Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Совершенствование методов долгосрочного хранения крови и костного мозга в замороженном состоянии в Службе Крови Вооруженных Сил

гй'Г-

'Л На пРавдх рукописи

БАГАУТДИНОВ Шамиль Мутаяабович

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДОЛГОСРОЧНОГО ХРАНЕНИЯ КРОВИ И КОСТНОГО МОЗГА В ЗАМОРОЖЕННОМ СОСТОЯНИИ В СЛУЖБЕ КРОВИ ВООРУЖЕННЫХ СИЛ

Специальность: 14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в Военно-медицинской академии

Научный консультант: доктор медицинских наук Е.Б.Жибурт

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор К.Я.Гуревич доктор медицинских наук профессор С.А.Матвеев доктор медицинских наук профессор В.Н.Мельникова

Ведущая организация - Санкт-Петербургская государственная медицинская академия последипломного образования

часов на заседании диссертационного совета Д 084.19.01 при Российском НИИ гематологии и трансфузиологии (193024, Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского НИИ гематологии и трансфузиологии.

Автореферат разослан ^993 года

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА

Защита состоится «

$998 года в "—

кандидат медицинских наук

В.С.БЫКОВ

Переливание крови, ее компонентов и препаратов является важнейшим средством в профилактике и коррекции анемического, геморрагического и иммунодефицитного синдромов. Совершенствование специализированных методов лечения в военных лечебных учреждениях предусматривает увеличение потребности в компонентах и препаратах крови. Особенно резко возрастает необходимость одномоментного использования большого количества гемотрансфузионных средств в рамках медицины катастроф - при возникновении очагов массовых санитарных потерь вследствие техногенных, социальных, стихийных и экологических бедствий, увеличение числа которых наблюдается в последние десятилетия.

Препятствием к накоплению запасов гемотрансфузионных сред, применяемых в повседневной практике, является их ограниченный срок хранения. В первую очередь, к компонентам периферической крови, срок хранения которых ограничен, а их потребность в экстремальных ситуациях резко возрастает, относятся эритроциты (срок хранения в жидком виде - 21-35 суток) и тромбоциты (срок хранения в жидком виде - 1-3 суток). Наличие технологии длительного хранения этих клеток крови позволяет создать: а) массивный запас аллогенных донорских сред; б) банк клеток с редкими фенотипами; в) запас аутологичных гемокомпонентов.

Особое значение имеет хранение клеток-предшественников гемопоэза: костного мозга и стволовых клеток периферической крови. Согласно современным представлениям о трансплантации гемопоэтических тканей наиболее эффективным при депрессии кроветворения следует признать пересадку полноценных аутологичных, сингенных или максимально совместимых аллогенных клеток-

предшественников гемопоэза. Технологии длительного хранения

позволяют создать банк аутологичных клеток-предшественников гемопоэза у контингентов с высоким риском лучевого поражения, либо пациентов, получающих лучевую или высокотоксичную цитостатическую химиотерапию.

Единственным путем длительного хранения полноценных клеток системы крови для лечебного применения в настоящее время является их хранение в замороженном виде под защитой специальных средств - криопротекторов. Современные морозильники обеспечивают широкий диапазон низких и сверхнизких температур (от -65°С до -196°С) и позволяют хранить компоненты крови до 10 лет и более. Технология криоконсервирования должна предусматривать регламент заготовки и приготовления компонента крови, его смешивания с криопротектором, программного замораживания, контроля режима хранения, оттаивания, отмывания, транспортировки и лечебного применения. В настоящее время имеется ряд таких технологий, внедренных за рубежом и отчасти регламентированных в России, однако имеется ряд проблем, решение которых требует углубленной научной разработки:

- повышение эффективности имеющихся криопротекторов;

- разработка методов хранения тромбоцитов при низких (порядка -65°С) температурах;

- разработка регламента изменения температурного режима хранения замороженных гемокомпонентов;

- изучение криопротекторов для хранения в замороженном виде клеток-предшественников гемопоэза.

В учреждениях службы крови Вооруженных Сил России создана система банков крови, оснащенных оборудованием с использованием жидкого азота и злеткрорефрижераторами с возможностью изменения температуры от -40°С до -196 °С. Фактором, сдерживающим формирование запасов

гемотрансфузионных сред длительного хранения, является несовершенство технологий криоконсервирования.

Целью работы является оптимизация программ долгосрочного хранения крови и костного мозга в замороженном состоянии в Вооруженных Силах.

В задачи исследования входит:

1. Изучение эффективности и разработка оптимальных режимов криоконсервирования эритроцитов под защитой различных криопротекторов при температуре -80°С и -196°С.

2. Изучение эффективности и выбор оптимальных режимов криоконсервирования тромбоцитов под защитой диметилацетамида (ДМАЦ) при температуре -80°С и -196°С.

3. Изучение эффективности и выбор оптимальных режимов криоконсервирования клеток-предшественников гемопоэза под защитой ДМАЦ при температуре -196°С.

Научная новизна

Разработан способ криоконсервирования эритроцитов с использованием 18,5% пропиленгликоля и 5% ДМАЦ при температуре -80°... -140°С. Доказана возможность долгосрочного хранения эритроцитов при температуре -80°... -140°С с использованием криопротектора на основе 1,2-пропандиола и ДМАЦ в стандартных полимерных гемоконтейнерах отечественного производства.

Разработан эффективный метод низкотемпературного консервирования тромбоцитов при -80°С с 2,5% раствором диметилацетамида. Впервые показана возможность замораживания кровяных пластинок в электрохолодильнике до -80°С в отечественных полимерных контейнерах без использования аппарата программного замораживания. Установлено, что тромбоцитоконцентраты, консервированные при -80°С, по своим морфофункциональным характеристикам

¿3. /2??

превосходят концентраты тромбоцитов, криоконсервированные при -196°С. Впервые выявлена более высокая морфофункциональная сохранность клеток при

низкотемпературном консервировании тромбоцитоконцентратов, заготовленных с помощью аппаратов-фракционаторов крови, чем концентратов кровяных пластинок, полученных способом дифференцированного центрифугирования консервированной донорской крови.

Выявлена высокая эффективность криоконсервирования костного мозга под защитой 3% раствора диметилацетамида. Впервые в эксперименте на смертельно облученных мышах установлена лечебная эффективность пересадки костного мозга, криоконсервированного с 3% раствором диметилацетамида. Выявлено, что при криоконсервировании костного мозга хладоограждающая способность 3% раствора ДМАЦ соответствует криофилактической активности 10% раствора ДМСО. Доказано, что посмертный костный мозг, криоконсервированный под защитой 3% раствора ДМАЦ при -196°С, сохраняет функциональную полноценность после 10 лет хранения (срок наблюдения). Установлена функциональная полноценность костного мозга, взятого у трупов внезапно скончавшихся людей в первые 8 часов с момента смерти.

Положения, выносимые на защиту

1. Способ криоконсервирования эритроцитов с использованием криопротектора на основе 18,5% пропиленгликоля и 5% ДМАЦ при температуре -80 -140 сС (в электрических морозильниках) обладает следующими преимуществами: а) обеспечивает сохранность более 90% клеток; б) позволяет использовать стандартные полимерные гемоконтейнеры однократного применения отечественного производства; в) позволяет отказаться от эксплуатации

дорогостоящего жидкоазотного оборудования и металлических контейнеров многоразового использования; г) способствует снижению трудозатрат и расходов средств при организации работы банка крови.

2. Способ криоконсервирования тромбоцитов при -80°С под защитой 2,5% раствора диметилацетамида обладает следующими преимуществами: а) обеспечивает более высокую функциональную полноценность клеток, по сравнению с способом криоконсервирования при -196°С; б) позволяет использовать стандартные полимерные гемоконтейнеры однократного применения отечественного производства; в) позволяет отказаться от эксплуатации жидкоазотного оборудования, металлических контейнеров многоразового использования и аппарата программного замораживания.

3. В интересах повышениия функциональной полноценности криоконсервированых тромбоцитов, концентраты этих клеток целесообразно заготавливать с помощью аппаратов-фракционаторов крови.

4. Способ криоконсервирования костного мозга с использованием в качестве криопротектора 3% раствора диметилацетамида обеспечивает сохранность высокой биологической полноценности клеток-предшественников гемопозза.

Практическая значимость работы и ее реализация

Разработанные методы криоконсервирования эритроцитов позволяют замораживать и хранить концентраты эритроцитов в электрических морозильниках с использованием криопротектора на основе 18,5% пропиленгликоля и 5% ДМАЦ при температуре -80 -140 °С в стандартных полимерных гемоконтейнерах отечественного производства, что позволяет частично отказаться от эксплуатации жидкоазотного оборудования и

г*

металлических контейнеров многоразового использования. При этом повышается производственная и экономическая эффективность работы банка крови, качественно возрастает инфекционная безопасность криоконсервированных

эритроцитов, обеспечивается более высокая степень биологической полноценности трансфузионной среды по сравнению с криоконсервированием эритроцитов при -196°С с использованием глицерина или ПДС.

Разработанный метод криоконсервирования тромбоцитов позволяет эффективно замораживать тромбоцитоконцентраты в отечественных полимерных контейнерах в электрохолодильнике (при -80°С) без использования аппарата программного замораживания, что существенно упрощает организацию создания "банков" кровяных пластинок. Консервирование тромбоцитов при -80°С под защитой 2,5% раствора диметилацетамида обеспечивает большую сохранность функциональных свойств, чем их криоконсервирование в жидком азоте (-196°С).

Использование тромбоцитоконцентратов, полученных с помощью алпаратов-фракционаторов крови, для

низкотемпературного консервирования значительно повышает функциональную полноценность кровяных пластинок для клинического применения.

Применение 3% растнора диметилацетамида в качестве криопротектора позволяет надежно сохранять функционально полноценные миелокариоциты костного мозга при замораживании в жидком азоте (-196°С). При этом не требуется удаление криопротектора перед инфузией размороженной миеловзвеси реципиенту. Полученные данные о сохранности пролиферативной способности миелоидной ткани, взятой от внезапно скончавшихся людей, подтверждают целесообразность

резервирования посмертного костного мозга для клинического применения. Использование диметилацетамида криопротектора отечественного производства позволяет создавать долгосрочные запасы криоконсервированной миелоидной ткани в интересах военной и экстремальной медицины.

Основные материалы исследования доложены и обсуждены на 6 международных, 11 национальных, 19 региональных и ведомственных съездах, симпозиумах и конференциях.

Результаты исследования опубликованы в 86 печатных работах. По теме работы получено 211 удостоверений на рационализаторские предложения. Результаты работы внедрены в практику в НИЛ-Центре крови и тканей Военно-медицинской академии!, Главном военном клиническом госпитале имени Н.Н.Бурденко, Центральном военном клиническом госпитале имени А.А.Вишневского, 32 Центральном военно-морском клиническом госпитале, станциях переливания крови Ленинградского военного округа (г.Санкт-Петербург) и Тихоокеанского флота (г.Владивосток и г.Петропавловск-Камчатский).

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа изложена на 256 страницах машинописного текста, содержит 51 таблицу. Указатель литературы включает 229 отечественных и 230 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследований.

Низкотемпературное консервирование эритроцитов проводили при -80°С, -140°С и -196°С. Также были изучены эритроциты, криоконсервированные при температуре -196°С, а

Зз. т9

затем в процессе хранения перенесенные из жидкоазотного хранилища в электрорефрижераторный прилавок фирмы "Reveo" на -140°С.

Наряду с общепринятыми методами исследовали эффективность криоконсерванта для эритроцитов, который включает: 1) а-пропиленгликоль (ВФС - 42-1594-86) - 370,0; 2) ДМАЦ (N.N-Диметилацетамид), х.ч., ТУ 6-09-537-73, ГОСТ 388573 - 100,0; 3) сахароза, чда, ГОСТ 8833-75- 32,0; 4) натрия хлорид, чда, ГФ X, с. 426, 442 - 6,0 5) воды для инъекций (ГФ X, с. 74 ) - до 1000 мл Все ингредиенты, включенные в указанный раствор, разрешены Фармкомитетом МЗ РФ для клинического применения и отвечают требованиям, предъявляемым к веществам для внутривенного введения.

Изучение морфофункциональной полноценности

эритроцитов, подвергавшихся низкотемпературному

консервированию при различных температурах, проводилось в следующих группах образцов:

I группа - эритроциты, криоконсервированные при температуре -196°С в жидком азоте под защитой пропандиосахароля (ПДС).

II группа - эритроциты, замороженные в электрорефрижераторе "Reveo" при температуре -80°С под защитой пропиленгликоля и диметилацетамида (ДМАЦ).

III группа - эритроциты, хранившиеся в низкотемпературном прилавке фирмы "Reveo" при температуре -140°С под защитой комбинированного криопротектора (ПДС + ДМАЦ).

IV группа - эритроциты, криоконсервированные при температуре -196°С в жидком азоте под защитой 20 % раствора глицерина.

V группа - эритроциты, криоконсервированные под защитой ПДС при температуре -196°С и подвергшиеся переносу в электрохолодильник "Reveo" (-140°С).

VI группа - эритроциты, криоконсервированные при температуре -196°С под защитой глицерина в конечной концентрации 20%, температурный режим хранения которых изменяли с -196°С на -140°С.

Исследования морфофункциональной полноценности эритроцитов в каждой группе проводили до и после низкотемпературного консервирования ЭК.

Сохранность клеточного материала в процессе

низкотемпературного консервирования и хранения в опытных и контрольных образцах ЭК рассчитывали с использованием следующих показателей:

1) Доля сохранных клеток (в %).

2) Количество разрушенных эритроцитов (КРЭ) после низкотемпературного консервирования (в %) - с фотометрической оценкой степени гемолиза.

3) Процент сохранности клеточного материала - по количеству общего гемоглобина в ЭК до и после замораживания.

При сравнительной оценке результатов, полученных при использовании различных методик расчета, достоверных различий не выявлено.

Оценку морфофункционального состояния эритроцитов проводили по следующим методикам:

1) Подсчет количества эритроцитов.

2) Определение процентного соотношения дискоидных, обратимо измененных и предгемолитических форм эритроцитов при помощи сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).

3) Определение содержания общего гемоглобина.

4) Определение уровня свободного гемоглобина в надосадочной жидкости.

5) Определение гематокритного показателя в ЭК.

6) Определение кислотной резистентности эритроцитов.

7) Исследование реологических свойств биосреды.

8) Исследование степени активации процесса перекисного окисления липидов (ПОЛ) на мембранах эритроцитов [Владимиров Ю.В., Арчаков Ю.И., 1972], определяемого по уровню содержания малонового диальдегида (МДА).

Э) Определение содержания АТФ в эритроцитах.

10) Изучение газотранспортной функции эритроцитов при помощи анализатора диссоциации кислорода HEM-O-SCAN фирмы "Aminco" (США), позволяющего построить кривую диссоциации оксигемоглобина (КДО) и рассчитать точку Р50.

При разработке метода низкотемпературного

консервирования тромбоцитов объектом изучения являлся

11

концентрат тромбоцитов, содержащий 2,5x10 клеток.

Исследования морфофункциональной полноценности тромбоцитов, криоконсервированных в жидком азоте при температуре -196°С и замороженных в электрорефрижераторе фирмы "Reveo" при температуре -80°С, проводили в 8-ми сериях опытов:

1) тромбоциты, полученные аппаратным методом и криоконсервированные npi/i температуре -196°С под защитой 2,5% раствора ДМАЦ (11 образцов).

2) тромбоциты, полученные методом дифференцированного центрифугирования консервированной донорской крови и криоконсервированные при температуре -196°С под защитой 2,5% раствора ДМАЦ (15 образцов).

3) тромбоциты, полученные аппаратным методом и криоконсервированные при температуре -196°С под защитой 5% раствора ДМСО (6 образцов).

4) тромбоциты, полученные методом дифференцированного центрифугирования консервированной донорской крови и криоконсервированные при температуре -196°С под защитой 5% раствора ДМСО (6 образцов).

5) тромбоциты, полученные аппаратным методом и замороженные при температуре -80°С под защитой 2,5% раствора ДМАЦ (12 образцов).

6) тромбоциты, полученные методом дифференцированного центрифугирования консервированной донорской крови и замороженные при температуре -80°С под защитой 2,5% раствора ДМАЦ (26 образцов).

7) тромбоциты, полученные аппаратным методом и замороженные при температуре -80°С под защитой 5% раствора ДМСО (7 образцов).

8) тромбоциты, полученные методом дифференцированного центрифугирования консервированной донорской крови и замороженные при температуре -80°С под защитой 5% раствора ДМСО (8 образцов).

Методики исследования морфофункциональной

полноценности тромбоцитов:

1.. Подсчет количества тромбоцитов.

2. Определение количества нормальных (овально-дискоидных) и патологических форм тромбоцитов с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ).

3. Определение степени АДФ-индуцированной и агристин-индуцированной агрегации тромбоцитов.

4. Определение степени реакции тромбоцитов на гипотонический шок (РГШ).

<13ЛЧЯ

5. Определение рН концентрата тромбоцитов.

6. Исследование перекисного окисления липидов в тромбоцитах по уровню содержания малонового диальдегида (МДА).

7. Подсчет количества лейкоцитов в тромбоцитоконцентрате.

При разработке метода низкотемпературного консервирования миелокариоцитов материалом исследований была костномозговая взвесь мышей, гематологических больных и скоропостижно умерших людей, обработанная 3% раствором диметилацетамида с последующим замораживанием при -196°С. ДМАЦ использовали для изучения его криозащитных свойств при замораживании и хранении миеловзвеси.

Работа проводилась в два этапа. На первом этапе исследовали морфофункциональную полноценность костного мозга мышей, криоконсервированного под защитой 3% раствора ДМАЦ, а также токсичность ДМАЦ. На втором этапе изучали функциональную способность костного мозга гематологических больных и миеловзвеси скоропостижно скончавшихся людей, криоконсервированных при -196°С под защитой 3% раствора ДМАЦ, а также влияние диметилацетамида на жизнеспособность костного мозга при 18-20°С в сравнении с 10% раствором диметилсульфоксида.

При изучении токсичности ДМАЦ оценивали переносимость диметилацетамида при внутривенном введении. За животными наблюдали 10 суток, обращая внимание на их физическую активность, отношение к пище. О токсичности ДМАЦ судили также по результатам гистологических исследований внутренних органов мышей (селезенки, печени, легких, сердца, почек).

Лечебную эффективность трансплантации костного мозга у животных оценивали по:

- выживаемости животных до 8-го дня после облучения;

- весу животных;

- величине селезеночного индекса (вес селезенки х 100 / вес мыши);

- результатам гистологического исследования селезенки;

- пролиферативной активности гемопоэтических клеток.

Исследование функциональной полноценности

миелокариоцитов аутологичного и посмертного костного мозга проводили до замораживания и после отогрева без предварительного удаления криопротектора.

Для изучения сохранности костномозговых клеток и их морфологической полноценности применяли следующие методы:

1. Подсчет количества ядросодержащих клеток в клеточной суспензии.

2. Подсчет миелограмм.

3. Определение жизнеспособности путем суправительной окраск, а также методом люминесцентной микроскопии, способом витального флюорохромирования жидких препаратов.

4. В качестве критерия оценки пролиферативного потенциала костного мозга определяли количество колониеобразующих единиц грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ) на

с

2x10 миелокариоцитов. Использовали метод клонирования КОЕ-ГМ в системе "агаровый квадрат". К кластерам относили клеточные конгломераты, в которых насчитывалось менее 20 клеток. Колониями считали конгломераты, образованные двадцатью и более клеточными элементами.

Материал проанализирован методами математической статистики на персональном компьютере IBM PC с использованием программы Microsoft Excel 5,0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При разработке способа криоконсервирования эритроцитов при температуре -80°С предприняли попытку усиления криофилактической активности ПДС путем введения в его состав ингредиента, обладающих собственной высокой криопротективной активностью - диметилацетамида (ДМАЦ). В результате сравнительной оценки растворов ДМАЦ различной концентрации были отобран вариант комбинированного криозащитного раствора, содержащий 10% ДМАЦ и обеспечивающий наиболее высокую степень защиты клеточной суспензии, подвергаемой криоконсервированию.

В ходе изучения морфофункциональных свойств эритроцитов после размораживания выявлена достаточно высокая степень сохранности их в процессе замораживания-хранения при температуре -80°С в электрохолодильнике (табл.1).

Дополнительно выполнили отдельные из исследований через сутки после размораживания и отмывания ЭК.

Таблица 1

Показатели сохранности морфофункциональных свойств эритроцитов, замороженных при температурах -80°С (I) и -196°С (II)

Показатель I (п = 45) II (п= 15) Р

Вес ЭК, г 181,6±2,02 182,4±2,71 >0,05

Гемоглобин, г 47,1+0,80 46,6+0,40 >0,05

Количество эритроцитов, х1012/л 3,95+0,04 3,96±0,07 >0,05

Свободный гемоглобина, г/л 0,69±0,04 0,62±0,05 >0,05

Гематокрит, % 41,8±0,28 41,2±0,36 >0,05

Морфология:

- % дискоидных и др. обратимо 97,6+0,39 96,6+040 >0,05

измененных клеток

- % сфероцитов Кислотная резистентность:

- % высоко- и среднестойких форм

- % низкостойких форм и сфероцитов

- пик гемолиза,мин

- окончание гемолиза, мин Реологические свойства:

- ИДэритроцита, у.е.

- КВэр/среды, у.е. Содержание МДА, нмоль/109 клеток

АТФ, мкмоль/г НЬ Газотранспортная функция:

- Р50, мм рт.ст.

- коэффициент Бора, у.е.

2,4+0,39 3,4±0,40 >0,05

90,9+0,70 89,3+1,20 <0,05

9,1+0,70 10,7±1,20 <0,05

5,5+0,16 5,0±0,14 <0,05

8,9±0,16 8,1±0,17 <0,05

0,98±0,04 0,87+0,04 <0,05

2,08+0,05 2,21+0,07 <0,05

1,22+0,09 1,14+0,08 >0,05

3,33±0,05 3,15±0,02 <0,05

23,0+0,38 21,2±0,44 <0,01

- 0,31±0,003 - 0,30+0,002 <0,05

Установлена достаточная степень сохранности размороженных эритроцитов в процессе хранения их при температуре +2°...+4°С, взвешенными в растворе 8".

Предлагаемая методика замораживания и хранения эритроцитов в электрохолодильнике позволяет отказаться от использования жидкого азота и алюминиевых контейнеров, что значительно повышает безопасность их лечебного применения, упрощает и удешевляет процедуру их низкотемпературного консервирования, делает метод надежнее.

Установлена достаточно высокой сохранности тромбоцитов, замороженных и хранившихся в жидком азоте при температуре -196°С. При этом, КТ, полученные с помощью аппаратов-фракционаторов крови ФК-3,5 и РК-0,5, в среднем,

дают более чем на 5% большую сохранность клеток в процессе криоконсервирования. Наши результаты подтверждают сведения о том, что использование 5% раствора ДМСО в качестве криопротектора при криоконсервировании тромбоцитов обеспечивает достаточно высокую сохранность их морфофункциональных свойств, однако не выявлено значительных преимуществ ДМСО по сравнению с ДМАЦ при их использовании для криоконсервирования тромбоцитов в жидком азоте.

При отработке режима криоконсервирования тромбоцитов при -80 °С установили, что если объем замораживаемой среды в компопласте составляет 100-120 мл (50-60 мл плазмы или тромбоцитоконцентрата и 50-60 мл криопротектора), эта среда, при помещении ее в специальный металлический пенал-холдер, распределяется ровным слоем толщиной 0,7-0,8 см. При этом, процесс охлаждения такого объема биологической среды внутри компопласта от 20-21 °С до -80°С в электрохолодильнике на -80°С длится от 34 до 50 минут, а скорость охлаждения составляет 2-3°С в минуту, что соответствует рекомендуемому диапазону скоростей охлаждения для тромбоцитов при их замораживании.

Срок хранения концентратов тромбоцитов при температуре -80°С составлял от 1 до 12 месяцев.

Оценку эффективности низкотемпературного

консервирования тромбоцитов в электрохолодильнике на -80°С проводили в сравнении с показателями эффективности общепринятого метода криоконсервирования тромбоцитов в жидком азоте при температуре -196°С (контрольные группы).

Сохранность клеток при замораживании тромбоцитов под защитой 2,5% раствора ДМАЦ предлагаемым методом в электрохолодильнике на -80°С, в среднем, более чем на 10%

выше чем у тромбоцитов, криоконсервированных традиционным способом (табл.2). Таблица 2

Характеристика консервированных при температурах -196°С (I) и -80°С (II) тромбоцитоконцентратов, полученных сепараторным методом

Показатели I (п=11) II (п=12) Р

Сохранность тромбоцитов, % 64,50+1,85 75,1+3,2 <0,05

Степень агрегации тромбоцитов:

- АДФ-индуцированной, % 17,1+1,1 21,2+1,2 <0,05

- агристин-индуцированной, % 36,7±1,2 42,3+1,2 <0,01

РГШ, % 26,66+1,26 33,03±1,32 <0,001

РН 6,90+0,09 6,97+0,12 >0,05

МДА в КГ, нмоль/10 клеток 0,642±0,010 0,602±0,008 <0,05

При сравнении показателей морфофункциональной полноценности тромбоцитов, полученных с помощью сепараторов крови и замороженных при температуре -80°С под защитой 5% раствора ДМСО, с аналогичными показателями тромбоцитов, полученных и замороженных теми же способами, но под защитой 2,5% раствора ДМАЦ, достоверных различий (за исключением агристин-индуцированной агрегации) не выявлено (табл.3). Таблица 3

Характеристика концентратов тромбоцитов, полученных сепараторным методом и замороженных при температуре -80°С под защитой 5% раствора ДМСО (II) и 2,5% раствора ДМАЦ (I)

Показатели 1(п=12) II (п=7) Р

Сохранность тромбоцитов, % 75,1+3,2 82,5+3,1 >0,05

Степень агрегации тромбоцитов:

- АДФ-индуцированной, % 21,2±1,2 23,3±1,1 >0,05

- агристин-икдуцированной, % 42,3+1,2 49,9+1,3 <0,01

РГШ, % 33,03+1,32 35,1±1,2 >0,05

РН о 6,97±0,12 7,08±0,08 >0,05

МДА в КТ, нмоль/10 клеток 0,602±0,008 0,577±0,020 >0,05

Таким образом, разработанные технические условия замораживания тромбоцитов обеспечивают оптимальный (2-3°С/мин) режим охлаждения тромбоцитоконцентрата от 20-21°С до -80°С в электрохолодильнике. Концентрат тромбоцитов, сохраняемый по предлагаемой методике при температуре -80°С, по своим морфофункциональным характеристикам является более полноценной гемотрансфузионной средой в сравнении с тромбоцитоконцентратом,. сохраняемым общепринятым способом при температуре -196°С.

Известно, что диметилацетамид разрешен для клинического применения. Однократное введение ДМАЦ в дозе 1,5 г/кг, а также инфузия диметилацетамида в количестве 1,5 г/кг трехкратно с интервалами 10 суток не оказывали токсического влияния на организм мышей.

Общее облучение мышей в дозе 1000 рад без последующей пересадки костного мозга вызывало выраженное лучевое поражение.

В группе облученных мышей, не защищенных пересадкой костного мозга (контрольная группа), выжило 50% особей, а в

группах, получивших после облучения трансплантация свежего криоконсервированного с ДМАЦ костного мозга выживаемость -87%.

Результаты исследования 15 образцов аутологичного костного мозга гематологических больных, инкубированного в течение 15 мин с 3% раствором ДМАЦ и 10% раствором ДМСО показывают, что морфологическая сохранность клеток не изменилась, а функциональная активность клеток-предшественников грануломоноцитопоэза идентично снижалась под влиянием обоих криопротекторов.

Замороженный костный мозг хранили в жидком азоте в течение 1,5 месяцев. Непосредственно перед выполнением исследования образцы оттаивали на водяной бане при температуре 38°С в течение 60 сек.

Пролиферативная активность миелоидных клеток, криоконсервированных с диметилацетамидом снижается на снижение на 50%, а криоконсервированных с 10% раствором ДМСО - на 54%. То есть хладоограждающий эффект обоих растворов практически одинаков.

При исследовании криоконсервированного с 3% раствором ДМАЦ трупного костного мозга, заложенного на хранение 10 лет тому назад установлено, что содержание миелокариоцитов в оттаянных образцах существенно не изменилось при сравнении с исходными показателями. Показатели морфологической сохранности клеток существенно не отличалось от костного мозга криоконсервированногов течение 1,5 месяцев.

Показатели колониеобразующей способности костного мозга после 10 лет хранения находились в пределах нормальных величин и не отличались существенно костного мозга после 1,5 месяцев хранения. Однако кластерообразующая способность

была в 3,6 раза ниже, чем миелоидной ткани, криоконсервированной в течение 1,5 месяцев.

Исследовали хладоограждающую способность 3% раствора ДМАЦ по отношению к костному мозгу гематологических больных в сравнении с 10% раствором ДМСО (табл.4). Таблица 4

Влияние ДМАЦ (I) и ДМСО (II) на морфофункциональную полноценность криоконсервированного костного мозга гематологических больных (М±т) Показатели Образцы костного мозга

до замораживания после отогрева

I (п=15) II (п=15) I (п=15) П(п=15)

Количество клеток, тыс/мкп 35,5+4,5 32,5±4,0 32,0±3,0 29,5±5,5

Морфологическая 87,5+6,5 81,5±5,0 67,5±5,5* 66,0±4,0*

сохранность клеток, %

Колониеобразующая

способность:

- КОС, ед 22,0+5,5 24,0±4,0 20,0+4,0 19,0±3,5

- КлОС, ед 55,0+9,5 61,0±12,0 47,0+7,5 56,0±6,0

Морфологическая сохранность клеток не изменилась, а функциональная активность клеток-предшественников грануломоноцитопоэза под влиянием криопротектора снижалась. Выраженность угнетающего действия ДМАЦ на пролиферативную способность миелокариоцитов не отличалась существенно при сравнении с 10% раствором ДМСО.

Таким образом, хладоограждающая способность ДМАЦ по отношению к аутологичному костному мозгу не отличается существенно от криофилактического эффекта ДМСО.

ВЫВОДЫ

1. Криоконсервирование крови и костного мозга в службе крови Вооруженных Сил способствует улучшению обеспечения

гемотерапевтическими средствами лечения пострадавших и больных.

2. Разработан способ криоконсервирования эритроцитов при температуре -30°С и -140°С с использованием криозащитного раствора на основе пропиленгликоля и диметилацетамида в конечных концентрациях 18,5% и 5% соответственно, обеспечивающий сохранность 94±3 % клеток, позволяющий использовать отечественные полимерные гемоконтейнеры.

Изменение температуры хранения ЭК, изначально криоконсервированных при температуре -196°С под защитой пропандиосахароля и глицерина, на -140°С не сопровождается ухудшением морфофункциональных характеристик эритроцитов.

3. Разработан способ криоконсервирования тромбоцитов при температуре -80°С с использованием криозащитного раствора на основе 2,5% диметилацетамида, обеспечивающий сохранность до 75% клеток, позволяющий повысить биологическую полноценность трансфузионной среды по сравнению с концентратами тромбоцитов, криоконсервированными при температуре -196°С.

4. Разработан способ криоконсервирования костного мозга при температуре -196°С с использованием криозащитного раствора на основе 3% диметилацетамида, обеспечивающий сохранность до 90% клеток-предшественников грануломоноцитопоэза с возможностью хранения до 10 лет (срок наблюдения).

5. Посмертный костный мозг скоропостижно скончавшихся людей, взятый в течение 8 часов с момента смерти и криоконсервированный при температуре -196°С под защитой 3% диметилацетамида, является возможным источником получения большого количества биологически полноценных стволовых клеток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При организации банков долгосрочного хранения биопродуктов в Вооруженных Силах целесообразно использовать наряду с жидкоазотным оборудованием (на -196°С) и электрохолодильники на -80°С и -140°С.

2. При криоконсервировании эритроцитов в электрорефрижераторе при температуре -80°С и -140°С целесообразно использовать полимерные гемоконтейнеры отечественного производства и криозащитный раствор на основе пропиленгликоля и диметилацетамида в конечных концентрациях 18,5% и 5% соответственно.

3. При возникновении аварийной ситуации в банке крови возможен перенос контейнеров с криоконсервированными эритроцитами из жидкого азота в электрохолодильные установки с температурой -140°С.

4. Криоконсервирование тромбоцитов возможно в электрорефрижераторе при температуре -80°С с использованием полимерных гемоконтейнеров отечественного производства и криозащитного раствора на основе 2,5% диметилацетамида.

Концентрат тромбоцитов для криоконсервирования можно заготавливать на фракционаторах отечественного производства.

5. Для создания запасов костного мозга путем длительного хранения при температуре -196°С можно использовать криозащитный раствор следующего состава:

- диметилацетамид - 24 мл

- глюкоза - 40 г

- трилон Б - 0,4 г

- вода для инъекций до 100 мл.

6. Использовать режим замораживания костного мозга с диметилацетамидом:

1 этап - от + 4°С до начала кристаллизации со скоростью 1°С/мин;

2 этап - от момента окончания кристаллизации до - 150°С со скоростью 5-10°С/мин;

3 этап - погружение в жидкий азот.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Консервирование биологических объектов при низких температурах// Повышение эффективности процессов и оборудования холодильной промышленности,- Л., 1971.- С.103-104 (соавт. Рыжков C.B. и др.)

2. Изучение сохранности консервированного костного мозга при транспортировке/Яез. докл. науч. конф. молодых ученых ЛИПК по вопросам гематологии и трансфузиологии.-Л., 1972.- С.28-29 (соавт. Недельский Г.Т. и др.)

3. Использование низких температур для консервирования крови и тканей//Холодильная техника.-1973.-№4.-С.47~48.(Рыжков С.В и соавт)

4. Опыт применения размороженных эритроцитов в хирургической клинике/Яез. докл. науч. конф. работников службы крови. - Л., 1974.-С.30. (соавт. Плешаков В.Т. и др.)

5. К вопросу о транспортировке костного мозга, консервированного методом замораживания// Воен. - мед. журн.- 1976,- №3.-С.23-25 (соавт. Холодный А.Я и др.)

6. К вопросу производства сухих препаратов крови в условиях военного округа//Матер. науч. конф .по проблеме заготовки и переливания крови, костного мозга и других тканей. - Л., 1976.-С.59-60

7. Криоконсервирование эритроцитов для клинического примененияШатер. науч. конф. по проблеме заготовки и переливания крови, костного мозга и других тканей,- Л., 1976.-С. 7-8. (соавт. Петренко Г.И и др.)

8. Лечебная эффективность трансплантации костного мозга, консервированного различными способами// Вопросы трансплантации костного мозга. -Л., 1976.-С.67-72. (соавт. Холодный А.Я и др.)

9. Об использовании различных типов отогревателей ядросодержащих клеток для выведения их из замороженного состояния//Воен.-мед.журн.-1976.-№8.-С.25-27. (соавт. Холодный А.Я и ДР-)

Ю.Результаты низкотемпературного консервирования эритроцитов с глицерином и ПВП// Механизмы криоповреждения и криопротекции биологических структур. -Киев, 1976.-С.71-75.(соавт. Рыжков C.B. и др.)

11.Система учета "банка" замороженного костного мозга и эритроцитов// Проблемы гематологии и переливания крови.-1976,- №9.-С.57-60. (соавт. Холодный А.Я и др.)

12.Сравнительная оценка защитного действия различных криофилактиков при замораживании аутологичного костного мозга//Механизмы криоповреждения и криопротекции биологических структур. -Киев, 1976.-С.75-79. (соавт. Холодный А.Я и др.)

13.Сравнительная оценка новейших образцов отечественной аппаратуры для низкотемпературного консервирования костного мозга и ядросодержащих клеток крови//Материалы науч. конф. по проблеме заготовки и переливания крови, костного мозга и других тканей. -Л., 1976,-С.96-97.(соавт. Холодный А.Я.. и др.)

14.Сравнительная оценка процесса криоконсервирования кроличьего костного мозга в различных аппаратах// Криобиология и криомедицина -Киев, 1976.- Вып.2.- С.59-62 (соавт. Холодный А.Я и др.)

15.Криоконсервирование эритроцитов для клинического применения// Пробл. гематологии и переливания крови.-1977.- Т.22, №2,- С.19-22.(соавт. Рыжков C.B. и др.)

16.К оценке криозащитного эффекта различных веществ при ультранизком замораживании костного мозга// Воен. - мед. журн.- 1978,-№4,- С.74-75 (соавт. Холодный А.Я и др.)

17.Пособие по службе крови в Вооруженных Силах СССР,- М., 1979.278 с. (соавт. Колесников И.С. и др.)

18.Длительное хранение костно-мозговых клеток, криоконсервированных с диметилацетамидом (ДМАЦ) для клинических целей//Восстановительные и компенсаторные процессы при лучевых поражениях.-Л..1979.-С.164-165. (соавт. Холодный А.Я и др.)

19.Защитный эффект диметилацетамида (ДМАЦ) при криоконсервировании клеток костного мозга. -М.,1981.-11 с. Рукопись депонирована во ВНИИМИ МЗ СССР,№4744-8. (соавт. Холодный А.Я и ДР-)

20.Применение трансплантации аутологичного костного мозга для профилактики и лечения послеоперационных анемий// Вестник хирургии,-1982.-Т. 129, №12.-С.93-97.(соавт. Малахов С.Ф. и др.)

21. Криоконсервирование больших объемов аутологичного костного мозга на аппарате КЗ-65// Матер, конф. по теоретич. и прикладным вопросам криобиологии. -Харьков, 1984.-Т.1.-С.170. (соавт. Малахов С.Ф. и др.)

22.Организационные принципы работы "банка" аутологичного костного мозга в хирургической клинике// Трансплантация костного мозга в клинике и эксперименте. -М., 1984.-С.80-82 (соавт. Малахов С.Ф. и др.)

23.Организация заготовки, хранения и применения аутологичного костного мозга в многопрофильной хирургической клинике// Тез. докл. 2 Всесоюзн. конф. по теоретич. и прикладным вопросам криобиологии. -Харьков, 1984,-Т.1.- С.105 (соавт. Малахов С.Ф. и др.)

24.Пятнадцатилетний опыт криоконсервирования клеток крови, костного мозга и некоторых тканей// Актуальные вопросы оказания и совершенствования хирургической помощи на ВМФ.- П., 1984- С.54-55 (соавт. Попов С.Д. и др.)

25.Изменение биохимических показателей аутологичного костного мозга при криоконсервировании// Механизмы криоповреждения и

криопротекции биологических структур. - Киев: Наукова думка, 1976,-С.79-82.(соавт. Холодный А.Я и др.)

26.Морфологическая сохранность клеток костного мозга мышей, консервированного методом замораживания// Матер, науч. конф. молодых ученых. -Л., 1976.- С.10-12 (соавт. Андреев А.И. и др.)

27. Опыт применения полиэтиленоксида-4000 (ПЭСМ000) при низкотемпературном замораживании посмертного мозгаII Проблемы гематологии и переливания крови.-1976.- №12.- С.12-15 (Холодный А.Я и ДР)

28.Гистограмма объемных размеров эритроцитов, консервированных замораживанием при ультранизких температурах// Проблемы гематологии и переливания крови.-1977.-№6.-С.14-16 .(соавт. Холодный А.Я. и др.)

29.Морфологическая и функциональная сохранность криоконсервированного посмертного костного мозга через 6 лет хранения в жидком азоте// Трансплантация костного мозга в клинике и эксперименте - М., 1984.- С.88-89 .(соавт. Холодный А.Я и др.)

30.Влияние криоконсервирования на топологические переходы суперспиральной ДНК нуклеотидов клеток костного мозга человека// Криобиология. - Киев: Наукова думка, 1986.- С.34-38 (соавт. Ващенко Т.Н. и др.)

31.Криоконсервирование эритроцитов: показания и опыт применения// Матер. 2 съезда трансфузиологов Украины. - Киев, 1986. -С.11 (соавт. Попов С.Д. и др.)

32.Эффекгивность трансплантации костного мозга, криоконсервированного с ДМАЦ, в эксперименте// Матер. 2 съезда трансфузиологов Украины,- Киев, 1986.-С.13 (соавт. Петренко Г.И. и др.)

33.Результаты низкотемпературного консервирования эритроцитов и их лечебная эффективность// Вопросы заготовки и применения крови, её компонентов и препаратов в военно-медицинских учреждениях. -Л., 1986,-С.28-33 (соавт. Калеко С.П. и др.)

34.Криоконсервирование костного мозга доноров с использованием криопроектора ДМАЦ// Вопросы заготовки и применения крови, её компонентов и препаратов в военно-медицинских учреждениях. -Л., 1986.-С.34-40 (соавт. Холодный А.Я. и др.)

ЗБ.Опыт организации работы отделения криоконсервирования// Вопросы заготовки и применения крови, её компонентов и препаратов в военно-медицинских учреждениях. -Л.: ВМедА, 1986,- С.41-43 (Рыжков C.B. и др.)

Зб.Опыт работы "банка" (отделения) криоконсервирования в составе военно-медицинского учреждения// Актуальные вопросы трансфузиологии. - Л., 1987,- С.7 (соавт. Петренко Г.И. и др.)

37.Криоконсервирование и применение тромбоцитов// Актуальные вопросы трансфузиологии,- Л., 1987.- С.31-32 (соавт. Калеко С.П. и др.)

38.Применение криоконсервированных эритроцитов при определении групповой принадлежности крови// Актуальные вопросы военно-морской и клинической хирургии- Л.: ВМедА, 1989.-С.17-18 (Калеко С.П. и др.)

ЗЭ.Криоконсервирование эритроцитов под защитой криоконсерванта "пропандиосахароль"// Методич. рекомендации. -Харьков: ИПКиК АН УССР, 1990. -8 с. (соавт. Калеко С.П. и др.)

40.Способ хранения стандартных криоконсервированных эритроцитов// Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике,- Л., 1989,- С.21. (соавт. Вильянинов В.Н. и др.)

41. Приспособление для укладки пластикатных контейнеров// Там же,-С.114 (соавт. Шкатов Е.А. и др.)

42.Организация работы отделения криоконсервирования ("банка") крови военной станции переливания крови// Методич. рекомендации. -СПб., 1991 .-Юс. (соавт. Калеко С.П. и др.)

43.Руководство по военной трансфузиологии/Ред. Нечаев Э.А.- М.: Воениздат, 1991 (разделы 6 и 10)

44.Эффективность аутомиелотрансфузии при комбинированном лечении рака грудного отдела пищевода// Актуальные вопросы аутотрансфузии крови и ее компонентов. -СПб., 1991. (соавт. Лыткин М.И. и др.)

45.Опыт организации заготовки и криоконсервирования крови и клеток костного мозга у лиц с повышенным риском радиационной травмы// Современные медицинские технологии в совершенствовании лечебно-эвакуационного обеспечения войск.- СПб., 1993.- С.31 (соавт. Калеко С.П. и др.)

46.Способ оценки жизнеспособности аутологичного костного мозга// Усовершенствование метолов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике. - СПб., 1994,- С.15-16 (соавт. Булатов К.Б. и др.).

47.Метод замораживания эритроцитов при температуре -80 °С// Там же.- С.74 (соавт. Попова H.H. и др.)

48.Способ использования хранилищ ХБ-0,5 для размещения в них контейнеров с эритроцитами/Яам же.- С.4 (соавт. Петренко Г.И. и др.)

49.Метод криоконсервирвания клеток костного мозга с диметилсульфоксидом (ДМСО)// Там же,- С.4-5 (соавт. Петренко Г.И. и ДР-)

50.Оптимизация производственной работы станции переливания крови//Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения,- СПб, 1995.-С.441-442 (соавт. Калеко С.П. и др.)

51 .Организация банков низкотемпературного консервирования клеток крови и костного мозгаII Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии.- СПб., 1995.-С. 56-57 (соавт. Данильченко В.В. и др.)

52.0пыт замораживания эритроцитов при -80-140 0CII Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии.- СПб., 1995.- С.225-226 (соавт. Петренко Г.И. и др.)

53.Сравнительная оценка эффективности различных способов криоконсервирования аутологичного костного мозга//Там же,- СПб., 1995,-С.237-238. (соавт. Данильченко В.В. и др.)

54.Analysis of efficacy of two methods of bone marrow cryopreservation// Bone Marrow Transplantation.-1995,- Suppl.- A.221. (with Petrenko G.I. et al.)

55.Метод ускоренного охлаждения биосуспензии в электрохолодильнике// Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике.- СПб., 1996.- С.8 (соавт. Петренко Г.И. и др.)

56.Метод замораживания эритроцитов под защитой комбинированного криопротектора// Там же.- С. 15. (соавт. Вильянинов В.И. и др.)

57.Метод сохранения биопродукга при переносе его с -196 °С на -140 "СП Там же.- С. 53. (Петренко Г.И. и др.)

58.Способ замораживания эритроцитов при -80 "CII Новые технологии в трансфузиологии,- Ялта, 1996,- С.15-16. (соавт. Вильянинов В.Н. и др.)

59.0пыт фракционирования костного мозга полиглюкином// Новые технологии в трансфузиологии.- Ялта, 1996.- С.29-35 (соавт. Данильченко В.В. и др.)

бО.Критерии оценки "трансплантационного потенциала" аутологичного костного мозга// Новые технологии в трансфузиологии.-Ялта, 1996,- С.61-65 (соавт. Тюрин Р.В. и др.)

Подписано к печати 14.10.98. Формат 60 х84 '/„ _

Типография ВМедА

"ЗакаТ1ПМ 06ъем1%п.л.