Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка методов лабораторной диагностики цирковирусной инфекции свиней

На правах р\ копнем

ТИМИНА Анна Михаиловна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЦИРКОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ СВИНЕЙ

16.00.03 «Ветеринарная микробиология, вир) сологая. эпизоотология, микология с чикотоксикологией и иммунология»

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2006

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных»

На\ чный р> ководнтель - кандидат биологических на\ к

Щербаков Алексей Владимирович

Официальные оппоненты: - доктор ветеринарных наук, профессор Узюмов

Василий Лаврентьевич, (ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир); - доктор биологических наук, профессор Цыбанов Содном Жамьянович, (ВНИИВВиМ. г. Покров)

Вед\ шая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт экспериментальной ветеринариии (ВИЭВ. г. Москва)

Защита диссертации состоится «29» июня 2006 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, п. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат разослан «<?£» мая 2006 года

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук.

старшин на>чныи сотрудник се ¿■-¿¿¿г^' Г.М.Семёнова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Эмерджентные болезни являются одной из наиболее актуальных проблем современного животноводства. В инфекционной патологии свиней важная роль принадлежит недавно получившим широкое распространение болезням, ассоциированным с цирковирусами.

У свиней идентифицированы два вида цирковирусов. Цирковирус свиней типа 1 (ЦВС-1) был обнаружен в 1974году как нецитопатогенный контаминант перевиваемой культуры клеток почек поросят PK-15 (Tischer I., 1974) и считается непатогенным вирусом, так как не вызывает каких-либо клинических признаков у инфицированных животных. Цирковирус свиней типа 2 (ЦВС-2) был впервые выделен от больных поросят в Канаде в 1998г. (Allan G.M., 1998; Meehan В.М., 1998; Ellis J.A., 1998) и является первичным этиологическим агентом синдрома мультисистемного истощения поросят-отьёмышей (СМИО). Кроме того, этот вирус ассоциирован с синдромом нефропатии и дерматитов поросят, а также вовлечён в респираторную и репродуктивную патологию свиней. ЦВС-2 распространён во всех странах с развитым свиноводством, причём встречается практически в 100% стад. Чрезвычайно широкое распространение ЦВС-2 и многообразие клинических проявлений инфекции делают его одним из наиболее значимых для современного свиноводства инфекционных агентов (Chae С., 2004). По современным оценкам заболевания, связанные с ЦВС-2, особенно СМИО, обходятся Европейским производителям в 600 млн. евро в год (Charreyre С., 2005).

В России ЦВС-2 был впервые обнаружен в 2000 году (A.B. Щербаков и др., 2003). Цирковирусная инфекция была установлена во многих из обследованных хозяйств РФ. В то же время неизученным оставался широкий круг проблем, связанных с этой инфекцией: степень распространения цирковирусов среди домашних свиней и диких кабанов, генетическое разнообразие вируса, циркулирующего на территории России, вовлечённость ЦВС-2 в различные формы инфекционной патологии свиней. Обусловлено это

было гем. что о гсу тствоаали, либо были несовершенны методы диагностики цирковир)сноп инфекции.

Цели и задачи исследования. Основная цель данной работы состояла в разработке методов диагностики цирковпруснон инфекции свиней и применении разработанных методов для из>чения распространения и клинического проявления этой инфекцин на территории РФ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать метод обнаружения и типирования цирковирусов свиней, основанный на мультиплексной ПЦР;

- применить разработанный метод в диагностических исследованиях и изучить связь между различными формами инфекционной патологии свиней и наличием ЦВС;

- провести филогенетический анализ изолятов ЦВС-2, циркулирующих в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне РФ:

- исследовать на наличие цирковирусов клеточные культуры, применяющиеся в ФГУ "ВНИИЗЖ" для вирусологических исследований и производства вакцин;

- получить рекомбинантный капсидный белок ЦВС-2 и разработать на его основе иммуноферментную тест-систему для выявления антител к вирусу в сыворотках крови свиней;

- применить разработанную иммуноферментную тест-систему для изучения распространения ЦВС-2 в хозяйствах РФ.

Научная новизна исследований. Разработан метод обнаружения и типирования цирковирусов свиней, основанный на мультиплексной ПЦР.

Изучены особенности клинического проявления иирковнрусной инфекции свиней в хозяйствах РФ.

Проведен филогенетический анализ российских изолятов ЦВС-2. показано большое генетическое разнообразие вируса, циркулирующего в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне РФ.

Получен рекомбинантный капсидный белок цирковируса свиней типа 2 и на его основе разработана иммуноферментная тест-система для выявления антител к ЦВС-2.

Проведён мониторинг цирковирусной инфекции свиней и показано чрезвычайно широкое распространение ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах РФ и среди диких кабанов.

Практическая значимость исследований. В результате проведённых исследований разработаны следующие методики:

«Методика обнаружения и типирования цирковирусов свиней с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ ВНИИЗЖ 02.06.2005г.;

«Методика обнаружения антител к цирковирусу свиней типа 2 в непрямом варианте иммуноферментного анализа», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ ВНИИЗЖ 29.09.2005г.

Разработанные методики используются в диагностике цирковирусной инфекции свиней.

Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и опубликованы на 5-й всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва. 19-21 октября 2004г.), на 3-й международной научно-практической конференции «Ветеринарне забеспечення свинарства: сучасний стран i шляхи розвитку» (Харьков, 2005г.), «International Conference on Animal Circoviruses and Associated Diseases» - Queen's University, (Belfast, Northern Ireland, UK. 1 lth-13th September 2005), на заседаниях учёного совета ФГУ "ВНИИЗЖ" в 2004-2006 гг.

Основные положения, выноашые на защиту:

Метод обнаружения и типирования цирковирусов свиней, основанный на мультиплексной ПНР.

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург

ОЭ 20q£ акт 5Щ

Ршультаты изучения клинических проявлений цирковирусной инфекции свиней в хозяйствах РФ.

Репльтаты филогенетического анализа российских изолятов ЦВС-2.

Роко.мбинантный капсидный белок ЦВС-2 и разработанная на его основе и.мм>ноферментная тест-система для выявления антител к вирусу.

Результаты использования разработанной и.ммунофер.ментной тест-системы в серологическом мониторинге цирковирусной инфекции.

Структуры и объём работы. Диссертация изложена на 130 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и приложения. Список используемой литературы включает 207 источников, из которых 192 иностранных. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 15 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы Патологический материал. В работе использовали органы и ткани от свиней и диких кабанов из хозяйств РФ.

Клеточные культуры. Клеточные культуры, используемые в ФГУ "ВНИИЗЖ" для вирусологических исследований и производства вакцин: PK-15, СПЭВ. ГК, Vero, ПСГК, Marc-145, ППК-666. ВНК 21, СП.

Вирусы и бактерии. Для проверки специфичности мультиплексной ПЦР были использованы вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней, вирус болезни Ауески (ВБА), парвовирус свиней (ПВИС), цитомегаловирус свиней (ЦМВ), лимфотропный герпесвирус свиней (ЛГВ), вису с трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС). вирус эпизоотической диапеи свиней, ротавирус свиней и бактерии Pasteurella multocida. Actinobac:ilus pleuropneumoniae. Haemophilus parasuis. Mycoplasma hvopneumoniae. Mycoplasma hyorhinis, Bordetella bronchiseptica, Streptococcus suis.

Staphylococcus sp.. Escherichia coli. Clostridium perfringens, Salmonella choleraesuis.

Сыворотки. Использовали полевые сыворотки от домашних свиней и диких кабанов из свиноводческих и охотничьих хозяйств различных регионов России.

Бактериальные штаммы. Для трансформации и экспрессии рекомбинантных плазмид использовался штамм Ml5 E.coli: [pREP4] E.coli К12 (nal\ str\ rif, lac', ara', gal", mtl", F'*, recA", uvr", Ion") pREP4 - kanr. Источник штамма - фирма «Qiagen».

Плазмпды. Для получения экспрессируюшей конструкции была использована плазмида pQE (фирма «Qiagen»).

Пероксидазный конъюгат. Использовали коммерческий препарат антисвиных антител против иммуноглобулина IgG. меченных пероксидазой хрена, полученный из института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва.

Выделение ДНК. Выделение суммарной ДНК из патологического материала и культуры клеток проводили по модифицированному методу О.Г. Грибанова с соавторами (О.Г. Грибанов. 1996), либо с использованием набора реагентов GenePak™ «Биоком» (Москва).

Расчёт н синтез праймеров. Расчёт праймеров выполняли на основе нуклеотндных последовательностей цирковирусов свиней типа 1 и 2, представленных в базе данных GenBank. Синтез праймеров осуществляла фирма «Синтол» (Москва).

ПЦР проводили в реакционной смеси следующего состава :2,5 мкл 10х буфера для Тац-полимеразы, 3 мМ Mg2~, 0,2 мМ dNTPs, 1,0 ед. Taq-полимеразы, по 10 пмоль праймеров, 3 мкл раствора вирусной ДНК и воду до конечного объема 25 мкл. Амплификацию проводили на ДНК-амплификаторе Minicycler РТС-100 (MS Research, США) или Mastercvcler gradient (США) при следующем температурном режиме: 2 мин предварительной денатурации при 94°С. 35 циклов амплификации (40 сек денатурации при 94°С, 30 сек отжига

праймеров при 55^. 30 сек элонгашш ".ри 72°С) и 2 мин заключительной элонгации. При необходимости проводили второй раунд амплификации с внутренними праимерами в смеси аналогичного состава в течение 20-25 циклов. Продукты реакции анализировали с помощью электорофореза в 2.0% агарожом геле, содержащем 0.001% бромистого этндия. при силе тока 50 мА.

Н\ клеотндное секвенированне проводили с использованием набора «fmol DNA Cycle Sequencing System» (Promega. США) согласно инструкции. Для сравнительного анализа установленных последовательностей ДНК и графического построения дендрограмм использовали пакет прикладных программ SeqProgs.

Молекулярное клонирование продуктов ПЦР. Продукты ПЦР очищали от компонентов реакционной смеси по методике, аналогичной выделению ДНК. Реакции рестрикции и лигирования проводили в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей ферментов. Трансформацию и приготовление компетентных клеток E.coli проводили по методике Ханаана (1988). Культивирование E.coli проводили в среде LB и на LB-arape при 37°С. Скрининг клонов, несущих рекомбинантные плазмилы, проводили с помощью аналитического выделения плазмид и последующего рестрикционного анализа. Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli осуществляли методом щелочного лизиса по методу Бирнбойма и Доли, модифицированного Н.Г. Холодиловым (1990).

Экспрессия рекомбинантных белков. Экспрессию рекомбинантных белков проводили добавлением индуктора (ИПТГ) в дневную культуру клеток, достигшую логарифмической фазы роста.

Очистка рекомбинантных белков. Очистку рекомбинантных белков проводили с помощью металл-хелатной хроматографии. Осадок клеток E.coli обрабатывали лизирующим буфером, затем центрифугировали 5 мин при 12000 об мин. К надосадку добавляли Ni-NTA agarose («Qiagen») и инкубировали при помешивании 15 мин. Сорбент дважды промывали лизирующим буфером. Белки переводили в раствор с помошью элюируюшего буфера. Уровень

экспрессии и степень очистки препарата белка оценивали с помощью электрофореза з ПААГе. Концентрацию белков определяли по БредФорл> (Егоров. 1991).

Непрямой вариант ИФА. Тестирование сывороток в ИФА методом последовательных разведений и методом одного разведения проводили по общепринятой методике с некоторыми модификациями.

При использовании коммерческого набора «Ingezim circovirus IgG IgM» (Ingenasa, Испания) постановку ИФА и интерпретацию результатов проводили в соответствии с инстру кцией фирмы-производителя.

Статистическая обработка результатов. Определение среднего арифметического ( X ) при количестве опытов (п), среднего квадратичного отклонения (сг) средней арифметической проводили согласно руководству И.В.Полякова(1975).

Для обработки данных ИФА использовали компьютерную программу Power Basic, которая регрессионным анализом (приближение функций по методу наименьших квадратов) позволяла рассчитывать значения параметров уравнения А, В . значение коэффициента корреляции R, стандартную ошибку и построить линию регрессии.

При определении согласованности разработанной иммуноферментной тест-системы и коммерческого набора '(Ingezim circovirus IgG / IgM» (Ingenasa. Испания) использовали метод капа-статистики (Shoukri M.N.. 1996: С.А. Дудников, 2005).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка мультиплексной ПЦР для выявления и типирования цирковирусов свиней

В результате анализа нуклеотидных последовательностей генома цирковирусов. представленных в базе данных GenBank. были установлены участки гена ОРС2. в которых наблюдались значительные отличия между ЦВС-

1 и ЦВС-2 и. одновременно, высокая консервативность последовательностей для всех изолятов в пределах типа.

Для выявления н типнрования иирковирусов свиней были сконструированы три прай.мера. один из которых является универсальным для обоих вирусов, а два других - видоспецифичными для ЦВС-! и ЦВС-2. Пранмеры были рассчитаны таким образом, что фрагменты ДНК. амплифицируе.мые в ходе ПЦР. имеют различную длину: 613 пар нуклеотидов для ЦВС-2 и 370 п.н. для ЦВС-1. Это позволяет определять тип цирковируса свиней з исследуемых пробах по размеру ампликона. Взаимное расположение праймеров на геноме представлено на рисунке 1 Для увеличения аналитической чувствительности метода система была дополнена двумя внешними прай.мерами, универсальными для обоих типов.

613 п.н. ЦВС 2

ОРС 2

Рис. 1. Расположение на геноме универсального и типоспеиифичных праймеров для обнаружения и дифференциации иирковирусов свиней Примечание: ЦВС - универсальный праймер для иирковирусов саинен ЦВС 1 и ЦВС2 - специфичные праймеры хтя ЦВС типа 1 и типа 2 соответственно

На рисунке 2 показаны возможные результаты мПЦР. Как видно из фотографии агарозного геля, в пробах, содержащих ЦВС-2. синтезируется фрагмент ДНК длиной 613 п.н. (треки 8. 9, 10, I П. в пробах, содержащих ЦВС-1. лмплифицируется фрагмент длиной 370 л.н. (треки 7). в пробах, содержащих оба вируса, два фрагмента соответствующей длины (треки 5. 12).

Для проверки специфичности метода были использованы материалы, содержащие другие вирусные или бактериальные патогены, --асто

обнаруживаемые > больных свиней: вирус РРСС. вирус болезни Ауески, парвовирус свиней, цитомегаловирус свиней, лимфотропнын герпесвирус свиней, вирус ТГС. вирус эпизоотической диареи свиней, ротавирус свиней. Pasteurella multocida. Actinobacillus pleuropneumoniae. Haemophilus parasuis. Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis. Bordetella bronchiseptica, Streptococcus suis. Staphylococcus sp.. Escherichia coli. Clostridium perfringens, Salmonella choleraesuis. В пробах, содержащих перечисленные инфекционные агенты, в мПЦР со специфичными для ЦВС праймерами не наблюдалось синтеза фрагментов ДНК.

12 3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 13

Рис. 2. Обнаружение и типирование цирковирусов свиней методом мультиплексной ПЦР Примечание: Трек 1 - отрицательный контроль:

Треки 2.3.6- отрицательные пробы:

Треки 8. 9, 10, 11 - тканевые суспензии от поросят, содержащие ЦВС-2:

Треки 4. 7 - культуры клеток, содержащие ЦВС-1:

Трек 5 - культура клеток содержащая ЦВС-1 и 11ВС-2:

Трек 12 - положительный контроль (смесь ЦВС-1 и ЦВС-2);

Трек 13 - маркер (снизу вверх: 100. 200. 300. 400. 500. 600 п.н. и т.д.).

Таким образом, разработанный метод позволял специфически выявлять и типировать цирковирусы свиней в пробах патологического материала и клеточных культурах. По результатам комиссионных испытаний предложенная «Методика по обнаружению и типированию цирковирусов свиней с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции» была одобрена Учёным советом и утверждена директором ФГУ ВНИИЗЖ

Применение мПЦР в диагностических исследованиях Согласно данным зарубежной литературы, с ЦВС-2 ассоциированы различные заболевания свиней: синдром мультисистемного истошения

отьёмышей (СМИО), пневмонии, дерматит и синдром нефропатни (ДСНП), врождённый тремор (ВТ) и некоторые другие.

Чтобы определить роль цирковир>сов в инфекционной патологии свиней в животноводческих хозяйствах РФ, с использованием разработанного метода исследовали более 500 проб патологического материала. Пробы были получены в период 2000-2005 гг. из 106 хозяйств различных регионов РФ. На наличие ЦВС исследовались органы и ткани от свиней с респираторной патологией и признаками СМИО, от мертворожденных поросят, свиноматок с нарушением воспроизводительной функции или агалактией, свиней с дерматитами, признаками нефропатии, патологией нервной системы. Кроме того, анализировали органы и ткани клинически здоровых животных, в том числе сперму хряков-производителей.

Основными формами клинического проявления ЦВС-2 инфекции в странах Западной Европы и Северной Америки является СМИО и комплекс респираторных заболеваний, причем часто бывает трудно их дифференцировать. Проведенный нами ан&тиз ситуации показал, что в российских свиноводческих хозяйствах СМИО также тесно взаимосвязан с респираторным комплексом, и эти две формы инфекционной патологии очень

>5 90 "

| 80 -

2 70 -

| 60 -

| 50 -

| 40 -

| 30 -

= 20 -

= 10 -

* о-

0-2 мес 2-4 мес 4-6 мес старше 6 мес

Рис. 3. Зависимость обнаружения ЦВС-2 методом ПЦР от возраста свннеп

и

трудно разграничить. В российских хозяйствах истощение поросят, как правило, является следствием развития у них респираторных заболеваний в послеотьемном возрасте, и поражение органов дыхания является главной формой патологии у поросят с признаками истощения.

За период 2000-2005 гг. на наличие ЦВС была исследована 321 проба патологического материала от свиней с респираторной патологией. Исследовались различные возрастные группы свиней: от новорожденных поросят до свиноматок. Зависимость частоты обнаружения ЦВС-2 в патматериале от возраста животных отражена на рисунке 3.

Наибольшее количество ЦВС-положительных животных (78,3%) приходилось на возраст 2-4 месяца, что соответствует послеотьёмному периоду. Высокий процент (72,7%) обнаружения ЦВС-2 наблюдался и у поросят в период откорма (4-6 месяцев). Частота обнаружения ЦВС-2 у поросят-сосунов и свиноматок с респираторной патологией была значительно меньше: 20,8 и 31,5 % соответственно. Таким образом, наши исследования подтвердили, что респираторные заболевания, ассоциированные с ЦВС-2, присущи, главным образом, поросятам послеотъемного периода.

Примечательно, что именно у поросят-отъёмышей респираторная 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

к «4

~ """""" """ • — — — — а» ¿¡¡4—зоо п н.

1 I

Рис. 4. Обнаружение ЦВС-2 методом мПЦР в различных органах и тканях поросёнка с поражениями лёгких и истощением

Примечание:

треки 1.17- маркер (снизу вверх: 100. 200. 300. -00. 500. 600. 700 п.н. и т.д.). трек 2 - отрицательный контроль.

треки 3-12 - результаты мПЦР с ДНК из ющнх органов и тканей больного поросенка: сердца, легких, лимфоузлов, селезенки, головного мозга, кишечника, поджелудочной железы, почек, печени. миндалин. коови. сыворотки, носовых истечений: трек 16 - положительный контроль (смесь ЦВС-' и ЦВС-2).

клиника сопровождалась истощением, тогда как у других возрастных групп признаки СМ! 10 были выражены в гораздо меньшей степени или вовсе отсутствовали.

На рнс\нке 4 показаны результаты тестирования на наличие ЦВС-2 органов и тканей поросёнка с респираторной патологией и признаками СМИО. Как зидно из фотографии, метолом мПЦР ЦВС-2 обнаруживали во всех анализир\-емых знутренних органах и тканях за исключением головного мозга и сыворотки крови. Наличие вируса в столь широком спектре органов свидетельствует о мультисистемном характере заболевания.

Таблица 1

Результаты комплексного исследования патологического материала от

поросят с респираторной патологией и истощением на наличие ___инфекционных агентов_

М- хозяйства область, край Обнаруженные возбудители

ЦВС-2 другие 1 вирусы сем РаБГеигеПасеае микоплазмы другие бактерии

Да I Московская -г 1 ! Н. рапкшБ А.р1еигорпеишошае - -

№ 2 Новгородская РРСС цмв Р. тикоаёа (0) Н. рагавшБ М. Ьуорпеитошае М. ИуогЫшв стрептококки, стафилло-кохки

№3 | " ' РРСС Новосибирская Р. тикоаёа (0) М. Ьуорпеитошае М. ЬуогЫтэ стрептококки

ЛЬ 4 - РРСС Вологодская , ЦМВ 1 ' лгв Н. рагавшБ М. Ьуорпеитошае М. ЬуогЫшв стрептококки

Ла 5 - РРСС | Н. рагаБШБ Оатовская > -

№ 6 ! - РРСС 1 Н. ракишз Рязанская 1 М. Ьуорпеитошае М. ЬуогЫгш ■

X» 7 - РРСС Краснодарский ПВИС Н. рататв М. ЬуогЫшБ

X» 8 - РРСС 1 Р. тЫкхпёа (А) Хабаровский ВБА | Н. рагашБ цмв ; лгв 1 М. Ьуорпеитошае

.V« 9 - РРСС ( Р. тиИоЫа Белгородская 11МВ Н. рагашБ | А.р1еигорпеитотае М. Ьуорпеитошае М. ЬуогЫп1э сальмонел лы

.V» 10 - РРСС , Р. тикоЫа (А) Самарская ЦМВ | Н. рагашБ 1 ЛГВ ' М. Ьуорпеитошае М. ЬуогЫшБ стрептококки

Необходимо отметить, что в наших исследованиях практически не было случаев, чтобы ЦВС-2 был обнаружен в легких больных поросят как единственный инфекционный агент. Все случаи респираторных заболеваний и СМИО имели форму смешанной инфекции. Наряду с цирковирусом в материале от больных поросят часто обнаруживали вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней и различные бактерии: Pasteurelia multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae. Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis и другие. Эти результаты согласуются с точкой зрения, согласно которой полная клиническая картина, характерная для СМИО, развивается при совместном действии ЦВС-2 с другими инфекционными агентами.

В таблице 1 в качестве примера приведены результаты обследования нескольких крупных свинокомплексов, в которых у поросят периодов доращивания и откорма наблюдали признаки поражения респираторной системы и синдром истощения. Как видно из таблицы 1, в лёгких поросят одновременно с ЦВС-2 обнаруживали другие инфекционные агенты вирусной и бактериальной природы.

Помимо СМИО и респираторной патологии с ЦВС-2 связывают ряд других заболеваний: дерматит и синдром нефропатии, врождённый тремор, репродуктивные нарушения и перинатальный миокардит, гранулематозный энтерит, экссудативный эпидермит, некротизируюший лимфаденит, некротизируюший трахеит и другие. В связи с этим на наличие ЦВС нами были исследованы пробы пагматериала от свиней с нарушениями воспроизводительной функции, поражениями почек, дерматитами и патологией ЦНС.

При исследовании 53 проб патматериала от абортированных плодов ЦВС-2 не обнаружили ни разу, а при исследовании плацент от абортировавших свиноматок этот вирус выявили лишь в одном случае из -6. Таким образом, результаты наших исследований свидетельствуют о незначительной роли цирковирусов в репродуктивной патологии свиней в хозяйствах РФ.

Для изучения роли хряков-производителей, лак фактора передачи вируса, мы провели исследование 85 образцов спермы хряков. посту пивших на анализ из пяти свиноводческих хозяйств. В пе51ес1-ГЩР не выявили ни одного ЦВС-положительного образца.

При исследовании патматериала от свиней с поражениями почек и дерматитами ЦВС-2 обнаружили в 2 образцах из 15. У свиней с симптомами поражения центральной нервной системы цирковирусы не выявили ни в одном из исследованных случаев.

Таким образом, в результате проведённых исследований было установлено, что в российских хозяйствах ЦВС-2 ассоциирован, главным образом, с респираторной патологией и синдромом истощения поросят послеотъёмного периода. Роль этого вируса в других формах инфекционной патологии свиней в хозяйствах РФ, по-видимому, очень незначительна.

Исследование патматериала и внутренних органов от диких кабанов Для многих инфекционных заболеваний свиней дикие кабаны рассматриваются как природный резервуар и потенциальный источник-инфекции. С целью изучения распространения ЦВС-инфекшш в дикой фауне был исследован патологический материал от диких кабанов, павших или отстрелянных с диагностической целью во Владимирской. Московской и Тверской областях.

Методом мПЦР ЦВС-2 выявили у кабанов в семи из четырнадцати обследованных охотохозяйств. Необходимо отметить, что у животных не наблюдалось патологоанатомических изменений, характерных для СМИО или комплекса респираторной патологии, то есть имело место бессимптомное вирусоносительство.

Таким образом, проведенные исследования позволили установить, что ЦВС-2 распространён в популяции диких кабанов на территории России, и эти животные могут являться природным резервуаром возбудителя цирковирусной инфекции свиней.

Исследование на наличне цирковирусов свиней клеточных культу р. применяющихся в ФГУ ВНИИЗЖ

Цирковирусы свиней способны инфицировать различные типы клеточных культур. Применение контаминированных вирусом культур клеток для изготовления живых аттенуированных вакцин представляет потенциальную опасность для свиноводства, так как может приводить к инфицированию цирковирусами вакцинируемых животных.

В связи с этим используемые в ФГУ ВНИИЗЖ клеточные культуры исследовались на наличие контаминации цирковирусами свиней. В результате проведенных исследований установили, что пять из семи исследованных образцов культур клеток СПЭВ и РК-15 контаминированы цирковирусом свиней первого типа. Несмотря на то, что описана способность ЦВС-1 реплицироваться в клетках почки африканской зелёной мартышки, все протестированные нами образцы клеток Vero не содержали этот вирус.

Все тестируемые образцы культур клеток оказались свободными от ЦВС-2.

Секвенирование и филогенетический анализ российских изолятов

ЦВС-2

Одной из задач наших исследований было изучение генетического разнообразия вируса, циркулирующего на территории России.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура ОРС2 одиннадцати изолятов ЦВС-2 от домашних свиней и семи изолятов от диких кабанов, выделенных в различных хозяйствах РФ в 20002006 гг. Филогенетический анализ установленных последовательностей проводили с использованием программы SEQPROGS. При проведении сравнительного анализа использовали имеющиеся в информационной системе GenBank последовательности гена ОРС2 цирковирусов. выделенных в различных регионах планеты.

Дендрограмма. отражающая филогенетические взаимоотношения изолятов ЦВС-2. представлена на рисунке 5. Из нее видно, что ЦВС-2 отличается большим генетическим разнообоазием. и изоляты ЦВС-2. зыделень; г з

различных регионах мира, образуют несколько генетических групп (кластеров). Охарактеризованные нами российские изоляты оказались представленными сразу в нескольких кластерах.

Примечательно, что все российские изоляты от домашних свиней были близки в филогенетическом отношении к изолятам. выделенным на территории Западной Европы и Канады. Близкое генетическое родство российских и зарубежных изолятов, вероятно, объясняется тем. что в Россию завозят племенных животных из разных стран мира.

В близком филогенетическом родстве с изолятами от домашних свиней находились несколько изолятов, выделенных от кабанов (Истринский/каб/05, Талдомский/каб/05, Конаковский/каб/05), что может объясняться передачей вируса от домашних животных диким. В то же время изоляты Волоколамский/каб/05, Суздальский/каб/05, Кимрский/каб/05 и Покровский/каб/05, также выделенные от диких свиней, образовали обособленные кластеры. Не было обнаружено зависимости между географическим происхождением изолятов от диких кабанов и их принадлежностью к тому или иному кластеру. Изоляты из двух соседних районов (Кимрский/каб/05 и Конаковский/каб/05) представляли разные генетические группы, и, наоборот, изоляты из разных областей (Волоколамский/каб/05 и Суздальский/каб/05) принадлежали к одному кластеру.

Таким образом, в результате проведенных исследований было показано, что в российской популяции диких кабанов циркулируют цирковирусы различного происхождения: некоторые изоляты. вероятно, характерны именно для дикой фауны, тогда как другие были привнесены в нее от домашних свиней.

Смена штаммов ЦВС-2 в хозяйствах - еще один г.пкт. установленный в ходе филогенетического анализа. Изоляты. з^деленные в двух свинокомплексах Вологодской области (Налеезо 2003. Ботово/2000) соответственно в 2000 и 2003 гг., принадлежали к однсГ; ~епогруппе. а изоляты

2005 и 2006 гг. (Ботово/2005. Надеево/2006) из этих же хозяйств - к другой группе (рисунок 5).

'8_L

1_L

процент нуклеотилных различий

tí

CHIDQ017260 (,!R»n ví'I.sr.i CHIDQ23I5I6 Ярославль/2004 YIockm/2005 FRA AF055393

- Воронеж/2003

• ikrpiliuuu.l KJÚ

- Ботовоо/2005

- Надеево/2006 -Минск/2004

- Хабаровск/2004

■К'ичршиькаШ?

• №Li(>KuiaMtk'iiii<k'ju i):

- С) иальскии/кап И5

- ISU-31/L'SA AJ223I85 " JAP AB07230I •SKORAF454546

• SAFR AY325495 -2B/CAN AFU2862 ■ Красиолар/2004 -CERAF20I306 ■AUSTRIA NC005148

- Таллочскни 'кйн'О? ■Наокю/2003

-2E/CAN AFI09399 -Ботом/2000

— Коиакоккпижаб "5

— ПлКрОВСКПН Kjii'll*

— МапштныГ|/2001

— 2C/CAN AF109398 -2D/CANAFU7753

J

Рис. 5. Дендрограмма, отражающая уровень гомологии нуклеотидных последовательностей гена ОРС2 изолятов ЦВС-2, выделенных от домашних свиней и диких кабанов (хаб).

Генетические исследования аирковирусов свиней проводятся не только с целью установления уровня сходства или различия между изолятами из разных географических регионов, но и для того, чтобы определить, существуют ли отличия на уровне генома между изолятами, выделенными от больных животных, и изолятами от <ллнически здоровых свиней. Большинство

исследователем приходит к выводу, что нет существенных генетических отличий между изолятамн ЦВС-2. полученными от СМИО положительных и СМПО отрицательных (клинически здоровых) свиней, а клинические проявления ЦВС-инфекции зависят не от мутаций в геноме вируса, а от так называемы.х "дополнительных факторов", необходимых для развития СМИО.

Проведенный нами генетический анализ российских изолятов ЦВС-2 также позволяет сделать заключение об отсутствии генетических маркеров вирулентности ЦВС-2, так как многие изоляты вируса, выделенные от больных и клинически здоровых животных, были генетически близки между собой.

Таким образом, в результате проведённого филогенетического анализа нами было установлено большое генетическое разнообразие российских изолятов ЦВС-2, выделенных от домашних свиней и диких кабанов: отсутствие зависимости между принадлежностью ЦВС-2 к тому или иному генетическому кластеру и географическому происхождению изолята. Кроме того показано, что в хозяйствах может происходить смена штаммов ЦВС-2. Принципиальные отличия на уровне генома между изолятами ЦВС-2 от клинически больных и клинически здоровых животных отсутствуют.

Получение рекомбинантного капсидного белка ЦВС-2 в системе экспрессии Е. coli

Диагностика ЦВС-инфекции может осуществляться не только путем обнаружения вируса в органах и тканях свиней, но и определением антител к нему в крови животных, причем обнаружение антител имеет преимущество при проведении массовых исследований. В связи с этим одна из целей нашей работы состояла в разработке иммуноферментной тест-системы для выявления антител к цирковирусу свиней типа 2. Поскольку данный вирус плохо размножается в культурах клеток, в качестве антигена для ИФА использовали рекомбинантный капсидный белок ЦВС-2.

Схема конструирования плазмиды. экспрессии;.кэшей рекомбинантный белок ЦВС-2. показана на рисунке 6.

геном uiiDMJBiipjca свк-еЛ типа С

cap (ОРС2) —

гер (ОPC!)

. пцр

ОРС2

8amH1 I -1 Hino 111

Hind III

Рис. 6. Схема клонирования гена ОРС2 цирковируса свиней типа 2 в экспрессируюшую плазмиду pQE

ДНК ЦВС-2 выделяли из 10% суспензии лимфоузлов поросенка с признаками СМИО. Ген, кодирующий капсидный белок вируса, амплифицировали методом ПЦР, в реакции использовали праймеры. в структуру которых были заложены сайты рестрикции Bam HI и Hind III. После обработки соответствующими рестриктазами ампликон клонировали в экспрессируюший плазмидный вектор pQE.

В результате трансформации рекомбинантной плазмидой компетентных клеток Ml5 E.coli получили клоны, экспрессирующие структурный белок ЦВС-2, содержащий на N-конце шесть остатков гистидина. Молекулярная масса рекомбинантного белка соответствовала расчётной (рисунок 7). Из клонов, экспрессиру юших белок ЦВС-2. выделили рекомбинантные плазмиды и проверили методом нуклеотидного секвенирования на отсутствие нуклеотидных замен и сдвигов в рамке считывания, приводящих к изменению аминокислотного состава рекомбинантного белка.

:о

Экспрессию рекомбинантного белка проводили в течение 4 часов путем внесения в культуру E.coli ИПТГ в концентрации 0.2 мМ. Очистку рекомбинантного белка осуществляли методом металл-челатнои хроматографии с применением \i-NTA агарозы в соответствии с инструкцией прошводителя («Qiagen»), Выход очищенного белка со 100 мл культуры E.coli достигал 1.4 мг.

М I 2 3

кДа

31.0

21.5

14.4

Рис. 7. Электрофоретический анализ рекомбинантного белка ЦВС-2 в 12%-м полиакриламидном геле Примечание: М - маркер (кДа: 97.5; 66,2: 55.0: 42.7:40.0: 31.0: 21.5; 14.4);

1 - белки E.coli до индукшш:

2 - белки E.coli через 4 часа после индукции:

3 - очищенный рекомбинантный белок ЦВС-2

Определение антигенной активности и специфичности рекомбинантного белка

Антигенную активность белка проверяли в непрямом варианте ИФА с контрольными сыворотками. В качестве контрольных использовали положительную и отрицательную сыворотки, проверенные в ИФА коммерческого набора «[пдейпп агатпк кв /1§М» (1п§епаэа. Испания). Результаты проверки антигенной активности рекомбинантного белка отражены на рисунке 8. Концентрация гечомбинантного белка, при которой оптическая

плотность положительного контроля в 2 раза превышала оптическую плотность отрицательного контроля, составляла 0,5469 мкг/мл.

Антигенную специфичность рекомбинантного белка проверяли в непрямом варианте ИФА с сыворотками крови свиней, содержащими антитела к вирусам классической чумы свиней, болезни Ауески, репроду ктивно-респираторного

0 70 35 17,5 8.75 4,375 2.1875 1,0938 0 5469 Концентрация антигена (мкг/мл)

Рис. 8. Антигенная активность рекомбинантного белка в непрямом ИФА с контрольными сыворотками

синдрома свиней. Mycoplasma hyopneumoniae. Pasteurella multocida, трансмиссивного гастроэнтерита и парвовирусу свиней. Активность антигена с гетерогенными сыворотками не превышала фоновый уровень, полученный в реакции с отрицательной сывороткой.

При разработке непрямого варианта ИФА были решены следующие задачи: определено рабочее разведение антигена, отработаны условия сенсибилизации лунок микропанелей (состав буферов для сенсибилизации и блокирования планшетов), установлены оптимальное рабочее разведение сывороток, позитивно-негативный порог реакции, допустимые величины оптических плотностей отрицательных и положительных сывороток, показатель воспроизводимости реакции (коэффициент вариации).

сыв. положительная сыв.отрицательная

Разработка непрямого варианта ИФА

Критерии реакции, установленные в результате проведенных исследований, представлены в таблице 2.

Таблица 2

> становленные показатели н-ИФЛ для обнару жения антител к ЦВС-2

Показатели Значение

Рабочее разведение антигена 1:200 (7мкг/мл)

Рабочее разведение сывороток крови 1:40

Условия сенсибилизации антигена 1 16-18ч 4"С в КББ

Срок хранения сорбированного антигена без снижения активности не менее 12 мес ,

Позитивно-негативный порог 0,15>5РХ),1

Допустимые величины оптической плотности 1 0,102-0,142 ОЕ

отрицательного контроля I

Допустимые величины оптической плотности 0,871-1,141 ОЕ '

положительного контроля

Коэффициент вариации | 7,9%

Для сравнения разработанного метода относительно референтной тест-системы 226 сывороток крови свиней исследовали на наличие антител к ЦВС-2 в непрямом варианте ИФА и в коммерческом наборе «1п2е5та агсотош ¡¡Л!» (1п2епаБа, Испания). Согласованность двух тестов определяли методом капа статистики. Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3

Согласованность результатов двух иммуноферментных тест-систем при выявлении антител к ЦВС-2 в сыворотках крови свиней

Сравниваемые Результаты в наборе Всего Выявленная

тест-системы «¡пгепаэа» превалентность в

положи отрица непрямом ИФА

тельно тельно

Рс!\льтаты 1 положи 125 0 125 (125-ОУ226

в непрямом 1 тельно =0.55

ИФА 1 отрица 60 11 101 (60-41У226

ВПИИЗЖ 1 тельно =0.45

Всего 185

Выявленная (125-60) 226 <0--!) 126 226

иревалеитность в наборе I =0.82 =0.18

«¡пгепаэа»

Абсолютная согласованность результатов ИФА (. 25--1 226-0.735 С.п чайная согласованность положительных рет -;л\:г 1 с | .82 \ 0.55=0.451

Случайная согласованность отрицательных резу тьтатов 0.18 \ 0.45=0.081 Обобщенная случайная вероятность согласованности результатов 0.451 х 0.081=0.037 Наблюдаемая согласованность результатов без учёта слу чанностн 0.735-0.037=0.698 Неслучайная максимально возможная согласованность методов 1-0.037=0.963 k-критерий (капа-статистика): 0.698 / 0.963=0,72

Значение капа интерпретировали следующим образом {Landis. Koch. 1977): -очень хорошая согласованность

параметров при значении капа 0.81 -1.00

-чорошее 0.61-0.80

умеренное 0.41-0.60

-слабое 0,21-0.40

-очень слабое 0.01-0.20

-незначимое <0

Полученное в нашем случае значение к-крнтерия, равное 0,72, свидетельствует о хорошей согласованности результатов двух тест-систем.

Применение разработанного непрямого варианта ИФА для изучения распространения ЦВС-2 в хозяйствах РФ

С применением разработанной иммуноферментной тест-системы исследовали более 2000 проб сывороток крови свиней из 60 свиноводческих хозяйств РФ. В 58 хозяйствах у свиней обнаружили антитела к ЦВС-2. В двух фермах антитела к вирусу не выявили, однако необходимо учитывать, что из этих хозяйств поступило всего несколько сывороток, причём только от свиноматок. Таким образом, результаты анализа сывороток крови подтвердили чрезвычайно широкое распространение цирковирусной инфекции свиней в хозяйстах России.

В неблагополучных по цирковирусной инфекции хозяйствах антитела к вирусу обнаружили у 2%+0,1% поросят до приёма молозива, 5,1% + 0,5% поросят до 2-месячного возраста, 31,1% + 5% поросят в возрасте 2-4 мес., 42.2% + 7% 4-6-месячных поросят. 40,5% - 6% ремонтного молодняка и 23,4% - 3% взрослых животных (рисунок 9). Результаты ИФА по обнаружению антител к ЦВС-2 согласовывались с результатами ПЦР по выявлению вируса: максимальное количество положительных на ЦВС-2 проб в ПЦР приходилось на поросят заключительной стадии дорашивания или период откорма.

60 Е 50 5 40 1 30

I 20

8 Ю о

безмолошвныс 0-2 чес.

2-» чес.

4-6 мес

ремонтный молодняк

взрослые

Рис. 9. Изменение количества серопозитивных в отношении ЦВС-2 свиней в зависимости от возраста

С использованием разработанной тест-системы проанализировали уровень антител к ЦВС-2 у 408 племенных животных, закупленных рядом российских хозяйств в Канаде, Польше и Дании. 38% импортированных свиней

были серопозитивны в отношении ЦВС-2.

При исследовании сывороток крови диких кабанов антитела к ЦВС-2 обнаружили у животных из различных регионов: от Владимирской и Московской областей до Приморского края РФ, что свидетельствует о широком географическом распространении ЦВС-2 в дикой фауне России.

Таким образом, в результате проведённых исследований были разработаны методы диагностики цирковирусной инфекции свиней: мультиплексная ПЦР для обнаружения и типирования цирковирусов и непрямой вариант ИФА для выявления антител к ЦВС-2 в крови животных. Применение разработанных методов в диагностических исследованиях позволило установить особенности клинического проявления и степень распространения цирковирусной инфекции в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне РФ, определить генетическое разнообразие российских изолятов ЦВС-2. выявить культуры клеток, контаминированные ЦВС-1.

3. выводы

1. Разработан метод диагностики цирковирусной инфекции свиней, основанный на мультиплексной ПЦР и позволяющий в одной реакции обнаруживать и дифференцировать ЦВС-1 и ЦВС-2.

2. С использованием разработанного метода изучены особенности клинического проявления цирковирусной инфекции в хозяйствах РФ. Установлено, что ЦВС-2 ассоциирован в российских хозяйствах, главным образом, с респираторными болезнями поросят и СМИО. Определены другие инфекционные агенты, участвующие в развитии этих заболеваний. Показано, что роль ЦВС в репродуктивной и нервной патологиях свиней в российских хозяйствах незначительна.

3. Установлено, что ЦВС-2 распространён в российской популяции диких кабанов, и эти животные могут являться природным резервуаром вируса.

4. На наличие цирковирусов свиней исследованы культуры клеток, используемые в ФГУ "ВНИИЗЖ". Определены образцы культур клеток СПЭВ и PK-15, контаминированые цирковирусом свиней типа 1. Показано, что все исследованные культуры клеток свободны от ЦВС-2.

5. Методом нуклеотидного секвенирования определена первичная структура гена ОРС2 18 российских изолятов ЦВС-2, выделенных от домашних свиней и диких кабанов. Филогенетический анализ установленных последовательностей выявил большое генетическое разнообразие вируса, циркулирующего на территории РФ. Не выявлено зависимости клинических проявлений болезни от первичной структуры генома вируса.

6. Проведено молекулярное клонирование и экспрессия в Е. coli гена ОРС2. получен рекомбинантный капсидный белок цирковируса свиней типа 2.

7. На основе рекомбинантного антигена разработан непрямой вариант ИФА для выявления антител к ЦВС-2 в сыворотках крови свиней. Установлена хорошая согласованность (к=0.72) результатов, полученных в

разработанной теет-ситеме и коммерческом наборе "Ingezim circourus IgG IgM" (Ingenasa. Испания). S. Результаты применения разработанной иммуноферментной тест-системы в серомониторинге цирковирусной инфекции свиней свидетельствуют об очень широком распространении ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне России.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

((Методика обнаружения и типирования цирковирусов свиней с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции»;

«Методика обнаружения антител к цирковирусу свиней типа 2 в непрямом варианте имму ноферментного анализа».

Методики комиссионно испытаны, одобрены Учёным советом, утверждены директором ФГУ ВНИИЗЖ и используются для диагностики цирковирусной инфекции свиней.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

!. Щербаков A.B., Ковалишин В.Ф.. Тимина A.M., Яковлева A.C. Генодиагностика инфекционных болезней свиней // Генодиагностика инфекционных болезней: сб. тр. 5-ой Всерос. научно-практ. конф. - М., 2004.-Т. 2. - С. 243-247. 2. Кукушкин С.А., Ковалишин В.Ф., Долганова Е.К., Тетерин И.А., Тимина A.M.. Каньшина A.B., Шевцов A.A., Пузанкова О.С., Потехин A.B. Диагностика и профилактика инфекционных болезней свиней в современных условиях // Актуальные проблемы и перспективы развития агропромышленного комплекса: Пробл. агроэкономики, вет. медицины и биотехнологии в жив-ве. - Иваново. 2005. - Т. 2 - С. 119-120.

3. Кукушкин С.А.. Байбиков Т.З.. Ковалишин В.Ф . Тнмнна A.M.. Яковлева А.С. Пролиферативно-некротизируюшая пневмония свиней // Ветеринария. - 2005. - Л» 9. С. 17-20.

4. Ковалишин В.Ф.. Щербаков А.В., Тимина A.M.. Яковлева А.С., Челышева М.В. Современные методы диагностики болезней свиней инфекционной этиологии // Матер1али науково-практично1 конференцп 3 М1Жнародною участю '<Ветеринарне забеспечення свинарства: сучасний стран i шляхи розвитку» - XapKie, 2005. - С. 78-84.

5. Кукушкин С.А., Байбиков Т.З., Тимина A.M.. Ковалишин В.Ф., Тетерин И.А. Новая инфекционная патология - пролиферативно-некротизируюшая пневмония свиней // Матер¡али науково-практично1 конференцп 3 м!Жнародною участю «Ветеринарне забеспечення свинарства: сучасний стран i шляхи розвитку» - Харюв, 2005. -С. 74-78.

6. Timina A.M., Kukushkin S.A., Baibikov T.Zh.. Sherbakov A.V., Kovalishin V.F. Monitoring of porcine circovirus type 2 on pig farms of the Russian Federation // Proc. of the Int. Conf. on Animal Circoviruses and Associated Diseases / Queen's University, Belfast, Northern Ireland. UK,2005.-P. 79.

7. Timina A.M., Kovalishin V.F., Sherbakov A.Y. Diagnostics of PCV-2 infection in Russia // Proc. of the Int. Conf. on Animal Circoviruses and Associated Diseases / Queen's University. Belfast. Northern Ireland, UK,2005.-P. 98.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Тираж 90 экз . май 2006г.

I

i

¡

»1 4 2 42

Актуальность темы. Эмерджентные болезни являются одной из наиболее актуальных проблем современного животноводства. В инфекционной патологии свиней важная роль принадлежит недавно получившим широкое распространение болезням, ассоциированным с цирковирусами.

У свиней идентифицированы два вида цирковирусов. Цирковирус свиней типа 1 (ЦВС-1) был обнаружен в 1974 году как нецитопатогенный контаминант перевиваемой культуры клеток почек поросят РК-15 (199) и считается непатогенным вирусом, так как не вызывает каких-либо клинических признаков у инфицированных животных. Цирковирус свиней типа 2 (ЦВС-2) был впервые выделен от больных поросят в Канаде в 1998г. (116, 117, 145) и является первичным этиологическим агентом синдрома мультисистемного истощения поросят-отъёмышей (СМИО). Кроме того, этот вирус ассоциирован с синдромом нефропатии и дерматитов поросят, а также вовлечён в респираторную и репродуктивную патологию свиней. ЦВС-2 распространён во всех странах с развитым свиноводством, причём встречается практически в 100% стад. Чрезвычайно широкое распространение ЦВС-2 и многообразие клинических проявлений инфекции делают его одним из наиболее значимых для современного свиноводства инфекционных агентов (36). По современным оценкам заболевания, связанные с ЦВС-2, особенно СМИО, обходятся Европейским производителям в 600 млн. евро в год (168).

В России ЦВС-2 был впервые обнаружен в 2000 году (14). Цирковирусная инфекция была установлена у свиней во многих из обследованных хозяйств РФ. В то же время неизученным оставался широкий круг проблем, связанных с этой инфекцией: степень распространения цирковирусов среди домашних свиней и диких кабанов, генетическое разнообразие вируса, циркулирующего на территории России, вовлечённость ЦВС-2 в различные формы инфекционной патологии свиней. Обусловлено это было тем, что отсутствовали, либо были несовершенны, методы диагностики цирковирусной инфекции.

Цели и задачи исследования. Основная цель данной работы состояла в разработке методов диагностики цирковирусной инфекции свиней и применении разработанных методов для изучения распространения и клинического проявления этой инфекции на территории РФ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать метод обнаружения и типирования цирковирусов свиней, основанный на мультиплексной ПЦР;

- применить разработанный метод в диагностических исследованиях и изучить связь между различными формами инфекционной патологии свиней и наличием ЦВС;

- провести филогенетический анализ изолятов ЦВС-2, циркулирующих в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне РФ; исследовать на наличие цирковирусов клеточные культуры, применяющиеся в ФГУ ВНИИЗЖ для вирусологических исследований и производства вакцин;

- получить рекомбинантный капсидный белок ЦВС-2 и разработать на его основе иммуноферментную тест-систему для выявления антител к вирусу в сыворотках крови свиней;

- применить разработанную иммуноферментную тест-систему для изучения распространения ЦВС-2 в хозяйствах РФ.

Научная новизна исследований.

Разработан метод обнаружения и типирования цирковирусов свиней, основанный на мультиплексной ПЦР.

Изучены особенности клинического проявления цирковирусной инфекции свиней в хозяйствах РФ.

Проведен филогенетический анализ российских изолятов ЦВС-2, показано большое генетическое разнообразие вируса, циркулирующего в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне РФ.

Получен рекомбинантный капсидный белок цирковируса свиней типа 2 и на его основе разработана иммуноферментная тест-система для выявления антител к ЦВС-2.

Проведён мониторинг цирковирусной инфекции свиней и показано чрезвычайно широкое распространение ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах РФ и среди диких кабанов.

Практическая значимость исследований. В результате проведённых исследований разработаны следующие методики:

Методика обнаружения и типирования цирковирусов свиней с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ ВНИИЗЖ 02.06.2005г.;

Методика обнаружения антител к цирковирусу свиней типа 2 в непрямом варианте иммуноферментного анализа», одобренная учёным советом и утверждённая директором ФГУ ВНИИЗЖ 29.09.2005г.

Разработанные методики используются в диагностике цирковирусной инфекции свиней.

Публикации научных исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и опубликованы на 5-й всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 19-21 октября 2004г.), на 3-й международной научно-практической конференции «Ветеринарне забеспечення свинарства: сучасний стран i шляхи розвитку» (Харьков, 2005г.), «International Conference on Animal Circoviruses and Associated Diseases» - Queen's University, (Belfast, Northern Ireland, UK, 1 lth-13th September 2005), на заседаниях учёного совета ФГУ ВНИИЗЖ в 2004-2006 гг.

Основные положения, выносимые на защиту:

Метод обнаружения и типирования цирковирусов свиней, основанный на мультиплексной ПЦР.

Результаты изучения клинических проявлений цирковирусной инфекции свиней в хозяйствах РФ.

Результаты филогенетического анализа российских изолятов ЦВС-2.

Рекомбинантный капсидный белок ЦВС-2 и разработанная на его основе иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу.

Результаты использования разработанной иммуноферментной тест-системы в серологическом мониторинге цирковирусной инфекции.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 130 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения и приложения. Список используемой литературы включает 207 источников, из которых 192 иностранных. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 15 рисунками.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработан метод диагностики цирковирусной инфекции свиней, основанный на мультиплексной ПЦР и позволяющий в одной реакции обнаруживать и дифференцировать ЦВС-1 и ЦВС-2.

2. С использованием разработанного метода изучены особенности клинического проявления цирковирусной инфекции в хозяйствах РФ. Установлено, что ЦВС-2 ассоциирован в российских хозяйствах, главным образом, с респираторными болезнями поросят и СМИО. Определены другие инфекционные агенты, участвующие в развитии этих заболеваний. Показано, что роль ЦВС в репродуктивной и нервной патологиях свиней в российских хозяйствах незначительна.

3. Установлено, что ЦВС-2 распространён в российской популяции диких кабанов, и эти животные могут являться природным резервуаром вируса.

4. На наличие цирковирусов свиней исследованы культуры клеток, используемые в ФГУ ВНИИЗЖ. Определены образцы культур клеток СПЭВ и РК-15, контаминированые цирковирусом свиней типа 1. Показано, что все исследованные культуры клеток свободны от ЦВС-2.

5. Методом нуклеотидного секвенирования определена первичная структура гена ОРС2 18 российских изолятов ЦВС-2, выделенных от домашних свиней и диких кабанов. Филогенетический анализ установленных последовательностей выявил большое генетическое разнообразие вируса, циркулирующего на территории РФ. Не выявлено зависимости клинических проявлений болезни от первичной структуры генома вируса.

6. Проведено молекулярное клонирование и экспрессия в Е. соИ гена ОРС2, получен рекомбинантный капсидный белок цирковируса свиней типа 2.

7. На основе рекомбинантного антигена разработан непрямой вариант ИФА для выявления антител к ЦВС-2 в сыворотках крови свиней. Установлена хорошая согласованность (к=0,72) результатов, полученных в разработанной тест-ситеме и коммерческом наборе "1п§ег1ш агсоу^иБ 1§С/1§М" (1п§епаза, Испания).

8. Результаты применения разработанной иммуноферментной тест-системы в серомониторинге цирковирусной инфекции свиней свидетельствуют об очень широком распространении ЦВС-2 в свиноводческих хозяйствах и дикой фауне России.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

Методика обнаружения и типирования цирковирусов свиней с использованием мультиплексной полимеразной цепной реакции»;

Методика обнаружения антител к цирковирусу свиней типа 2 в непрямом варианте иммуноферментного анализа».

Методики комиссионно испытаны, одобрены Учёным советом, утверждены директором ФГУ ВНИИЗЖ и используются для диагностики цирковирусной инфекции свиней.

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цирковирусы свиней - сравнительно недавно открытые патогены, широко распространены во всех странах с развитым свиноводством. Несмотря на то, что в России ЦВС были открыты еще в 2000 году, неизученным оставался широкий круг вопросов: степень распространения цирковирусов среди домашних свиней и диких кабанов, генетическое разнообразие вируса, циркулирующего на территории России, вовлечённость цирковирусов в различные формы инфекционной патологии свиней. Для решения этих задач необходимо иметь в распоряжении надёжные методы диагностики.

В результате проведённых исследований нами был разработан метод мультиплексной ПЦР, позволяющий в одной реакции выявлять цирковирусы свиней и одновременно определять их тип. Метод основан на использовании трех праймеров, один из которых является универсальным для обоих типов вируса, а два других - видоспецифичными для ЦВС-1 и ЦВС-2. Специфичность метода была проверена на других видах вирусов и патогенных бактерий, часто встречаемых при инфекционной патологии у свиней. Со всеми гетерологичными инфекционными агентами были получены отрицательные результаты.

С помощью разработанного метода мультиплексной ПЦР в период с 2000 по 2005 годы исследовали более 500 проб патологического материала от свиней, поступавшего из хозяйств различных регионов РФ. На наличие ЦВС исследовали органы и ткани от свиней с респираторной патологией и СМИО, от мертворожденных поросят и свиноматок с нарушением воспроизводительной функции или агалактией, свиней с дерматитами, признаками нефропатии, патологией нервной системы и другие.

При исследованиях материала от свиней с респираторной патологией разных возрастных групп оказалось, что наибольшее количество положительных в отношении ЦВС-2 проб (78,3%) приходится на возраст 2-4 месяца (период доращивания). У этой возрастной группы респираторные заболевания часто сопровождались истощением. В период откорма количество ЦВС-2 положительных животных также было велико и составляло 72,7%. У больных животных других возрастных групп ЦВС-2 выявляли значительно реже. Таким образом, наши исследования подтвердили данные литературы (181, 35, 96), что респираторные заболевания, ассоциированные с ЦВС-2, присущи, главным образом, поросятам послеотъёмного периода.

При анализе в ПЦР различных органов и тканей поросят с респираторной патологией и СМИО оказалось, что вирус успешно выявляется во всех тестировавшихся образцах за исключением мозга и сыворотки крови. Наличие вируса в столь широком спектре органов свидетельствует о мультисистемном характере заболевания.

У животных с респираторными заболеваниями и признаками истощения наряду с ЦВС-2 обнаруживали другие виды вирусов и патогенных бактерий. Это подтверждает данные литературы (6, 21, 195) о значении "дополнительных факторов" в развитии полной клинической картины заболевания.

При других формах инфекционной патологии свиней ЦВС-2 был обнаружен лишь в единичных случаях: в одном случае из 99 при абортах у свиноматок и по одному случаю при дерматитах и поражении почек. У свиней с нарушением функции центральной нервной системы не было ни одного случая выявления ЦВС. Обнаружение ЦВС-2 в нескольких пробах кишечника у поросят с диарейным синдромом нельзя однозначно объяснить участием вируса в кишечной патологии, поскольку в пробах кишечника были одновременно выявлены патогенные бактерии. При исследовании методом пез1ес1-ПЦР 85 образцов спермы от клинически здоровых хряков цирковирусы не были выявлены. В то же время ЦВС-2 обнаруживали в других тканях племенных животных.

Таким образом, в результате проведённых нами исследований было установлено, что в российских свиноводческих хозяйствах ЦВС-2 ассоциирован, главным образом, с респираторной патологией и синдромом истощения поросят-отъёмышей. Роль этого вируса в других формах инфекционной патологии свиней в хозяйствах РФ, по-видимому, незначительна.

Что касается цирковируса свиней первого типа, то при проведении диагностических исследований этот вирус выявили лишь в одном случае, причем одновременно с ЦВС-2. Эти результаты свидетельствуют о том, что ЦВС-1 не играет сколь-либо важной роли в инфекционной патологии свиней.

С целью изучения распространения ЦВС-инфекции в дикой фауне исследовали материал от диких кабанов, павших или отстрелянных с диагностической целью во Владимирской, Московской и Тверской областях. В семи из четырнадцати охотохозяйств у кабанов был обнаружен ЦВС-2, то есть оказалось, что кабаны являются природным резервуаром цирковирусной инфекции свиней.

Поскольку цирковирусы свиней способны инфицировать различные типы клеточных культур, образцы культур клеток, используемых в ФГУ ВНИИЗЖ, исследовали в мультиплексной ПЦР на наличие контаминации цирковирусами свиней. Оказалось, что некоторые образцы клеточных культур РК-15 и СПЭВ контаминированы цирковирусом свиней типа 1. ЦВС-2 в исследованных образцах культур клеток обнаружен не был. Таким образом была показана возможность применения мПЦР для технологического контроля вакцинных препаратов.

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура ОРС2 одиннадцати российских изолятов ЦВС-2 от свиней и семи изолятов от кабанов. Филогенетический анализ установленных последовательностей показал, что ЦВС-2 отличается большим генетическим разнообразием, а все российские изоляты от домашних свиней близки в филогенетическом отношении к изолятам, выделенным на территории Западной Европы, Канады, Тайваня и Таиланда. Оказалось, что не существует зависимости между географическим происхождением изолятов и их принадлежностью к тому или иному кластеру. Родство российских и зарубежных представителей, вероятно, объясняется тем, что в Россию завозятся племенные животные из разных стран мира. Было показано, что в течение 3-5 лет в некоторых хозяйствах произошла смена циркулирующих в них штаммов ЦВС-2.

Филогенетический анализ показал также, что в российской популяции диких кабанов циркулируют цирковирусы различного происхождения: некоторые варианты, вероятно, характерны именно для дикой фауны, тогда как другие могли быть привнесены в нее от домашних свиней.

С целью разработки иммуноферментной тест-системы для выявления антител к цирковирусу свиней типа 2 экспрессией в Е. coli был получен рекомбинантный капсидный белок цирковируса свиней типа 2. В непрямом ИФА с контрольными сыворотками была показана его высокая антигенная активность и специфичность.

На основе рекомбинантного антигена разработали непрямой вариант ИФА для выявления антител к ЦВС-2 в сыворотках крови свиней. В ходе разработки метода определили рабочее разведение антигена и сывороток, оптимальные режимы постановки реакции. Также установили позитивно-негативный порог реакции, допустимые значения оптической плотности контрольных сывороток и коэффициент вариации.

Установлено, что результаты, получаемые в непрямом ИФА, хорошо согласуются с результатами, получаемыми при использовании коммерческого набора «Ingezim circovirus IgG / IgM» (Ingenasa, Испания). Согласованность двух тест-систем, определили по методу капа статистики. Значение k-критерия было равно 0,72.

С использованием разработанной иммуноферментной тест-системы исследовали более 2000 проб сывороток крови от свиней из 60 хозяйств. Во всех хозяйствах, за исключением двух, в крови у животных обнаружили антитела к ЦВС-2. Максимальное количество серопозитивных свиней приходилось на возраст 4-6 месяцев и ремонтный молодняк, что хорошо согласуется с результатами ПЦР по обнаружению вируса. При исследовании сывороток крови племенных свиней, ввезённых из-за рубежа, антитела к ЦВС-2 выявили у 38% животных, что подтверждает широкое распространение ЦВС-2 в странах, экспортирующих племенных свиней.