б.н., проф. Васильев A.B.).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материал и методы исследования. В исследовании использовались культивированные аутологичные хондроциты, полученные из биоптатов ушного хряща кроликов. В качестве трехмерного матрикса для культивированных хондроцитов применялся коллагеновый гель на основе коллагена I типа, приготовленного из сухожилий хвостов крыс. Готовый тканеинженерный хрящевой эквивалент представлял собой диск диаметром 6,0; 8,0 или 10,0мм (в зависимости от этапа исследования), толщиной 1,5-2,0мм и с концентрацией клеток 5х106 кл/мл.

Исследование клеточных структур и гистологических препаратов проводилось на биологических микроскопах Leica DM RXA2, KeyenceBZ-8100 с последующей фоторегестрацией и инвертированном флуоресцентном микроскопе Olympus 1X51 (Olympus, Япония).

Приготовление тканеинженерного хрящевого эквивалента, иммуногистохимические исследования, а также подготовка микропрепаратов с последующим морфологическими исследованиями проводились в Лаборатории клеточной пролиферации ФГБУН «Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова» РАН совместно с к.б.н. Киселевой Е.В. (руководитель - д.б.н., проф. Васильев A.B.).

Для морфологических и иммуногистохимических исследований материал фиксировали по стандартной методике с заливкой в парафиновые блоки, из которых затем делались полутонкие срезы толщиной 4 мкр. Для анализа общей морфологии применяли окраску гематоксилином и эозином и метахроматический краситель толуидиновый синий.

Для проведения иммуногистохимического анализа срезы депарафинизировали непосредственно перед окраской антителами.

Для визуализации окраски использовали вторые антитела: ImmPRESS (Vector Lab) и субстрат диаминобензидин (DAB, Vector Lab).

Для флуоресцентной визуализации использовали вторичные антитела, конъюгированныес флуорохромами Alexa (MolecularProbes). Для окрашивания ядер использовали DAP1.

Иммуногистохимическое исследование проводили на гистологических срезах ткани роговицы и хрящевых эквивалентов. Для этого гистологические срезы были депарафинизированы, регидратарованы и промыты.

Для выявления специфических компонентов хрящевой ткани применяли

следующие маркеры:

- моноклональные антитела против агрекана (NovusBiologicals);

- моноклональные антитела хрящевого протеогликана (Chemicon).

Для оценки состояния роговично-хрящевого комплекса и его толщины на 30 и 120 сутки от момента трансплантации аутологичного хрящевого эквивалента в ожоговое бельмо проводили оптическую когерентную томографию на аппарате Spectralis HRT/OCT Heidelberg engineering. Оценивали толщину центральной зоны роговично-хрящевого комплекса и в качестве группы сравнения были взяты глаза кроликов с ожоговыми бельмами роговицы. Исследование выполнялось аспирантом лично в Отделе травматологии, реконструктивной хирургии и глазного протезирования (руководитель - д.м.н., проф. Ченцова Е.В.).

Исследование in vivo проводилось на 45-ти кроликах - самцах породы шиншилла массой 2,0-3,0 кг в возрасти бти месяцев.

Все животные содержались и использовались в исследованиях соответственно Хельсинской декларации и рекомендациям Директив Европейского Сообщества (№86/609 ЕС)

Работа была проведена в виде 5 последовательных экспериментальных исследований, причем первые три эксперимента были предварительными для определения биосовместимости тканеинженерной конструкции (ТИК) с различными структурами (роговица, склера, ухо). При выполнении любых вмешательств животные вводились в состояние медикаментозного сна: 1,0 мл ксилозина (20мг/мл акт. вещества) и 1,0 мл. кетамина (50мг/мл акт. вещества).

По ходу операций внутривенно производилось дополнительное вливание смеси препаратов ксилозина и кетамина в пропорции 1:1 и объёме до 1,5 мл.

-1-е экспериментальное исследование - имплантации аутологичного хрящевого эквивалента (АХЭ) на модели периферический кератэктомии (5 животных - 5 глаз). На данном этапе для трансплантации был использован АХЭ <1 = 6,0 мм, толщиной - 1,5 мм и с концентрацией хондроцитов - 5х 10й кл/мл. Выполнено совместно с д.м.н. Макаровым П.В. и к.м.н. Капитоновым ЮА.

Техника операции. В 1 мм от верхнего края роговицы вдоль лимба ножницами произведен разрез конъюнктивы с 3.00 до 9.00. Конъюнктива отсепарована от склеры тупым методом в направлении верхнего века. На 13 часах выполнен разрез конъюнктивы в радиальном направлении перпендикулярно лимбу с формированием лоскута на ножке. В верхней части роговицы, прилежащей к лимбу выполнен надрез трепаном (с! = 6,0мм) примерно на 1/3 глубины. Расслаивателем выкроен и удалей круглый послойный лоскут роговицы, ограниченный участком трепанации. Тканеинженерная конструкция уложена на дефект роговицы, фиксирована перекидными швами (Ейисоп 10.0), проведенными в ткани роговицы. Поверх конструкции наложен лоскут конъюнктивы на ножке, фиксирован узловыми швами к роговице по краю её дефекта. Тканеинженерная конструкция покрыта полностью.

Клиническую картину оценивали ежедневно. Срок наблюдения составил 60 дней.

-2-е экспериментальное исследование - трансплантация аутологичного хрящевого эквивалента в субтеноново пространство (10 животных - 10 глаз). Выполнено совместно с к.м.н. Капитоновым ЮА.

Техника операции. В 5 мм от верхнего края роговицы ножницами произведен линейный разрез конъюнктивы параллельно лимбу длиной 15мм. Конъюнктива отсепарована вглубь тупым способом. Склера отчищена от теноновой оболочки. Из диска тканеинженерной конструкции лезвием выкроен

и

участок ткани прямоугольной формы размерами 10 х 15 мм, толщиной 1,5-2,0 мм и уложен на нативную склеру вдоль верхней прямой мышцы. Конъюнктива ушита непрерывным швом (ЕЙнсоп 10.0). Для профилактики раздражения конъюнктивальных швов была произведена некровавая блефарорафия тремя П-образными швами (ЕЙисоп 8.0).

Клиническая картина оценивалась ежедневно. Однако при условии наличия блефарорафических швов проводилась оценка отделяемого, его количества и признаков отторжения ткани. Блефарорафические швы были сняты через месяц после трансплантации тканеинженерной конструкции (ТИК). Срок наблюдения составил 90 дней от момента трансплантации.

-3-е экспериментальное исследование - подкожная трансплантация аутологичного хрящевого эквивалента для замещения хрящевой ткани (10 животных - 10 век). Изначально планировали имплантировать ТИК в толщу века, однако, так как веки кролика достаточно тонкое образование и проведение подобных оперативных вмешательств технически не представляется возможным, было выбрано для исследования ухо животного, имеющее схожую анатомическую структуру. Эксперимент выполнен самостоятельно диссертантом.

Техника операции. С наружной стороны уха кролика в средней и нижней трети удален шерстяной покров. Операционное поле обработано антисептическим раствором. В нижней трети подкожно введен Лидокаин 2% 1,0 мл для отслаивания кожи. Ближе к основанию уха произведен линейный разрез кожи длиной 20 мм. Тупым способом кожа полностью отсепарована от подлежащего ушного хряща по обе стороны от разреза с формированием кармана. Из диска тканеинженерной конструкции лезвием выкроен участок ткани прямоугольной формы размерами 10x15 мм, уложен в сформированный карман. Кожа ушита наглухо непрерывными швами (ЕЙнсоп 8.0).

Клиническую картину оценивали ежедневно. Срок наблюдения составил 90 дней от момента имплантации аутологичного хрящевого эквивалента.

-4-е экспериментальное исследование - центральная субтотальная трансплантация аутологичного хрящевого эквивалента в несквозной дефект роговицы (10 животных - 10 глаз). На данном этапе для трансплантации был использован АХЭ d = 8,0мм, толщиной-1,5 мм и с концентрацией хондроцитов - 5х 10лкл/мл. Выполнено совместно с к.м.н. Капитоновым ЮА.

Техника операции. В центральной части роговицы выполнен надрез трепаном (d = 8,0мм) примерно на 1/3 толщины стромы роговицы. Выкроен и удален круглый несквозной диск роговичной ткани. Хрящевой эквивалент уложен в сформированный дефект ткани роговицы. Конструкция фиксирована перекидными швами (Ethicon 10.0), проведенными в ткани роговицы. В 1 мм от верхнего края роговицы вдоль лимба лезвием произведен круговой разрез конъюнктивы. Конъюнктива отсепарована от склеры тупым методом, натянута на сформированный роговично-хрящевой комплекс и ушита непрерывными швами. Произведена некровавая блефарорафия тремя П-образными швами (Ethicon 8.0).

Клиническую картину оценивали по наличию или отсутствию отделяемого, гиперемии конъюнктивы. Первый объективный осмотр состоялся на 30-е сутки от момента трансплантации после удаления блефарорафических швов. Срок наблюдения в общей сложности составил 90 суток.

-5-е экспериментальное исследование - центральная субтотальная трансплантация аутологичного хрящевого эквивалента на модели ожогового бельма 4-5 категории по классификации Филатова В.П. и Бушмич ВТ. (10 животных - 10 глаз). На данном этапе для трансплантации был использован АХЭ d = 10,0мм, толщиной- 1,5 мм и с концентрацией хондроцитов - 5*106 кл/мл. Выполнено совместно с к.м.н. Капитоновым ЮА.

Техника операции. В центральной части роговицы выполнен надрез трепаном (d = 9,5мм) примерно на 1/3 толщины стромы роговицы. Выкроен и удален круглый несквозной диск роговичной ткани. Хрящевой эквивалент уложен в сформированный дефект ткани роговицы. Конструкция фиксирована узловыми и перекидными швами (Ethicon 10.0), проведенными в ткани

роговицы. В 2мм от края роговицы на 13 часах выполнен разрез конъюнктивы перпендикулярно лимбу. Конъюнктива отсепарована от склеры тупым методом в направлении верхнего века и произведено формирование лоскута на ножке. Конъюнктивальным лоскутом полностью покрыт роговично-хрящевой комплекс и ушит узловыми швами по кругу (ЕЙпсоп 10.0). Произведена некровавая блефарорафия тремя П-образными швами (ЕЙпсоп 8.0).

Блефарорафические швы сняты на 30-е сутки после оперативного вмешательства. Срок наблюдения составил 120 дней.

После всех оперативных вмешательств животные получали одинаковую противовоспалительную терапию для профилактики вторичной инфекции в течение 14 дней.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Апализ результатов изучепия архивного материала

На предварительном этапе исследования диссертантом самостоятельно проведен анализ архивного материала. Были отобраны истории болезней пациентов за период 2001-2011г.г. с тяжелыми ожоговыми бельмами 4-5 категорий - 39 пациентов (48 глаз), поступивших в институт для различных видов хирургического лечения. Из этого количества глаз была выделена группа, а именно 42 глаза, на которых было проведено кератопротезирование, из них 14 глаз - без предварительного укрепления и 28 - с предварительным укреплением бельма (табл.1). Укрепление бельма проводилось: на 1 глазу -аллосклерой, на 2 глазах - аутослизистой с губы и на 25 глазах - аутохрящем из уха.

Таблица 1.

Распределение глаз с бельмами тожелых категорий по виду планового оперативного

лечения

Реконструкц ня век Пластика кон-х сводов Укрепление ожогового бельма АутоТ/ АллоЛТ Кератопрот езирование ВСЕГО

18 48 28 32 42 48

Кератопротезирование в среднем выполнялось в срок от 6 месяцев и более после укрепления бельма у пациентов. Использовалась стандартная модель кератопротеза Федорова - Зуева. Самым значимым осложнением кератопротезирования был асептический некроз над гаптической частью кератопротеза с последующим отторжением протеза (табл.2). В 13 случаях (из 14 глаз - 92,9%) кератопротезирования без предварительного укрепления ожогового бельма асептический некроз развился в сроке от месяца до двух лет после оперативного вмешательства. В единственном случае (100%) укрепления бельма аллосклерой асептический некроз развился в периоде до б месяцев. При укреплении бельма аутослизистой в 1 случае (50%) в раннем послеоперационном периоде (до 2месяцев) также было отмечено развитие асептического некроза. Во всех этих случаях некроз тканей привел к обнажению гаптичееких элементов кератопротезов и отторжению их в последующем.

При укреплении бельма аутохрящом уха асептический некроз конъюнктивы имел место в 5 случаях (20%) из 25, однако никогда не доходил до отторжения кератопротеза, так как локализовался у края оптического цилиндра.

Таблица 2.

Частота развития осложнений в зависимости от способа укрепления

бельма.

^Зн^у креплен. Осложненвд\^ Аутоелизистая с губыт п =2 Аллосклера п= 1 Аутохрящ из уха п = 25 Без предв-ого укрепления п=14

Асептический некроз 1(50%) 1(100%) 5(20%) 13(92,9%)

Отторжение кератопротеза 1(50%) 1(100%) 13(92,9%)

Полученные результаты подтвердили, что на сегодняшний день наиболее удачным материалом для укрепления ожогового бельма из перечисленных является аутохрящ из уха пациента. Являясь разновидностью соединительной ткани, хрящевая ткань выполняет опорную функцию в организме, ее протеогликаны имеют способность ускорять процессы регенерации, а сама ткань, будучи бессосудистым образованием, устойчива к васкуляризации.

Однако при дальнейшем клиническом наблюдении данных пациентов были выявлены определенные недостатки аутохондропластики, которые значительно снизили результат хирургического лечения. А именно:

• низкая эластичность аутохряща и невозможность его моделирования вызывает несоответствие кривизны интерфейса хрящевой и роговичной поверхностей, соответственно возникает несоответствие между роговично-хрящевым комплексом и опорными элементами кератопротеза, что вызывает частое зарастание оптического цилиндра, обнажение краев хрящевого диска с развитием вторичных осложнений, низким косметическим результатом и резким снижением качества жизни пациентов;

• ввиду дефицита аутохрящевой ткани отсутствует возможность использовать хондрокомплксы большего диаметра (9-12мм), которые имеют больший потенциал к стабилизации кератопротеза. Результаты ретроспективного анализа архивного материала подтвердили

данные литературы и тем самым доказали, что имеется объективная необходимость и потребность в поиске новой ткани для подготовки ожогового бельма, обладающей высокими каркасными функциями, но при этом лишенной выше указанных недостатков для обеспечения более высоких функциональных, косметических и социальных результатов после кератопротезирования.

На этапе подбора клеточной составляющей ТИК был сделан выбор в пользу хондроцитов. Выбор основан на нескольких положениях:

- для получения культуры хондроцитов травматичность забора хрящевой ткани незначительна для пациента;

- каркасные свойства хрящевой ткани удовлетворяют требованиям хирургов к материалу для укрепления бельм.

Результаты лабораторных исследований культуры хондроцитов и тканеинженернон конструкции

Иммуногистохимический анализ экспрессии маркера пролиферации - Ki-67, а также специфических маркеров хрящевой ткани (агрекана, коллагена 2 типа, хрящевого протеогликана) показал наличие активной пролиферации клеток, при этом скорость пролиферации значительно не изменяется вплоть до 10 пассажа. Количество Ю-67 положительных клеток в культуре составляло от 55 до 80%. Подобранные условия культивирования позволяют сохранить характерную для хондроцитов морфологию (полигональные клетки) и экспрессию специфических белков (хрящевого протеогликана, агрекана) как минимум до 8 пассажа. Экспрессия коллагена 11 типа сохранялась до 7 пассажа.

Гистологический анализ хрящевого эквивалента показал гистотипическое сходство полученной тканеинженерной конструкции с нативной хрящевой тканью: клетки, расположенные близко к поверхности эквивалента, имеют вытянутую форму, длинная ось расположена параллельно поверхности АХЭ, в более глубоких слоях клетки располагаются одиночно или скоплениями, напоминающими изогенные группы хондроцитов гиалинового хряща. Метахромазия при окрашивании толуидиновым синим указывает на наличие кислых гликозоаминогликанов в матриксе хрящевого эквивалента.

Иммуногистохимический анализ хрящевого эквивалента (ХЭ) для выявления специфических компонентов внеклеточного матрикса хрящевой ткани подтвердил экспрессию специфических маркеров - агрекана, хрящевого протеогликана и коллагена 2 типа. Таким образом, гистологический и иммуногистохимический анализ показали гистотипическое подобие созданной in vitro ТИК хрящевой ткани.

Результаты экспериментального исследования

Послеоперационная терапия и весь период наблюдения за экспериментальными животными велись на базе экспериментального научного центра ФГБУН «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России (руководитель - к.б.н. Щипанова А А.) совместно с к.м.н. Капитоновым Ю.А.

Проведенный анализ клинического течения после 1-го эксперимента (периферическая трансплантация ТИК на модели периферической кератэктомии) показал, что на протяжении всего срока наблюдения (60 суток) отсутствовали клинические признаки инфекционно- токсического или аутоиммунного воспаления (отторжение). Однако после выведения животных из эксперимента, гистологическое исследование показало наличие хрящевых клеток (хондроцитов) на месте трансплантации у 4 животных из 5. У животного №4рп гистологическое исследование показало некроз клеток трансплантата и лимфоцитарную реакцию в этой области, что говорит об отторжении ХЭ, хотя активной клинической картины отторжения не наблюдалось. Иммунногистохимический анализ срезов роговиц подтвердил данные гистологии: у 4 животных были выявлены в области транспланта маркеры хрящевой ткани (агрекан, коллаген 2 типа и хрящевой протеогликан), которые объективно свидетельствуют о наличии в области трансплантат живых клеток хрящевой ткани.

После 2-го экспериментального исследования (трансплантация ТИК в субтеноново пространство) клинически признаков какой-либо воспалительной реакции выявлено не было. Весь срок наблюдения (90 суток) реакция склеры на ХЭ соответствовала сроку после оперативного вмешательства. Гистологическое исследование микропрепаратов не выявило ХЭ в зоне трансплантации ни у одного из животных. Так как данный этап был пилотным и гистологическое исследование проводилось только на длительном сроке наблюдения (90 суток), можно предположить, что особенности зоны трансплантации, а именно наличие в субтеноновом пространстве выраженной сосудистой сети, способствует высокой скорости процессов тканевого обмена,

иммунной реакции, что могло стимулировать прорастание сосудов в трансплантированную тканеинженерную конструкцию, что в свою очередь могло привести к дифференцировки хондроцитов или их гибели. Известно, что для сохранения хондрогенного потенциала хондроцитов и мультипотентных мезенхимных клеток необходимы гипоксичеекие условия, а инвазия хрящевой ткани сосудами вызывает реорганизацию хрящевого матрикса.

В ходе 3-го эксперимента (подкожная трансплантация аутологичного хрящевого эквивалента для замещения хрящевой ткани)было установлено, что ввиду высоких регенераторных способностей выбранных экспериментальных животных (кролики) клиническая картина была крайне скудной. Послеоперационная рана подверглась быстрому рубцеванию и признаков инфекционно-токсического воспаления выявлено не было. Гистологическое исследования после 90 суток наблюдения выявило у всех животных в зоне трансплантации оссифицированный участок ткани со значительным количеством молодых форм клеток. Такой результат получен, вероятнее всего, в результате того, что при трансплантации не была затронута надхрящница и не изменена поверхность собственной хрящевой пластинки ушной раковины, соответственно не были получены сигналы от специфического микроокружения для сохранения фенотипа трансплантата, что привело к его дальнейшей дифференцировке в костную ткань.

Проанализировав полученные результаты трех предварительных этапов исследования, были избраны перспективные направления дальнейшего применения ТИК для усиления прочностных свойств ожогового бельма. Для этого на этапе 4-го экспериментального исследования была проведена центральная субтотальная трансплантация ХЭ ((1 = 8,0 мм) в несквозной дефект роговицы. При этом у 9 животных из 10 выявлено полное приживление ТИК. У животного №31р к концу 1-й недели наблюдения выявились признаки инфекционно-токсического воспаления, которые не купировались несмотря на проводимую противовоспалительную терапию, поэтому животное было выведено из эксперимента раньше срока (на 60-е сутки). Гистологическое

исследование полностью подтвердило данные клинической картины. У всех экспериментальных животных (кроме животного №31р) было выявлено встраивание ХЭ в область сформированного дефекта роговицы с большим количеством фибробластов в этой зоне. Кроме того, во внеклеточном матриксе определялось большое количество гликозамингликанов, которые характерны для хрящевой ткани. При гистологическом исследовании срезов роговицы животного №31р выявлена выраженная лимфоцитарная инфильтрация со множеством наполненных кровеносных сосудов, ХЭ в зоне трансплантации при этом не обнаружено, что вполне может свидетельствовать о лизисе ТИК.

Полученные результаты после последнего 5-го эксперимента (центральная субтотальная трансплантация ТИК (<1 = 10,0 мм) в ожоговое бельмо) свидетельствуют о полном приживлении ХЭ в ожоговом бельме. При клиническом послеоперационном наблюдении ни у одного из животных признаков инфекционно-токсической реакции не было выявлено в течение всех 120 суток наблюдения. Кроме того, ОКТ, проведенная всем животным на 30-е и 120-е сутки наблюдения объективно подтвердила увеличение толщины центральной зоны бельма в глазах с трансплантированным ХЭ (в сравнении с парными глазами, на которых также был сформирован идентичный ожог той же категории и на том же сроке). В среднем толщина бельма с ТИК на 30 сутки составила 1025,4 ± 50,128мкм (толщина ожогового бельма на парном глазу624,5 ± 23,765). К 120 суткам толщина ожогового бельма как с трансплантированной ТИК, так и парного глаза уменьшились (979 ± 44,522мкм и 589,6 ± 26,453мкм, соответственно), что вполне объясняется снижением отека поврежденных тканей (табл.3). При проведении гистологического исследования во всех срезах в зоне трансплантации определялся пласт хрящевого эквивалента, причем толщина его варьировала незначительно на всем протяжении.

Таблица 3.

Результаты ОКТ на 30-е и 120-е сутки после центральной субтотальной трансплантации ТИК в ожоговое бельмо.

№ животного Толщина роговично-хршцевого комплекса, мкм п=10 Толщина ожогового бельма, мкм п=10

30-е сутки 120-е сутки 30-е сутки 120-е сутки

КЬЛаЗбож 1031 983 653 631

ЮзЛШож 949 905 670 643

ИЬЛ'гЗЗож 947 902 645 612

ИЬЛ939ож 1099 1049 598 553

Ш>Лг40ож 951 927 551 517

НЬЛз41ож 1122 1074 637 598

Ш)Л-42ож 1121 1068 612 570

Ш>Л143ож 1049 1003 621 588

ИЬ№44ож 997 956 638 601

Ш>№45ож 988 950 620 583

Среднее значение измерений 1025,4 ± 50,128 979 ± 44,522 624,5 ± 23,765 589,6 ± 26,453

Таким образом, в ходе последних двух экспериментальных исследований удалось еще раз подтвердить возможность трансплантации тканеинженерного хрящевого эквивалента в роговицу животного и доказать его полную биосовместимость. Кроме того, была отработана хирургическая методика трансплантации ХЭ в ожоговое бельмо роговицы (Приоритетная справка на патент РФ «Способ подготовки ожогового бельма роговицы к кератопротезированию» №№2014127131 от 3.07.2014г., Гундорова Р.А., Ченцова Е.В., Макаров П.В., Киселева Е.В., Капитонов Ю.А., Канукова Т.А.). С помощью ОКТ было показано получение роговично-хрящевого комплекса большей толщины по сравнению с идентичными ожоговыми бельмами на парных глазах, что создает хорошие условия для последующей фиксации опорной пластины кератопротеза и позволит предотвратить ее обнажение.

Анализируя результаты проведенных этапов экспериментального исследования, можно выделить следующие преимущества ТХЭ:

• получение необходимого объема клеточного материала;

• Возможность использования аутологичного материала (отсутствие иммунного конфликта);

• плотно-эластическая консистенция ТИК, облегчающая моделирование и фиксацию при трансплантации;

• возможность повлиять на физические свойства препарата при его производстве (толщина, кривизна, диаметр);

• возможность использования косметических контактных линз после имплантации кератопротеза.

Все полученные результаты в ходе данной работы могут стать основой для дальнейших экспериментальных, а затем и клинических исследований в области применения тканеинженрных конструкций для различных офтальмопатологий.

ВЫВОДЫ

1 .Основными недостатками ткани, применяемой для укрепления бельма в настоящее время, является: низкая пластичность материала; отсутствие конгруэнтности между внутренней поверхностью век и поверхностью роговицы с пересаженным аутохрящевым трансплантатом; отсутствие возможности моделирования аутохряща; дефицит трансплантационного материала.

2. После трансплантации культивированного хрящевого эквивалента в эписклеральное пространство к 90 суткам наблюдения определяется полная элиминация тканеинженерной конструкции, подтвержденная гистологическим исследованием.

3.Трансплантация культивированного хрящевого эквивалента в собственную соединительную ткань (ухо животного) к 90 суткам наблюдения

завершается приживлением тканеинженерной конструкции. Гистологически определяется дифференцировка хрящевого эквивалента в костную ткань в зоне трансплантации к концу срока наблюдения (90 суток).

4.Клинически и морфологически доказана биосовместимость и переносимость трансплантированного хрящевого эквивалента с роговичной тканью. Иммуногистохимически и гистологически показано гистотипическое сходство трансплантированной тканеинженерной конструкции с нативной хрящевой тканью и доказана ее полная биосовместимость с тканями роговицы (как нативной, так и ожоговой).

5.0птимальными физическими параметрами хрящевого эквивалента для укрепления ожогового бельма роговицы являются: d = 10,0 мм; толщина - 1,5 мм; концентрация хондроцитов - 5х Ю'кл/мл.

6. Показано достоверное увеличение толщины центральной зоны ожоговой роговицы с трансплантированной тканеинженерной конструкцией по сравнению с интактным ожоговым бельмом.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

¡.Искусственный эквивалент аутохрящевой ткани: создание и перспективы его применения для укрепления бельма перед кератопротезирование (экспериментальное исследование) / Беляев Д.С., Канукова Т.А., Хорошилова-Маслова И.П., Киселева Е.В., Васильев A.B., Чернетский И.С., Макаров П.В. // Ш научно-практическая конференция по офтальмологии с международным участием «Восток-Запад»:сб. науч. тр. -Уфа, 2012. -С. 129-130.

2.Исследование биосовместимости нового аутологичного материала для изменения архитектоники роговицы при посттравматической патологии / Нероев В.В., Гундорова РА., Васильев A.B., Киселева Е.В., Капитонов ЮА., Канукова Т.А. // V Российский общенациональный офтальмологический форум: сб. трудов. -М., 2012. -Т.2. -С.766-769.

3.Artificial tissue equivalent autologous cartilage: creating and prospects of its applicstion to strengthen permanent opaque cornea befor keratoprosthesis

(experimental study) / Neroev V.V., Gundorova RA., Vasiliev A.V., Kiseleva E.V., Khoroshilova-Maslova I.P., Kapitonov Y.A., Belyaev D.S., Kanukova T.A. // Международный конгресс по травме глаза «1SOT-2012»: материалы конф. -Индия, Джайпур,2012г. -С.5-6.

4. Новые возможности укрепления ожоговых бельм роговицы перед кератопротезированием / Гундорова РА., Васильев A.B., Макаров П.В., Киселева Е.В., Капитонов ЮА., Капукова Т.А. // Всерос.науч. конф. с межд. уч.«Федоровские чтения.»: сб. науч. работ. -М., 2014. -С. 42.

5.Новые методы укрепления архитектоники роговицы перед последующим кератопротезированием / P.A. Гундорова, Е.В. Киселева, Ю.А. Капитонов, Т.А Канукова. // Всероссийской конференции «Новые технологии в офтальмологии»: сб. науч. трудов. - Казань, 2014. -С.61-63. ö.Consalidation of corneal architectonics by tissue engineering based on a cultivated cartilage / Gundorova R.A., Kiseleva E.V., Kapitonov U. A., Kanukova T.A. // Международный конгресс по травме глаза «1SOT-2014»: матер.конф. -Дубровник, Хорватия,2014г. - С. 12.

7.Два типа тканеинженерных эквивалентов хрящевой ткани на основе хондроцитов для использования в реконструктивной хирургии/ Е.В. Киселева, Е.В. Батухтина, ТА. Канукова, В.В. Терских. // VI Троицкая конференция « Медицинская физика и инновации в медицине»: сб. трудов. - Троицк, 2014. -С.182-184.

8.Перспективы использования тканеинженерной конструкции на основе культивированных аутологичных хондроцитов на этапах подготовки бельма к кератопротезированию / РА.Гундорова, Е.В. Киселева, П.В. Макаров, ЮА. Капитонов, ТА. Канукова. // Российский офтальмологический журиал. -2014. -Т.7 . -№3. -С.65-70.

9.Исследования новых возможностей пластики дефектов тканей в офтальмологии / РА. Гундорова, Е.В. Киселева, ЮА. Капитонов, ТА. Канукова.// Катаракталгьиая и рефракционная хирургия. - 2014. -Т.14. -№.3. -С.41-44.

Подана заявка на патент РФ:

10.«Способ подготовки ожогового бельма роговицы к кератопротезтрованию», Гундорова РА., Ченцова Е.В., Макаров П.В., Киселева Е.В., Капитонов ЮА., Канукова Т.А. Приоритетная справка №№2014127131 от 3.07.2014г.

Список сокращений

АХЭ-аутологичный хрящевой эквивалент

ТИК-тканеинженерная конструкция

ХЭ-хрящевой эквивалент

ВАР1-флуоресцентный краситель

НКГ-гейдельбергский ретинальный томограф ОСТ-оптическая когерентная томография

Подписано в печать: 14.02.15 Заказ №6598 Тираж: 100 экз.

Типография «ОПБ-Принт» ИНН 7715893757 107078, г. Москва, Мясницкий пр-д, д. 2/1 (495) 777 33 14

www.opb-print.ru