Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммунобиологический статус и морфофункциональные изменения в лимфоидных органах при цирковирусной инфекции свиней

На правах рукописи

> -

■У

Андреев Денис Александрович

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНАХ ПРИ ЦИРКОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ СВИНЕЙ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

пос. Персиановский 2009

003481513

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт» Российской академии сельскохозяйственных наук

Научные руководители: доктор биологических наук

Ермаков Алексей Михайлович доктор ветеринарных наук Миронова Анна Анатольевна Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Паршин Павел Андреевич кандидат ветеринарных наук, Заслуженный ветеринарный врач РФ Руденко Владимир Петрович Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Ставропольский

государственный аграрный университет»

Защита состоится 11 ноября 2009 года в Ю00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 220.028.03 при ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет» по адресу: 346493, Ростовская область, Октябрьский (с) район, п. Персиановский.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет» 346493, Ростовская область, Октябрьский (с) район, п. Персиановский.

Автореферат разослан « ' » октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Т.Н. Дерезина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Эмерджентные болезни являются одной из наиболее актуальных проблем современного животноводства. В инфекционной патологии свиней важная роль принадлежит недавно получившим широкое распространение болезням, ассоциированным с цирковирусами.

У свиней идентифицированы два вида цирковирусов. Цирковирус свиней типа 1 (ЦВС-1) был обнаружен в 1974 году как нецитопатогенный контаминант перевиваемой культуры клеток почек поросят РК-15 и считается непатогенным вирусом, так как не вызывает каких-либо клинических признаков у инфицированных животных.

Цирковирус свиней второго типа (ЦВС-2) является возбудителем болезни поросят, впервые зарегистрированной в Канаде в 1991 году, и в связи с поражением различных систем организма назван «синдромом послеотъёмного мультисистемного истощения» (СПМИС). Болезнь характеризуется проявлением комплекса клинических признаков, включающих потерю веса, отставание в росте, одышку, диарею, желтуху и пневмонию. В естественных условиях СПМИС чаще отмечают у поросят 6-15 недельного возраста, у которых регистрируют наибольший отход, при этом пик заболеваемости приходится на 10-ти недельный возраст. У инфицированных животных вирус обнаружен в клетках лимфоидной системы (макрофагах, дендритных клетках, Т- и В- лимфоцитах), являющихся клетками-мишенями для ЦВС-2 (Б.Г. Орлянкин с соавт., 2002; E.G. Clark, G.M.; 1997 Allan et al., 1998; A. Mankertz et al., 2000; B. O'Connor et al., 2001 и др.). Интенсивное размножение вируса в клетках иммунной системы приводит к их гибели и развитию иммунодефицитного состояния. У таких животных создаются условия для возникновения вторичных инфекций, вызываемых условно-патогенными микробами (J. Segales et al., 2001). Вместе с тем, исследований лимфоидных тканей свиней при цирковирусной инфекции свиней недостаточно, нет данных по распределению Т- и В-лимфоцитов в лимфатических узлах свиней при разной тяжести заболевания, что и определило цель нашего исследования.

Цели и задачи исследования. Выяснить эпизоотическую ситуацию по цирковирусной инфекции свиней в Ростовской области, изучить иммунный статус и морфологические изменения в лимфатических узлах у свиней, инфицированных ЦВС-2 при разной выраженности синдрома послеотъемного мультисистемного истощения.

Для решения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить эпизоотическую ситуацию по цирковирусной инфекции свиней в хозяйствах Ростовской области.

2. Выяснить ко-инфицирующие факторы при цирковирусной инфекции у свиней.

3. Изучить клинико-эпизоотологические проявления при разной степени тяжести цирковирусной инфекции у свиней.

4. Изучить иммунный статус свиней больных синдромом послеотъемного мультисистемного истощения разной степени тяжести.

5. Изучить морфофункциональные изменения в лимфоидных органах при разной выраженности синдрома послеотьемного мультисистемного истощения.

Научная новизна. Выяснена эпизоотическая ситуация по инфекционным болезням свиней в т.ч. по цирковирусной инфекции свиней в хозяйствах Ростовской области. Изучены клинико-эпизоотологические особенности проявления цирковирусной инфекции свиней. Впервые изучено влияние цирковирсной инфекции на морфологические показатели крови, гистологические структуры в лимфатических узлах в зависимости от течения при спонтанной цирковирусной инфекции свиней. Изучена динамика иммунного статуса свиней больных цирковирусной инфекцией, выявлена динамика распределения Т- и В- лимфоцитов в различных лимфатических узлах свиней по мере развития цирковирусной инфекции.

Теоретическая и практическая значимость работы. Представленные результаты эпизоотологического обследования неблагополучных по цирковирозу свиноводческих хозяйств могут быть использованы при разработке планов противоэпизоотических мероприятий. Морфометрические данные исследований лимфатических узлов свиней при цирковирусной инфекции могут быть использованы для комплексной диагностики синдрома послеотьемного мультисистемного истощения свиней. Полученные данные по иммунологическому статусу свиней при цирковирусной инфекции и распределения Т- и В- лимфоцитов в лимфатических узлах больных животных могут использоваться в учебном процессе по специальностям «Биология», «Ветеринария» и «Зоотехния», написании учебных пособий и практических рекомендаций.

Диссертационное исследование проведено в соответствии с темой научных исследований Государственного научного учреждения «СевероКавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт» Россельхозакадемии - "Разработать методы ранней диагностики, эффективные средства и способы профилактики и лечения массовых заболеваний у молодняка высокопродуктивных животных" государственная регистрация №15070.3666026906.06.8.001.2.

Реализация результатов исследований. Результаты исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по эпизоотологии и патанатомиии в ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», в работе Ростовской областной ветеринарной лаборатории, СББЖ г. Новочеркасск, ветеринарная клиника «ВитаВет» г. Шахты, внедрены в ЗАО «Батайское» Азовского района и ОАО Совхоз «Южный» Сальского района, Ростовской области.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», ГНУ «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт» в 2006-2008 гг.

и на 3 всероссийских и международной научно-практических конференциях гг. Ростове, Воронеже, Краснодаре, Новочеркасске.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 научных работ, из них 3 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа изложена на 156 страницах компьютерного текста, содержит 25 таблиц, 39 рисунков. Библиографический список включает 248 источников, в том числе 194 зарубежных.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Динамика показателей морфологических и биохимических исследований крови отражает развитие синдрома послеотъёмного мультисистемного истощения животных, вызванного ЦВС-2, и носит диагностический характер.

2. Динамика иммунного статуса у свиней инфицированных ЦВС-2 отражает тяжесть течения инфекционного процесса, а изменения в лимфатических узлах, носят закономерный характер, могут визуализироваться до развития клинических форм и отображают истощение иммунной системы по мере развития заболевания.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы, методы и объемы исследований

Работу выполняли с 2006 по 2008 гг. в лаборатории функциональной диагностики болезней сельскохозяйственных животных и визуальной диагностики и патологии молодняка животных ГНУ СКЗНИВЙ Россельхозакадемии, Ростовской областной ветеринарной лаборатории, а также в хозяйствах Ростовской области.

При изучении распространения инфекционных и инвазионных заболеваний использовались отчетные данные ГУРО «Ростовская областная ветеринарная лаборатория».

Для определения роли и места цирковирусной инфекции в условиях Ростовской области нами изучен нозологический профиль, удельный вес, географическое распространение и годовая динамика инфекционных заболеваний свиней в Ростовской области.

За период с 2006 по 2008 гг. в хозяйствах Ростовской области осмотру подвергнуто 6247 свиней, больных различными инфекционными и незаразными болезнями. Из них 17% с инфекционной патологией. За подопытными животными было установлено постоянное клиническое наблюдение, при этом учитывали процент заболеваемости, выздоровления и падежа. Ежедневно проводили клиническое обследование свиней, а лабораторные исследования проводили при первичном и повторном осмотрах и при выздоровлении.

Для изучения эпизоотической ситуации по цирковирусной инфекции свиней было проведено обследование поголовья поросят в 12 хозяйствах Ростовской области, проанализированы результаты лабораторных исследований ГУРО «Ростовская областная ветеринарная лаборатория» и лаборатории функциональной диагностики болезней сельскохозяйственных животных ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии.

Таблица 1

Объем проведенных исследований, голов_

№ п./п. Вид проведенного исследования Всего проведено исследований

1 Исследовано животных клинически, голов 6247

2 СПМИС 209

3 Выявлено больных РРС 317

4 животных, голов: Микоплазмоз 162

5 Рото- и короновироз 65

6 Вскрыто павших свиней, голов 42

7 Гематологических 247

8 Проведено лабораторных исследований: Иммуноферментных 411

9 Биохимических 463

1 ПЦР 238

11 Иммуногистохимических 173

12 Гистологических 50

Диагностику цирковирусной инфекции проводили в лаборатории ГНУ СКЗНИВИ РАСХН и ГУРО «Областная ветеринарная лаборатория», с помощью тест-системы «CIR-КОМ», методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле. Cat.№ VET-1-R 0,5.

Для установления определения тяжести и особенности течения синдрома мультисистемного послеотьемного истощения свиней проводили морфологический и биохимический анализ крови. Морфологические и биохимические исследования крови проводились в ГУРО «Областная ветеринарная лаборатория» и лаборатории функциональной диагностики болезней сельскохозяйственных животных ГНУ СКЗНИВИ

Россельхозакадемии. Морфологический анализ крови включал: определение числа эритроцитов и лейкоцитов в сетке камеры Горяева, определение концентрации гемоглобина гемиглобинцианидным методом, гематокрита по методике предложенной И.И. Архангельским и Л.П. Сошенко (1993), определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ), выведение лейкограммы по общепринятым методикам (Е.А. Маринин, 1980; И.П. Кондрахин с соавт., 1985; B.C. Камышников, 2000).

Биохимический анализ крови включал определение следующих показателей: щелочной фосфатазы по ферментативному гидролизу п-нитрофенилфосфата, активности аспартатаминотрансферазы и

аланинаминотрансферазы по методу Райтмана-Френкеля, а-амилазы - по Каравею, глюкозы - орто-толуидиновым методом, мочевины - с помощью био-лахема-теста, белка - с помощью биуретовой реакции, билирубина - по методу Ендрашика-Грофа, альбумина - по реакции с бромкрезоловым зеленым, креатинина - методом Яффе (B.C. Камышников, 2000; И.П. Кондрахин с соавт., 1985; Е.А. Маринин, 1980).

Гистологические исследования проводились по общепринятой методике с окраской гематоксилином и эозином, а также окраской по Масону.

Из образцов лимфатических узлов, фиксированных в формалине и заключенных в парафин, изготовляли серийные срезы толщиной 4 мкм с последующей иммуногистохимической окраской антителами к маркеру Т-лимфоцитов СД2, СДЗ (Dako, разведение 1:100); к маркеру В-лимфоцитов СД20, к маркеру пролиферации Ki-67. Срезы обрабатывали в микроволновой печи 10 минут на мощности 700 Вт с целью открытия антигенных детерминант, блокировали активность эндогенной пероксидазы и инкубировали с первичными антителами 18 часов при температуре 4°С. Затем срезы обрабатывали вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена в течение 30 минут. Визуализацию осуществляли инкубацией с аминоэтилкарбазолом (АБС), дающим продукт красно-коричневого цвета в месте локализации выявляемого антигена.

Проводили обзорную светооптическую микроскопию, морфометрию структурных компонентов и клеточного состава по методу Г.Г. Автандилова. При увеличении микроскопа в 38,5 раз определяли площади коркового и мозгового вещества, первичных и вторичных лимфоидных узелков, коркового плато, паракортикальной зоны, мозговых тяжей, мозговых синусов, промежуточных корковых синусов, краевого синуса, капсулы и трабекул.

Цитоархитектонику структурно-функциональных зон лимфатических узлов проводили при увеличении микроскопа в 990 раз. Подсчитывали абсолютное количество клеток на стандартной площади. Дифференцировали бласты, средние и малые лимфоциты, плазматические клетки, макрофаги, ретикулярные клетки, нейтрофильные и эозинофильные гранулоциты, митотически делящиеся клетки, дегенерирующие клетки (с пикнотическим ядром).

Статистическую обработку результатов исследований проводили по H.A. Плохинскому (1970), Хитоси Кумэ (1990) с использованием компьютерной техники AMD ATHLON.

2.2. Результаты исследования эпизоотологической ситуации по болезням свиней в Ростовской области

По результатам наших исследований нозопрофиль инфекционной патологии свиней в Ростовской области к настоящему времени представлен 20 нозологическими единицами (таблица 2): цирковирусная инфекция, микоплазомз, актинобацилярная плевропневмония, сальмонеллез, короновирусный гастроэнтерит, колибактериоз, дизентерия, пастереллез,

лептоспироз, ротовирусный энтерит, репродуктивно-респираторный синдром, гемофилезный полисерозит, диплококкоз, хламидиоз, парвовирусная инфекция, болезнь Ауески, листериоз, рожа, стрептококкоз, классическая чума.

Таблица 2

Нозологический профиль инфекционных болезней свиней по РО за 2006 - 2008 гг.

№ п/п Болезни 2006 г 2007 г 2008 г

число заболело пало число забо- пало число забо- пало

небл- живо- (гол) небл- лело (гол) небл- лело (гол)

агоп- тных агоп- живо- агоп- живо-

олучных пунктов (гол) олучных пунктов тных (гол) олучных пунктов тных (гол)

1 цирковирусная инбекиия 5 137 17 8 204 24 12 285 39

2 микоплазмоз 18 938 234 17 1397 362 19 1735 486

3 актинобац. плевпопневм. 9 458 121 9 - - 9 - -

4 сальмонеллез 21 1738 281 14 1271 197 9 834 138

5 ТГС 9 459 347 11 517 382 12 583 407

6 колибактериоз 21 4583 432 32 5828 503 39 7261 620

7 дизентерия 9 1271 134 15 1617 202 22 1995 304

8 пасгереллез 12 7 3 10 5 3 8 4 2

9 лептоспироз 3 10 4 4 15 6 6 21 9

10 ротовирусный энтерит 2 47 21 3 63 33 5 90 47

И РРСС 8 341 5 12 416 7 17 538 10

12 гемофилезн.полисер 3 87 21 3 - - 3 - -

13 диплококкоз 5 715 236 5 1104 355 7 1282 487

14 хламидиоз 21 1154 9 28 1632 13 33 1817 20

15 парвовирусная инфекция 8 281 12 12 379 18 17 484 25

16 болезнь Ауески 1 5 5 2 7 7 2 9 9

17 листериоз 2 21 3 3 25 4 3 32 6

18 рожа 19 2348 451 22 3264 635 31 4879 711

19 стрептококкоз 12 563 113 14 730 142 15 853 182

20 классическая чума 1 67 15 3 84 21 4 105 30

Итого: 201 15452 2569 279 21885 3623 378 30341 355

Цирковируспая инфекция свиней в 2006 г регистрировалась в 5 - ти, в 2007 г в 8 - ти, в 2008 г в 12 - ти неблагополучных пунктах. Удельный вес цирковирусной инфекции свиней по количеству неблагополучных пунктов в среднем составил 22,36 ± 3,96% (Р < 0,002) (таблица 2). Заболеваемость от цирковирусной инфекции свиней соответственно были 5,5 ± 0,18 (Р <0,02) (таблица 3).

Сезонность цирковирусной инфекции свиней. Цирковирусная инфекция свиней отмечается в течение всего года, но интенсивность эпизоотического процесса неодинаковая в разные периоды года. Как видно из таблицы 3, Цирковирусная инфекция свиней имеет тенденцию к распространению. Если в 2006 году заболеваемость находилась на уровне 5,31, в 2007 г - 5,53, то в 2008 достигала 5,65 (в среднем за 3 года 5,5 ± 0,18, Р <0,02). Наибольшие случаи заболевания регистрировались в 2006 году в январе - 1,09 и декабре 1,36, в 2007 г в марте - 1,24 и в декабре 1,64, в 2008 г в январе — 1,56 и в декабре 1,55. Наименьшие случаи заболевания СПМИС отмечались в 2006 г в июне - 0,21 и июле - 0,35, в 2007 г в июле и октябре сведений о регистрации случаев заболевания нет. В 2008 г в июле - 0,24 и октябре - 0,27. Исходя из данных, указанных выше, можно сделать вывод, что с течением лет частота заболеваемости СПМИС прогрессирует.

Таблица 3

Заболеваемость свиней инфекционными болезнями _в РО за 2006 - 2008 гг. (на 1000 гол) _

№ п/п Болезни 2006 г 2007 г 2008 г Средний показатель за 3 года,М±м Р

1 цирковирусная инфекция 5,31 5,53 5,65 5,5 ±0,18 <0,02

п микоплазмоз 36,33 37,87 43,71 39,31 ±3,89 <0,02

3 актинобац. плевропневм. 17,74 - - 5,91 ± 10,24 <0,5

4 сальмонеллез 67,32 58,85 1654 47,57 ±27,2 <0,01

5 TTC 17,78 14,01 11,56 14,45 ±3,13 <0,001

6 колибакгериоз 177,52 157,98 144,01 159,84 ±16,83 <0,5

7 дизентерия 49,23 43,83 39,57 44,21 ±4,84 <0,05

8 пасгереллез 0,27 0,14 0,08 0,16 ±0,1 <0,25

9 лептоспироз 039 0,41 0,42 0,4 ±0,01 <0,01

10 ротовирусный энтерит 1,82 1,71 1,79 1,77 ± 0,06 <0,25

И РРСС 13,21 11,28 10,67 11,72 ±1,33 <0,01

12 гемофилезн. полисерозит 337 - - 1,12 ±1,95 <0,5

13 диплококкоз 27,69 29,93 25,43 27,68 ±2,25 <0,05

14 хламидиоз 44,7 44,24 36,04 41,66 ±4,87 <0,5

15 парвовирусная инфекция 10,88 10,27 9,6 10,25 ±0,64 <0,05

16 болезнь ауески 0,19 0,19 0,18 0,19 ±0,01 <0,25

17 листериоз 0,81 0,68 0,63 0,71 ±0,09 <0,01

18 рожа 90,95 88,48 96,8 92,07 ±4,26 <0,25

19 сгрептококкоз 21,81 19,79 16,92 19,5 ±2,46 <0,01

20 классическая чума 2,6 2,28 2,08 2,31 ±0,26 <0,01

2.3. Сопутствующие инфекции при синдроме мультисистемного истощения свиней

Нами было выяснено, что особенно ярко синдром послеотьемного мультисистемного истощения свиней проявляется клинически при наслоении

сопутствующего заболевания бактериальной или вирусной природы.

На рисунке 1 отображено количество случаев обнаружения сопутствующих инфекций при синдроме мультисистемного истощения. Наряду с цирковирусной инфекцией из 94 клинически больных поросят у 33 (35,1%) из них зарегистрирован репродуктивно-респираторный синдром (РРСС), по 18 случаев (19,1%) приходилось на микоплазмоз и микоплазмоз с репродуктивно-респираторным синдромом соответственно. У 12 (12,8%) поросят цирковирусной инфекции сопутствовала бактериальная пневмония, а у 8 (8,5%) поросят мы наблюдали бактериальную септицемию. Выявлено только 2 случая (2,1%), когда цирковирус был обнаружен без присутствия других возбудителей.

30 25 20 lü 1Ü

ЦВИС+ЯСС ЦВИО+мако- ЦВИС+FPCCf ЦВИС+ ЦВИС+ ЦВИС+

щшзмоз микоплазмоз бик.пневмйнияба|ссепшцемия дэ.инфекции

ЦВИС

цвис+исс

+гриап

Рисунок 1. Количество случаев выделения возбудителей сопутствующих инфекций при синдроме мультисистемного истощения свиней

Нами проведен анализ сопутствующих бактериальных легочных инфекций. Установлено, что у 5,3% поросят, у которых цирковирусная инфекция проявлялась клинически, в легких выделена Pasteurella multocida, в 3,2% случаев - Bordetella bronchiseptica и в 1,1% случаев - Actibacillus pleuropneumoniae (рисунок 2).

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что 41,5% поросят являются источником вируса, а клинически болезнь проявляется у 22% вирусоносителей (или 9% от общего количества исследованных поросят). Наиболее часто синдрому мультисистемного истощения из вирусных инфекций сопутствует респираторно-репродуктивный синдром свиней (55% случаев), а из бактериальных - микоплазмоз (38% случаев). Из 94 исследованных клинически больных поросят только у 2-х (2,1%) цирковирус встречался без сопутствующих инфекций. Бактериальная септицемия выявлена у 9%, а бактериальная пневмония - у 13% поросят с клинической картиной синдрома мультисистемного истощения. Из респираторных бактериальных заболеваний при этом превалировал пастереллез.

2.4. Особенности клинического течения цирковирусной инфекции у свиней

Результаты наблюдений по особенностям клинических форм цирковирусной инфекции занесены в таблицу 4. Надо сказать, что этим же способом мы воспользовались для оценки тяжести течения цирковирусной инфекции.

Таблица 4

Характеристика тяжести течения СПМИС_

Признаки Клиническое течение заболевания

Легкое Среднее Тяжелое Крайне тяжелое

Температура, С0 38,9 ±0,6 39,6 ±0,9 40,6 ± 0,9 ниже 38,5 выше 41,5

ЧСС, уд/мин 98 ±7 110± 10 121 ±15 140

Астения нет умеренная выраженная адинамия

Одышка, дд/мин 18 15 ± 10 26 ±9 35 и выше

Аппетит не нарушен снижен поедает только сочные корма отсутствует

Скорость наполнения капилляров, сек 3 3±1 4 ± 1 Боле 5

Если у животного не менее 4 клинических признаков соответствует легкому течению заболевания или заболеванию средней тяжести (но не более 2-х), а остальные не выражены, животных относили в группу с легким течением заболевания. Если у животного не менее 4-х клинических признаков соответствовали средней тяжести или тяжелому течению (но не более 2-х), а остальные легкому или нормальным значениям животных относили в группу с заболеванием средней тяжести. Если у животного не менее 4-х клинических признаков соответствовали тяжелому течению или очень тяжелому течению (но не более 2-х), а остальные среднему или легкому течению, животных относили в группу с тяжелым течением заболевания. Если у животного не менее 4-х клинических признаков соответствовали очень тяжелому течению, животных относили в группу с очень тяжелым течением заболевания.

Клиническое обследование больного животного не всегда дает полное представление о характере болезни, поэтому необходимо проводить специальные исследования.

2.5. Результаты морфологических и биохимических исследований крови

Нами проведены морфологические исследования крови у свиней с разной степенью синдрома послеотьемного мультисистемного истощения (СПМИС). В опытах использовали 240 поросят крупной белой породы в возрасте 4-х, 5-и и 6-и месяцев. Такие же исследования были проведены в группах животных в возрасте 5-и и 6-и месяцев.

Животные каждого возраста были разбиты на 4 группы по 20 голов. Контрольная группа включила 20 голов клинически здоровых поросят в

возрасте 4-х месяцев не имеющих дефицита массы тела и клинических признаков заболевания. При исследовании в ПЦР были получены отрицательные результаты на все инфекционные заболевания свиней. Опытные группы были составлены из животных, при исследовании материала от которых был получен положительный результат в ПЦР на ЦВС-2. Животные опытных групп были разбиты на 3 группы по 20 голов в каждой, критерием деления животных на группы был дефицит массы тела. В первой группе дефицит массы тела составил 10-20% от данного показателя здоровых животных, во второй группе дефицит массы тела составил от 21 до 40% и в третьей группе дефицит массы тела составил более 40% (табл. 5).

Таблица 5

Показатели крови у свиней с СПМИС в 4-и мес. (N=80)_

Контрольная Опытные группы

Показатели группа I II III

Эритроциты, х 1012/л 6,47±1,129 5,87±1,43 4,07± 1,25* 3,46+1,23

Гемоглобин, г/л 104,9±8,98 96,3±9,07 89,65± 10,75* 74,57+9,2

Гематокрит 0,42±0,024 0,35±0,032* 0,30±0,03** 0,27±0,02

СОЭ, мм/ч 2,14±0,91 3,25±1,82 5,72±1,02* 10,03±1,23

Лейкоциты, *109г/л ]2,5±0,7 9,8+2,19* 6,1±2,16* 5,8±2,25

Сегментоядерные нейтрофилы, % 36,8+12,21 48,6± 11,22 54,1±13,42* 57,8±12,5*

Лимфоциты, % 47,4±12,18 23,7±8,51 16,9+3,01* 13,7+2,3*

Моноциты, % 2,4±1,33 1,5±0,28 0,8±0,42 0,42±0,31

Сиаловые кислоты, 1,87±0,64 2,72±0,41 3,27±0,62 4,18±0,67

ммоль/л

Фибриноген, г/л 3,1 ±0,62 3,75±0,57 5,14±0,64 9,07+0,71

С-реактивный белок, - 1 2 3

кресты

Общий белок, г/л 67,6±2,21 69,62±4,81 58,1±3,31* 55,23+3,42*

*Примечание:Р<0,001 относительно здоровых телят

С возрастом показатели красной крови постепенно увеличиваются, так эритроциты в контрольной группе увеличивается с 4 месячного до 6 месячного возраста с 6,47±1,129хЮ12/л до 6,85±0,91><1012/л, гемоглобин со 104,9±8,98 г/л до 109+8,53 г/л. При СПМИС физиологического нарастания показателей красной крови не происходит, а напротив, отмечается снижение показателей. Так в первой опытной группе число эритроцитов и количество гемоглобина снижаются с 5,87±1,43 *1012/л и 96,319,07 г/л до 4,4±0,86 *1012/л и 96,7±11,43 г/л соответственно, во второй опытной группе с 4,07± 1,25хЮ12/л и 89,65± 10,75 г/л до 3,3±0,77 х 10,2/л и 85±10,63 г/л, а в третьей с 3,46±1,23><1012/л и 74,57±9,2 г/л до 2,79+0,42 и 78,2±1,31 соответственно.

Таким образом, при СПМИС у животных с возрастом не происходит физиологического нарастания показателей красной крови, а наоборот, отмечается снижение этих показателей, которое выражено тем интенсивней, чем сильнее прогрессирует истощение. По мере развития СПМИС у свиней отмечается развитие лейкопении и эозинопении. Но, особенно выражено

снижение абсолютного количества лимфоцитов, их процентное количество отображало трехкратное снижение во второй опытной группе по отношению к здоровым животным, но, учитывая нарастающую лейкопению, абсолютная лимфопения выражена еще сильнее. Несмотря на относительную нейтрофилию в опытных группах, за счет выраженной лейкопении отмечается абсолютная нейтропения.

Таблица 6

Показатели крови у свиней с СПМИС в 6-и мес. (N=80)_

Показатели Контрольная группа Опытные гр уппы

I II III

Эритроциты, х 1012/л 6,85±0,91 4,4±0,86 * 3,3±0,77** 2,79±0,42

Гемоглобин, г/л 109±8,53 96,7±11,43 * 85±10,63** 78,2±1,31

Гематокрит 0,43±0,08 0,35±0,06 * 0,27±0,1** 0,21±0,05

СОЭ, мм/ч 3,05±3,2 8,2±3,2 * 13,3±3,2** 17,4±3,1

Лейкоциты, *109г/л 16,08±2,27 12,37±3,38* 9,43±1,48* 7,14±2,05

Сегментоядерные нейтрофилы, % 30,6±8,34 44,17±3,32 43,57±3,2* 51,6±7,2*

Лимфоциты, % 52,2±9,35 31,59±2,37 27,14±1,42* 19,51±1,3*

Моноциты, % 4,61± 1,4 3,53±0,24 2,54±0,23 1,2±0,21

Сиаловые кислоты, ммоль/л 1,77±0,62 1,81±0,58 2,67±0,61 4,49±0,6

Фибриноген, г/л 2,19±0,63 3,49±0,61 5,53±0,58 8,56±0,64

С-реактивный белок, кресты - 1 2 3

Общий белок, г/л 69,37±4,32 53,68±1,77 47,3±1,88* 45,8±1,63*

*Примечание:Р<0,001 относительно здоровых телят

Отмечались общие тенденции развития гипопротеинемии и гипоальбуминемии у свиней по мере нарастания СПМИС. Развивается гипергликемия, что укладывается в теоретические аспекты развития стрессреакции. Растет уровень щелочной фосфатазы и протромбинового времени, что одновременно с гипоальбуминемией может говорить как о гепатопривном синдроме, так и возможном увеличении остеокластной активности для поддержания уровня кальция в крови, кроме того, как в возрастном аспекте, так и по мере нарастания СПМИС, отмечалось нарастание маркеров воспаления.

2.6. Результаты изучения иммунологического статуса у поросят

с СПМИС

Задачей этого этапа исследований явилось изучение особенностей клеточного и гуморального звеньев иммунитета у поросят с СПМИС. Нами проведены иммунологические исследования крови у поросят тех же групп, которым проводили морфологические и биохимические исследования крови. Результаты определения относительного и абсолютного содержания Т-

лимфоцитов у подопытных поросят в возрасте 4-и мес. представлены в таблице 7.. в возрасте 6-и мес. в табл. 8.

Таблица 7

Показатели клеточного иммунитета периферической крови у подопытных поросят в возрасте 4-х месяцев

1'руппа, (п = 20) Т- лимфоциты

Т-лимфоциты Т-хелперы, Т-супрессоры,

% х10"/л % х10у/л % *10"/л

Контрольная 46,3 ± 0,5 2,45±0,1 26,3 ± 0,9 0,64±0,01 11,7 ±0,6 0,29±0,02

1 опытная 44,32 ± 1,3* 1,03±0,02** 21,72 ± 1,9* 0,22±0,02** 11,8± 1,6 0,12±0,02*

11 опытная 31,3 ±1,4** 0,32±0,03** 16,72 ±1,1*' 0,17±0,01*" 9,31 ±0,9* 0,1±0,01**

III опытная 26,24±1,7 0,21±0,03** 12,51 ±0,9* 0,03± 1,02** 8,52 ± 0,5** 0,02 ±1,2*

* р<0,05,** р <0,01,*** р <0,001 в сравнении с животными контрольной группы.

Снижение общего числа Т-лимфоцитов и отдельных популяций РОК, снижение их соотношения (р-РОК и в-РОК) отражают нарушение лимфопоэза при СПМИС, перераспределение клеток и изменение регуляторного потенциала лимфоидных тканей.

Таблица 8

Показатели клеточного иммунитета периферической крови у подопытных поросят в возрасте 6 месяцев

Группа, (п = 20) Т - лимфоциты

Т-лим( юциты Т-хелпеоы. Т-супоессооы,

% х109/л % х 109/л % х109/л

Контрольная 48,6±0,5 4,08±0,02 29,4±0,9 1,2±0,01 13,5±0,6 0,55±0,01

1 опытная 43,82±1,3 1,71±0,12 22,3±1,9* 0,38±0,12 12,6±1,6 0,22±0,01

И опытная 30,4±1,4** 0,78±0,02 17,2Ш,1** 0,13±0,01 9,41±0,9** 0,07±0,01

III опытная 26,7±1,43* 0,37±0,01 15,84±1,4 0,06±0,01 8,37±0,9* 0,03±0,01

р<0,05,** р <0,01 в сравнении с животными контрольной группы.

Из теории общей иммунологии (В.М. Апатенко, 1982; Х.К. Барбер, 1980), выраженное снижение количества Т-лимфоцитов по отношению к здоровым животным сопровождается снижением клеточного иммунитета, что влечет за собой снижение продуктивности (Л.И. Винницкий, 1997; Л.Ю. Карпенко, 1997).

Анализ показателей, характеризующих гуморальное звено иммунитета у поросят в возрасте 4 и 6 месяцев (табл.9, 10) выявил, что относительное содержание в крови В-лимфоцитов у животных контрольной группы составило 23,1%, а среднее абсолютное значение 1,94><109/л, уровень иммуноглобилина A, G и М составил соответственно 3,67 мг/мл, 11,5 мг/мл, 1,88 мг/мл.

Таблица 9

Показатели гуморального иммунитета у подопытных поросят в возрасте 4-х месяцев

Группа, (п = 20) В-лимфоциты Иммуноглобулины

% х107л А, мг/мл G, мг/мл М, мг/мл

Контрольная 23,8 ±2,1 1,26±0,04 4,21±0,1 15,2±0,21 1,37±0,022

I опытная 22,14 ±0,3 0,51±0,05 3,58±0,04 14,7±0,1 1,28± 0,19

II опытная 14,37 ±2,1** 0,15±0,06** 2,17±0,1** 12,4±0,03 1,14±0,22

III опытная 11,72 ±0,16* 0,09± 0,31 * 1,98±0,1 11,7±0,21 1,05± 0,03

*р<0,05,** р <0,01 в сравнении с животными контрольной группы.

У поросят третьей опытной группы процентное количество В-лимфоцитов периферической крови снизилось до 10,72%, но, учитывая лейкопению и лимфопению, абсолютное значение В-лимфоцитов оказалось 0,15±0,03х109/л, что на 92,27% ниже, чем в контрольной группе. Средний уровень иммуноглобулина А, в и М составил соответственно 1,95 мг/мл, 9,84 мг/мл, 1,08 мг/мл, что на 46,87,14,43 и 42,55% ниже, чем в контрольной группе.

Таблица 10

Показатели гуморального иммунитета у подопытных поросят в возрасте __6 месяцев___

Группа, (п = 20) В-лимфоциты Иммуноглобулины

% х109/л А, мг/мл G, мг/мл М, мг/мл

Контрольная 23,1±2,2 1,94±0,016 3,67±0,5 11,5±0,4 1,88 ±0,2

I опытная 19,64±2,6 0,77±0,028 2,59±1,2 10,6±0,39 1,13 ±0,4

II опытная 12,07±2,7 р,31±0,034** 2,13±1,6** 11,4±0,42 1,42 ± 0,7

III опытная 10,72±2,61 0,15±0,03* 1,95±1,81 9,84±0,2 1,08±0,3

р<0,05,** р <0,01 в сравнении с животными контрольной группы

Как видно из таблиц, по мере развития СПМИС происходит снижение как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета, при этом выраженность иммунодефицита увеличивается по мере возраста животных.

2.7. Морфофункциональная характеристика лимфатических узлов свиней при цирковирусной инфекции

Для морфологического исследования была отобрана однородная группа поросят в возрасте 5 месяцев с дефицитом массы тела от 21 до 40% и подтвержденным методом ПЦР диагнозом цирковирусная инфекция. Нами были проведены гистохимические исследования с окраской на СВ2 и СБ20 маркеры.

В момент исследования лимфатических узлов происходит снижение общего количества Т-клеток, Т-лимфобластов и, как следствие,

активированных цитотоксических лимфоцитов — основных элементов защиты от зараженных цирковирусом клеток.

Во всех лимфатических узлах животных 5-месячного возраста отмечается увеличение содержания В-клеток, плазмобластов и антителообразующих плазмоцитов, которые могут блокировать антителами Т-клеточный цитотоксический эффект.

Перераспределение активности в пользу гуморального иммунного ответа в лимфатических узлах может в дальнейшем приводить к инактивации Т-клеточных иммунных реакций и системы мононуклеарных фагоцитов при сохранении плазмоцитарной реакции с повышенной антителообразующей способностью клеток.

Известно, что при вирусных заболеваниях в организме может формироваться протективный ТИ-1-зависимый цитотоксический иммунный ответ. Основные события при этом происходят в паракортикальной зоне регионарных основному процессу лимфатических узлах. Морфологически они проявляются увеличением размеров данной зоны, ростом численности лимфоцитов, усилением пролиферативных процессов. Развитие и длительное клиническое проявление заболевания в виде синдрома мультисистемного истощения свидетельствует о несостоятельности иммунной защиты против вирусной инфекции. По нашим данным, морфологическим подтверждением срыва противовирусного иммунного ответа может служить массовая гибель лимфоцитов в паракортикальной зоне практически всех лимфатических узлов.

Гиперплазия структурно-функциональных зон, ответственных как за клеточный, так и за гуморальный иммунный ответ, может быть расценена как отражение существующего на определенных стадиях развития инфекции антагонизма гуморального и клеточного иммунитета, что способствует функциональной недостаточности последнего. Но такая гиперплазия отмечается у животных 4-7 недельного возраста.

В результате проведенного нами морфологического и морфометрического исследований во всех лимфатических узлах животных выявлены однотипные изменения, которые заключались в гиперплазии коркового вещества за счет практически всех его структурно-функциональных зон - первичных и вторичных лимфоидных узелков, коркового плато, паракортикальной зоны. Корково-мозговой индекс составлял 1,43±0,02.

Из таблицы 11 видно, что в лимфатических узлах суммарная площадь первичных лимфоидных узелков превышает площадь вторичных лимфоидных узелков. Вторичные лимфоидные узелки, как правило, содержали полностью сформированные герминативные центры с дифференцировкой на темную и светлую зоны, довольно высоким процентом бластов и сохранением митотической активности в темной зоне.

Таблица 11

Результаты морфометрического исследования внутренних подвздошных лимфатических узлов при цирковирусной инфекции у свиней

Структурные компоненты лимфатического узла Площади структурных компонентов доли в процентах, М±ш Содержание клеточных элементов в структурнофункдиональных зонах

Виды клеток на площади (200 мкм)

Капсула 1,35±0,03% Вторичные лимфоидные узелки

Бласты 27,3±1,55

Трабекулы 1,12±0,02% Средние лимфоциты 59,42±2,61

Краевой синус 7,96±0,18% Малые лимфоциты 15,2±1,16

Корковое вещество 1,22±1,17% Макрофаги 7,26±0,6

Субсинусный слой 0,6±0,02% Ретикулярные клетки 2,76±0,09

Корковое плато 8±0,16% Клетки с фигурами митозов 3,61±0,04

Первичные лимфоидные узелки 14,48±0,2% Мозговые тяжи

Плазмобласты 3,02±1,01

плазмоциты 41,9±1,15

Вторичные лимфоидные узелки 9,34±0,13% Малые лимфоциты 34,62±5,73

Макрофаги 7,99±0,87

Паракортикальная зона 9,65±0,11% Ретикулярные клетки 12,45±1,19

Промежуточные корковые синусы 10,81±0,24% Клетки с фигурами митозов 1,21±0,01

Мозговое вещество 37,15±0,73% Дегенерирующие клетки 4,21±0,25

Паракортикальная зона

Бласты 1Д1±0,02

Мозговые тяжи 20,08±0,61% Средние лимфоциты 2,85±0,05

Мозговые синусы 17,39±0,89% Малые лимфоциты 83,05±2,21

Ретикулярные клетки 8,5±0,08

Корково-мозговой индекс 1,45±0,04 Макрофаги 12,9±0,08

Общая площадь лимфатического узла 100% Дегенерирующие клетки 8,27±0,02

Вместе с тем, отмечалось преобладание первичных лимфоидных узелков над вторичными во всех лимфатических узлах, что возможно связано с постепенным угасанием пролиферативных процессов. Из литературных данных известно, что на начальных этапах практически любого инфекционного процесса наблюдается интенсивное образование центров размножения. О предшествующей активности В-клеточных зон лимфатических узлов свидетельствует также клеточный состав мозговых тяжей, представленный зрелыми плазматическими клетками, малыми лимфоцитами, ретикулярными клетками, макрофагами, небольшим количеством плазмобластов и

эозинофильных гранулоцитов; однако регистрируется превалирование клеток с пикнотическими ядрами над митотически делящимися клетками. Клеточный состав паракортикальной зоны представлен в основном малыми лимфоцитами и ретикулярными (интердигитирующими) клетками; содержание средних лимфоцитов и бластов незначительно. Как и в зоне мозговых тяжей, обращает на себя внимание преобладание процессов гибели лимфоцитов над их пролиферацией - число дегенерирующих лимфоцитов в 2,2 раза превышает число клеток с фигурами митозов, в некоторых лимфатических узлах фигуры митоза полностью отсутствуют. Довольно велика численность макрофагов, фагоцитирующих остатки погибших лимфоцитов.

Мозговые синусы лимфатических узлов при цирковирозе у свиней, выглядели широкими крупнопетлистыми образованиями, пронизывающими всю ткань узла. Просвет их был довольно плотно заполнен клеточными элементами - ретикулярными клетками, макрофагами, лимфоцитами, гранулоцитами. Эти изменения можно трактовать как компенсаторные. Расширенные синусы являются структурной предпосылкой для замедления тока лимфы, что в условиях персистирующей инфекции может способствовать задержке возбудителя, пораженных клеток или их фрагментов в лимфатическом узле, созданию оптимальных условий для фагоцитоза, накопления лимфоцитов и межклеточных взаимодействий.

Таким образом, в лимфатических узлах свиней с синдромом мультисистемного истощения выявлены изменения структуры, свидетельствующие об имевшей место активации как Т-клеточных, так и В-клеточных зон, которые на момент исследования находилась в стадии угасания, о чем свидетельствует усиление процессов гибели лимфоидных клеток во всех структурно-функциональных зонах.

4. ВЫВОДЫ

1. Цирковирусная инфекция свиней в 2006 г регистрировалась в 5-ти, в 2007 г в 8, в 2008 г в 12-ти неблагополучных пунктах. Удельный вес цирковирусной инфекции свиней по количеству неблагополучных пунктов в среднем составил 22,36±3,96%. Заболеваемость и смертность от цирковирусной инфекции свиней составляла соответственно 5,5±0,18 и 0,69 ± 0,07. В среднем за 3 года летальность находилась на уровне 12,62 ± 0,97%.

2. Наиболее часто синдрому мультисистемного истощения из вирусных инфекций сопутствует респираторно-репродуктивный синдром свиней (55% случаев), а из бактериальных - микоплазмоз (38% случаев). Из 94 исследованных клинически больных поросят только у 2-х (2,1%) цирковирус встречался без сопутствующих инфекций. Бактериальная септицемия выявлена у 9%, а бактериальная пневмония - у 13% поросят с клинической картиной синдрома мультисисмемного истощения. Из респираторных бактериальных заболеваний при этом превалировал пастереллез.

По мере роста животных показатели красной крови постепенно увеличиваются, так эритроциты в контрольной группе увеличивается с 4 месячного до 6 месячного возраста с 6,4711,129хЮ12/л до 6,8510,91 *1012/л, гемоглобин со 104,918,98 г/л до 10918,53 г/л. В присутствии СПМИС физиологического нарастания показателей красной крови не происходит, а наоборот, отмечается снижение этих показателей, снижение выражено тем сильнее, чем сильнее прогрессирует истощение.

3. По мере развития СПМИС у поросят отмечается развитие лейкопении и эозинопении. Но, особенно выражено снижение абсолютного количества лимфоцитов, их процентное количество отображало трехкратное снижение во второй опытной группе по отношению к здоровым животным, но учитывая нарастающую лейкопению, абсолютная лимфопения выражена еще сильнее. Несмотря на относительную нейтрофилию в опытных группах, за счет выраженной лейкопении отмечается абсолютная нейтропения.

4. По мере нарастания СПМИС у поросят развивается гипопротеинемии и гипоальбуминемии, гипоргликемия, растет уровень щелочной фосфатазы и протромбинового времени, что одновременно с гипоальбуминемией говорит о гепатопривном синдроме

5. У поросят с тяжелой формой СПМИС отмечалась лейкопения до 5,8x10% и лимфопения до 13,7хЮ9/л. Лимфопения сопровождалась снижением процентного содержания Т-лимфоцитов до 26,24%, а абсолютного -до 0,21х109/л, что на 2,24хЮ9/л меньше, чем в контрольной группе. Процентное и абсолютное значение Т-хелперов и Т-супрессоров составило 12,51% и 0,03х109/л, 8,52% и 0,02х Ю9/л соответственно, что на 0,61х109/л и 0,27*109/л меньше, чем у здоровых животных.

6. У поросят с тяжелой формой СПМИС процентное количество В-лимфоцитов в периферической крови снизилось до 11,72%, но, учитывая лейкопению и лимфопению, абсолютное значение В-лимфоцитов оказалось

0.09±0,31х109/л, что на 93% ниже, чем в контрольной группе. Средний уровень иммуноглобулина А, в и М составил соответственно 1,98 мг/мл; 11,7 мг/мл; 1,05 мг/мл, что на 47,03,23,3 и 23,4% ниже, чем в контрольной группе.

7. В лимфатических узлах свиней с синдромом мультисистемного истощения выявлены изменения структуры, свидетельствующие об имевшей место активации как Т-клеточных, так и В-клеточпых зон, которые на момент исследования находилась в стадии угасания.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Диагноз синдром послеотъемного мультисистемного истощения свиней (СПМИС) необходимо ставить с учетом клинических признаков, морфологических и биохимических исследований крови, данных иммунологического исследования и морфометрии лимфатических узлов.

2. Полученные сведения о морфофункциональных особенностях иммунной системы и лимфатических узлов могут быть использованы в качестве исходных критериев для оценки и прогнозирования тяжести течения СПМИС у животных с установленным диагнозом цирковирусная инфекция.

3. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в научных целях, при составлении учебных и справочных пособий, чтении лекций, ведении лабораторно-практических занятий по специальности ветеринария и зоотехния.

6. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ:

1. Андреев, Д. А. Иммуногистохимическое исследование лимфоузлов при цирковирусной инфекции свиней / Д.А. Андреев, С.Н. Карташов, A.M. Ермаков, и др. // Ветеринарная патология, 2008.- N 4. - С. 26-30.

2. Андреев, Д.А. Некоторые аспекты морфологического исследования крови у поросят с цирковирусной инфекцией. / Д.А. Андреев // Современное состояние и перспективы развития патологии, морфологии и онкологии животных». Материалы Всеросс. науч.- практич. конф. -г. Новочеркасск, 2008. -С. 87-89.

3. Ключников, А.Г. Патоморфологическая характеристика лимфатических узлов при цирковирусной инфекции свиней / А.Г. Ключников, С.Н. Карташов, Д.А. Андреев и др. // Современное состояние и перспективы развития патологии, морфологии и онкологии животных». Материалы Всеросс. науч.- практич. конф. - г.Новочеркасск, 2008. -С. 89-94.

4. Карташов, С.Н. Морфофункциональные изменения в печени при цирковирусной инфекции у поросят / С.Н. Карташов, А.Г. Ключников, Д.А. Андреев и др. // Современное состояние и перспективы развития патологии, морфологии и онкологии животных». Материалы Всеросс. науч.- практич. конф. -г.Новочеркасск, 2008. -С. 94-96.

5. Андреев, Д.А. Показатели красной крови при цирковирусной инфекции у свиней / Д.А. Андреев, A.A. Миронова // Повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы на основе инновационных достижений». Материалы Всеросс. науч.-практич. конф. -г. Новочеркасск, 2009. -С. 67-69.

6. Андреев, Д.А. Морфометрические исследования лимфатических узлов у свиней при цирковирусной инфекции / Д.А. Андреев, A.A. Миронова, С.Н. Карташов и др. // Повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы на основе инновационных достижений». Материалы Всеросс. науч.-практич.конф. -Новочеркасск, 2009. - С. 67-69.

7. Карташов, С.Н. Изменения крови при синдроме послеотъемного мультисистемного истощения свиней / С.Н. Карташов, А.И. Бутенков, Д.А. Андреев // Инновационные пути развития животноводства: сборник научных трудов/ Карачаево-Черкесская государственная технологическая академия. - г. Ставрополь: Сервисшкола, 2009. - С. 322-325.

8. Карташов, С.Н. Поражение гепатобилпарного тракта при цирковирусной инфекции у свиней / С.Н. Карташов, А.Г. Ключников, Д.А. Андреев // Труды Кубанского государственного аграрного университета. Научный журнал Серия «Ветеринарные науки» № 1(ч.1) 2009 г. - С. 47-5J

9. Карташов, С.Н. Патоморфологическая характеристика печени и почек при цирковирусной инфекции свиней / С.Н. Карташов, А.Г. Ключников, Д.А. Андреев, A.C. Лысак // Труды Кубанского государственного аграрного университета. Научный журнал Серия «Ветеринарные науки» № 1(ч.2) 2009 г. - С. 35-37.

10. Карташов, С.Н. Основные изменения кишечника при синдроме послеотъемного мультисистемного истощения свиней / С.Н. Карташов, А.Г. Ключников, Д.А. Андреев // Известия оренбургского государственного аграрного университета. Теоретический и научно-практический журнал № 1(21)2009г.-С. 245-248.

Андреев Денис Александрович

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИМ СТАТУС И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ЛИМФОИДНЫХ ОРГАНАХ ПРИ ЦИРКОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ СВИНЕЙ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Подписано в печать 2,10.09 Печать оперативная Объем 1 усл.печ.лист. Заказ № 3610/1 Тираж 100 экз. Издательско-полиграфическое предприятие ООО "МП Книга", г.Ростов-на-Дону, Таганрогское шоссе, 106

Актуальность темы. Эмерджентные болезни являются одной из наиболее актуальных проблем современного животноводства. В инфекционной патологии свиней важная роль принадлежит недавно получившим широкое распространение болезням, ассоциированным с цирковирусами.

У свиней идентифицированы два вида цирковирусов. Цирковирус свиней типа 1 (ЦВС-1) был обнаружен в 1974 году как нецитопатогенный кон-таминант перевиваемой культуры клеток почек поросят РК-15 и считается непатогенным вирусом, так как не вызывает каких-либо клинических признаков у инфицированных животных.

Цирковирус свиней второго типа (ЦВС-2) является возбудителем болезни поросят, впервые зарегистрированной в Канаде в 1991 году, и в связи с поражением различных систем организма назван «синдромом послеотъёмно-го мультисистемного истощения» (СПМИС). Болезнь характеризуется проявлением комплекса клинических признаков, включающих потерю веса, отставание в росте, одышку, диарею, желтуху и пневмонию. В естественных условиях СПМИС чаще отмечают у поросят 6-15 недельного возраста, у которых регистрируют наибольший отход, при этом пик заболеваемости приходится на 10-ти недельный возраст. У инфицированных животных вирус обнаружен в клетках лимфоидной системы (макрофагах, дендритных клетках, Т- и В- лимфоцитах), являющихся клетками-мишенями для ЦВС-2 (Б.Г. Орлянкин с соавт., 2002; E.G. Clark, G.M.; 1997Allan et al., 1998; A. Mankertz et al., 2000; В. O'Connor et al., 2001 и др.). Интенсивное размножение вируса в клетках иммунной системы приводит к их гибели и развитию иммунодефи-цитного состояния. У таких животных создаются условия для возникновения вторичных инфекций, вызываемых условно-патогенными микробами (J. Segales et al., 2001). Вместе с тем, исследований лимфоидных тканей свиней при цирковирусной инфекции свиней недостаточно, нет данных по распределению Т- и В-лимфоцитов в лимфатических узлах свиней при разной тяжести заболевания, что и определило цель нашего исследования.

Цели и задачи исследования. Выяснить эпизоотическую ситуацию по цирковирусной инфекции свиней в Ростовской области, изучить иммунный статус и морфологические изменнеия в лимфатических узлах у свиней, инфицированных ЦВС-2 при разной выраженности синдрома послеотъемного мультисистемного истощения.

Для решения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить эпизоотическую ситуацию по цирковирусной инфекции свиней в хозяйствах Ростовской области.

2. Выяснить ко-инфицирующие факторы при цирковирусной инфекции у свиней.

3. Изучить клинико-эпизоотологические проявления при разной степени тяжести цирковирусной инфекции у свиней.

4. Изучить иммунный статус свиней больных синдромом послеотъемного мультисистемного истощения разной степени тяжести.

5. Изучить морфофункциональные изменения в лимфоидных органах при разной выраженности синдрома послеотъемного мультисистемного истощения.

Научная новизна. Выяснена эпизоотическая ситуация по инфекционным болезням свиней в т.ч. по цирковирусной инфекции свиней в хозяйствах Ростовской области. Изучены клинико-эпизоотологические особенности проявления цирковирусной инфекции свиней. Впервые изучено влияние цирковирсной инфекции на морфологические показатели крови, гистологические структуры в лимфатических узлах в зависимости от течения при спонтанной цирковирусной инфекции свиней. Изучена динамика иммунного статуса свиней больных цирковирусной инфекцией, выявлена динамика распределения Т- и В- лимфоцитов в различных лимфатических узлах свиней по мере развития цирковирусной инфекции.

Теоретическая и практическая значимость работы. Представленные результаты эпизоотологического обследования неблагополучных по цирковирозу свиноводческих хозяйств могут быть использованы при разработке планов противоэпизоотических мероприятий. Морфометрические данные исследований лимфатических узлов свиней при цирковирусной инфекции могут быть использованы для комплексной диагностики синдрома послеотъемного мультисистемного истощения свиней. Полученные данные по иммунологическому статусу свиней при цирковирусной инфекции и распределения Т- и В- лимфоцитов в лимфатических узлах больных животных могут использоваться в учебном процессе по специальностям «Биология», «Ветеринария» и «Зоотехния», написании учебных пособий и практических рекомендаций.

Диссертационное исследование проведено в соответствии с темой научных исследований Государственного научного учреждения «СевероКавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт» Россельхозакадемии - "Разработать методы ранней диагностики, эффективные средства и способы профилактики и лечения массовых заболеваний у молодняка высокопродуктивных животных" государственная регистрация №15070.3666026906.06.8.001.2.

Реализация результатов исследований. Результаты исследований используются при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по вирусологии и патанатомиии в ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», в работе Ростовской областной ветеринарной лаборатории, СББЖ г. Новочеркасска, ветеринарной клинике «ВитаВет» г. Шахты, внедрены в ЗАО «Батайское» Азовского района и ОАО Совхоз «Южный» Сальского района, Ростовской области.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях ФГОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», ГНУ «СевероКавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт» в 2006-2008 гг. и на 3 всероссийских и международной научно-практических конференциях гг. Ростове, Воронеже, Краснодаре, Новочеркасске.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 10 научных работ, из них 3 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа изложена на 156 страницах компьютерного текста, содержит 25 таблиц, 39 рисунков. Библиографический список включает 248 источников, в том числе 194 зарубежных.

4. ВЫВОДЫ

1. Цирковирусная инфекция свиней в 2006 г регистрировалась в 5-ти, в 2007 г в 8, в 2008 г в 12-ти неблагополучных пунктах. Заболеваемость и смертность от цирковирусной инфекции свиней составляла соответственно 5,5±0,18 и 0,69 ± 0,07. В среднем за 3 года летальность находилась на уровне 12,62 ± 0,97%.

2. Наиболее часто синдрому мультисистемного истощения из вирусных инфекций сопутствует респираторно-репродуктивный синдром свиней (55% случаев), а из бактериальных - микоплазмоз (38% случаев). Из 94 исследованных клинически больных поросят только у 2-х (2,1%) цирковирус встречался без сопутствующих инфекций. Бактериальная септицемия выявлена у 9%, а бактериальная пневмония - у 13% поросят с клинической картиной синдрома мультисистемного истощения. Из респираторных бактериальных заболеваний при этом превалировал пастереллез.

По мере роста животных показатели красной крови постепенно увеличиваются, так эритроциты в контрольной группе увеличивается с 4

11 месячного до 6 месячного возраста с 6,47±1,129^10 /л до 6,85±0,91хЮ /л, гемоглобин со 104,9±8,98 г/л до 109+8,53 г/л. В присутствии СПМИС физиологического нарастания показателей красной крови не происходит, а наоборот, отмечается снижение этих показателей, снижение выражено тем сильнее, чем сильнее прогрессирует истощение.

3. По мере развития СПМИС у поросят отмечается развитие лейкопении и эозинопении. Но, особенно выражено снижение абсолютного количества лимфоцитов, их процентное количество отображало четырехкратное снижение во второй опытной группе по отношению к здоровым животным, но учитывая нарастающую лейкопению, абсолютная лимфопения выражена еще сильнее. Несмотря на относительную нейтрофилию в опытных группах, за счет выраженной лейкопении отмечается абсолютная нейтропения.

4. По мере нарастания СПМИС у поросят развивается гипопротеинемии и гипоальбуминемии, гипергликемия, растет уровень щелочной фосфатазы и протромбинового времени, что одновременно с гипоальбуминемией говорит о гепатопривном синдроме

5. У поросят с тяжелой формой СПМИС отмечалась лейкопения до 5,8><109/л и лимфопения до 13,7хЮ9/л. Лимфопения сопровождалась снижением процентного содержания Т-лимфоцитов до 26,24%, а абсолютного - до 0,21х109/л, что на 2,24><109/л меньше, чем в контрольной группе. Процентное и абсолютное значение Т-хелперов и Т-супрессоров составило 12,51% и 0,03><109/л, 8,52% и 0,02*109/л соответственно, что на 0,61хЮ9/л и 0,27хЮ9/л меньше, чем у здоровых животных.

6. У поросят с тяжелой формой СПМИС процентное количество В-лимфоцитов в периферической крови снизилось до 11,72%, но, учитывая лейкопению и лимфопению, абсолютное значение В-лимфоцитов оказалось 0,09±0,31хЮ9/л, что на 93% ниже, чем в контрольной группе. Средний уровень иммуноглобулина А, О и М составил соответственно 1,98 мг/мл; 11,7 мг/мл; 1,05 мг/мл, что на 47,03, 23,3 и 23,4% ниже, чем в контрольной группе.

7. В лимфатических узлах свиней с синдромом мультисистемного истощения выявлены изменения структуры, свидетельствующие об имевшей место активации как Т-клеточных, так и В-клеточных зон, которые на момент исследования находилась в стадии угасания.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Диагноз синдром послеотьемного мультисистемного истощения свиней (СПМИС) необходимо ставить с учетом клинических признаков, морфологических и биохимических исследований крови, данных иммунологического исследования и морфометрии лимфатических узлов.

2. Полученные сведения о морфофункциональных особенностях иммунной системы и лимфатических узлов могут быть использованы в качестве исходных критериев для оценки и прогнозирования тяжести течения СПМИС у животных с установленным диагнозом цирковирусная инфекция.

3. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в научных целях, при составлении учебных и справочных пособий, чтении лекций, ведении лабораторно-практических занятий по специальности ветеринария и зоотехния.

129

1.9. Заключение

Клетки-мишени для вируса CAV, PCV и TTV in vivo хорошо изучены и известны. Для CAV это, в основном, являются гемоцитобласты в костном мозге и предшественники лимфоцитов в тимусе (A.M. Земсков с соавт., 1999; M.S. McNulty, 1991; М. Hironori et al., 1999; A.L. Hamel et al„ 2003; D. Todd, 2001). Кроме того, CAV-антиген обнаруживали в тимусе, селезенке, костном мозге, провентикулюсе и в двенадцатиперстной кишке экспериментально зараженных птиц (W.J. Smyth et al., 2001).

Что касается обоих типов PCV, то они способны инфицировать несколько тканей свиней, что зависит от количества циркулируем ого в организме вируса, клинического статуса и возраста животного. При экспериментальном заражении PCV-1 обнаруживали в тимусе, селезенке, мезентериальных лимфатических узлах, почках, тонком кишечнике и легких (О.В. Кухаркина с соавт., 2007; G.M. Allan et al., 1994; G.M. Allan et al., 1995). G.M. Allan et al. (1994) сообщают, что PCV-1 может поражать моноциты/макрофаги, но не Тили В-клетки in vivo. При экспериментальном заражении PCV-2, антиген выделяли из печени, легких, почек, поджелудочной железы, миокарда, кишечника, семенников, мозга и слюнной железы, щитовидной железы и надпочечников (Дж. Л. Микинс с соавт., 1982; И.М. Карпуть, 1993; S. Kennedy et al., 2000), а также обнаруживали в миндалинах, селезенке, лимфатических узлах и подвздошной кишке (R.M. Pogranichniy et al., 2000).

У больных в естественных условиях поросят с синдромом мультиси-стемного истощения, вирус PCV-2 выделялся из следующих органов: легкие, лимфатические узлы, селезенка и миндалины (A.L. Hamel et al., 1998; D. Mahe et al., 2000). Существует мнение, что PCV-2 сначала поражает миндалины и лимфатические узлы (С. Rosell et al., 1999) или тимус (L. Darwich et al., 2004), a затем распространяется по всему организму с током крови (M. Ouardani et al., 1999; S.A. Krakowka et al., 2004). Существует два противоположных мнения о репликации вируса. Одни авторы считают, что вирус инфицирует лимфоциты и реплицируется в них, в частности в В-клетках (Б.Ф. Семенов с со-авт., 1982; T. Shibahara et al., 2000), другие полагают, что репликации в лимфоцитах не происходит (С. Choi et al., 1999; J. Kim et al., 2003).

Исследования с использованием потоковой цитометрии дают основание полагать, что PCV-2 вероятно не инфицирует "спокойные" (resting) лимфоциты in vivo, однако было доказано инфицирование моноцитов и макрофагов (Ю.Н. Федоров с соавт., 1996; D.F. Gilpin et al., 2003).

Оба типа вируса PCVI (С. Choi et al., 2002) и PCV2 (G.W. Stevenson et al., 2001) обнаруживаются в нервной ткани поросят, больных врожденным тремором (СТ), несмотря на то, что никакой корреляции концентраций того или иного вируса с клиническим проявлением заболевания выявлено не было. PCV-2 также может поражать и персистировать в дендритических клетках, хотя активность репликации в этих клетках не велика (I.E. Vincent et al., 2003).

Синдром послеотьемного мультисистемного истощения — заболевание поросят послеотьемного периода, характеризующееся истощением, одышкой, диареей, отставанием в росте, лихорадкой, увеличением лимфоузлов, бледностью или желтушностью кожи (E.G. Clark, 1997; J.С. Harding, 1997; J. Ellis et al., 1998; I. Kiss et al., 2000; L. Darwich et al., 2004).

Синдром отмечают, в основном, у поросят 6-15 недельного возраста, свободных от основных кишечных и респираторных заболеваний, включая гастро-интестинальные и респираторные заболевания, такие как микоплазменная пневмония, актинобациллярная плевропневмония, сальмонеллез, трансмиссивный гастроэнтерит, болезнь Ауески, атрофический ринит, дизентерию свиней (И.Л. Винницкий с соавт., 1997; С.А. Кукушкин с соавт., 2005; Б.Г. Орлянкин с соавт., 2005; В.И. Чермашенцев с соавт., 2006; R. Drolet et al., 1997; J. Ellis et al., 1998; T. Sirinarumitr et al., 2001; I. Richthofen et al., 2007). При этом редко поражаются поросята-сосуны, что, вероятно, можно объяснить их лактогенным иммунитетом.

Основным клиническим симптомом при СПМИС является истощение животных. Чаще всего поражаются поросята, которые к моменту отъема хорошо развиты. Животные начинают терять в весе, что может продолжаться неделями и приводит на конечной стадии болезни к ярко выраженной клинической картине (Е.В. Велик, 2007, 2008; В. Daft et al., 1996; P. LeCann et al., 1997; J. Segales et al., 1997; L. Carrasco et al., 2000). Очень часто у больных животных наблюдается одышка, которая иногда может угрожать жизни животного. При этом может развиваться обширная легочная недостаточность (C.L. Truong et al., 2001; L. Darwich et al., 2004). В рамках вторичных бактериальных инфекций, вызываемых пневмотропными патогеннами, вместе с одышкой может появиться и кашель.

При СПМИС наблюдаются значительные изменения в органах и тканях. Так, в крови и лимфоидных тканях происходит изменение соотношения числа лимфоцитов (содержание которых сильно понижается), к числу моноцитов и нейтрофилов (количество которых увеличивается). Так, их соотношение у больных животных может составлять 60-70% нейтрофилов и 30-40% лимфоцитов, в то время как у здоровых оно обратное. В то же время, общее количество лейкоцитов остается неизменным (В.М. Апатенко, 1982; I.W. Walker et al., 2000; L. Darwich et al., 2004). При этом у животных в острой фазе отмечены случаи анемии.

При иммуногистохимическом исследовании лимфоидной ткани, отмечали поражения лимфоузлов, миндалин, Пейеровых бляшек, селезенки и тимуса. В ряде случаев базофильные внутриплазматические включения содержащие ЦВС-2, обнаруживаются в клетках гистиоцитного происхождения (P.M. Баевский, 1979; М.В. Войно-Ясенецкий, 1981; С. Rosell et al., 1999). Может иметь место также спорадический мультифокальный коагулирующий некроз (J. Segales, М. Domingo, 2002), а так же другие тканевые изменения: гепатиты различной степени, лимфоцитные и лимфогистиоцитные инфильтрации в почки, кишечная атрофия с вариантами слущивания и/или дегенерации клеток эпителия (С. Rosell et al., 1999; G.M. Allan, J.A. Ellis, 2000; С. Rosell et al., 2000), обширные поражения легких: орган диффузно спавшийся, на ощупь легкое тяжелое, твердое, резиноподобное. Часто выявляются уплотнения верхушечных долей, вызванных вторичной бактериальной инфекцией. В тяжелых случаях имеют место альвеолярные кровоизлияния. У заболевших животных наблюдают пневмонию, от многоочаговой лимфогистиоцитной до рассеянной гранулематозной интерстициальной, часто сопровождаемой присутствием гигантских аномальных клеток (Б.Г. Орлянкин с соавт., 2002; М. Kiupel et al., 1998; J. Mankertz et al., 1998b; F. McNeilly et al., 1999).

У поросят иммуносупрессия связана с репликацией вируса и его способностью распространяться на гепатоциты и Купфферовы клетки, также как и на дендритные клетки и макрофаги (S.A. Krakowka et al., 2005). В основном CD8+ клетки ответственны за цитотоксический ответ. В результате циркови-русной инфекции изменяется уровень лимфоцитов в периферической крови, особенно снижается количество CD4+, CD8+, DP (double-positive) клеток (L. Darwich et al., 2002). Хотя по данным других авторов уровень CD4+ клеток снижается и у поросят отьемышей без СПМИС (J. Segales et al., 2001). Ряд авторов описывают снижение уровней Т- и В-клеток у инфицированных поросят (J. Segales et al., 2001; L. Darwich et al., 2002; L. Darwich et al., 2004; F. Chianini et al., 2003; J. Kim et al., 2003), что зависит от типа лимфоидной ткани и интенсивности репликации вируса (L. Darwich et al., 2002; L. Darwich et al.,

2004; Р. СЫашш а1., 2003). Предполагается, что гибель В-лимфоцитов приводит к иммуносупрессии при патоцитологии сохранившихся макрофагов, которые являются источником вируса при перемещении по организму (Т. БЫЬаЬага е1 а1., 2000). Существуют противоречивые данные о способности цирковируса образовывать апоптозы. А.Я. Кезет^еБ е! а1. (2004) сообщает о возможности возникновения апоптозов в лимфоидной ткани клинически здоровых и больных поросят с признаками СПМИС в зависимости от стадии болезни и тяжести гистологических изменений. У клинически здоровых поросят в лимфоидной ткани процесс апоптоза и пролиферации находится в балансе, поддерживается стабильная популяция клеток. Если не возникает РСУ-опосредованный апоптоз, снижающаяся клеточная пролиферация у больных СПМИС поросят может быть основной причиной снижения количества клеток в лимфоидной ткани (А.К. Яезепёез е1 а1., 2004; Ь. Мапс1поН е1 а!., 2004). Альтернативная теория предполагает другое объяснение изменений в популяции лимфоцитов. Б.А. Кгако\ука е1 а1. (2002) считают, что гибель фагоцитов обусловлена вирусом и более поздним запуском клеточного метаболизма.

Более поздние исследования УЛ. Окис1а е1 а1. (2003) с экспериментальным заражением поросят изолированных от других животных, подтвердили теорию А. 8. Ьас1е^аег-М1кке18еп е1 а1. (2002) и дали основание полагать, что развитие СПМИС связано с уровнем титров вируса в сыворотке крови. В эксперименте у 6 из 16 зараженных поросят развился СПМИС, вирус был обнаружен во всех органах и тканях. У поросят с клиническими признаками СПМИС отмечался высокий уровень титра вируса во всех тканях. Нужно отметить, что антитела к вирусу были обнаружены у большинства зараженных животных на 14 день и 4-й месяц после инфицирования. У поросят с клинической картиной СПМИС антитела не были обнаружены в течение 28 дней после инфицирования. Результаты исследований показали, что развитие СПМИС может зависеть от количественного аспекта распространения вируса по тканям и выработки антител (УЛ. Оки<1а е! а1., 2003). Большинство последующих исследований связывают тяжесть проявления СПМИС с накоплением вируса в лимфоидной ткани и печени (8.А. Кгако\ука е1 а!., 2005), а использование иммуностимуляторов отягощает течение болезни.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы, методы и объемы исследований

Работу выполняли с 2006 по 2008 гг. в лаборатории функциональной диагностики болезней сельскохозяйственных животных и визуальной диагностики болезней молодняка животных ГНУ СКЗНИВИ Россельхозакадемии, Ростовской областной ветеринарной лаборатории, а также в хозяйствах Ростовской области.

При изучении распространения инфекционных и инвазионных заболеваний использовались отчетные данные ГУРО «Ростовская областная ветеринарная лаборатория».

Для определения роли и места цирковирусной инфекции в условиях Ростовской области нами изучен нозологический профиль, удельный вес, географическое распространение и годовая динамика инфекционных заболеваний свиней в Ростовской области.