Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Эффективность трансфузий криоконсервированных при -80°С донорских тромбоцитных концентратов у больных гемобластозами

На правах рукописи

ШЕРСТНЕВ Филипп Сергеевич

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТРАНСФУЗИЙ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ПРИ -80°С ДОІ ЮРСКИХ ТРОМБОЦИТНЫХ КОНІ (Е1 1ТРАТОВ У БОЛЬНЫХ ГЕМОБЛАСТОЗАМИ

14.01.21.- гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диесертации па соиекание ученой степени кандидата

005540569

медицинских на\'к

г 8 НОЯ 2013

Саикт- Петербург 2013

005540569

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального медико-биологического агентства»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, доцент Костяев Андрей Александрович кандидат медицинских наук, доцент Загоскина Тамара Павловна

Официальные оппоненты:

Багаутдинов Шамиль Муталабович. доктор биологических наук, старший научный сотрудник НИО (медико-биологических исследований) НИЦ ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Дуткевич Игорь Георгиевич, доктор медицинских наук, профессор и.о. зав. кафедрой трансфумиологии ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им И.И. Мечникова» Минздрава России

Ведущее учреждение:

ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Зашита состоится 16 декабря 2013 года в_часов на заседании

диссертационного совета Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России (193024, г. Санкт-Петербург, уд 2-я Советская, 16).

Автореферат разослан « »

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Татьяна Валентиновна Глазанова

Актуальность проблемы

Трансфузии тромбоцитных концентратов (ТК) в настоящее время -единственный общепринятый во всем мире эффективный метод профилактики и лечения тромбоцитопенического геморрагического синдрома у онкогематологических больных. Ежегодно в мире на фоне снижения числа переливаний эритроцитов наблюдается рост потребления ТК на 5 -7 %. При этом проблема обеспечения реципиентов тромбоцитами остается не решенной. Ограниченность срока годности нативных тромбоцитов, непредсказуемость момента, когда пациенту потребуется их экстренное переливание, а также относительная трудозатратность получения ТК требуют поиска новых путей обеспечения этой трансфузионной средой.

В современных условиях определенную гибкость в управлении ресурсами кровяных пластинок для обеспечения растущих потребностей онкогематологических клиник может придать создание запаса криоконсервированных ТК. Несмотря на большой спектр известных методов их замораживания, единственным разрешенным в России является способ криоохладжения тромбоцитов при температуре минус 196°С с ограждающим раствором «Тромбокриодмац».

Разработан в эксперименте эффективный метод криоконсервирования малых объемов ТК при температуре минус 80°С, не апробированный для терапевтических доз кровяных пластинок. Не проведена сравнительная оценка морфофункциональной сохранности замороженных по этому режиму ТК, заготовленных различными методами. До настоящего времени не изучена клиническая эффективность и целесообразность применения нового экономичного метода криоконсервирования тромбоцитов

Степень разработанности темы исследования

Ограниченный срок хранения нативных ТК - от 3 до 7 суток - приводит в ряде ситуаций к отсутствию данного гемокомпонента для экстренных переливаний, что чревато развитием геморрагических осложнений. Для создания запасов длительно-хранящихся тромбоцитов разработаны методы криоконсервирования. В России применяются ТК, замороженные до -196

защитой криопротектора тромбокриодмац (Аграненко В.А. Криоконсервированные тромбоциты и их клиническая эффективность // Гематология и трансфузиология. 1987. № 5. С. 22-24). Трудоемкость и затратность жидкоазотного метода криоконсервирования ограничивает применение криоконсервированных ТК в клинической практике. Вместе с тем создан метод консервирования в электрических морозильниках при -80°С, исключающий необходимость в жидком азоте (Захаров В. В. Консервирование тромбоцитов замораживанием при -80°С под защитой диметилацетамида: Автореф. дис. . канд. мед. наук. СПб. 1996. 22 с). В эксперименте показана удовлетворительная сохранность морфо-функциональных свойств кровяных пластинок, криоконсервированных в режиме быстрого двухступенчатого замораживания до -80°С (Кузнецов К.В. Консервирование тромбоцитов замораживанием при -80°С по экспоненциальной программе: Автореф. дис. канд. мед. наук. СПб., 2006. 23 е.).

Цель исследования

Изучение эффективности режима криоконсервирования тромбоцитов в объеме лечебной дозы при температуре минус 80оС с ограждающим раствором тромбокриодмац для клинических целей и оценка эффективности трансфузий размороженных тромбоцитных концентратов у онкогематологических больных.

Задачи исследования

1. Определить морфофункциональную сохранность тромбоцитов, криоконсервированных при температуре минус 80°С в терапевтических дозах в режиме быстрого двухступенчатого замораживания с криопротектором «Тромбокриодмац» по экспоненциальной программе.

2. Выявить оптимальный метод заготовки тромбоцитов, позволяющий подготовить для замораживания - оттаивания наибольшее количество функционально полноценных кровяных пластинок.

3. Установить клиническую эффективность криоконсервированного с криопротектором «Тромбокриодмац» при - 80°СТК при лечении и профилактике тромбоцитопенического геморрагического синдрома.

4

4. Оценить влияние клинических и иммунных неблагоприятных факторов на эффективность трансфузий криоконсервированного ТК реципиентам.

5. Провести сравнительную оценку клинической эффективности трансфузий нативных и криоконсервированных с «Тромбокриодмац» при -80°С тромбоцитов у онкогематологических больных.

Научная новизна

Впервые при криоконсервировании тромбоцитного концентрата для клинического использования применен режим быстрого двухступенчатого замораживания до температуры -80°С (патент на изобретение №2326532). Выявлена сопоставимая с нативными морфофункциональная сохранность замороженных-оттаянных кровяных пластинок.

Дана оценка клинической эффективности трансфузий криоконсервированных при температуре -80сС под защитой раствора «Тромбокриодмац» тромбоцитов при лечении больных гемобластозами. Охарактеризовано влияние различных факторов, снижающих эффективность трансфузий криоконсервированных ТК. Показано, что клиническая эффективность криоконсервированных в данном режиме и нативных тромбоцитов значимо не отличается.

Теоретическая и практическая значимость работы

Определена возможность использования метода криоконсервирования терапевтических доз тромбоцитов под защитой «Тромбокриодмац» в режиме быстрого двухступенчатого замораживания для клинического использования. Установлена высокая сохранность морфофункциональных свойств кровяных пластинок на всех этапах криоконсервирования гго данной программе.

ТК, заготовленные методом аппаратного афереза, являются предпочтительными для криоконсервирования в сравнении с полученными дискретным способом. Клиническая эффективность размороженных ТК сопоставима с таковой свежих тромбоцитов, однако размороженные тромбоциты рекомендуется использовать в клинической практике при отсутствии нативных.

Методология и методы исследования

В работе использованы общенаучные методы: анализ (проспективный и ретроспективный), синтез (сравнительно-сопоставительный), частно-научные методы (лабораторный, клинический, инструментальный), методы математической статистики.

Основные положения, выносимые на защиту

Криоконсервирование тромбоцитов под защитой криопротектора «Тромбокриодмац» в режиме быстрого двухступенчатого замораживания до температуры -80°С обеспечивает морфофункциональную сохранность кровяных пластинок, достаточную для их эффективного клинического применения.

Предпочтительным методом заготовки ТК для криоконсервирования при -80°С, обеспечивающим высокую морфологическую сохранность клеток, является аппаратное фракционирование.

Декриоконсервированные тромбоциты обладают выраженным гемостатическим эффектом, сопоставимым с таковым при использовании нативных пластинок.

В качестве положительного результата следует отметить достижение удовлетворительной гемостатической активности и положительного часового прироста клеток после трансфузии размороженных ТК у реципиентов с наличием и отсутствием отягощающих факторов. Через сутки скорректированный прирост кровяных пластинок более 4,5x109/л, свидетельствовавший об эффективности гемотрансфузии, получен в 35% при использовании криоконсервированного ТК и в 43% - нативного.

Внедрение

Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе в ГБОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А. Вагнера Минздрава России.

Апробация работы

Результаты исследования и основные положения работы доложены на

научно-практической конференции молодых ученых с международным

участием «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины», Киров, 176

18.04.2007 г.; Всероссийском совещании «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Епифановские чтения), г. Киров, 27-28.05.2008г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 50-летию ФГУ «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России», г. Киров, 2012 г.; научно-практической конференции «Проблемы заместительной терапии концентратами тромбоцитов» (ГНЦ РАМН 19 октября 2010 г.).Москва.

По материалам диссертации опубликовано 14 печатная работа, из них -3 статьи в рецензируемых журналах, 2 патента на изобретение.

Результаты проведенного исследования внедрены в практику работы лаборатории криоконсервирования крови и тканей, гематологической клиники ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».

Личное участие автора в получении результатов. Авторомличнопроведена заготовка и криоконсервирование ТК, определены показания к их трансфузии, организовано переливание размороженных тромбоцитов реципиентам, оценена их эффективность, а также выполнена статистическая обработка и анализ полученных данных.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 102 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», две главы собственных исследований, «Заключение», «Выводы», «Практические рекомендации», «Список литературы».

Диссертация выполнена в ФГБУН «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России» (директор института - кандидат медицинских наук И.В.Парамонов).

Автор выражает глубокую благодарность за помощь в работе ведущему научному сотруднику лаборатории консервирования крови и тканей к.м.н. C.B. Утёмову и главному врачу станции переливания крови институтаВ.К. Кунофу, заведующему отделом заготовки крови станции переливания крови М.Г. Князеву.

Материалы и методы исследований

С целью определения эффективности режима двухступенчатого замораживания до температуры минус 80°СТК, предназначенных для клинического применения, изучили морфо-функциональную сохранность замороженных - оттаянных кровяных пластинок.

ТК получали выделением из цельной донорской крови аппаратным методом (сепаратор «Amicus» фирмы «Baxter»), а также с помощью трехкратного дискретного тромбоцитафереза. От 95 доноров-добровольцев заготовили 102 ТК, в том числе 54 образца - с помощью аппаратного тромбоцитафереза и 48 - методом дискретного тромбоцитоплазмафереза. Полученные тромбоциты подвергали низкотемпературному замораживанию в пластикатных контейнерах «Компопласт 300» под защитой криоконсерванта «Тромбокриодмац». Для криоконсервивания биообъектов по двухэтапной экспоненциальной программе использовали электроморозильники на -30°С и -80°С. Первоначально ТК охлаждали в электроморозильнике «Криостат». Вторым этапом явилось замораживание с использованием электроморозильника «Sanyo» (Япония) при температуре - 80°С.

Срок хранения криоконсервированных ТК составил 106+10 суток. Отбор проб для исследования проводили из гемоконтейнера после окончания трансфузии. Период времени между размораживанием ТК и трансфузией составил 15 - 50 минут.

Исследование функциональной активности тромбоцитов осуществляли трижды: непосредственно после их выделения из крови, перед замораживанием ипосле отогрева замороженных образцов. Подсчет количества тромбоцитов дои по окончании замораживания выполняли в камере Горяева в двух параллельных пробах с вычислением концентрации и общего содержания данных клеток в ТК.

Функциональную полноценность тромбоцитов исследовали с помощью определения адгезивности к стеклу и индуцированной агрегации клеток фотометрическим методом с использованием лазерного агрегометра «Биола» (модель LA - 230) на 10 минуте после добавления индукторов агрегации.

8

Агрегацию тромбоцитов изучали с основными индукторами: аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 2,5 мкг/мл, коллаген - 2мг/мл, ристомицин - 1,5 мг/мл, адреналин - 2,5 мкг/мл.

Реакцию на гипотонический шок (РГШ) определяли методом R. Handin с помощью спектрофотометра СФ-46 при длине волны 610 нмв течение 10 минут. Величины агрегации и РГШ исследовали в пробах при стандартном количестве тромбоцитов 250 ООО - 350 ООО /мкл. Для исследования рН концентрата тромбоцитов и криоконсервирующих растворов использовали иономеруниверсальный ЭВ-74 и иономер рН - 150.

Трансфузии тромбоцитов, криоконсервированных по названному режиму, выполняли на основании решения Ученого совета института (протокол № 4 заседания Ученого совета Кировского НИИ гематологии и переливания крови от 27.04.2006) с добровольного информированного согласия пациентов.В исследование включены результаты лечения 30 пациентов гематологической клиники, получивших трансфузии ТК (14 женщин и 16 мужчин). Возраст больных находился в пределах от 22 лет до 68 лет (медиана возраста - 51 год).

Трансфузии ТК назначали с лечебной целью больным с глубокой тромбоцитопенией при возникновении проявлений спонтанного тромбоцитопенического геморрагического синдрома (ГС). Профилактические трансфузии ТК выполняли при количестве тромбоцитов <10х109/л, на фоне курсов интенсивной полихимиотерапии или ДВС-синдрома, лихорадки, сепсиса, спленомегалии, а также при пороговом уровне пластинок <20x10%, у больных промиелоцитарным лейкозом в острой фазе заболевания или у клинически стабильных пациентов перед выполнением инвазивных процедур при числе клеток < 50x10 /л.

В качестве критериев эффективности трансфузий использовали оценку клинических проявлений спонтанной кровоточивости и количественное определение скорректированного прироста тромбоцитов (СПТ) через 1 час (СПТ,) и 18-24 часа (СПТ18-24) после ее проведения.

Степень тяжести тромбоцитопенического геморрагического синдрома

определяли по шкале ВОЗ. Отсутствие геморрагий оценивали как 0 баллов;

9

один балл соответствовал появлению петехий, гематом на слизистых и незначительных наружных кровотечений. Наличие мелены, гематурии, кровохарканья, маточного, носового кровотечения свыше часа, не требующих трансфузий эритроцитов, оценивали как два балла. Три балла присваивали при наличии любых анемизирующихгеморрагий, требовавших переливания эритроцитов; любые фатальные кровопотери расценивали как 4 балла.

Отягощающими факторами, неблагоприятно сказывающимися на эффективности тромбоцитотерапии, считалиНЬА, НРА - аллоиммунизацию, о которой свидетельствовало выявление в сыворотке крови больных антилимфоцитарных и/или антитромбоцитарных антител, а также клинические факторы: ДВС-синдром, инфекция с фебрильной лихорадкой (выше 38°С), сепсис, спленомегалия, введение амфотерицина В. Указанные клинические факторы присутствовали у реципиентов при 16 трансфузиях ТК.

Цифровые данные исследований подвергали статистической обработке с помощью программы Вюз1а1. Достоверность различий определяли с использованием критерия Стьюдента, для выборок, не имеющих нормального распределения - с помощью критерия Манна - Уитни. Оценку отличий показателей повторных трансфузий одним и тем же реципиентам производили с использованием критерия Уилкоксона. Анализ различий качественных признаков проводили с помощью критерия Хи-квадрат. Достоверными отличия считали при р<0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

Для выбора оптимального способа заготовки тромбоцитов для последующего криоконсервирования-размораживания оценили в динамике процесса число клеток, полученных аппаратным и дискретным методами. Установлено, что число клеток, заготовленных аппаратным методом, более чем в 4 раза превышало таковое в образцах, полученных с помощью дискретного афереза. Некоторое снижение числа тромбоцитов отмечено на каждом этапе замораживания-оттаивания во всех исследуемых образцах, однако эти изменения недостоверны (рис.1).

При оценке уровня агрегации и адгезии в качестве исходного показателя использовали результат измерения свойств нативных клеток. С учетом того, что процедура тромбоцигафереза, при которой кровь соприкасается с чужеродной поверхностью, приводит к концентрированию клеток, как следствие возникает обратимая агрегация тромбоцитов. Поэтому наряду с результатами, соответствовавшими норме для цельной венозной крови, наблюдали снижение агрегационной активности клеток с адреналином и АДФ.

5 4,5

4 4,75

3,5 3 ■И §|

2,5

2 1,5 Ш"

1 0,5 0

е4РКЭ

V

0,95/

Аппаратный аферез Дискретный аферез

Ш нативные щ с протектором Шра

змороженные

Рисунок I — Динамика количества тромбоцитов на этапах «заготовка -смешивание с протектором - размораживание»

В нативных клетках АДФ вызывал необратимую однофазную агрегацию на уровне 13,3±2,9 и 27,8±7,6 соответственно для аферезных ТК и полученных из обогащенной тромбоцитами плазмы (р>0,05). Между заготовленными различными способами нативными ТК не выявлено различий показателя светопропускания и среднего радиуса агрегатов, за исключением небольшого различия величины последнего при индукции коллагеном (рис. 2). Светопропускание, оцененное по методу Вот(1962), после индукции ристомицином составило 44,7±5,31% для аферезных и 49,0±10,2% для дискретных тромбоцитов, сопоставимые результаты получены после индукции

коллагеном - соответственно 50,6±6,4% и 52,3±10,1 процента. Несколько меньше была степень агрегации с адреналином - 25,9±4,5 процента и 28,7±6,9%соответственно (р>0,05).

Рисунок 2 - Динамика способности тромбоцитов к агрегации на этапах «заготовка - смешивание с протектором - размораживание»

При изучении влияния конечной концентрации криоконсерванта на тромбоциты во время эквилибрации не выявлено существенного уменьшения количества клеток, но отмечено некоторое снижение их функциональной активности. Так, степень агрегации пластинок с ристомицином и коллагеном уменьшилась по сравнению с ее значением у нативных в 1,3 раза, а радиус агрегатов ТК, полученных дискретным методом, с АДФ - почти в 1,7 раза (р<0,05).

Показатель агрегации с АДФ, ристомицином и коллагеном размороженных клеток был снижен в сравнении с исходными данными в 1,4 — 1,8 раз как в образцах, заготовленных аппаратным методом, так и дискретным (р<0,005). Радиус агрегатов оказался в большей степени уменьшенным при использовании в качестве индукторов ристомицина, коллагена и адреналина для тромбоцитов, полученных аппаратным аферезом, и АДФ - дискретным

12

(р<0,005). Таким образом, воздействие различных внешних факторов на тромбоциты в процессе тромбоцитафереза, эквилибрации и замораживания-оттаивания оказывают влияние на степень их агрегации, вызывая разнонаправленные сдвиги агрегационной активности.

Сопоставимыми оказались показатели адгезивности к стеклу во всех исследуемых образцах как для ТК, полученных аппаратным, так и дискретным методом (рис. 3). Значения данного параметра не имели достоверных отличий, за исключением размороженных ТК, полученных с помощью аппаратного афереза (р<0,05 в сравнении с нативными).

50 /------* *

40 ■{ ' ./'

35 ¥ | 4

30 г / V ^':

У , - ы '

20 ¥ ,./' ''

15 - . ( «>Г ^ ,

10 ¥ . ■

5 Г _ -' }» . ~ £

о У-................................................■•..........

Аппаратный зферез

Рисунок 3 - Динамика способности тромбоцитов к адгезии на этапах «заготовка - смешивание с протектором - размораживание»

При оценке РГШ (табл. 1) выявлено, что в нативных тромбоцитах процент восстановления оптической плотности был сопоставим с данными литературы; к 10 минуте он не отличался значимо в тромбоцитах, полученных различными методами, однако в дискретных процесс протекал медленнее по сравнению с ТК, заготовленными с помощью сепаратора.

¿т

шРяд! я Ряд2 ¡|РядЗ

дискретный оферез

Таблица 1 - Реакция тромбоцитов на гипотонический шок на различных этапах замораживания-оттаивания (М±ш)

Способ получения РГШ, %

3 минуты 5 минут 10 минут

Аппаратный аферез Нативные ТК 76,5±2,76 76,5±1,89 86,9±1,6

Смешанные с консервантом ТК 77,2±2,0 80,1±1,76** 83,6±1,82

Размороженные ТК 72,07±3,25 79,9±3,15** 77,2±2,7**

Дискретный аферез Нативные ТК 58,2±4,63* 66,1 ±4,64* 79,5±4,9

Смешанные с консервантом ТК 54,6±8,21 61,7±8,32 71,3±7,85

Размороженные ТК 39,1±4,99** 46,4±6,02** 60,8±6,45**

Примечание: * - достоверность отличий показателей тромбоцитного концентрата, полученного методом аппаратного и дискретного афереза (р<0.05), критерий Стьюдента

** - достоверное различие по сравнению с аналогичным показателем нативных тромбоцитов до смешивания с криопротектором, р<0,05, критерий сравнения Уилкоксона.

Необходимо отметить, что восстановление показателя в размороженных клетках оказалась для образцов, полученных обоими методами, несколько замедленным (р<0,05). Однако в целом процент восстановления оптической плотности тромбоцитов был высоким. Динамика реакции на гипотонический шок размороженных пластинок была сопоставима с нативными. Однако в сепараторныхТК, этот процесс оказался более быстрым по сравнению с дискретными, и уже на 5 минуте отмечалось значимое восстановление оптической плотности (р<0,05).

Следует заметить, что аппаратный тромбоцитаферез позволяет получить большее количество кровяных пластинок в ТК по сравнению с дискретным трехкратным аферезом. Это подтверждается достоверно высоким количеством кровяных пластинок в ТК на всех этапах криоконсервирования. Функциональная активность тромбоцитов, полученных разными методами, сопоставима, за исключением восстановления их оптической плотности. В сепараторных клетках оно начинается раньше и более выражено.

14

Для оценки гемостатического эффекта трансфузий криоконсервированных ТК реципиентов разделили на группы по степени тяжести ГС: 1 группа (0 баллов) - 9 (29%) человек, 2 группа (1 балл) — 11 пациентов (37%), в 3 группу объединили 10 больных (34%), проявления кровоточивости у которых соответствовали 2-3 баллам (значимый геморрагический синдром). ГС, тяжестью в 4 балла, не наблюдали.

После переливания размороженных тромбоцитов достоверно уменьшилось число пациентов 3 группы, их доля составила 13% (4 пациента). Тяжесть ГС у них после трансфузий ТК расценивали как 0 - 1 балл (рис. 4). При этом необходимоотметить. что у 1 реципиента кровотечение усилилось и дополнительно потребовалось переливание эритроцитной массы, а у 1 больной динамики не наблюдалось.

Рисунок 4 - Тяжесть геморрагического синдрома по ВОЗ у пациентов до и

после переливания криоконсервированного тромбоцитного концентрата

Примечание: * - значимые отличия от исходного уровня (р<0,05)

Определяли динамику количества тромбоцитов в крови реципиентов до,

через час и через сутки после переливания размороженных ТК (табл. 2).

Среднее число пластинок, определенное в периферической крови через 1 час

после трансфузии достоверно повысилось, а через 18-24 часов оказалось

снижено, но оставалось значимо выше исходного уровня (р<0,05).

15

«Восстановление» уровня тромбоцитов (СПТ1Час) составило 6,5±1,42 х 107л, «выживаемость» кровяных пластинок на следующие сутки (СПТ18-24ч) -2,1±2,61х109/л.

Таблица 2 - Динамика уровня тромбоцитов периферической крови после трансфузии криоконсервированных тромбоцитных концентратов (М±ш)

Показатели Количество тромбоцитов, х 109/л, п=30

Исходный уровень тромбоцитов 13,34±2,23

Уровень тромбоцитов через час после трансфузии 28,45±4,20*

Уровень тромбоцитов через 18-24ч после трансфузии 23,3±4,20*

Примечание". * - достоверное отличие показателя от исходного уровня (р<0,05).

Сравнительный анализ результатов трансфузий размороженных ТК у пациентов в зависимости от отсутствия (первая группа) или наличия у больного сопутствующих неблагоприятных факторов (вторая группа) показал, что в группе больных без отягощающих состояний ГС встречался реже (36%), 64% трансфузий произведены с профилактической целью. В группе с наличием неблагоприятных факторов отмечена тенденция к более частому развитию тяжелого ГС.

Число реципиентов, у которых ГС не был выявлен на следующие сутки после трансфузии, в первой группе превышало, таковое во второй -соответственно 86% и 57%. Показано, что у пациентов в отсутствие неблагоприятных факторов трансфузии размороженных ТК обеспечивали гемостаз в большинстве (85%) случаев, тогда как наличие отягощающих состояний (иммунных и клинических), возможно, стало причиной сохранения или рецидивов ГС в 43%.

Для выявления влияния неблагоприятных факторов на эффективность трансфузий криоконсервированных ТК оценили динамику уровня тромбоцитов, СПТ, число трансфузий, соответствующих критерию достижения эффекта на основании определения СПТ, а также абсолютный прирост количества тромбоцитов через 1 и 18-24 часа (табл.3).

Из результатов, представленных в таблице 3, следует, что пациенты 1 и 2 групп отличались по исходному уровню тромбоцитов, средний уровень которых на момент трансфузии во второй группе превышал таковой в первой в 2,1 раза (р<0,05).

Таблица 3 - Эффективность трансфузий криоконсервированных тромбоцитных концентратов в зависимости от наличия отягощающих факторов (М±ш)

Показатель Группа 1 (п=14) Группа 2 (п=16)

Уровень тромбоцитов в крови реципиента до трансфузии, х 109/л 10,0±2,9 21,6±5,7*

Количество перелитых тромбоцитов в ТК, х10" 4,16+0,39 4,06+0,43

Прирост тромбоцитов через 1 час, х 107л 12,8±2,9 9,1+3,8

Прирост тромбоцитов через 18-24 часа, х 109/л 8,5±3,1 4,1+8,9*

СПТ ! час х 107л 5,76±1,44 6,90±1,99

СПТ , 8.24ч. х 10ч/л 3,91±1,5 0,82+3,85*

Трансфузии с СПТ!час>7,5 х 109/л 67% 29%*

Трансфузии с СПТ18.24часа> 4,5х109/л 44% 33%

Примечание - * достоверные различия (р<0,05)

После переливания ТК указанные показатели в 1 группе, особенно величина абсолютного прироста пластинок и СПТ через сутки, были более значимы. Количество трансфузий со значением СПТ1час более 7,5х109/л с достаточным СПТ|8.24 часа (более 4,5х109/л) у реципиентов без отягощающих также превышало их число у больных с наличием таковых.При этом у пациентов первой группы прирост циркулирующих тромбоцитов оказался равномерным, тогда как его разброс во 2 группе был более значителен. Вероятно, именно с этим фактом связано отсутствие значимых статистических различий уровня СПТ 18-24 часа в исследуемых группах, однако общая тенденция сохранения близкого к достаточному количеству пластинок в крови реципиентов без факторов риска осталась.

Для исключения влияния нозологических, неблагоприятных и других причин на эффективность трансфузий ТК сравнили клинико-лабораторные характеристики прироста клеток после переливания нативных и криоконсервированных пластинок у одних и тех же реципиентов. Период между процедурами составил не более 2 суток, критерии для их назначения были сопоставимы. Короткий интервал позволял при анализе результатов не учитывать различие показателей клинического статуса и факторов иммунной рефрактерности, оказывающих влияние на эффективность трансфузий.

После переливания размороженных тромбоцитов к моменту трансфузии нативных ТК частота выявления значимого ГС (2 и 3 степени тяжести) снизилась с 45% до 8 %. Количество больных, у которых через сутки ГС не отмечен, увеличилось после трансфузий криоконсервированных ТК с 22 до 59% (р<0,05), а нативных - с 59 до 67% (р>0,05).

Таким образом, при переливании нативных и криоконсервированных пластинок получены сопоставимые результаты. В обеих группах после трансфузий наблюдалось уменьшение пациентов с выраженным ГС. Следовательно, трансфузии криоконсервированных тромбоцитов оказывали не меньший гемостатический эффект, чем нативные.

При анализе динамики количества тромбоцитов в крови реципиентов выявлено, что СПТі час после переливания нативных ТК соответствовал критерию эффективности как при наличии отягощающих факторов, так и без них (табл. 4). Аналогичный показатель при трансфузиях размороженных кровяных пластинок был ниже независимо от наличия указанных факторов.

Таблица 4 - Прирост тромбоцитов после трансфузий криоконсервированных и нативных тромбоцитов

Показатели Криоконсервированный ТК Нативный ТК

Всего пар трансфузий, п= 27

СПТ 1час>х 109/л 6,5±1,42 9,4±1,86 *

СПТ 18-24 часа, X 10% 2,1 ±0,94 2,6±1,06

Неблагоприятные отягощающие факторы, п=14

Количество перелитых тромбоцитов, хЮ11 4.1 ± 0.43 3.7 ± 0.29

СПТ 1час,х 107л 4,8±1.60 10.3±2.66

СПТ 18.24 часа. X 10% 0,7 ±2.67 0,8±0,46

Без неблагоприятных отягощающих факторов, п=13

Количество перелитых тромбоцитов в ТК, хЮ11 4.2 ±0.39 4.0±0.66

СПТ 1час,х 10% 6,9±1.28 9.1±1.81

СПТ 18-24 часа, X 10% 3.8±1.31 4.8±1.10

Примечание: * - достоверные отличия, критерий сравнения Уилкоксона

В целом из общего числа переливаний кровяных пластинок достигло уровня СПТ1час>7,5х109/л - 30% при использовании криоконсервированного ТК и 48% - нативного. Близкий к эффективному СПТ через час (4-7,5x10%) получен результат после 22% трансфузий криоконсервированных ТК и 26% нативных. СПТі8_24часа более 4,5х109/л, свидетельствовавший об эффективности гемотрансфузии, получен в 35% при использовании криоконсервированного ТК и в 43% - нативного.

Следовательно, эффективность замороженных и нативных тромбоцитов оказалась сопоставимой (р>0,05). Такой же вывод можно сделать в отношении трансфузий криоконсервированных и свежих ТК, которые не привели к приросту клеток (р>0,05).

Таким образом, следует считать, что эффективность криоконсервиро ванных ТК, использованных при отсутствии свежезаготовленных, не отличается. При этом установлено, что наряду с удовлетворительной гемостатической активностью обеих трансфузионных сред и положительным часовым приростом клеток после трансфузии отмечено низкое количество кровяных пластинок через сутки, особенно в присутствии отягощающих клинических факторов.

На основании проведенных комплексных лабораторных исследований и клинической оценке эффективноститрансфузий криоконсервированных при температуре минус 80°С тромбоцитов с «Тромбокриодмац» установлено, что целесообразно создание запаса замороженных с помощью данного метода кровяных пластинок для экстренных трансфузий в случае отсутствия нативных.

Выводы

1. Режим криоконсервирования тромбоцитов с криопротектором «Тромбокриодмац» при температуре минус 80°С является эффективным, позволяет сохранить до 83% клеток, полученных дискретным, и до 90%, полученных аппаратным аферезом.

2. Качественные свойства размороженных кровяных пластинок: индуцированная агрегация55 - 78%, способность к адгезии 83 - 90%, реакция на гипотонический шок 77 - 89% позволяют использовать их для переливания.

3. Оптимальным методом получения тромбоцитных концентратов для последующего криоконсервирования при -80°С с ограждающим раствором «Тромбокриодмац» является аппаратный тромбоцитаферез, позволяющий выделить лечебную дозу устойчивых к повреждающему воздействию замораживания - оттаивания кровяных пластинок.

4. Трансфузии криоконсервированных тромбоцитовпозволяют купировать геморрагический синдром в 86% случаев при отсутствии иммунных и клинических отягощающих факторов и в 57% - при их наличии.

5. Трансфузии криоконсервированных тромбоцитов оказывают сопоставимый с нативнымитромбоцитными концентратами гемостатический эффект. Адекватный прирост тромбоцитов через 1 час достигнут после 30% переливаний криоконсервированных кровяных пластинок и 48% - нативных. Достаточный скорректированный прирост тромбоцитов через 18-24 часа получен после 35% и 48% трансфузий соответственно.

Практические рекомендации

1. Для бесперебойного обеспечения пациентов гематологических клиник и тромбоцитными концентратами рекомендовано создавать отделение долгосрочного хранения крови и ее компонентов (криобанк).

2. Для создания запаса криоконсервированных тромбоцитных концентратов для клинического применения у больных гемобластозами рекомендуется использовать метод замораживания с криопротектором «Тромбокриодмац» по двухэтапной экспоненциальной программе до -80°С в электрических морозильниках.

3. Оптимальными методом заготовки тромбоцитов для последующего криоконсервирования является аппаратный тромбоцитаферез, позволяющий получать лечебную дозу устойчивых к повреждающему воздействию замораживания - оттаивания кровяных пластинок в меньшем объеме.

4. Криоконсервированные тромбоцитные концентраты следует применять для экстренных трансфузий в случае невозможности переливания нативных одногруппных либо совместимых по системам ABO и Резус тромбоцитов.

Перспективы дальнейшей разработки темы

Перспективными являются исследования, направленные на определение оптимальных механизмов функционирования криобанка, его структуры, определению объемов неснижаемого запаса криоконсервированных гемокомпонентов.

Разработан также ряд режимов криоконсервирования кровяных пластинок в условиях умеренно-низких температур. Важной представляется их клиническая апробация.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Криоконсервирование терапевтических доз тромбоцитных концентратов / Ф.С. Шерстнев, A.A. Костяев, Т.П. Загоскина C.B. Утёмов, Н.М. Турина, Н.Л. Ежова // Мат. научно-практ. конф. молодых ученых «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины». (Киров, 17-18 апреля, 2007), Киров, 2007. - С.22 -24.

2. Костяев, A.A. Способ криоконсервирования тромбоцитов / A.A. Костяев, Ф.С. Шерстнев, C.B. Утемов // Патент РФ №2326532. Заявлено 29.08.2006; Опубл. 20.06.2008, Бюл. №17.

3. Криоконсервирование тромбоцитов в лечебных дозах / Ф.С. Шерстнев, A.A. Костяев, C.B. Утемов [и др.] // Всерос. совещ. «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Епифановские чтения)». - Киров, 2008,- С.52-53.

4. Опыт клинического применения криоконсервированных тромбоцитных концентратов / Ф.С. Шерстнёв, C.B. Утёмов, A.A. Костяев, Н.Л. Ежова // Трансфузиология,- 2008,- №1-2, Т. 10. - С. 70.

5. Бутина, Е.В. Эффективность иммунологического подбора доноров тромбоцитов / Е.В. Бутина, Г.А.Зайцева, Ф.С.Шерстнев // Гематология и трансфузиология. - 2010. -Т.55, №5. - С.36-37.

6. Шерстнев, Ф.С. Криоконсервирование донорских тромбоцитов, заготовленных аппаратным методом. Ф.С. Шерстнёв, C.B. Утёмов, A.A. Костяев // Мат. Всерос.конф. «Проблемы заместительной терапии концентратами тромбоцитов»,- М., 2010.- С - 26.

7. Клиническое применение тромбоцитных концентратов, криоконсервированных при -80°С с раствором «Тромбокриодмац» /Ф.С.Шерстнев, C.B.Утемов, A.A. Костяев//Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины. - Киров, 2010.- С. 116-117.

8. Агрегационная активность донорских тромбоцитных концентратов / Ф.С. Шерстнев, Н.Л. Ежова, C.B. Утемов[и др.] // Трансфузиология,- 2011.- №2,Т. 12.- С.135-136.

9. Эфффективность трансфузий криоконсервированных донорских тромбоцитных концентратов в гематологической клинике / Шерстнев Ф.С., Костяев A.A., Загоскина Т.П.[и др.] // Пермский медицинский журнал,- 2012.-№6,- С. 5-10.

10. Сравнение эффективности трансфузий нативных и криоконсервированных тромбоцитных концентратов / Ф.С. Шерстнев, C.B. Утемов, A.A. Костяев, Т.П. Загоскина, К.А. Ветошкин, A.B. Лянгузов, Н.В. Минаева, СЛ. Калинина // Всерос. науч.-практич.конф. молодых ученых с межд. участием «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Епифановские чтения)».- Киров, 2012,- С. 114 - 115.

11. Криоконсервирование донорских тромбоцитных концентратов / Ф.С. Шерстнев, C.B. Утемов, A.A. Костяев[и др.] // В сб. «Холодовая цепь в службе крови»,- М., 2012.- С. 35.

12. Сохранность донорских тромбоцитов при их замораживании под защитой комбинированногокриоконсерванта / К.А. Ветошкин, Е.П. Сведенцов ... Ф.С. Шерстнев[и др.] // Трансфузиология. - 2012. - № 3, Т.13.- С. 39 - 40.

13. Сведенцов, Е. П. Комбинированный криопротекторный раствор для замораживания тромбоцитов / Е.П. Сведенцов, К.А. Ветошкин, ... Ф.С. Шерстнев[и др.]// Патент РФ №2477953, Приоритет от 12.03.2012., Зарегистрирован 27.03.2013.

14. Эффективность трансфузий нативных и криоконсервированных тромбоцитов у больных гемобластозами / Ф.С. Шерстнев, A.A. Костяев, C.B. Утемов[и др.] // Вестник службы крови России - 2013. - №2. - С. 31-34.