Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка лабораторного образца инактивированной вакцины против гемофилезной плевропневмонии свиней

" '^Российская академия сельскохозяйственных наук Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии

На правах рукописи УДК 619:616.981.616.636.4

АСПИРАНТ РУБИНСКИЙ ИГОРЬ АЛЕКСАНДРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО ОБРАЗЦА ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ГЕМОФИЛЕЗНОЙ ПЛЕВРОПНЕВМОНИИ СВИНЕЙ

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

г. Покров — 1994 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии и в Свердловской научно-исследовательской ветеринарной станции.

Научные руководители: кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник

КУШНИР А. Т., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ЛАВРЕНТЬЕВ Н. И.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор СИДОРОВ М. А. (Московский институт прикладной биотехнологии), кандидат ветеринарных наук ЧИСЛОВ Ю. В. (ВНИИВВиМ).

Ведущее учреждение — ВГНИИ контроля, стандартизации и сертификации вет. препаратов.

Защита состоится 18 марта 1994 года в часов

на заседании специализированного совета Д-120.61.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, г. Покров, Владимирской обл., ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан «

/7 » февраля 1994 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Г. П. Федоров

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕВ1СТИКА РАБОТУ ■.

Актуальность теш. Интенсификация производства овинакк, перевод отрасли яа промвшяейаую основу, связанная о 8?ий высокая концентрация животных на ограниченная территориях резко изменили этологлю свиней, что сривеяо к сяижеега резистентности животних, возникновении новых ¿окезнзй. К «ишду тажовнх относится ге;.:сх5ияёзкая плевропневмония свиней <ГГО). Эр заболевание ■ зарегистрировано во всех странах мира с развитие свиноводством. В число их входит Россия. Болезнь характеризуется васокой конта-гиозностьо, а её возбудитель - вирулентностью. Основной путь заноса возбудителя в ранее благополучные по ГШ хозяйства - это ввод ашэоъ'ных бактерионосителей. Впервые появившись в стаде -он вызывает бояезнь, которая затем надоко распространяется а охватывает все Еозрастнне группы свиней. Зкоаоадческий уцарб, на-восашй гемофилёзяой плевропневмонией, охромей, так как гибель яивотнюс иогет достигать 10С{5. Лечение эффективно дашь в острой фазе, Порейояавшие свиньи становятся баятерио не кит в дяш, снижают прирост массы тела. Зайопевание. восат стационарный характер и избавиться о? него крупному свиноводческому хозяйству практически невозможно. Б связи с этим, первостепенное значение приобретают прогргжи, направленные на предупреждение заноса возбудителя плевропневмонии в благополучные сгада. Среда профилактических мероприятий важное место занимает активная ищуниаздия, Иммунопрофилактика гемофвлёззой цяэвроаневшкпи. свиней осуществляется вакцинами различных составов, по разязчныи схемам Число разработаякшс и праддожеянад к практическому ярименэтпо шво~, полиБалеатиьс, ассоциированных препаратов для спецэ^гчесгсй профилактики ГШ достаточно веяихо. Еояьшлотвд тлевшихся-вакцин

аозвоияек-слезим- заболеваемость в тяхссть течения.болегка, угепьсггь расаод аедикакевтол на ьечекяе, яоеыслть сохранность животных. Их эф£еп?игкос?ь определяется: аяштешгым составом, era соотвётэтхь'егд с цирку ¡шрувдш в даш'.оЕ геогрэфлчеогой зоне серовароы (серосараиа), схемой, пршенеиля. В соотвеетвли с этли, йоияыо conepseисхшвакия состава вакцин, методов и схем здцая гдзотных, необходаас вестя иосаедоаания з направлении создашь бодее совершашшх техкояогдм, давда воздагность быстрого получения обьёмов высокоэф^ект^внах препаратов из

кестшх серошраантов возбудителя ГШ1.

Цель л задачи исследований. Цеп» нашей работы - разработка ияачуивароваинай хакцдкы пробив гшэфядёзней пкевредаешоакд свиней на основе иествых шташэв.

Ддк достанеши указанной цела шоб.ходамо бы до решить cac— дуздвг задача:

» выделят* культура возбудитедл ГШ, сашей и обобрать яре-' годные дня создания внгсшщого препарата, обдадавдие твдячmm сеойибзши п горозей сгабиькссли,. аьтяваае в ии^шологичежои отаооешд, даивдо яшг-Зояьала ярлроат клеточной масса при культ;:-■влреванла на всхусгвейяых глтатеяыго. средах;

- огработатъ схеш изамавацаи культур возбудителе болазкк;

- разработать паббра?ор<шй регаамзкт узготовпегше экедерн-ментазъасго образца йкаигивярованвой вакцдацг;.

— сп&едезтаа зЕсаершечталыош путем ш:ншзсьну а ш-.-уягзч-рувдуя! дозу (ЭДН) на пороодгах;

- олределить срски яаезеуяжерия и п.родоякггслуюс'гь шадня~ тега при однократной введения вагадаы поросята;

. - отработать схеык вайцянадаи гдаотшк. {поросята} в усвоиа-

ях эксперимента;

- провести кошссио.чине испытания янактквировацкоЯ вакцянк на бе лих к свшьях, подготовить проект норцатявло-техна-ческой докукевтации (НТД) к на его основе изготовить опытные серии гакцйны о цеаьо проведения ароизводетшшкх испытаакй. .

Научная новизна. Научная ковизна ароведёнинх исследований созтоит в тон, что:

- выбран метод отбора поп$тх иэояятов» пригодных к исдсяь-зоез.чыо прх производство стшктивяроьгнних вакцин против ГШ свиней;

- усовершенствована яидкая питательная среда лят. чнраюава-. пая возбудителя оолезгш з биологическом реакторе (Оформлена заявка на >юлучение патента Российской Фадерадаа.};

- предгсяено лабораторное оборудование, поазодяшев воспроизводить техно логический процесс куитявгтрсваняя кггкроорга«- . низка в мшшатьре (шнв-роактора общей ёмкости) 2600 и 11500

с системами, сухой стеряякзадЕИ подаваемого в кх полость воздуха)♦

Практическая значмгоать. На основании эксйеряаектаиьшос исследований разработата зкспериметеавьнае образцы шакгиваровэн-гой, экульгировзаной а фэ{аюа-квасцовой,вакцяим.'протгв ПИ свиней. Обе гюдафякадча препарата успезшо исднтанн вусловаях производства на поголовье 300 свяней.

Предю«вн метод отоора полевцх яэопятов, пригодных к депо-, яьзовэнп» лря производстве шахчивгровашшх вадцин против ГШ1. Зыбракни-й кояезой язогят возбудима®'0олваяк-.я^по»8ояаа зад.'.'.-' дегоговлжт экспериментальной, эмульгированной форьюявахщнга. (готовим ;ю уть-зрздёняой Г/В ШХ СССР и.Ь?,Х$&} г,теяюдоглп), уоторал с пржяйт^пнаш эффектом испытана в ууюьаях'произвол-' ства £13 аогодевье боле? 150000 садяяй.

Разработан проект иоршгитщо-техчаческой документации, включавдхй: "Лабораторий регдапет (технология) изготовления и контроля качества экспериментальных, инактизлоованных (эмулы'я-. розшсаой, <$оршл-квасдовом) вакцин против геыофилёзной плевропневмония свиней", "^Экспериментальные, ингктивираваннка (ъиупъ-гирова;.ная, фэрмол-квасцрвая) вакцины против геыофалёзиой плевропневмонии свиней (Технические условия.)", "Вре.-ленная инструкция rio применена» эксдершлентаяьных, виактивированных (эмульгированной ,. форыоп-квасцовой) вакцин против гемофилёзяой п.чевро-пневдания свиней". Вся документация рассмотрена и одобрена Учёным советом Свердловской ШВС и утверждена её директором. Технология производства вакцины учитывает био-тогические особенности возбудителя йояезнк в каждом из числа неблагополучных по ГПП хозяйств (их груше), рассчитала на изготовление больших и калах объёиэв той или иной (из двух предлокенних) дадафикацяй препарата.

•Ос^р&яые поюкекня диссертационной работы, вадвигаеше на . защиту: .

. . - жидкая питательная среда дпя культивирования возбудителя ГПП свиней в биоаоглческом реакторе; '

- технологические процессы; получения внактивировакиой вакцины;

- экспериментальное обоснование защитной эффективности ша-. ктйвгрованной вакцины против гемофияёзной плевропневмонии свинеа

Апробация наготы», Материалы диссертация доложены на-научных конференциях НШ НЗ ГСФС? (I95G), ашмввим (ISS2), на засе-дашщх Учёного совета Свердловской íMBC к ВНИИВДн!.! (I9S0-I&93 , и'). ■.•."..■■■■'-.'■.'.'■

Публикации. По теш диссертационной работа опубликовало 2 научных статьи. Оформлена одна заявка на получение Патента. Российской Федерации, Две работу представлены для опубликования.

Объём и структура работа. Диссертация наложена на 20? диетах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, . собственнее исследования, обсуждение, шведа, практические предложения, список литература (287 историков, в том.числе 63 отечественных). Работа иллистрарована 18 таблицами и 8 рисунками, дополнена применениями.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1» Материалы я метода..

При проведении исследований использовали: S3 пробы патологического ¡материала {кусочки легких); 58 культур возбудителя ГШ • свиней, выделзнннл из лёгочной ткани лава;«: поросят; производственный штамп 17-19 из коллекции Московского Института, прикладной биотехнологии (выделен И.А.. Сидоровым, АЛЬ ¡Ццшшм); полевые изо-ляти ъозбудитеяя плевропневмония К-4,. 0-11, 4-2 из различных регионов Российской Федерации; пшержддуняае кроличьи сыворотки к полевым изо/штаг: К-4, 0-Г1, 4-2 и производственному итамму 17-19; питательные среды, изготовленные ■ по общепринятый методикам (М.А. ■ Сидоров (1086), Л.С.'Лабияская (1978), Ф.Я. Андросов (1981)); сыворотку крови крупного рогатого скота сухуо для вирусологических исследований; ^шдкуа питательную среду для культивирования возбудителя ГНИ в биологическом реакторе (пропись C.B. Санебдад-зо, М.А. Сидорова (I9SS))j экспериментальную дитательнув смесь ( собсгвеяная разработка) ; бно:/.ассу полевого изодята. ГУ-I? возбудителя плевропкезмснии, яолучекнуо в соответствии с самостоятельно разработанным лабораторным регламентом; 1С#-й раствор форма-

дъдегкда; образцы трёх икактявировакных вакцин против ГПП свиней (эмульгированная, хдор-калыдаезая, форюл-квасцовая).

£ одатах гспользовадя селах нашей (нелинейные) массой тела 16-18 г, поросят Зб-ЭО-даевнох1© возраста, кроликов массой тела 2.0-2,5 кг.

Шсгологжческяй иатерйал отбирали от павших поросят 50-105-дневного возраста с изменениями в органах и тканях, характерными дли острого и аодострого течения ГПП. Кусочки лёгких замораживала при -10-12°С в течение суток и доставляли в отдел микробиология Свердловской ШВС для бактериологического исследования, которое ирокдади в соответствии с имеющейся схемой (Р. Нильсен, П. Кюшотеян Ц585)>.

Морфологические, тшкториальные, ротовые, бяохюические свойства вздзленйых культур изучали общепринятыми метода;,я, Тестировала культур до реакций агглвтапации на стекле с гилерда-ыукныш швороткает проводили в соответствии с методой Б. Рапл (1285). Ех вирулентность оценивали по результатам заражения белых «шей (3 голова) бактериальной суспензией с концентрацией 10 единиц ьугности (ВО но оптическому стандарту (ОС) ГИСК да. Тарасевиза (доза 0.5 съ?, шграперитокиааько). Чувствительность к антибиотикам определяли методом диффузии в агар с применением стандартных дисков. Подсчёт чзаш инкапсулированных клеток в культуре каадаго из мзолятов проводили на препаратах, окрашенных

2

по методу Гккса. Прирост клеточной массы с I с;л плотной питательной среда определяли .то разнице накопления биомассы в течение 6 часов.

Нуаьтда возбудителя ялеврошевшяии свиней • хранила в среде сдаороточно-дрояаевого ШБ (СЩЕЕ) с 5% дефл ориаировшшой крова кроижа при -36-40оС.

К?ад;й полевой изолят оценивали на пригодность к использо-ванэд для изготовления лабораторного образца янактазировшюй закцинн против ИШ по следующим критериям: дарфояомческая однородность культуры я.её стабильность (подеержешюсть диссоциации) ■ при длительном пассировании на питательных средах; вирулентность для бешх t.-ышей п поросят} величина промежутка времееи от sapa-' хв!Ш до габеля (maa)¡ седеркаййе в культуре гшйшеуларовяшда клеток; выход клеточной шссу с 1 ог? плотной питательной среды зз 6 часов; устойчивость д дгйстзго антибиотиков; сего логическая . идентичность с циркулирующим в данной географической зоне оеро-варом возЗудктеля болезни. ■

Потребность Н./¡¿еияо/гпси/пол/ае в различных веществах, • составпящих хздкуд питательную среду,-определяли;яутёи яупьти-вированяя микроорганизма в бульоне Хотткнгера с содержанием '.-.. амяшюго азота 2С0 с различии® • концентрациями, источняка ■ фактора У, сизороткя крози крупного рогатого с;;ота и Других но«-.' -цонеятоь. Посеы куш?ивдрэваяи при 37°С в течение 6 часов (точно), Оптическую плотность определяли прибором ФЭК-58М. Контролем сдукяая питательные среда, содержащие в своём составе оптимальные концентрации ранее рзстлтроваяшх добавок. Ка основания результатов измерения оптической плотности сред коигро.гч рзесчя-унвеяи яонцена-рацаю бактерий в культуральной среде»

. Более точное определение оотякайьаой концентрада кожонзя- _ -тоъ проводила по результатам депашня роста Зэхтеркй в смасях с . различим ах содержание?-!. На основании результатов измерения он-, «леской плотности рассчяишаш пложенные зиаче'шш-концентрации клеток в куяьтураяьной среде, удельную' «tó.tójcw» роста, п^сдаязш-. теяьность,одного полного цикла деления бактерий я число гензра- -

ди2 шкроорганазиа т. течение одного часа. Пря рассчёгах пользовались методами, предяогсеннышг Н.Д. йерусалшаиш (1949, 1963).

С целью определенна стартовых концентраций клеточного материала питательную смесь разливала в стеришше пробирки по 5

о

сц и засевали взвесью 6-часовой культуры шкроорганкзиа, содер-аадей 5, 10, 50, 100 млн я I млрд и.т./см3. Пробирки с посева!,ш погадали з термостат (37°С) на 8 часов.

Пря определении оптииальнах рекимов аэрации вырывание Микроорганизма вели з течение 8 часов при 3?°С в условиях посте-пенкого эакяслеоая питательной среда в режимах: без' аэрации (контроль) и лри срохояденяи через смесь стерильного воздуха с объёкаой скоростью 0.2, 0.5, 1.0 л/шн (каздай лз них отрабати-вади отдельно). Суммарная продолжительность аэрация среды в каждом эксперименте составляла $0 мин. Перемешивание содерашого реактора осуществлялось за счёт двокента воздуха.

Ростовые свойства экспериментальной питательной сиесп (3) определяли во интекоиввостя роста изолята 4-2 в сравнении с контролем (пропись А, Московский институт прлклзд::ой биотехнологии)

. Дм'инактивации бкомассы микроорганизма использовали ческие и- физические способа. Полевой изо лот Г/-17Е1 выращивали в течение 6 часов в среде СЛЯШ. Для стандартизации взвесь ксн-цедтрпровадя до 200 Ш по. ОС ШОК ш. Тарасевача центрифугированием пря 6000-6500 od/мин в течение 30 мин. Взвесь делила на части и инантивлроваяи одним из способов: прогревание в водяя-но2 бане при 56°С одек час, добавление 0.1 или 0.5$ форыальде-' гида с аосдедущей вадерекой снеси при 3?°С один час, многократное задарааявание и оттаивание (5 раз) в течение суток.

С. целъа определения токсичности для белых шшей фэрмальде-

- У -

гида 10$5~а его раствор добавляли к стерильному физиологическое раствору до концентрации 0.1, 0.5, 2.5, 5.0^ и инъецировали белым шиам. Группе контроля вводили плацебо (0.2 сгл^). Наблюдение за яивотнння вем 10 дней.

Пои определении оптн-альной концентрации бактерий в биомассе для изготовления закциш испытывали суспензии с содержанием 10, 20, 40, 80 нлрд п.т./см3, которые использовали для иммунизация белых милей. Через 14 дней после прививки проводили контроявное заражение. Наблюдение за зарааениыш зшвотншли веяи 7 даей. Результаты эксперимента обработана статистически по методу Кер-бера в годпфикации Ашарина.

С целью оценка токсичности инактивпрованной биомассы возбу- . дате ля ГПП на белых г.каах испытано 7 препаратов. Еактерзнн апье-цировали подксгшо (область сппш), однократно, в дозе 0.2 см^. Контролем служили зл-шотные, которым инъецировали: стерильный фи-зеологический раствор; 0.9^-й раствор натрия хлорида, содер&ади2 0.1 иди 0.5% раствора формальдегида; бактераалькув суспензию с концентрацией 200 ЕЛ аз окмтых от культуральяой среда клеток, прогретых при 56°С в'течение часа; осзобоадённуэ от бактерий ку-яьтуральную среда; стерильный СДШБ; освобождённую от клеток шкрсорганизма культуральнув среда', содержащую 0.1 ила 0.555 формальдегида, выдегокакну» при 37°С один час; такук ае среду (без бактерий), дрогретуэ при 56°С один чзс. Наблюдение за шоами вели в течение 10 дней. 3 одних опытах изучали токсичность свежеприготовленных препаратов (вкдараани 24 часа после получения), а з других - изменение их токсичности и ишудагенности с увеличением сроков хранения (реяш - 0-2°С, вадеркка от изготовления до использования -.15, 30 суток). Через 14 дней после однократ-

ней вакцинации всех лхвотных зарааали путём интрадеритонианьно-го введения яетально2 дозы (Дй^) -глвого возбудителя ГЛП (0.5 млрд ы.т.,/гол). Наблюдение за заравдишия шиамивели ? дней. Токсичность оценивала по результатам ответной реакции организм белнх штей на введение 'антигенов, ах сохранности и изменению массы теаа в период от вакпгнада до заракения.

Контроль препаратов на стерильность я безвредность осуществляли согласно утверкдёаной кзтохике (Москва, 1972).

Шшимаяънув яетальнуэ дозу (Д&д) 6-еасовой, агаровой культуры ' возбудателя ГПП свиней определяли по результата!,1 табели поросят 44-45-дневного возраста в течение Б дней после интраназа-льного заражения .их бах-хериашгьма суспензиями с концентрациями клеток 0.125, 0.250, 0.600 и 1.000 ыард м.т./см3 в дозе 2 с.-,г. Рассчёги проведена в соответствии с ыегодсм Кербера в модификации Алмарана (19Б2).

Эффективная, наименее токсичная доза (ЭНХД) каддой, из ■ предложенных к иептамшнн вакщгя саредеша по результата! кля-ничесгагс наблюдений за прлгетшди язвотшаш в течение 24 часов . (нашенве токсичная) в контрольного заражения привитых кивотных (пмдуЕОлогически эффектная).-

йгыукогекность вакцин оценивала до сроку наступления и продолжительности идаунитета.

Статистическою обработку результатов исследований проводили с использование!.' мэнокрастальной ЭВМ МК-61, ■ ПЭВМ "Профи" в пакета самостоятельно еоставяекгш: программ.

£.2.1. Свойства культур возбудите ли ГПП сгшеС. видепенвдх от яогх>аа.

В результате бактериологических исследований гатматераала

изолировано 58 культур, которое по порфслогпчссх'.'пл л тингсгоохальным сзойсгваг.: прэдстз^ляли собой гтегсодвингше, не споро образующие, грамотрицзтешше леяочкв и ксккобаатеряв размером 0.2-0.Зх хО.3-0.4 шал, окрухенние яапсулоЗ. Носаедаяя наиболее хорошо била выражена у шлодах (6-10-часових) культур микроорганизма (0.2-1.5 диаметра клетм). Бзггория хорош окрашивались шшжо-вымл'красителями. Их рост зависел от каянчм в питательных субстратах фактора 7. При яоссзе ка пластинчатый МИД., формирование колоний происходило на рассгбянли не более 20-30 км от диска фильтровальной бумаги, пропитанной 1;?-;л раствором дяфосфоппрлди!-нуклеотзда (ДШ). Хсроаяй рост иакрооргашзна отмечали при температуре 37-3о°0 (22-40°С) на содержащих фактор У иш! экстракт дробей средах с >Н 7.2-7.4 (6.2-8.0). На крозяняом ага^е' ш-росргаяизи формировал нелные колоиип (росякчатого тяяа) округлой формц, с ровьь-ми краями, гладкой поверхностью, серо-беше на тёмном фоне, флуоресцирующие в пучке косопроходящего света, диаметром 0.2-1.0 км. В СЛиПБ наблюдали равномерное помутнение' среда с образованием на дне пробирки небольшого осадка, который ¡три встряхивании легко разбивался с образованием однородной взвеси.

Культуры возбудителя ГПП оставаясь хдзнеспособянма: на сы-вороточяо-дрснг«>:5о;.; 1;ЦЬ\ (СДША) дс 12-14 дней, в среде Сдав, бульоне Хотткнгера с 5-10£ крози кролика: прз температуре -5-Ю°С г- до 2.5-3.0 мее, а при температуре -35-40°С г более 2.5 лет. '•

До блсзсшнескЕи свойства:,; взделеняне кувмэда возбудителя отличались от итшжа "/-19, за ксхгазчеяаем язодетов ]Ш 14.-20 з 35-42, яоторке в первых 4-5 дассаяах- вндадялв сероводород ярд выращквагал в среде сдав. Бодашство из них (79.315») вызывало

гибель Ю0£ белых швей шссоц тела 16-18 г в тзчекиэ 16-13 часов посла ийтраперитоиазлыюго введения им бактериальной сусден-зви с-концентрацией Ю Ш по ОС ГИСК игл. Тарасовича в дозе 0.5 см3.

Положительные результаты'(-и- - максимально) получены при взшагтейстзии испытанных антигенов с гйпериыцунпой кроличьей сывороткой к возбудителю ГИЛ шгаша 17-18, занимающего промер-точное понижение неаду серовардои I и 2 (И.А. Сидоров, Д.К. Скородумов, 1388).

Чувствительность к левощцетину, карбекяцяшшу, тетрациклину зарегистрирована у 1СС% .полевых изолятов возбудителя плевропневмония, к алпицидтишу - у 69.96*, эритромицину - у 55.17$, пояишксину - у 34.46«, пенициллину - у 27.58$, гентамлцину - у 17.24$, неоиицину у 8.62$, какамицкну - у 6.83£, стреитошци-ну - У 5.74$, олететрияу - на у одного (0.00$).

Выход клеточной ыассв с I сы2 плотной питательной среда за € часов и содержание в ней клеток, окруженных капсулой, кодеба- . лось от 0.17 до 2.84 млрд м.т./сы^ (0.91+0.07 млрд м.т./см2, Р>0.999) и от 69.03. до 23.9СЙ (87.71+2.35,^, Р>0.£99), соответственно'.

Для работ по созданию лабораторного образца инактивироваа-ной вхкцины против ГШ1 свикеС отобраны долевые изсдяты /¿'г 17, 24 и 19, выделенные от павших поросят совхоза "Горноуральскии" и подсобного хозяйства УВЗ Свердловской области, соответственно. Все они представдояы однородными и стабильны».® в морфе логическом отношении культурами, вирулентными для белых мыпей, морских свинок, поросят (гибель ЮО/а животных наступала в течение 6-12 часов после их заражения). Еыделепше культура обеспечивали высокий уровень прироста плеточной кассы с I см^ плотной питательной

среда за 6 часов, а такае - содержание клеток, окруженных капсулой (1.06. 1.88, 1.07 млрд м.т./си2 н 98.30, 96.37, 36.15£, соответственно, у язояятов Ш J7, 19, 24). Она оказались неустойчивыми к действию таких антибиотиков, как:'ампициллин, левомице-тин, карбеняциллян, тетрациклин (частично их рост подавляли также - пшэдпшши, эритромицин, яодишкоап, а Ш F7 и 24 - монош-цин). Указанные особенности, выбранянх куямур, не изменялись и не утрачивались при длительном их хранении я пассировании на питательных средах.

йтг^унох'ешше сеойстзд проверены в условиях лаборатории я производства на поголовье <3слее I5QCOO свиней. В результате замены в утверждённой технологи:! итаыла ГУ-19 на язояят ГУ-Г7НА заметно повысилось качество вакцины, что позволяло сократить заболеваемость кивотних ГШ с 13.77 до 8.28? л снизить отход поросят от этсй болезни с 4.75 до 2.7S&.

2.2.2. Получение биомасса зозбудвтедя текофздёано-й пяевш-пнезьвдкяя связей ¿уь? изготовления инактивт&ованкой ваддияа.

С целью получения биомассы бактерий исследования проводили в направлении совершенствования среда для вирадавандя я поиска оптимальных ре.?.иыав культивирования. За основу оыла взята стандартная среда, ксподьзуемая-при производстве ннактивлрованной вакцины из штампа ГУ-19. В результате проведённых исследований установлено, что'путём вклэчендя в состав питательной среда препарата PI-268, комплексного соединения нелеза органической природа, экстракта пекарских дро&жей, а такке стартового значения рН и времени внесения глюкоза, ростовые свойства питательной среда значительно улучшились, о чём свидетельствуют данные интенсивности роста бактерий в усовершенствованной смеси 3 (I.4I

лог и.т./ч, 29,24 ии,- 2.03 ген/ч) пс сравнению с базовой средой А <1.18 лог и.т./ч, 34.86 дин л 1.70 геи/ч). Концентрация бактерий в I ал культураяьккх сред А и В через б часов составила. 12.52 п 4S.37 ылрд «.т., соответственно. Более высокому накопление! бакхлассы в усовершенствованной среде способствовал более янтеясйвдай реяш аэрации (С.5-1.0 л/шга ка I л среде) в сравнений с принятой технологией (0.2-0.5 л/мин на I л бульона). Усовершенствованная питательная ср.еда, как и базовая, была безвредна для лабораторных животных и сваней.

2.2,3. Квантизация биомассы возбудите ля ГШ свпией

йнзктявацйю биомассы возбудителя ГПП свиней проводили пров-реваниеи и ввдеркивандеи в смеси с различными концентрациями формальдегида. Для решения вопроса о выборе оптимальных конаентг-рацкй бактерий, в вакцине и формальдегида - определяли их токсичность для белых шшей и свдней. '.Доказано, что наиболее аряемле-г дам по токслчностд является ,0.5^-раствор формальдегиде, (безопас-нал доза его для: белых шией'по.ьчшакческой реакция составляет 5,62х10~2+2.14x1г/кг кивого веса, а по сохранности - 6.99х .86х10~2 г/кг живого веса, и для свиней (по кишаческой реакции) - I.25xIG~2 г/и? кивего веса),.

СуспензЕя бактериальных клеток, отштая от культурадьной среды, прогретая при 56°С з теченяе часа (¡u.%s. безопасна для животных. Еииласса возбудителя ГШ (клетглнгукьтурэяьная среда), прогретая прг 56°С з течение одного часа, проявляла токсичность, которая выражалась образовакшш у 50% прпвптвд нквотквх eyxix некрозов тканей.на месте введения, снижением сохранности до:8С£,. а такае - уменьшением фпзгологачеекк,дрлзасог. Более высокой токсичностью обладала биомасса, шактявароваякая формальдегидом

(0.5 и 0.1%).

В ходе акспериментов установлено неспецифическое воздействие на ивдуннуп систему 0.1#-то раствора формальдегида, свежего дрод2.евого экстракта (в составе сдав) и определённая имгдукогея-ность бактериальных токсинов, выделяемых возбудителе»! ГШ в ку~ яьтуральяую среду. Биомасса, изгстозленнат за 24 часа до использования и инактимрованная прогреванием при 5о°С одии час, в дозе 9.97x10""° веса на обладала токсичность»., С увеличением срока выдержки Зпоглассы до 20 суток это свойство препарата пос- ' тгпенно утрачивается. В группах, вакцлгшровашщх этим бактери-ном через 15 и 30 двой лосяэ его изготовления (до контрольного заражения), выгило 80 и £0$ привитого поголовья, соответственно. Имцуногешюсть препарата, постепенно, возрастала, а затем - енз-калась, что подтверждено результатами контрольного заражения. В. группах белых :.цщей, дривзткх свежим, ввдеряадашм 15 и 30 суток бакхерияок, выяиер.экость составила 20 , 75 и 33J», соответственно. Напболтлей токсичностью обладала ояокасса с копц^гграцзеЗ 200 3-й, содеряаит О Л.^ фор^ьдегида а дозе.3.64x10""^ cr/Vr веса. Это «ё свойство практически не .измекяйось с увеличением сроков хранения.

Токсичность препарата на основе многократно з&моро?.енао1 и размороженной биомассы яоезеяенпр дэдала. Установлена,': что пос-введения свеггго бзктерияа в дозе ciß/i* веса, ги-

бель IOCi мышей наступала а течение 40-44 часов,. Сохранность ¡¿н-ютпых, привитых бактераяои» ъкдерханнни. в тачание 15 и 3Q суток, составляла СО и Ш'1% их первоначального числа, соответственно. Однократная вакцизация- многократно самороаенкой и разму^оЕеявой биомассой, выдерканкой 15 и 30 суток, згичвдзла от заракедаа ле-

талькой дозой аозйудателя ПШ 66.66 я 6Э.СШ привитых

.екеотшх, .соответственно,

toKCMiosib йпо:,;аасы, инампвпровакной добавлением 0.555 йор'лаЛьдзгддз, держалась на одном уровне tío нее 15 суток, а затем, начинала ск*каться. Сохранность ййьотяцх, ии.^апзированнкх бак-теринсы, задерганным I, 15, 30 суток, после контрольного парадная составила 33.33, 66.6S ;¡ 25.00&, соответственно.

Экспериментально установлено, что получзние высокоэффективного иредэрата возмогло пр.: наличии в его сосгазе бактериальных клеток и ех тскокнса. lío. числа яспкганных бактеринов для созда-нич лабораторного образца пкактявирозашюй взкцаны наиболее при-годки;,; оказался метод инактивации биомассы путём добавления 0.5$ фориаяьдстлда, с доследуавей вздерякой смеси в течение 15-30 суток.

Концентрация бактерий в готовых препаратах составила 10 шрд Joí"?. Цолучено £800 а,? эмульгированной форкольакцинн, 3250 си3 хяо.р-каяьадевоЁ я 325Ü cií3 фор,цол-квасцй£0й вакцины.. Однократное, подкогное введгнке этих вакцин белиа гьаам глассой тела IS-I8 г в дозе 0,5 ciP не шзиваяо изменений общего состояния, заболевания й.гибели привитых етвотных в течение 10 дней.'.

2.2.4. Реактогеяные * кжуюгекдые свойства акспест-':енталь-нкх, анализированных вакютн

. Исследования вшюлнеш на поросятах в условиях совхоза "Гор-ноуральскзив Свердловской области. Оценку ишукогенности прозо-дияк г.о результатам контрольного заражения, а реактогенностн -по клиническим признакам ответной реакции организма. Для контрольного заражения использовали 6-часовую культуру возбудителя ГЙИ езгшей в дозе 3 шрд ;л.т./гол (три шшшашшх детальных Дозь).

Клинические признаки ответной реакции организма хивотных . регистрировали через 3-5 - 40-60 минут после выедания препаратов. Показано» что наибольшую опасность дм поросят приставляет хлор-кальциевая фсрмояаакцина. Её однократное введение в дозах 0.5, 1.0, 2.0 cri3 сопровождалось развитием клинически выраженной ответной реакции практически у всех привитых животных. .Особенно сильной она была у поросят с хорокей упитанностью. В ряде случаев отмечали их гибель. Поствакцшальвнй о1ход кпзотнах до с-. тигад 16.12%, Второе и третье места до токсичности заняли фор-мол-квасцозая и эмульгированная фортлзакцшш. Появление одшака» мышечной дрози регистрировали только у поросят, обработавших этяиз препаратами з дозе 4.-0 Число нисотвдх, ямевшлх кли-ническя шрзяетур сгветну» реакцию на гньекциэ формол-квасцо-вой вакцины из рассчёта 0,5, 1.0,. 2.0 ciP/гол было выше, чем па введение антигена с маслинным адькв актом (54 Лв я 33.75$, соответственно). Показано, что величина дозе., введение которой.шзц-вает клинически внраздшу» ответную реакции у 5С#. иялу визированных ясавоггкнх,'. составляет: для хлор-кальциевой форколвакцйны -0.41 см3, для формол-квасцовой - С.92 ciP и для эмульгированной - 1.39 см3. Этот показатель получил условное название "наименее токсичной дозы".

До иммуноген-кости препараты расположились сдедуадиы обра-. зом: хлор-кальцяевая, эмульгированная, фэрмол-квасцовая. Их минимальные щздунизаруодие дозн составила: 1.00, I.4I и 2.37 сы^, соответственно. Эти дозы, одновременно, являлись и пороговыми, что не позволяет при практической применении данных вакцин выдержать 3-5-крагный запас для обееяечвкад оптимальной дозы. Учитывая: эти обстоятельства, мы назвали данные минимальные иммунизирующие дозы "эффективной, наименее токсичной дозой"..

Высокая токсичность хяор-капздиевой формолвапцины послужила основанием лая прекранеяяя её дальяейшх лсшгаьяй.

Последукгпма исследованиями установлено, что реакция организма поросят 35-37-даегного возраста на однократное введение адультрованной' фориоявапданы в дозе 1.5 гаг не лмсла клинически выраженного проявления, Иммунизация хйвотнвх того не возрэс-та с применением форыоп-квасцогой ваадзнн в дозе 2.0 С1.<" граво--дияа к появлению у ща (дШ привягпх) каткосгл походал, регад-ноств пускунатура задних'конечностей, а тагле - рвоте, доносу, одлше» угнетена», швечной дрот-;. Поствакцинальный отход составам 6.662. Силу ответной реакции сргашгзма поросят, а следовательно, б негативного воздействия на него фор.мо л-квасцоьсй вакцина против ГШ удалось значительно сказать за счёт: .

- изиенешя глубяш яньскцгд пресарата в дескулатуру ¿едра с 25-ЗС до 10-15 №;

- увеличения возраста вакдавруешх гсивотнкх с 35-37 до 4547 дней, г.е. пугёы уменьшения дозы препаратаиз рассчёта на I кг киього веса.

При соблюдения этих двух условий, ответная реакция организма гивотшх на введение форгюл-квасцозой вакцины клинически проявлялась ослаЗленвеы аппетита, снижением двигательной активности вялссгьв, лётной одашкой, в отдельных сучьях - подёргзваниеы сгдельшгх грулд .скелетной вд-с^латуш. Реакция на посторонние раздрааателя ослабевала частично. Общее состояние нормализовалось через 2.2-2.5 часа после проведения вакцинации.

Результате суатиотаческой обработка тлатерлаяов паголсгоана-тонического и послеубойаого исследования -органон пазтмх и вынужденно убитых поросят по методу Иенсена, показам, 'что иммунитет

посла однократного, внутримышечного введения экслерименташшх, инактивярованных (эмульгированной, форыоя-квасцовсй) вакцин против ГПП формируется через 5 дней и сохраняется 2 месяца (срок, наодвдения). Наибольшая задета от контрольного заражения (по суше показателей) у ялзотных отмечена через 10 дней после применения эмульгированной формелвакцшы и в интервале с 10-го по 15-й день после явдунизадал фор,-.гал-квасцовоп вакциной. Исходя из теоретических предпосылок и данных литературы (Л.А. Зидьбер, 1957) интервал ¡ленду первой и второй прививка?,а эглульгнроваяюй форглолвакцшгок определён в 12-14 дней, а форггод-квасцовой -• 1416 дней. Установлено, что оба препарата обладает одинаковой т-глунсгешгастьк, но предпочтительнее применять эмульгированную форкоиваюешу, обладающей меньшей токсичностью для яивотша.

¡la основании материалов исследований разработан проект ЕТД по изготовлению, контролю качества и применения экспериментальных, инактйвпрозапшгх вакцин против гемофияёэной плевропневмонии свиней.

2.2.5. Комиссионные испытания

В комиссионных опытах подтверждена воспроизводимость лабораторного регламента и подуче ¡а лабораторные образцы ияактяви-рованных, э.-с/яьглровашюй, форг.:ол-кваецовой вакцин, которые дол-костью соответствовали требованиям технических условий. Контроль безвредности и имдуногенноста показал, что подкожное введение экспериментальной, гаульгярованной или форшд-кйасцовоЯ вакцины Ю-а белым липам массой тела 15-18 г яе вызывает изменении общего состояния, заболевания я гибели др^влткх животных а течение J0 дней, а однократна?, злутришкечяая издумзацйя поросят 35-57 и 43-50-даезного возраста с применением эцульги-

рованяой и форыоя-двасцовой вакцин в дозе 1.5 и 2.0 аР, соответственно, через 14 дней посла вакцинации предохраняла от заболевания и гибешя 100$ кивоткнх, подвергшихся контрольному заражению суспензией бактерий из 6-часовой, агаровой культуры возбудителя ГШ свиней (контрольный изоляг ГУ-24НА) в дезе 3 Щд. Из •' 5 контрольных (непривитых) поросят того не ьезраэта, гархсеаных одновременно с привитыми в дозе 3 ЛДэд, в течение 7 дней все заболели и погибла.

Проект НТД рассмотрен и одобрен на заседании Учёного совета Свердловской НИЗС и утвержден её директором.

з. завода

1.- Разработан и освоен лабораторный регламент изготовления и контроля качества инактявяроважшх (эмульгированной, спорно я: квасцовой), вакцин против геыофилёзной плеЕропнешоник свиней.

2. Усовершенствована жидкая питательная среда для культивирования возбудателя.ГЩ свиней, обеспечаващая накопление 30-35 млрд ы.т./см в теченнеб часов, при этом, содерканче кякапсударованных клетокь культуре составляет не ыенее 00£,

3.. Разработана действующие макеты лабораторных шкл-реак-торов объёма 2500 а 11500 С1у^, позволяю!;^ вести кулычшрова-нае возбудителя пяеврешетооная в условиях постоянного перешк« вания (200-240 об/шд), аэрации {0.5-1.0 л газа в шкугу на I д ■ питательной среди) и поддержания рН.

• , 4, Йодная" инактивация, возбудителя гемофилёзной плевропневмонии свиней 10%-и растворои формальдегида (0.5& по объёму) достигается в течение 24 часов.

5'. Эмульгированная формолвакцша в дозе 1,5 см'* после одяо-. кратного, внутримышечного введения поросята 35-37-дкевного воз-

раста обеспечивает защиту с 5-го дня в течение двух месяцев , (срок наблюдений).

6. Формол-квасцозая вакцина в объёмной дозе 2.0 сьР (однократно, внутримышечно) по ящуяогеяности не уступает зцульшро-ванноЗ, но обладает высокой рзактогепностьр в отношении поросят 35-37-дневного возраста и безопасна для 45-47 дневных аизотных.

?. Хлор-кальциевая форкол-вакцяна обладает высокими защитили;-: свойствами, но, в связи с высокой токсичномьи, не может быть рекомендована, для практического применения.

6. Для изготовления высокоэффективных, лнахтлвированннх .'■ вакцин претив ГЗП необходимо использовать местные шхашы с аиро-ким спектром антигенного родства по отношении к.сероваоам, циркулирующим в данном регионе. '

4; П?А№£ЕСКИВ НРВДЮлКШ :

В результате провзденгшх исследовании разработаны и предложены к практическому прпменешго:

1. Метод отбора аолэвах изолятэа, пригодных для изготовления инактивированних закцлн против гемссЕпяёзной плевропневмонии свиней,.

2. Жидкая питательная среда для культивирования ДПН-эавяся-мнх видов геясфиьшх бактерий.

3. Пакет корпативно-техггэтесксй документации, вклачавдий:

- Лабораторный регламент (технология) изготовления и контроля качеотва экспериментальных, пяактявированннх (эмульгированной, форшл-квасцовой^ валит против гешфилёзной плевропневмонии свиней.

- Технические условия.

■ - Браненное наставление по применению экспериментальных.

г 22 -

И''fiKTüBHповаинвл (лкуглгироватюД, формол-квасцоэой) вакцм': иго-тав геиофялэзнг.ь ыейролнеячэнш*. свиней.

ашссм- научна" РАБОТ, опуьйкованшд ¡Ю дагкшыш дассиртда ■-••■.

I. фОичскнй й-. А., Лаврентьев Н.й. . Влияние pH вачц;\;ного препарата на качество аэрозольной 'инмушгзацкп // И'езш*. Kli "проблемы диагностики, -профилактика .и лечегшя сельскогозяиствей-н«с якпетньи ь Яечер};оз0ЗД'.оЯ зоне". - ti-Howopon, 1^9?..-С.70-71.

Р.. 'РубннскгЛ H.A. Быделение :: отбор полсвьгх изодятов возбудителя rei.:a'5i: 1ёз:-:оЗ г.певролне-влонкк' евньей дпя создания рорапкой вакцины //.Сб. "Вопроси' вмвшмфноА вирусологии, ctv;^ бколигг.ч и •элизостоло-',ик". - Покров. 1992.-С.217.

3. Губиксччй И.А. Оценка яффепиоигстк ь&кцкни в уп -говиях производства // Сб. трудов гШК НЗ PC К?, ivO.i.-C.Vo.

' 4. Рыбинский Ii.А., Лаврентьев Н.К., Кул-лир L.Т. лг.дгпя тельпая среда для ку.чьтлвярован:!«* И. /ак //

ВаШИЗ. Заявка 93035269. J^ure приоритета 7.G7.lS93r.