Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Криоконсервирование костного мозга под защитой 3% раствора диметилацетамида

РГ6 - 8

ОД

онт да

На правах рукописи

Тюрин Роман Владиславович

КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЕ КОСТНОГО МОЗГА ПОД ЗАЩИТОЙ 37. РАСТВОРА ДЙМЕТЕЛАЦЕТАЩЦА

14.00.29. - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ - ПЕТЕРБУРГ 1996

№61 1М0 8 -АО ^

Работа выполнена в Боенно - ыедицинской академии

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник В. В. Данильченко Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Н.В. Бутомо

доктор медицинских наук профессор

заслуженный деятель науки K.M. Абдулкадыров

Ведущая организация.-

Научно - исследовательский институт онкологии им. проф. H.H. Петрова

Защита состоится - OrStûÙ 1996г. Б. часов на заседании специализированного совета (шифр Д.084.19.01) при Российском научно исследовательском институте гематологии и трансфузиологии (Санкт - Петербург, 193024, 2-я Советская 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

р __

Автореферат разослан "-/У " &— 1996г..

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

B.C. Быков

Актуальность работы.

Важнейшим вопросом в проблеме трансплантации костного мозга является совершенствование методов длительного хранения миелоид-ной ткани при низких температурах. Криоконсервирование миелоид-ных клеток - необходимый этап трансплантации аутологичного костного мозга, которая находит широкое применение при лечении больных острыми и хроническими лейкозами (Абдулкадыров K.M. и соавт, 1694; Beran М. et al., 1987), миеломной болезнью (Bjorkstrand В. et al., 1994), лимфомами (Афанасьев Б.В. и соавт., 1993) и другими неопластическими заболеваниями (Beatty P.G., 1993). Актуальность создания банков аутологичного костного мозга лиц, профессиональная деятельность которых связана с повышенным риском радиационных поражений, показала авария на Чернобыльской АЭС (Баранов А. Е. и соавт., 1989;Sale R.P. et al.,

1989).

В Российской Федерации для клинического применения разрешено использование костного мозга, криоконсервированного под защитой глицерина. Существенным недостатком этого метода является необходимость предварительного удаления криопротектора из костномозговой взвеси перед ее инфузией, что приводит к потере значительного количества клеток в миелотрансплантате.

Широкое применение в качестве криопротектора для криокон-сервирования костного мозга в нашей стране и за рубежом нашел диметилсульфоксид ( Areman Е.М. et al.,1990; Areman Е.М.,1991). Однако, ДМСО оказывает выраженное токсическое влияние на миело-кариоциты трансплантата и организм реципиента (Davis J.M.,

1990). Кроме того, в настоящее время в России ДМСО соответствующей степени очистки не производится. В связи с этим необходимы исследования по изысканию новых нетоксичных криозалдатных веществ

отечественного производства для криоконсервирования миелоидной ткани.

Среди разрешенных для клинического применения в России кри-опротекторов перспективным для криоконсервирования костного мозга является димешпацетамид (Холодный А. Я. и соавт., 1986). Его преимущества выявлены сравнительной оценкой криозалщтных свойств ДМАЦ и ДМСО при замораживании гранулоцитов (Трошина В.М. и соавт., 1977). Имеющиеся в литературе единичные сообщения о крио-консервировании костного мозга с диметилацетами'дом свидетельствуют о том, что наиболее выраженной криофилактической способностью обладает 3% раствор ДМАЦ (Холодный А.Я и соавт.,1979). Для научного обоснования применения диметилацетамида в качестве криопротектора костного мозга необходимы углубленное исследование его криозадатной способности при замораживании миелокариоци-тов до - 19б°С, экспериментальное исследование лечебной эффективности пересадки гемопоэтической ткани, криоконсервированной с ДМАЦ, и оценка влияния криопротектора на функциональное состояние костного мозга человека в процессе его длительного хранения.

В проблеме миелотрансплантации вопрос об источниках получения костного мозга занимает одно из ведущих мест. В настоящее время имеются убедительные данные о высокой функциональной активности трупного костного мозга (Обухов Д.А., 1992; ЕЦагаг В.К. е1 а1., 1986). Важнейшим вопросом применения посмертного костного мозга является определение"целесообразных сроков его получения от трупов скоропостижно умерших людей и разработка эффективных методов криоконсервирования. Все это определяет актуальность настоящего исследования с научной и практической точек зрения.

Цель исследования.

Целью настоящей работы явилось исследование жизнеспособное-

ти костного мозга, замороженного до - 196° С под зашитой ж раствора диметилацетамида.

Задачи исследования.

1. Изучить функциональную полноценность костного мозга, криоконсервированного с 31 раствором ДМАЦ, в эксперименте.

2. Оценить влияние 3X раствора ДМАЦ на морфофункционалъную полноценность миелоидных клеток при 18 * 20° С.

3. Исследовать морфофункциональное состояние криоконсервированного под защитой 3% раствора ДМАЦ костного мозга гематологических Сольных и миелоидной ткани, взятой у трупов скоропостижно умерших людей.

4. Оценить влияние 3% раствора ДМАЦ на функциональное состояние миелокариоцитов в сравнении с 10% раствором ДМСО.

5. Изучить возможность длительного хранения замороженной с ДМАЦ миелоидной ткани при - 196° С.

Научная новизна работы.

Выявлена высокая эффективность криоконсервирования костного мозга под защитой 3% раствора диметилацетамида. Впервые в эксперименте на смертельно облученных мышах установлена лечебная эффективность пересадки костного мозга, криоконсервированного с 3% раствором диметилацетамида. Выявлено, что при криоконсер-вировании костного мозга хладоограждающая способность 3% раствора ДМАЦ соответствует криофилактической активности 10% раствора ДМСО. Доказано, что посмертный костный мозг, криокон-сервированный под защитой 3% раствора ДМАЦ при - 196° С, сохраняет функциональную полноценность после 10 лет хранения (срок наблюдения). Установлена функциональная полноценность костного мозга, взятого у трупов внезапно скончавшихся людей в первые 8 часов с момента смерти.

- 4 -

Практическая значимость работы и ее реализация.

Применение 3% раствора диметилацетамида в качестве криопро-тектора позволяет надежно сохранять функционально полноценные миелокариоциты костного мозга гематологических больных и посмертного костного мозга при замораживании в жидком азоте (- 19б°С). При этом не требуется удаления криопротектора перед инфузией размороженной миеловзвеси реципиенту . Полученные данные о сохранности пролиферативной способности миелоидной ткани, взятой от трупов внезапно скончавшихся людей, подтверждают целесообразность резервирования посмертного костного мозга для клинического применения. Использование диметилацетамида - криопротектора отечественного производства позволяет создавать долгосрочные запасы ("банки") криоконсервированной миелоидной ткани в интересах экстремальной медицины.

Полученные в ходе исследования материалы использованы при подготовке отчета по теме НИР 100-95-пб "Обоснование системы долгосрочного хранения запасов гемотерапевтических средств, их транспортировки и применения в военное время"; применяются в практической деятельности НИЛ - Центра крови и тканей Военно -медицинской академии; используются при проведении лекций и практических занятий для слушателей академии. Материалы исследований по разработке метода криоконсервирования костного мозга с ДМАЦ направлены в Фармакологический комитет МЗМП РФ для получения разрешения на клинические испытания.

Апробация работы.

Результаты научных исследований доложены на XX Ежегодном конгрессе ЕВМТ (Харрогейт,1994), XVIII симпозиуме Международной ассоциации исследования лейкемии и родственных заболеваний (Дублин, 1994), XXI Ежегодном конгрессе ЕВМТ,(Давос, 1995), Российс-

кой конференции "Актуальные вопросы службы крови и гематологии" (СПб.,1995), Конференции "Актуальные вопросы клиники диагностики и лечения" (СПб., 1995), Всеармейской научной конференции "Актуальные вопросы гематологии" (ВМедА.,1995), П-ой международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии" (Ялта - Гурзуф, 1996).

Основные материалы исследований опубликованы в 13 печатных работах. Оформлены 4 рационализаторских предложения (й 4824/5/94Г., 4825/5/94Г., 4826/5/94Г., 4828/5/94Г.).

Структура и обьем работы.

Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Текст иллюстрирован 27 таблицами и 6 рисунками. Указатель литературы включает 154 источника, в том числе 73 отечественных и 81 иностранных работ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Костный мозг мышей, криоконсервированный с 3% раствором ДМАЦ, сохраняет высокую биологическую полноценность.

2. Хладоограждавдэя способность 3% раствора ДМАЦ при крио-консервировании костного мозга гематологических больных и посмертного костного мозга, соответствует криофилактической способности 10% раствора ДМСО.

3. При хранении посмертного костного мозга, криоконсервиро-ванного с 3% раствором ДМАЦ, в жидком азоте (- 196° С) функциональная способность миелокариоцитов сохраняется в течении 10 лет (срок наблюдения).

- 6 -СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и ыетоды исследования

Материалом исследований была костномозговая взвесь мышей, гематологических больных и трупов скоропостижно умерших людей, обработанная 3% раствором диметилацетамида с последующим замораживанием при - 196° С. ДМАЦ использовали для изучения его крио-защитных свойств при замораживании и хранении миеловзвеси.

Работа проводилась в два этапа. На первом этапе исследовали функциональную полноценность костного мозга мышей, криоконсерви-рованного под защитой 3% раствора ДМАЦ, а так же токсичность ДМАЦ. На втором этапе изучали функциональную способность костного мозга гематологических больных и миеловзвеси трупов скоропостижно скончавшихся людей, криоконсервированных при - 196° С под защитой 3% раствора ДМАЦ , а также влияние диметилацетамида на жизнеспособность костного мозга при 18 * 20° С в сравнении с 10£ раствором диметилсульфоксида.

Экспериментальное изучение лечебной эффективности трансплантации костного мозга, криоконсервированного под защитой 3% раствора диметилацетамида, проведено на 140 мышах линии (C57BL х CBA)-F-1. Исследование токсических свойств диметилацетамида проведено на 40 мышах. Характеристики групп экспериментальных животных представлены в таблицах 1,2.

Способ получения костномозговых клеток заимствован с видоизменениями из работы Бутомо Н.В. (1970).

Мышей - доноров забивали путем введения воздуха в v.penis. Костный мозг из канала бедренной кости вымывали в стерильный сосуд. Для вымывания использовали консервирующий раствор ЦОЛИПК-З. В качестве исходной клеточной суспензии использовали миеловзвесь содержащую 0,4 х 10б клеток в 1 мл. Дозу суспензии клеток делили

Таблица 1

Характеристика опытов на животных по изучению токсичности ДМАЦ

1 ¡Группа животных 1 1 I Количество! | животных | 1 | Количество введенного ДМАЦ, г/кг |

|Первая группа 1 1 1 ю | 1 | 0,75 |

I Вторая группа I 1 1 ю | 1 1 1.5 |

I Третья группа 1 1 1 10 | 1 1 4,5 |

|Интактные животные (кон- I трольная) | 1 1 1 1 1 10 | 1 ! 1 1 1

Таблица 2

Характеристика исследования лечебной эффективности миелотрансплантации

1 IГруппа животных 1 !Количество | животных 1 1 1 | Характеристика группы 1 1 1 1 |

¡Первая (опытная) 1 I 60 1 1 1 1 I Реципиенты криоконсервирован-| | ного костного мозга | 1 |

I Вторая (опытная) 1 | 60 1 1 г 1 I Реципиенты свежезаготовлен-| | ного костного мозга | 1 |

I Третья (конт -I рольная) 1 | 10 1 I 1 1 | Облученные животные, не залщ-| | щенные миелотрансплантацией | 1 |

I Четвертая (конт- 1 рольная) 1 1 | 10 1 1 1 1 | Интактные животные | 1 1 .1 -------------------.1

на две части. Одну порцию разбавляли консервантом ЦОЛИПК-З до концентрации клеток 0,2 х Ю6 в 1мл и вводили смертельно облученным мышам второй опытной группы через два часа после воздейс-

твия ионизирующего облучения. Общее облучение животных осуществляли одномоментно с помощью установки ГУТ - Со - 600 м в дозе 1009 рад. Другую порцию смешивали с ЗХ раствором диметилацетами-да и подвергали криоконсервированию. Для приготовления раствора криопротектора использовали следующие ингредиенты:

- диметилацетамид - б мл,

- глюкоза - 10 г,

- трилон Б - 0,1 г,

- вода для инъекций до 100 мл.

Замораживание производили на аппарате программного замораживания биологических объектов ЗПВ 00.00.00., разработанным в НИИ Проблем криобиологии и криомедицины АН УССР.

Лечебную эффективность трансплантации костного мозга у животных оценивали по:

- выживаемости животных до 8-го дня после облучения;

- весу животных;

- величине селезеночного индекса;

- результатам гистологического исследования селезенки;

- пролиферативной активности гемопоэтических клеток;

Селезеночный индекс определяли по формуле:

вес селезенки х 100 вес мыши

При гистологическом исследовании оценивали состояние ткани селезенки, тип и размеры кроветворных колоний определяли отношение площади кроветворных колоний к общей площади гистологического среза селезеночной ткани.

Пролиферативную активность ("трансплантационный потенциал") отдельных образцов костного мозга определяли методом экзогенного клонирования клеток предшественников гемопоэза методом Till &

Мс.Си11осЬ (1961).

При изучении токсичности ДМАЦ оценивали переносимость диме-тилацетамида при внутривенном введении. За животными наблюдали в течении 10 суток обращая внимание на их физическую активность, отношение к пище. О токсичности ДМАЦ судили также по результатам гистологических исследований внутренних органов мышей (селезенки, печени, легких, сердца, почек).

Изучение криофилактической активности ДМАЦ в сравнении с 10% раствором ДМСО при замораживании миелоидных клеток человека было выполнено при криоконсервировании костного мозга гематологических больных и посмертного костного мозга.

Аутологичный костный мозг получали от 7 гематологических больных, готовящихся к миелотрансплантации, аспирационным способом под общей анастезией из гребней и задней части крыльев повз-дошных костей в соответствии с требовании "Руководства по военной трансфузиологии"(1991). Всего исследовано 15 образцов ауто-логичного костного мозга. Посмертный костный мовг заготавливали от 15 внезапно скончавшихся людей в возрасте от 17 до 43 лет.

Фракционирование костного мозга осуществляли с использованием высокомолекулярного декстрана (полиглюкина).

Из каждого образца костного мозга отбирали по 20 мл клеточной суспензии, которую делили на две равные части. Одну "часть криоконсервировали с 3% раствором ДМАЦ, вторую - с 10% раствором ДМСО.

Для изучения возможности длительного хранения миелоидной ткани, криоконсервированной под защитой 3% раствора ДМАЦ, исследована жизнеспособность 18 образцов посмертного костного мозга, замороженного с диметилацетамидом и сохраняемого в жидком азоте в течении 10 лет (срок наблюдения).

Для изучения сохранности костномозговых клеток и их морфологической полноценности применяли следующие методы:

1. Подсчет количества ядросодержащих клеток в одном микролитре клеточной суспензии.

2. Подсчет миелограмм. Миелограммы составляли на основании определения 200 форменных элементов костномозговой взвеси. Мазки окрашивали по Лейшману. За норму принимали показатели клеточного состава костного мозга по Соколову В.В. и Грибовой И.А.

3. Определение жизнеспособности. Жизнеспособность миелока-риоцитов определяли путем сулравитальной окраски по методу Schrek R. (1963). Процент жизнеспособных клеток в исследуемой пробе высчитывали по формуле:

а хЮО а + б

где, а - количество неокрашенных клеток б - количество окрашенных клеток

Жизнеспособность клеток костного мозга определяли также методом люминисцентной микроскопии, способом витального флюорохро-мирования жидких препаратов. В качестве флюорохрома применяли акридин оранжевый. Исследование препарата выполняли с помощью люминисцентного микроскопа МЛ-2.

4. Исследование функциональной полноценности костного мозга.

В настоящей работе использовали метод клонирования КОЕ - ГМ в системе "агаровый квадрат" (Раков A.A. и соавт. 1990).

При подсчете количества образовавшихся агрегатов к кластерам относили клеточные конгломераты, в которых насчитывалось менее 20 клеток. Колониями считали конгломераты, образованные двадцатью и более клеточными элементами.

Цифровой материал проанализирован методами математической статистики на персональном компьютере IBM PC с использованием пакетов прикладных программ Бxel - 5 фирмы Microsoft.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При наблюдении за животными, которым был введен раствор ди-метилацетамида не выявлено каких - либо изменений в их поведении. После введения криофилактика мыши всех опытных групп были подвижны, их поведение, внешний вид, отношение к пище не отличались по сравнению с контрольной группой. Масса тела животных опытных групп (22,5 t 1,8 г) через 10 дней после последней инфу-зии препарата соответствовала показателям контрольной группы (23,8 ± 2,4 г, р > 0,05).

При макроскопическом исследовании внутренних органов (селезенки, сердца, печени, почек) изменений не обнаружено.

В результате гистологических исследований у большинства животных опытной группы в красной пульпе селезенок выявлена незначительная гиперплазия гранулоцитарного, зритроидного и мегакари-оцитарного ростков кроветворения. Белая пульпа была представлена крупными лимфоидными фолликулами. Основную их массу составляли малые и средние лимфоциты.

В печени, по сравнению с интактными мышами, отмечено увеличение лимфоидных и гистиоцитарных инфильтратов, расположенных в перипортальной соединительной ткани и внутри печеночных долек. В составе некоторых инфильтратов обнаружены клетки гранулоцитарного ростка различной степени зрелости, которые расценивались нами как очаги экстрамедуллярного кроветворения.

В легких выявлены утолщения межальвеолярных перегородок за счет инфильтрации моно - и полинуклеарными клетками.

В почках и мышце сердца опытных животных интенсивность лим-

фогистиоцитарных инфильтратов не отличалась от интактных мышей.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что однократное введение ДМАЦ в дозе 1,5 г/кг, а так же инфузия ди-метилацетамида в количестве 1,5 г/кг трехкратно с интервалами 10 суток не оказывали токсического влияния на организм мышей. Развитие экстрамедуллярных ростков кроветворения в" селезенке, печени и легких после введения диметилацетамида может быть связано со стимулирующим действием препарата на гемопоэз.

В ходе экспериментального изучения лечебной эффективности пересадки костного мозга, криоконсервированного с Ж раствором ДМАЦ, установлено, что общее облучение мышей в дозе 1009 рад без последующей миелотрансплантации вызывало выраженное лучевое поражение. В группе облученных мышей, не защищенных пересадкой костного мозга (контрольная группа), к девятому дню выжило 50% особей..Масса тела выживших животных (табл.3) была значительно меньше при сравнении с животными интактной группы (р < 0,05). Выраженные признаки лучевой болезни также были выявлены в результате исследования селезенок животных. Так, вес селезенки и величина селезеночного индекса облученных животных были значительно меньше соответствующих показателей интактных мышей (р < 0,05). При макроскопическом исследовании селезенок контрольной группы мышей наблюдали выраженную атрофию и пониженный тургор селезеночной ткани. Видимых кроветворных колоний не обнаружено.

Напротив, проявления лучевой болезни у мышей - реципиентов костного мозга были значительно менее выражены. Выживаемость мышей - реципиентов изологичного костного мозга , криоконсервированного с ДМАЦ, (87%) и реципиентов свежезаготовленного изоген-ного костного мозга (95%) значительно превышала соответствующие

показатели в группе облученных животных, не получивших инфузии костномозговой взвеси (50%). Установлено, что масса тела и вес

Таблица 3

Показатели эффективности трансплантации костного мозга у летально облученных мышей (М ± ш)

1 1 I Показатели 1 I i

| Группа 1 1 I вес | вес селезе- коли- |

| животных п | мыши | селезенки ночный чество [

1 Сгр) | (мг) индекс колоний|

I 1 та в селе-|

1 1 1 | зенке |

[Реципиенты крио- 1 I | *| * ■к *(

|консервированно- 52 |22,7±0,5[ 37,7±2,6 0,19+0,1 О с: | W , О -1 , Э j

го с 3% ДМАЦ 1 1

[костного мозга 1 1 1 I

¡Реципиенты све- 1 I ! *1 * *!

|жезаготовленного 57 [23,8+0,61 37,1+2,01 0,15+0,01 9,5+1,3 |

[костного мозга 1 ! 1 1 1

|Контрольная 5 1 1 [18,7+0,61 27,0+ 1,6 0,14±0,01 1

|группа 1 1 1 I

1 1 1 *1 А *

|Интактные мыши 1 10 [23,5+0,71 I 1 183,0+8,0 0,6+0,06 1 1 1

* - р < 0,05 при сравнении с контрольной группой

селезенок реципиентов криоконсервированного костного мозга и свежезаготовленной миеловзвеси превышала аналогичные показатели в контрольной группе мышей (р < 0,05, табл. 3). Величина селезеночного индекса в группе реципиентов криоконсервированного костного мозга оказалась больше, чем у животных, которым проводили

инфузии свежезаготовленной костномозговой взвеси (р < 0,05). При этом, величины вышеуказанных показателей у опытных животных были значительно ниже, чем у необлученных мышей (р < 0,05). При макроскопическом исследовании селезенок у большинства животных обнаружены колонии зкстрамедуллярного кроветворения. Количество колоний в селезенках животных - реципиентов криоконсервированно-го костного мозга (8,8 ± 1,5) не отличалось существено от соответствующих показателей реципиентов свежезаготовленного костного мозга (9,5 ± 1,3, р > 0,05). Следует подчеркнуть, что экзогенный характер колоний подтверждало их отсутствие при исследовании селезенок интактных мышей и животных, не получивших после облучения трансплантации костного мозга.

Данные гистологических исследований свидетельствовали о том, что кроветворение в селезенках реципиентов криоконсервиро-ванного костного мозга не отличалась при сравнении с животными, которым была проведена пересадка свежезаготовленного костного мозга . Так, в девяти срезах из 10 исследованных гистологических препаратов селезенок мышей, защищенных изогенным криоконсервиро-ванным миелотрансплантатом, выявлены колонии эритроидного, мие-лоидного и мегакариоцитарного типов.

Результаты исследования интенсивности кроветворения в селезенках показали, что величина относительной площади кроветворных колоний у реципиентов криоконсервированного костного мозга (26,67 ±1,5%) значительно превышала показатели в группе животных - реципиентов свежезаготовленного костного мозга (20,45 ± 2,0, р < 0,05).

Более выраженная интенсивность кроветворения в селезенках мышей, получивших пересадку костного мозга без предварительного удаления криопротектора, подтверждает гемостимулирующий эффект

диметилацетамида.

Для изучения влияния сроков заготовки на жизнеспособность посмертного костного мозга, нами была проведена сравнительная оценка морфофункциональной полноценности миелоидных клеток, заготовленных через 2, 4 и 8 часов с момента смерти. Содержание ядерных клеток в образцах костного мозга, взятых от трупов через 8 часов с момента смерти (21,9 ± 5,0 тыс/мкл) не отличались существенно от количества миелокариоцигов в костном мозге, заготовленном через 2 часа после смерти (24,3 ± 5,5 тыс/мкл, р > 0,05). Изучение жизнеспособности клеток методом суправитального окрашивания по Шреку показало, что количество морфологически сохранных миелокариоцитов в костном мозге, полученном через 2 часа с момента смерти (81,5 t 6,5%), соответствовало аналогичным показателям свежезаготовленного аутологичного костного мозга гематологических больных (85,5 ±8,5% р > 0,05). Показатели жизнеспособности костного мозга, заготовленного через 4 часа (63,0 ± 5,0%) и 8 часов (58,0 ± 7,5%) были значительно снижены при сравнении с миеловзвесью, полученной от трупов через 2 часа (р < 0,05). Результаты экзогенного клонирования колониеобразую-щих единиц грануломоноцитопозза (КОЕ) показали, что трупный костный мозг, заготовленный в период 8 часов с момента смерти, сохранял высокий пролиферативный потенциал. Его колониеобразую-щая способность КОЕ - ГМ во всех трех группах находилась в пределах нормальных величин. Однако в образцах костного мозга, ас-пирированного через 4 и 8 часов после смерти содержание колони-еобразующих клеток (38,5 ± 6,5 и 18,75 ± 3,0 К0С/2Х105 ядерных клеток) было существенно ниже при сравнении с костным мозгом, заготовленным через 2 часа с момента смерти (66,25 ± 4,0, р < 0,05). Это свидетельствует о прогрессивном снижении функциональ-

ной способности кадаверного костного мозга при увеличении сроков его заготовки.

В связи с тем, что в процессе подготовки к криоконсервиро-ванию от момента добавления к миеловзвеси криозащитного раствора и начала замораживания проходит определенный временной промежуток, нами было изучено влияние криозащитных растворов на жизнеспособность миелокариоцитов при положительных температурах (18 * 20° С). Установлено, что количество и морфологическая сохранность клеток кадаверного костного мозга и костного мозга гематологических больных после инкубации с 3% раствором ДМАЦ и 10% раствором ДМСО существенно не отличались от исходных показателей (р > 0,05). Пролиферативная способность клеток под влиянием обоих криофилактиков значительно снижалась. Количество колониобра-зующих единиц в посмертном костном и костном мозге гематологических больных после инкубации с ДМАЦ снизилось на S5Z и 44Х, а с ДМСО на 40% и 39£ соответственно. В то же время,, колониеобра-зуюидае способности костного мозга, инкубированного с ДМАЦ и ДМСО, достоверно не различались.

Сравнительное изучение криозащитной активности 3% раствора ДМАЦ и 10% раствора ДМСО было проведено на 15 образцах посмертного костного мозга и 15 образцах костного мозга гематологических больных, криоконсервированных под защитой указанных криопро-текторов и сохраняемых при температуре - 196° С в течении 1,5 месяцев. Результаты исследования представлены в табл.4,5.

Сравнение было проведено между показателями жизнеспособности костного мозга до замораживания с криофилактиками и после отогрева без отмывания криозащитных растворов.

В образцах посмертного костного мозга, криоконсервированно-го под защитой 31 раствора ДМАЦ количество миелокариоцитов после

отогрева существенно не отличалось от исходных показателей (табл.4, р > 0,05). Содержание эозин - резистентных клеток в декриоконсервированных образцах миелоидной ткани было снижено и составило 77,0% от их количества в образцах до замораживания (р < 0,05). Колониеобразующая способность КОЕ - ГМ в костном мозге после отогрева была достоверно ниже таковых показателей перед замораживанием (р < 0,05) и составила 50% от первоначальной

Таблица 4

Влияние ДМАЦ (I) и ДМСО (11) на морфофункциональную полноценность криоконсервированного посмертного костного мозга

(М ± ш)

1 I Показатели Образцы костного 1 мозга!

до замораживания после отогрева |

1 ....... I (п=15) III (п=15) 1 I (п=15) 1 II (П=15)|

(Количество клеток I тыс/мкл 1 1 41,0 ± 6,0142,0 ± 4,5 1 36,0±4,0 38,0± 6,0|

| Морфологическая |сохранность клеток 1 (%) 1 1 75,75± 7,0172,75+ 8,5 1 * 58,5 ±5,0 53,0± 2.5|

IКолониеобразующая 1 1

| способность: 1 * *1

| - КОС, ед 28,0 + 3,0|26,0 ± 5,0 14,0±2,5 12,0± 3,5|

| - КлОС, ед | 75,0 ± 8,5|64,0 +12,0 | 73,0±10,5 60,0+ 6,0| I

* - р < 0,05 при сравнении с показателями до замораживания

величины. Кластерообразующая способность (КлОС) клеток - пред-

шественников грануломоноцитопоэза до замораживания и после оттаивания существенно не различались (р > 0,05).

Анализ результатов исследования влияния диметилсульфоксида показал, морфологическая сохранность клеток костного мозга, кри-оконсервированного с ДМСО, после отогрева по данным эозиновой пробы составила, в среднем, 73% от исходных показателей (р < 0,05, табл. 4). Колониеобразующая способность КОЕ - ГМ в костном мозге, криоконсервированном с 10% ДМСО, существенно снизилась и составила 46% от исходных величин.

В результате исследования морфофункциональной полноценности образцов костного мозга, взятого у гематологических больных, установлено, что криоконсервирование под защитой ЗХ раствора ДМАЦ не вызывало снижение количества миелокариоцитов в костномозговой суспензии (табл. 5). Однако содержание морфологически полноценных клеток по данным эозиновой пробы уменьшилось на 23% (р < 0,05). Такие же данные были получены при подсчете эозин - резистентных клеток в костном мозге, криоконсервированном с ДМСО. Криоконсервирование костного мозга с ДМАЦ не вызывало существенного снижения пролиферативной активности клеток. Содержание КОЕ - ГМ в декриоконсервированном костном мозге составило 90% от их исходного количества. При сравнении колониеобразующей способности миелокариоцитов, криоконсервированных с ДМАЦ с аналогичными показателями костного мозга, криоконсервированного под защитой ДМСО достоверных различий не выявлено.

Таким образом, хладоограждающая способность ДМАЦ по отношению к аутологичному и посмертному костному мозгу не отличается существенно от криофилактического эффекта ДМСО. Более высокая сохранность КОЕ - ГМ в аутологичном костном мозге по сравнению с посмертным костным мозгом, по - видимому, можно объяснить боль-

Таблица 5

Влияние ДМАЦ (I) и ДМСО (II) на морфофункциональную полноценность криоконсервированного костного мозга гематологических

больных (М ± ш)

1 I

Образцы костного мозга

Показатели

до замораживания после отогрева

-1-1-1-

I (п=15) III (п=15) 1 I (п=15)111 (п=15)

Количество клеток тыс/мкл

35,5 ± 4,5132,5 ± 4,0|32,0 ±3,0]29,5± 5,5 -1-1-1-

Морфологическая сохранность клеток (%)

I |*|*

87,5 ± 6,5(81,5 ± 5,0167,5 ±5,5166,0+ 4,0

Колониеобразующая способность:

- КОС, ед

- КлОС, ед

22,0 ± 5,5|24,0 ± 4,0(20,0± 4,0(19,0± 3,5 55,0 ± 9,5161,0 ±12,0|47,0± 7,5|56,0± 6.0

_I_I_I-

* - р < 0,05 при сравнении с показателями морфофункцио-нальной полноценности образцов костного мозга до замораживания

шей чувствительностью кадаверных клеток к криоповреждающим факторам.

При изучении посмертного костного мозга, замороженного под защитой диметилацетамида до - 196° С и заложенного на хранение 10 лет тому назад установлено, что содержание нуклеаров в оттаянных образцах (18,5 ± 4,5 тыс/мкл) существенно не изменилось

при сравнении с исходными показателями (22,0 ± 7,0 тыс/мкл, р > 0,05). Содержание эозин - резистентных клеток (51,5 ± 8,0%) снизилось на 30% (р < 0,05). однако, существенно не отличалось от их количества (58,5 ± 5,0%) в костном мозге, криоконсервирован-ном в течении 1,5 месяцев (р > 0,05). Данные люминисцентной микроскопии, в целом, соответствовали результатам, полученным при исследовании жизнеспособности методом Шрека. Количество "нормальных" клеток было снижено на 40Х при сравнении с их содержанием в миеловзвеси перед замораживанием (р < 0,05).

Показатели КОС костного мозга после 10 лет его хранения находилось в пределах нормальных величин (9,0+2,0 на 2 х 105 ядерных клеток) и не отличались существенно от КОС костного мозга после 1,5 месяцев хранения (14,0 ± 3,0, р 0,05, табл. 13). Однако кластерообразующая способность была в 3,6 раза ниже (20,0 ± 4,0/2 х Ю5 ядерных клеток), чем миелоидной ткани, криоконсер-вированной в течении 1,5 месяцев (73,0 ± 10,5, р < 0,05).

Таким образом, в трупном костном мозге, криоконсервирован-ном под защитой ДМАЦ, в процессе длительного хранения (10 лет) происходит снижение некоторых показателей морфофункциональной полноценности клеток. При этом существенных различий между содержанием нуклеаров и эозин - резистентных клеток при сравнении с костным мозгом, криоконсервированным 1,5 месяца не обнаружено. Выявленная нами нормальная пролиферативная активность клеток -предшественников грануломоноцитопоэза подтверждает достаточно высокую степень морфофункциональной полноценности костного мозга, криоконсервированного под защитой ДМАЦ в течении 10 лет.

ВЫВОДЫ

1. Метод криоконсервирования костного мозга под защитой 3% раствора диметилацетамида позволяет сохранять при - 196° с в те-

чении 1,5 месяцев до 90% КОЕ - ГМ костного мозга гематологических больных и до 50% КОЕ - ГМ посмертного костного мозга.

2. Криозащитная активность 3% раствора ДМАД при замораживании до - 196° С костного мозга гематологических больных и посмертного костного мозга С. соответствует криозащитной способности 10% раствора ДМСО.

3. В эксперименте на смертельно облученных мышах выявлена высокая биологическая полноценность костного мозга, криоконсер-вированного с 3% раствором диметилацетамида.

4. Введение ДМАЦ в дозе 1,5 г/кг трехкратно с интервалом в 10 дней не оказывает токсического воздействия на организм мышей по данным гистологического исследования сердца, легких, печени, селезенки животных

5. Инкубация костного мозга с 3% раствором ДМАЦ и 10% раствором ДМСО при 18 * 20° С приводит к понижению колониеобразующей способности клеток - предшественников грануломоноцитоопоэза в одинаковой мере.

6. Посмертный костный мозг, криоконсервированный при - 196° С под защитой 31 раствора ДМАЦ, сохраняет жизнеспособность в течение 10 лет (срок наблюдения).

7. Посмертный костный мозг, взятый от трупов скоропостижно скончавшихся людей не позднее 8 часов с момента смерти, является перспективным источником получения большого количества биологически полноценных стволовых клеток.

8. Критериями функциональной полноценности аутологичного миелотрансплантата могут служить количество ядерных клеток и содержание колониеоСразующих клеток КОЕ - ГМ в заготовленном костном мозге.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для криоконсервирования костного мозга под защитой диметилацетамида с целью его последующего клинического примене,-ния следует использовать криофилактический раствор следующего состава:

- вода для инъекций до 100 мл.

Непосредственно перед началом криоконсервирования исходный раствор необходимо развести аутологичной плазмой в соотношении 1:3 для получения рабочего раствора 6% концентрации. Полученный криофилактический раствор смешивают с концентратом костномозговых клеток в равных пропорциях (1:1). Конечная концентрация ДМАЦ в костномозговой взвеси должна составлять 3%.

2. Замораживание костного мозга с ДМАЦ необходимо проводить по трехзталному режиму:

1 этап - от + 4° С до начала кристаллизации со скоростью 1° С/мин;

2 этап - от момента окончания кристаллизации до -150° С со скоростью 5 - 10° С/мин;

3 этап - погружение в жидкий азот.

3. Необходимо стремиться к максимально возможному сокращению времени эквилибрации костного мозга с криофилактиком до начала замораживания. Время инкубации миеловзвеси с криопротекто-ром при положительной температуре не должно превышать 15 мин. Оттаивание костного мозга перед реинфузией следует проводить непосредственно у постели больного. При этом оттаивание каждого последующего контейнера с миеловзвесью может быть начато только

- диметилацетамид

- глюкоза

- трилон Б

24 мл

- 40 гр.

- 0,4 гр.

после окончания трансфузии предшествующей дозы костномозговой взвеси. Трансфузию оттаянной миеловзвеси следует проводить без отмывания диметилацетамида.

4. Посмертный костный мозг для клинического применения следует заготавливать от трупов скоропостижно скончавшихся людей не позже, чем через 8 часов с момента смерти.

5. Для оценки качества миелотрансплантата целесообразно определять содержание миелокариоцитов и количество колониеобразую-ших клеток предшественников - грануломоноцитопоэза в костномозговой взвеси.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тюрин Р.В., Петренко Г.И., Багаутдинов Ш.М. и соавт. Метод криоконсервирования костного с диметилсульфоксидом (ДМСО) // Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследований и клинической практике. Выпуск 25. - СПб.,1994. - С.4-5.

2. Булатов И.К., Тюрин Р.Б., Петренко Г.И. Способ оценки жизнеспособности аутологичного костного мозга // Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследований и клинической практике. Выпуск 25. - СПб.,1994. - С.15.

3. Тюрин Р.В., Игнатович Г.П., Петренко Г.И. Способ фракционирования костного мозга // Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследований и клинической практике. Выпуск 26. - СПб.,1995. -С.84.

4. Ващенко В.И., Ващенко Т.Н., Тюрин Р.В. Биологическая

оценка функционального состояния посмертного костного мозга до и после криоконсервирования // Актуальные вопросы клиники диагностики И лечения. - СПб.: Б.И., 1995. - 230-234.

5. Данильченко В.В., Сидоркевич C.B., Капеко С.П., Вагаут-динов Ш.М., Петренко Г,И., Тюрин Р.В., Вельянинов В.Н. Организация банков низкотемпературного консервирования клеток крови и костного мозга // Актуальные вопросы службы крови и трансфузио-логии. - СПб. - 1995. - С.56.

6. Данильченко В.В., Калеко С.П., Багаутдинов Ш.М., Петренко Г.И., Тюрин Р.В. и соавт. Сравнительная оценка различных способов криоконсервирования // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии. - СПб. - 1995. - С.237.

?. Ващекко В.И., Вааенкс Т.Н., Тюрин Р.В., Киселева M.B. Сравнительная оценка сверхспиральной ДНК и колониеооразукжрй способности посмертного костного мозга // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии. - СПб. - 1995. - С.239.

8. Данильченко В.В., Тюрин Р.В., Богданов А.Н. и соавт. Ге-мокомпонентная терапия у больных после аутомиелотранспланта-ции // Актуальные вопросы гематологии. - СПб.: Б.и., '1М95.

С.67.

9. Данильченко В.В., Калеко С.П., Тюрин Р.В. и соавт. Опыт работы банка криоконсервированного костного мозга // Актуальные вопросы гематологии. - СПб.: Б.и., 1995. - С.113.

10. Мазуров В.И., Богданов А.Н., Климко H.H., Мельниченко В.Я., Максимов Г.А., Волошин C.B., Петренко Г.И., Гусев C.B., Тюрин Р.В. Значение миелотрансплантации в комплексном лечении гемобластозов // Актуальные вопросы гематологии. - СПб.: Б.и., 1995. - С.72.

11. Danilchenco v.v., Kaleko S.P., Bagautdinov Sh.M., Pet-

renco G. I., Tyurin R. V., Kiselova M. V. (Данильченко В. В., Калеко С.П., Багаутдинов Ш.М., Петренко Г.И., Тюрин Р.В., Киселева М.В.) Colony forming ability of a cadaver bone marrow kept for a long time at temperature of - 196° С // Bone Marrow Transplantation. - 1994. - Suppl. - P.108, A-55.

12. Petrenco G.I., Kaieko S.P., Tyurin R.V. et al. (Петренко Г.И., Калеко С.П., Тюрин Р.В. и соавт.) Experimental investigation of bone marrow cryopreseved with 3%. Dimethylacetamid // The XVIII Symposium of the International Association for Comparative Research on leukemia and related disease. - 1994. - Dublin.

13. Tyurin R.v., Petrenco G.I., Kiselova M.V. et al. (Тюрин P.В., Петренко Г.И. Киселева М.В. и соавт.) Comparative analysis of effectiveness for two methods of bone marrow cryopre-servation // Bone Marrow Transplantation. - 1995. - Suppl. -A-221.