Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Актинобациллезная (гемофилезная) плевропневмония и гемофилезный полисерозит свиней

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Московский Государственный университет прикладной биотехнологии

На правах рукописи УДК 619.4: 616.9

СКОРОДУМОВ Дмитрий Ивапович

АКТИНОБАЦИЛЛЁЗНАЯ (ГЕМОФИЛЁЗНАЯ) ПЛЕВРОПНЕВМОНИЯ И ГЕМОФИЛЁЗНЫЙ ПОЛИСЕРОЗИТ СВИНЕЙ (ЭТИОЛОГИЯ, ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, ОСНОВЫ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ АКПШОБАПДЛЛЁЗНОЙ ПЛЕВРОПНЕВМОНИИ)

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискапие учёной степени доктора ветеринарных наук

Москва - 1997

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московского Государственного Университета прикладной биотехнологии и в лаборатории микробиологии ВНИИЭВ имени Я. Р. Ковленко.

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор М. А. Сидоров

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук Н. Т. Татаринцев ( ВГНКИ) доктор ветеринарных наук А. А. Сидорчук ( МГАВМиБ ) доктор ветеринарных наук А. Т. Кушнир ( ВНИИВВиМ)

Ведущая организация : Всероссийский научно-исследовательский технологический институт биологической промышленности.

Защита диссертации состоится " _года

й часов на заседании диссертационного совета Д. 063. 46. 03.

при Московском государственном университете прикладной биотехнологии по адресу: 109 316, г. Москва, ул. Талалихина, 33.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ.

Автореферат разослан " АЗ " _1997 года.

Ученый секретарь диссертационн совета, кандидат ветеринарных на

И. Г. Серегин

L Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Болезни свиней представляют одну из значимых проблем ветеринарной науки и практики. Перевод свиноводства на промышленную технологию выявил значение ряда инфекционных болезней, которые до этого оставались за пределами внимания специалистов. К этой категории бактериозов свиней можно отнести актшюбациллёзную (гемофилёзнуго) плевропневмонию и гемофилёзный полисерозит свиней (Сидоров М.Л., 1987, 1988; J. Nikolet, 1976, 1983, 1986; Schultz R. А., 1985; Schope R. E. et al, 1964; Sebunya T.N.K, et al, 1983; Rising H. J., 1979,1980, 1991; Rosendal S. et al, 1983; Nielsen R., 1982,1995; Kielstein Р. и.а., 1980,1990,1992,1994; и другие).

Авсгинобациллёзная (гемофилёзная) плевропневмония приобрела повсеместное распространение, наносит значительный экономический ущерб, с большим трудом поддаётся лечению и специфической профилактике (Beaudet R, et al, 1994; Byrd W. et al 1992; Fedorka-Grey P. S. et al., 1990; Beskow P. et al .,1989; Bigbee H. C. et al, 1986; и др.).

Гемофилёзный полисерозит (болезнь Глессера) в связи с внедрением в технологию свиноводства использования СПФ-животных неожиданно проявил себя как заболевание, способное поражать все возрастные группы свиней, в отличие от сложившегося представления как о болезни, к которой чувствительны поросята-отьёмыши, подвергшиеся воздействию стресс-факторов (Amano Н. et al., 1987; ВасЫег J. F. et al., 1974; и др.).

В России исследования по указанным вопросам были начаты в 1974 г.

8 ВНИИЭВ им. Я. Р. Коваленко под руководством профессора Сидорова М. А. Имевшиеся к этому периоду публикации в отечественной литературе по биологии гемофильных бактерий, патогенных для свиней, были недостаточны для эффективной лабораторной диагностики инфекций, вызываемых Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae и H.parasuis. Разработки по диагностике и специфической профилактике перечисленных болезней практически отсутствовали.

Цели и задачи исследований.

Изучить биологические свойства НАД—зависимых бактерий, вызывающих генерализованные серозиты и фибринозно-геморрагическую плевропневмонию у свиней. На основе результатов таксономического анализа разработать схему идентификации указанных возбудителей. Исследовать возможность специфической профилактики актинобациллёзной плевропневмонии свиней. Для достижения сформулированных целей были поставлены следующие задачи:

1. Собрать коллекцию штаммов НАД-зависимых бактерий, ассоциирующихся с серознтами и фибрииозно-геморрагическими пневмониями свиней, провести сравнительное изучение их фенотшшческих и генотипических харак-

теристик. Определить критерии их дифференциации от таксономически близких и сходных видов бактерий.

2. Изучить чувствительность к H.parasuis и A.pleuropneumoniae различных видов лабораторных животных с целью выбора лабораторной модели для диагностики, выяснения вопросов пато- и иммуногенеза,

3. Исследовать патогенность A.pleuropneumoniae и H.parasuis для свиней.

4. Изучить методы серологической идентификации выделенных культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae и их серовариантную структуру.

5. Разработать и апробировать ускоренные методы обнаружения антигенов A.pleuropneumoniae.

6. Изучить возможность специфической профилактики акгинобациллезной плевропневмонии свиней при помощи инактивированной вакцины.

Научная новизна работы.

Установлена этиологическая роль H.parasuis в развитии генерализованных серозитов и Actinobacillus ( Haemophilus ) pleuropneumoniae в заболевании свиней фибринозно-геморрагической плевропневмонией в условиях отечественных свиноводческих хозяйств промышленного типа. Эти нозологические единицы впервые диагностированы в свиноводческих хозяйствах России.

Проведено комплексное изучение фенотипических и генотипичееких характеристик НАД-зависимых бактерий, выделенных от свиней при указанной патологии. Подтверждена принадлежность бактерий классифицируемых ранее как вид Haemophilus pleuropneumoniae к роду Actinobacillus. На основании нуме-рического анализа фенотипических признаков НАД-зависимых культур собранной коллекции выделены феноны, соответствующие видам H.parasuis, A.pleuropneumoniae и таксо1гу «малая группа» и определены дифференцирующие признаки между указанными видами и другими таксонами семейства Pas-teurellaceae. Определены критерии дифференциации культур НДД-независимого биовара A.pleuropneumoniae от сходных бактерий.

Экспериментально обоснованы методы серологической идентификации культур A.pleuropneumoniae и H.parasuis, а также обнаружения антигенов A.pleuropneumoniae в тканевом материале. Определена серотиповая структура НАД-зависимых культур A.pleuropneumoniae и H.parasuis, выделяемых при соответствующей патологии свиней.

Изучена патогенность A.pleuropneumoniae и H.parasuis для лабораторных животных и свиней. Показано значение гемолизинов и экзотоксинов A.pleuropneumoniae для вирулентности возбудителя и очерчена их роль в патогенезе акганобацшшёзной плевропневмонии свиней.

•. • . Дано научное обоснование методов лабораторной диагностики гемофнле-зов свиней и технологии изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против актинобациллёзной плевропневмонии свиней ( авторское свиде-

тельство № 907899 от 21.10.1981г.), доказана эффективность активной иммунизации против аютнобациллезпой плевропневмонии свиней в условиях неблагополучного хозяйства.

Практическая ценность работы.

Разработаны и используются в ветеринарных диагностических лабораториях и свиноводческих хозяйствах:

- Временные методические указания по лабораторной диагностике гемо-филёзного полисерозита поросят. Рекомендованы МСХ СССР 17.10.1978г. № 116-18.

- Временные методические указания по лабораторной диагностике гемо-филёзной плевропневмонии свиней. Утверждены ГУВ МСХ СССР 16.04.1981г.

- Методические указания по диагностике гемофилёзов свиней. Утверждены ГУВ МСХ СССР 02.11.1985г. №115-6а.

- Мсгодические указания на изготовление и применение коагглютини-рующего антительного диагпостикума для экспресс - идентификации Гемофи-люс плевропневмонке и индикации возбудителя в патологическом материале. Утверждены отделением ветеринарии РАСХН 16.02.1993г.

Временная инструкция о мероприятиях по борьбе с гемофилёзами свиней. Утверждена ГУВ МСХ СССР. 02.11.1985г. № 115-6а.

Разработаны и утверждены:

- Инструкция по изготовлению и контролю вакциныпротив гемофилёзной плевропневмонии свиней. Утверждена ГУВ МСХ СССР 11.07.1990г.

- Вакцина против гемофилёзной плевропневмонии свиней эмульгированная. Технические условия ТУ—10-09-53-90. Утверждены ГУВ МСХ СССР 11.07.1990г.

- Наставление по применению вакцины против гемофилёзной плевропневмонии свиней. Утверждено ГУВ МСХ СССР 11.07.1990г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты комплексного изучения биологических свойств и таксономического положения возбудителей актинобациллёзной плевропневмонии и гемо-филёзного полисерозита свиней, критерии их дифференциации по фенотипиче-ским свойствам от таксономически и экологически родственных видов бактерий.

2. Методы серологической идентификации культур А.р 1 еигорпеит ош ае и обнаружения антигенов возбудителя в тканевом материале.

3. Принципы изготовления и лабораторного контроля инактивированной вакцины против актинобациллёзной плевропневмонии свиней, результаты испытания эффективности вакцины в производственных условиях.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на заседаниях учёного и методического советов Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко (1975-1983г.г.), учёного совета ветери-нарно - санитарного факультета Московского Государственного университета прирадной биотехнологии (1984-1995г.г.), ветеринарной секции Научно-технического совета Министерства сельского хозяйства СССР (23.11.1983г.), на семинаре бактериологов республиканских ветеринарных лабораторий (г.Тбилиси,1980г.), на семинаре бактериологов областных ветеринарных лабораторий РСФСР (НПВЛ РСФСР, 1981г.), на совещании специалистов свиноводческих комплексов СССР (г.Москва, ВДНХ, 1980г.), на научных конференциях ВНИИЭВ им. Я.Р. Коваленко (1993г.), МГАВМиБ им. К. И. Скрябина (1991,1996г.г.)

По материалам диссертации опубликована 41 научная работа, методические указания и наставления; получены два авторских свидетельства на изобретения. Опубликована в соавторстве с М.А.Сидоровым монография «Гемофилёзы животных» (М.,Колос,1986).

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 552 страницах машинописного текста и состоит из введения, двух глав обзора литературы, материалов и методов исследований, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений и приложения. Диссертация содержит 82 таблицы, 30 рисунков. Список литературы содержит 472 источника, в том числе 61 отечественных и 411 иностранных авторов.

Собственные исследования.

1. Материалы и методы исследований.

Работа выполнена во ВНИИЭВ им. Я. Р. Коваленко и МГУПБ в период 1974— 1995г.г. Выполненные исследования являлись частью плановой научной тематики ВНИИЭВ и МГУПБ. Отдельные этапы исследований проведены совместно с Сидоровым М.А., Шубиным В.А., Гумбатовым Ю.К., Мицаевым Ш.Ш., Блему Ж., Силла Ф., Лаврентьевым Н.И., Романовой Л.Я., Субботиным В.В., Пруссак—Глотовым В.Э., Логиновым И.А., Корнелаевой Р.П.

Ряд комплексных исследований проведен совместно с сотрудниками лаборатории патологической анатомии ВНИИЭВ проф. Шубиным В.А., Татри-швили И.К., Андрышиным А.Н., лаборатории молекулярной биологии и биохимии ВНИИЭВ Артюхиным С.К. и Фоминым Б.А.

• В работе использовали штаммы типовых культур бактерий семейства Pasteureiiaceas: Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumonias (ссровары i, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 10, 12) , Pasteurella-haemolytica-подобные бактерии, гемофильные бактерии «малой группы», таксона «С», H.influenzae, H.parainfluenzae, H.parasuis

( серовары А, В, С, Д), Р.тикоас1а ( серовары А, В, Д), А.бшя, Л.%шегекп.

Подробному изучению, включая нумерический анализ, подвергнут 141 штамм НАД—зависимых эпизоотических культур бактерий, выделенных нами от свиней и 160 штаммов подвергнуты серологической идентификации. Бактериологически или патологоанатомически исследованы материалы от более 2200 свиней.

При изучении вопросов пато- и иммуногенеза использовали 157 свиней, 210 морских свинок, 546 белых мышей.

Для культивирования НАД-зависимых бактерий применяли «шоколадный» агар, бульон и агар Левинталя, сывороточно-дрожжевой агар и бульон, кровяной агар и бульон на основе МПБ, МПА, бульона и агара Хоттин-гера. В качестве источников специфических ростовых факторов использовали кристаллический гемин, НАД («Реахим»), дрожжевой экстракт, кровь различных видов животных, питающие культуры бактерий («баккормилки»). Культивирование бактерий в жидких питательных средах осуществляли в стационарных условиях и в режиме аэрирования (лабораторный ферментер). Морфологические, тинкториальные, культуральные и ферментативные свойства бактерий исследовали общепринятыми методами. В дифференциально—диагностические среды при определении ферментативной активности добавляли НАД и гемин, а также использовали СИБ и ПБДЭ—диагностические наборы производства Горьковского ИЭМ. Особенности колоний изучали в косопадающем пучке света при помощи стереоскопического микроскопа МБС—1 (Акатова Н.С.,1966).

При проведении нумерического анализа у каждого исследованного штамма бактерий определяли 57 физиологических признаков, показатели преобразовывали в числовую форму, затем при помощи ЭВМ вычисляли коэффициент несоответствия по формуле:_

о = а

а + Ы-сР

где: а - количество несовпадающих признаков,

Ь - количество совпадающих положительных признаков, с - количество совпадающих отрицательных признаков.

Полученную матрицу коэффициентов подвергали кластерному анализу с представлением конечных данных в виде дендрограммы, отображающей распределение штаммов по кластерам (фенонам).

Для генетической характеристики ( исследования проведены совместно с Артюхиным С.К. и Фоминым Б.А. ) эпизоотических и референтных штаммов ДНК выделяли по методу Машшг (1961 ). Нуклеотидный состав определяли спектрофотометр ически по тепловой денатурации с помощью спектрофотометра «Спекорд М-40».

Меченые ЪН препараты ДНК получали с помощью реакции НИК - трансляции ( Маниатис и соавт., 1985 ). Реакцию ДНК - ДНК гибридизации проводи-

ли по методу Денхардта ( 1966 ). Степень подобия нуклеотидных последовательностей ДНК определяли принимая за 100% радиоактивность гомологической реакции.

При изучении антигенной структуры бактерий использовали кроличьи гипериммунные сыворотки на цельные микробные клетки. Пробирочную и пластинчатую РА ставили по Mittal К. и соавт. ( 1984 ), при постановке РА с 2 -меркаптоэтанолом ( 2МЭ ) серийные разведения сыворотки делали в растворе с ОДМ -2МЭ. Эритроцитарные антигенные диагностикумы для РИГА готовили по методу Сидорова М.А. и Агаевой Э.М. Ставили РИГА и учитывали результаты общепринятым способом. Антителыше диагностикумы для реакции коагглюти-нации готовили по Mittal К. и соавт. (1987). Реакцию иммунофлуоресценции в двухступенчатом варианте проводили с использованием коммерческих меченых ФИТЦ антикроличьих сывороток и люминесцентного микроскопа MJI - 2.

Реакцию связывания комплемента с кроличьими сыворотками ставили в классическом варианте, при исследовании свиных сывороток крови - по Nicolet J. (1971 ) с добавлением в комплемент сыворотки крови крупного рогатого скота.

При оценке вирулентности бактериальных культур определяли ЛД50 по Риду и Менчу. Остаточную токсичность инактивированных вакцин определяли, используя тест прироста живой массы мышей. При определении специфической активности экспериментальных вакцин рассчитывали ИМД50, индекс и коэффициент эффективности препарата ( Безденежных И.С., Леонтьева Л.Г.Д969 ).

Цифровой материал обрабатывали, используя общепринятые методы математической статистики (Ашмарин И.П., Воробьёв A.A., 1962; Терентьев П.В., Ростова Н.С.,1977 ).

2.Рсзультаты исследований.

2.1. Свойства возбудителей, таксономическое положение и разработка лабораторной диагностики актинобациллёшой (гемофилсзной) плевропневмонии и гемофилёзного полисерозита свиней.

2.1.1. Питательные среды и культивирование А.р1сигорпеитошае и Н.рагаБшв.

Конструирование питательных сред для культивирования А.ркигорпеитошае и Н.рагазшз предполагает учёт потребности данных видов в

НАД. Минимальный уровень зоны оптимума у обоих видов бактерий близок и составляет 1,8 - 3,6 мкг. НАД в 1см3 среды. Верхний пороговый уровень имеет видовые и штаммовые различия, причём оп ниже у П.рагакшя (15,62 - 31,25 мкг/см3), чем у А.р1еигорпешпотае (250мкг/см3) и, в свою очередь, он меньше в пределах вида Н.рагазшэ у свежевыделешшх эпизоотических штаммов, нежели у адаптированных музейных культур. Полученные данные позволили обоснованно конструировать питательные среды с учётом возможных штаммовых потребностей в НАД. Из естественных источников НАД наиболее доступен и эффективен дрожжевой экстракт. Переживающие животные ткани также содержат достаточное для роста V - зависимых бактерий количество НАД. Наиболее удобно в этом случае использовать кровяной сгусток на агаре Цинссера или сывороточном агаре.

Испытание различных видов питающих культур бактерий как продуцентов НАД показало, что ростовой фактор экскретируют в достаточных количествах интенсивно растущие виды бактерий (эшерихии, сапрофитные бациллы, стафилококки), которые обеспечивают зону роста от 16,8 ± 0,89 мм до 31,6 ± 1,14 мм в зависимости от вида бактерий и типа питательной среды.

Однако, при использовании культур стафилококков, установили, что некоторые из них ингибируют сателлитный рост А.р1еигорпешпошае. Мы не обнаружили описания подобного феномена, хотя он известен у Р.тиИоас1а. Но в литературе есть сообщения о наличии гиалуроновой кислоты в составе капсулы некоторых штаммов А.р1еигорпеитошае. Следовательно, причиной ингибиции роста может быть синтез культурой стафилококка гиалуронидазы. Мы также не исключаем вероятность образования продуцентом НАД соединений типа НАД-азы. В любом случае, питающая культура бактерий должна быть предварительно проверена по указашюму критерию.

Определение НАД-зависимости - важный этап в идентификации А.р1еиго-рпеишошае (1-Й биовар) и II.para.4uis. Наши данные свидетельствуют о том, что референтные и эпизоотические культуры А.р1еигорпеитошае периодически могут утрачивать НАД- зависимость, причём это касается любого штамма 1-го биовара. Явление НАД -зависимости может быть восстановлено у культур, утративших это свойство, путём культивирования на «обеднённой» питательной среде с локальным источником НАД. Следовательно, на обычных питательных средах животного происхождения культуры, потерявшие НАД зависимость, утилизируют какие-то предшественники НАД, отсутствующие, например, в глюкозо-казеиновом агаре. На последней питательной среде их рост возможен только в присутствии НАД, зависимость от которого они приобретают вновь.

Результаты исследований по изучению НАД - зависимости гемофильных бактерий позволили нам дать оценку и рекомендовать для практических целей сочетание питательных сред, позволяющих в условиях диагностической лаборатории тестировать V - и X - зависимость.

Исследования показали отсутствие CCh - зависимости у изученных культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae, а также не удалось обнаружить существешшх различий в частоте изоляции культур из патологического материала в условиях обычной атмосферы и повышенного содержания СОг. Оба вида бактерий показали зависимость от наличия в питательной среде сыворотки крови. У H.parasuis эта потребность выражена сильнее чем у A.pleuropneumoniae. При отсутствии в'питательном субстрате сыворотки крови оба вида бактерий быстро диссоциируют.

Количественные показатели, характеризующие рост A.pleuropneumoniae и H.parasuis в жидкой питательной среде (бульон Хоттингера, 120мг % аминного азота, pH 7,6; 5% сыворотки крови крупного рогатого скота; 10% дрожжевого экстракта), свидетельствуют о более интенсивном росте первого вида, в частности, период генерации соответственно составил 40,8 и 67 минут, удельная скорость роста 1,008 и 0,622, прирост бактериальных клеток за 1 час культивирования 0,44 и 0,27 log.

Оценка питательных сред для первичной изоляции культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae (1-й биовар) показала, что для этой цели могут быть использованы агар и бульон Левинталя, "шоколадный" агар, сывороточно-дрожжевой бульон и агар, сывороточный и кровяной агар с локальными источниками V -ростового' фактора. Предпочтительнее использование прозрачных питательных сред,' позволяющих получать более полную информацию об особенностях колонии. Использование сред с локальными источниками НАД даёт важную информацию на первом этапе бактериологического исследования о НАД -зависимости, а в случае применения кровяного агара - также о гемолитической активности бактерий. Применение питающих бактерий как источника НАД требует отвивки культур в течении 24-48 часов из-за быстрой их гибели под влиянием метаболитов «баккормилок». Подращивание материала в течении 6-8 часов в сывороточ-но - дрожжевом бульоне, содержащем бацитрацин, с последующим рассевом на среды увеличивает вероятность выделения культур НАД-зависимых бактерий.

Для поддержания культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae при текущей работе в наибольшей степени подходят оптимальные плотные питательные среды с заливкой культур вазелиновым маслом при температуре хранения 5-8°С. Наиболее длительно сохраняют жизнеспособность (6-7 недель) культуры, выращенные в сгустках крови и сохраняемые в замороженном состоянии (табл. 1).

Жизнеспособность культур А.р1еигорпеитошае и Н.рагавшэ на питательных средах.

Табл. 1

Вид Темпера- Тип питательной среды и % жизнеспособных культур через различные сроки хранения (недели)

бактерий турный Сывороточно "Шоколадный" Под вазелиновым маслом Сывороточно- Пережив.

режим -дрожжевой МПА Сывороточно "Шоколадный" дрожжевой ткань

хранения МПА -дрожжевой МПА МПА 0,3% МПА (сгустки крови)

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 | 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 6 8

20-22 °С 100 100 71,42 28,57 100 14,3 100 100 87,7 28,6 100 100 В5.7 100 85,7 57.1 42.9 0 0 0 0 0 0

А.р1еиго-

рпеи- 5-8 "С 100 100 100 71,42 100 100 71,4 - 100 100 100 85,7 100 100 100 85,7 100 100 100 85,7 0 0 0 0 0 0

тошае

(7 ШТ.) -18"С 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 100 100 юо 100 29

20-22 °С 100 25 100 100 50 100 50 100 62,5 0 0 0 0 0 0

Н.рагазшэ

(8 шт.) 5-8 °С 100 62,5 - - 100 87,5 - - 100 100 37,5 - 100 100 25 - 100 100 12,5 - 0 0 0 0 0 0

-18 °С 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 100 100 100 100 62,5 -

че

2.1.2. Методы и результаты идентификации НАД—зависимых бактерий, выделенных от свиней, по культурально - морфологическим, ферментативным и генетическим свойствам.

Исследование ферментативных свойств НАД - и гемин - зависимых культур бактерий проводили на рутинных дифференциально-диагностических средах с добавлением ростовых факторов, а также на жидких средах Гисса в микрообъёмах и диагностических системах ПБДЭ и СИБ Горьковского НИЭМ. Максимальное совпадение результатов было получено на общепринятых средах, в ПБДЭ и микрообъёмах.

Таксономическое положение 165 культур НАД-зависимых бактерий, выделенных от клинически здоровых свиней, а также животных с явлениями фиб-ринозно-геморрагической плевропневмонии или генерализованных серозитов, было исследовано при помощи нумерического анализа. В качестве опорных в данную , коллекцию культур были включены типовые штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, H.parasuis, H.paramfluenzae, II.influenzae, A.lignieresii, A.suis. У каждого исследованного штамма были определены 57 фе-нотипических признаков, характеризующих их культуральные и ферментативные свойства. Все полученные данные были преобразованы в числовую форму, подвергнуты нумерическому анализу с конечным представлением полученных результатов в виде дендрограммы (рис. 1).

Рис.1

Упрощенная дендрограмма распределения НАД-зависимых эпизоотических и референтных культур.

Анализ дендрограммы проказывает, что на уровне подобия 63% все эпизоотические и референтные штаммы представляют единый массив, после чего они

подразделяются на два фенона условно обозначенных "А" и "Н". Фенон "А" на уровне подобия около 70% объединяет типовые штаммы актипобацшш'" (A.lignieresii, A.suis), бактерии "малой группы", Haemophilus (Actinobacillus); pleuropneumoniae и большинство эпизоотических штаммов, выделенных при' пневмониях свиней. Фенон "Н" при уровне подобия 76% объединяет типовые штаммы Н.influenzae, H.parainfluenzae, H.parasuis и группу эпизоотических' штаммов, выделенных при серозитах свиней. Таким образом, мы можем конста-' тировать, что полученные уровни подобия в данном случае являются родовыми. .

Культуры кластера "А" при уровне подобия 70% распадаются в свою оче-i редь на фенон №1, включающий A.lignieresii и A.suis, фенои №2, включающий/ на уровне сходства около 88% эпизоототеские культуры и типовой штамм гемо--фильных бактерий "малой группы". Остальные эпизоотические культуры фенона) "А" объединяются вокруг типовых культур Haemophilus (Actinobacillus): pleuropneumoniae (фенон№3). .j

В кластере "II" на уровне сходства около 76% выделяется в самостоятелу ный фенон вид H.influcnzae (фенон №4), при уровне сходства 81% выделяется-в' отдельный фенон (№5) яид H.parainfluenzae. Массив эпизоотических культур этого кластера ("Н") концентрируется вокруг типовых штаммов H.parasuis.

Следовательно, массив эпизоотических штаммов дифференцируется на три фенотипические группы, соответствующие ' видам Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, H.parasuis и «малой группе» гемофильных' бактерий. Полученные данные свидетельствуют о тяготении культур Haemophilus pleuropneumoniae не к роду Haemophilus, а к роду Actinobacillus.

С целью уточнения таксономического положения эпизоотических штаммов, классифицированных по фенотшшческим свойствам как Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae, НАД-независимых бактерий, обозначаемых; как Pasteurella-haemolytica- подобные бактерии, был определён нуклеотидный': состав и уровень гомологии ДНК культур этих групп с представителями родов., Haemophilus (H.parasuis, шт. J95 - таксон «С»), Pasteurella (P.multocida), Actinobacillus (A.suis), а также с типовыми культурами Haemophilus (Actinobacillus) ! pleuropneumoniae. ;

Результаты показали, что все исследованные штаммы по ГЦ -составу обра-' зуют довольно однородную группу с крайними значениями 39,8 - 43,2. (Х=41,3±0,2). Такие значения вполне соответствуют приводимым в Руководстве Берги для семейства Pasteureilaceae. Несколько более высокий ГЦ состава обнаружен у P.haemolytica - подобных бактерий (42,5±0,5) по сравнению с типовыми! штаммами A.pleuropneumoniae, (40,7±0,5). Эпизоотические штаммы Haemophilus; (Actinobacillus) pleuropneumoniae имели показатель 41,2±0,1 мол%:. ГЦ(табл.2). ■ '' ■ \

табл.2

Нуклеотидный состав ДНК изученных видов бактерий семейства Ра&(еиге11асеае и эпизоотических штаммов.

Штамм | Т„("С) | Мол.%ГЦ

A. pleuropneumonias шт. ССМ5670 70,5 40,5

^pleuropneumonias шт. Ferna 70,5 40,5

^pleuropneumonias шт. 5К98 70,7 41.0

P.haemolytica подобный шт. 2283/77 71,5 42,9

P.haemolytica-подобный ШТ. 2008/76 70,2 42.2

P.haemolytica-подобный шт. 339/76 71,3 42,5

A.ligniere$ii шт. ССМ5144 71,0 41,7

A.suis шт. ССМ5586 70,4 40,3

H.parasuis шт. Н230 70,4 40,3

Kparasuis шт. Н184 70,2 33,8

Haemophilus spp. таксон "С" шт. J95 71,6 43,2

P.multocida штамм 473 70,2 39,8

P.muftocida штамм P2D 70,9 41,5

Эпизоотический шт. №19 71,0 41,7

Эпизоотический шт. №27 70.8 41.2

Эпизоотический ШТ. №45 70,8 41,2

Эпизоотический шт. МП18 70,7 41,0

Эпизоотический шт. КМ17 70,6 40,7

Эпизоотический шт. МП4 71,0 41,7

Эпизоотический шт. МПЭ2 71,0 41,7

Эпизоотический шт. 4481/К4 70,7 41,0

Уровень гомологии ДНК внутри группы Р.Ьаето1у11са - подобных штаммов составил 100%; ДНК бактерий этой группы (шт.2288/77) имела гомологию с ДНК типовых пггаммов А,р1еигорпеитошае - 75%; с ДНК А.эшэ - 33%, с ДНК Р.ти1Ьэа(1а и Н.рагазшз не более 9%; с ДНК эпизоотических штаммов Наето-рЫ1ш (АсипоЬясШиз) ркигорпеитошае - 75—83%.

Табп.З

Уровень гомологии ДНК внутри группы эпизоотических штаммов и с некоторыми видами семейства Раз1еиге11асеае.

Штамм источник ДНК % гомологии ДНК

шт. 4481/К4 шт. КМ17

x I * х | а

Эпизоотический шт. 4481/К4 100 9 80 10

Эпизоотический шт. КМ17 70 7 100 10

Эпизоотический шт. МП18 78 3 100 10

Эпизоотический шт. №45 98 4 98 10

Эпизоотический шт. №27 95 9 75 6

Эпизоотический шт. МП4 80 6 95 6

А.р1еигорпеитошае шт. 5К98 98 13 78 3

А.зЫэ шт. ССМ5586 33 2 38 5

Н.рагазшэ шт. Н230 6 1 - -

Н.рагазшз шт. Н184 5 1 18 3

Р.тиКос1с1а шт. Р1Э 7 1 10 1

Р.тиНоайа шт. 473 3 1 10 1

Эпизоотические штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae по данным гибридизации ДНК образуют генетически взаимосвязанную группу с уровнем подобия нуклеотидных последовательностей ~ 70-100 %. В то же время бактерии этой группы тесно связаны с типовыми штаммами Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae (78-98%), на уровне 33-38% гомологичных нуклеотидных последовательностей с ДНК A.suis , и только на уровне гомологии ДНК 5-18 % с H.parasuis и 3-10 % с P.multocidaCT.aff/7.3;.

При интерпретации полученных результатов мы исходили из критериев генетического анализа, предложенных Медниковым и соавт.(1974), согласно которым культуры P.haemolytica - подобных бактерий не имеющие НАД— зависимости, могу г рассматриваться как биовар Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae. В целом эпизоотические штаммы, выделенные при фибри-нозно - геморрагических пневмониях, P.haemolytica - подобные бактерии и типовые штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae предстают как видовая общность с заметной внутривидовой гетерогенностью. Подобный внутривидовой уровень гетерогенности не исключает выделения дополнительных внутривидовых таксонов, кроме НАД—зависимого и - независимого биоваров.

Полученные данные свидетельствуют, что культуры A.pleuropneumoniae, обозначаемые в 9-м издании Руководства по систематике бактерий Берги как вид рода Haemophilus, не относятся к нему, а также штамм J95 (таксон «С»), упоминаемый в числе видов рода Haemophilus, по данным гибридизации также не относится к роду Haemophilus.

На основании результатов нумерического анализа, с учётом частоты встречаемости тех или иных положительных ферментативных реакций, для идентификации НАД-зависимых бактерий, выделяемых при пневмониях и генерализованных серозитах свиней, рекомендованы в качестве основных дифференциальных признаков (кроме культуральных): НАД—зависимость, образование уреазы, щелочной фосфатазы, гемолизина, кислоты из ксилозы, маннита и маннозы. Остальные ферментативные признаки можно рассматривать как до-полнительные(табл.4).

Потеря культурами A.pleuropneumoniae НАД-зависимости и признание существования НАД-независимого биовара этого вида бактерий делает неприемлемой схему идентификации, предлагаемую для НАД-зависимых культур. Неизбежно расширяется число бактериальных видов, от которых необходимо дифференцировать НАД - независимые культуры A.pleuropneumoniae. Ситуация осложняется тем, что сходные патологоанатомические изменения в лёгких могут вызвать другие виды бактерий. В опытах экспериментального (интраназального) заражения свиней сходные изменения в легких были обнаружены при инокуляции культур A.pleuropneumoniae НАД—зависимого и - независимого биоваров. A.suis и бактерий «малой группы». Данное обстоятельство увеличивает значение бактериологического исследования в диагностике болезни. Сравнительное изу-

чение физиологических свойств А.р1еигорпеитошае (1 и 2 биовары), А.эшв, Р.тикоаёа и В.ЬгопсЫзер^са как видов сходных и достаточно часто обнаруживаемых при пневмониях свиней позволило нам отобрать для их дифференциации следующий минимальный набор признаков: липкость колоний и вязкость бульона, наличие капсулы и жгутиков, гемолитическая и уреазная активность, образование щелочной фосфатазы, индола, кислоты из маннита, сорбита, салицина, мелибиозы, утилизация цитратов.

Табл.4

Ферментивная активность НАД-зависимых культур бактерий выделенных от свиней.

Признак Фенон №2, 9 штаммов, Фенон №3, 73 штамма, Фенон N86, 83 штамма,

"малая группа" А.р1еигарпеитопгае Н.рагавшз

(% положительных (% положительных (% положительных

реакций) реакций) реакций)

Потребность в росто-

вых факторах:

X 0 0 0

V 100 100 100

В-гемолиэ 0 100 0

Редукция нитратов 100 100 100

Индол 0 9,58 6,02

н2э 100 58,36 20,48

Уреаза 100 100 0

Желатиназа 0 0 0

Каталаза 44,40 26,65 85,54

р- галактозидаза 100 100 95,19

Натрия цитрат 0 0 0

Свертывание молока 33,30 17,80 0

Ч.Р. 0 0 0

МЛ 0 0 0

Лизин 0 0 0

Аргинин 0 0 0

Орнитин 0 0 0

Фенилаланин 0 0 0

Щелочная фосфатаза 100 100 0

Образование шепоты из;

глюкозы 100 100 79,53

сахарозы 100 100 93,98

лактозы 77,70 15,06 10,84

ксилозы 0 100 13,25

раффинозы 0 6,84 0

сорбита 0 34,24 О

глицерина 0 0 0

инулина 0 0 0

маннита 0 100 14,45

мальтозы 100 63,01 92,77

дульцита 0 0 0

рамнозы 0 0 36,10

арабинозы 11,10 0 27,71

декстрозы 0 100 13,25

маннозы 0 80,82 75,90

галактозы 100 80,82 51,80

трегалозы 44,44 0 0

адонита 0 0 0

инозита 0 0 0

салицина 0 0 0

2.1.3. Патогенные свойства А.ркцгорпеитошае.

Исследовали патогенносгь данного вида бактерий для лабораторных животных и свиней.

При испытаниях различных способов заражения морских свинок культурами А.р1еигорпеитошае животные этого вида оказались наиболее чувствительны к шгграназалыюй инокуляции (ЛД5о-125млн.м.к.), менее чувствительны - к внутрибрюшшшому (ЛДзо~1,585 млрд.м.к.) и малочувствительны к подкожному заражению. Сравнительная оценка вирулентности девяти штаммов А.ркигорпеитошае при шпрапазальном способе инокуляции по критерию объёма поражённой лёгочной ткани показала наибольшую вирулентность культур 1, 4, 5 сероваров и существенно меньшую у культуры серовара 3; культуры серова-ра 2 показали штаммовые различия. Патологоанатомические изменения при ин-траназалыюм заражении морских свинок характеризовались развитием фибриноз-но-геморрагической пневмонии.

В отличие от морских свинок белые мыши оказались более чувствительны к внутрибрюшинному заражению: ЛД50 составила для культуры серовара 4-Ю"2 м.к. , серовара 5-107'5 м.к., серовара 1-Ю835 м.к. Изменения в лёгких у заражённых мышей характеризовались развитием геморрагической пневмонии без отложения фибрина на плевре. В целом прослеживаются видовые отличия изменений в лёгких при актинобациллёзной пневмонии: в воспалительном экссудате максимальное количество фибрина отмечается у свиней, меньше - у морских свинок и он практически отсутствует у мышей.

Полученные результаты свидетельствуют, что морские свинки и белые мыши могут быть использованы в качестве лабораторной модели при изучении вирулентности штаммов возбудителя, вопросов пато - и иммуногенеза.

Испытание различных способов заражения 2-2,5 - месячных свиней показало их чувствительность к ишраназалыюму и грахеальному способам введения возбудителя при устойчивости к подкожной инокуляции культур. Заболевание удалось также воспроизвести контактным путем. При интраназальном и трахе-альном заражении (доза 4* 10'м.к.) инкубационный период составил 3 - 6 часов, контактном - 72 часа. При всех способах заражения однотипные изменения в виде фибринозно - геморрагической пневмонии отмечали в лёгких. Это свидетельствует, что естественными входными воротами возбудителя являются дыхательные пути.

При оценке патогенности для свиней культур возбудителя различных сероваров (сер. 1,2,3,4,5) установили, что колебания вирулентности больше отражают штаммовые различия или состояние культуры на момент исследования, чем серовариантную принадлежность. Только культура серовара 3 в опытах на свиньях и лабораторных животных закономерно показывала меньшую вирулентность, чем штаммы других сероваров. Тирания культуры эпизоотического

пггамма возбудителя на свиньях (интраиазальное заражение) показала ЛД50 на уровне 4-Ю7 м.к.

На результаты заражения свиней влияет возраст культуры бактерий. При интраназальном заражении свиней одинаковой дозой 6 - и 18 - часовых культур (4-10'м.к.) инкубационный период, соответственно, составил 3 и 7 часов, среднее время от заражения до гибели животных - 48,5 и 103 часа, количества летальных исходов -100% и 50%, объём поражённой лёгочной ткани - 70% и 47,5%, что свидетельствует о разной вирулентности культуры одного штамма на различных стадиях развития популяции.

Помимо свойств заражающей культуры возбудителя на течение и исход болезни влияют факторы внешней среды. В эксперименте показано значение факторов микроклимата (табл. 5). Двенадцать заражённых одной культурой свиней содержали в условиях микроклимата, соответствующего зоогигиеническим нормам (группа А) и с отклонениями (группа Б). В группах А и Б соответственно всего пало 66,6% и 100% свиней, из них в течении 24 часов - 33,3% и 66,6%. Среднее время от заражения до гибели в группах составило 67,5 и 27,3 часа, объём поражённой лёгочной ткани - 32,2±12Д% и 59,5±5,9%. Различия по последнему показателю в группах А и Б статистически достоверны (р<0,01).

В опытах экспериментального воспроизведения акгинобациллёзной пневмонии на морских свинках, свиньях, а также при исследовании животных, павших в условиях неблагополучного хозяйства, исследована диссеминация возбудителя (табл. 6).

Табл.5

Влияние микроклимата на течение актинобациллезной плевропневмонии у экспериментально зараженных свиней.

Группа Микроклимат Способ Кол-ео Исход заражения Среднее % поражения Наличие

помещения заражения животных Пало Пало в Выжило время от ткани плевритов

и доза всего 1-ые (%) заражения легких (%)

культуры (м.к.) <%> сутки {%) до гибели (час) (X ±а)

Соответ-

ствующий

А зоогигиеническим нормам 4-109 6 66,6 33,3 33,3 67,5 32,2 12,1 66,6

Отсутствие

полноценной

В вентиляции,

повышенная 4»10Т-4.109 6 100 65,6 0 27,3 59,5 5,9 16,6

температура

Табл. 6

Диссеминация А.р!еигорпеитоп>ае в организме экспериментально зараженных и естественно больных свиней.

Группы Течение Кол-во Частота изоляции культур возбудителя из органов и тканей (%)

животаых болезни живот- лег- кровь головной КОСТНЫЙ пе- селе- поч- бронх средост надпах. паховые поджеп. трахея

ных кие мозг МОЗГ чень зенка ки л.у. лу. л.у. л.у. л.у.

Летальный

исход в

твчвнив 5 100 60 40 60 60 80 60 100 100 60 100 X X

7-24 часов

Экспери- Летальный

ментально исход в

зараженные течение 7 100 100 57,14 42,35 42,85 57,14 100 100 85,71 57,14 71,42 X X

свиньи. 1-5 суток

Летальных

исходов а 75 0,0 12,5 0 0 12,5 40 62,5 12,5 12,5 0 X X

нет

Сверх-

Свиньи, острое

павшие в и острое 30 100 16,66 40 16,66 56,66 40 60 63,33 76,66 X X 56,66 100

условиях течение

хозяйства болезни

X - исследования не проводили.

При летальном исходе у свиней наиболее часто культуры возбудителя изолировали из поражённых участков лёгочной паренхимы (100%), бронхиальных и средостенных лимфатических узлов (63,33 - 100%), реже - из печени, селезёнки, почек, костного мозга, крови, головного мозга. Полученные данные определяют характер материала, отбираемого для бактериологического исследования.

Исследование экспериментально заражённых морских свинок (шпраназальная инокуляция) показало, что изменения в лёгких в виде очаговой гиперемии в зоне ветвлешгй крупных и средних бронхов развиваются уже через час после инокуляции культуры. Возбудитель на это стадии реизолировали из лёгочной ткани, бронхов, трахеи. Через три часа в лёгких развивались типичные изменения. На этой стадии в 25% случаев культуры возбудителя реизолировали из крови и паренхиматозных органов. По истечении 6 часов изменения в лёгких получили полное развитие. Таким образом, бактериемия и диссемипация возбудителя происходят на фоне уже имеющихся изменений в лёгких.

Наблюдение за экспериментально заражёнными больными свиньями в условиях неблагополучного хозяйства позволяют выделить три варианта течения болезни: сверхострое, острое и подострое. При сверхостром течении на фоне жёсткого респираторного синдрома летальный исход наступает в течении 624 часов. В грудной полости, где расположены поражённые доли лёгкого, обнаруживали 150-300см3 красноватой жидкости, изменённая доля лёгкого увеличе-

на в объёме, ткань на разрезе тёмно-красного цвета, интерлобулярные септы отёчны, консистенция поражённой ткани плотная, с разреза стекает красноватая жидкость, бронхи и трахея заполнены аналогичной пенистой жидкостью. Отложения фибрина на пульмональной и костальной плевре отсутствуют.

У животных с острым течением болезни отмечен прогрессирующий респираторный синдром с повышением температуры до 40,6—41°С, завершающийся летальным исходом в течении 6—7 суток. У павших свиней в грудной полости находили до 200 см3 красноватой жидкости с хлопьями фибрина. Поражённые лёгкие тёмно-красные, плотные, ломкие, с выраженным отёком междолько-вой соединительной ткани. Костальная и лёгочная плевра покрыты плёнками фибрина.

У свиней с подострым течением регистрировали симптомы пневмонии, лихорадку ремитирующего типа, плохую поедаемосгь корма. Поражённые доли лёгких увеличены, бугристые, плотные, неравномерно окрашены: участки тёмно-красного, серо-коричневого, грязно-бурого цвета. Через 15-20 дней в лёгочной ткани обнаруживали очаги уплотнения, окружённые соединительной тканью. Отложения фибрина на лёгочной и костальной плевре пронизаны соединительной тканью.

Гистологические изменения в лёгких на начальной стадии болезни могут быть охарактеризованы как бактериальный токсический шок (гистологические исследования проведены д.в.н. Шубиным В.А.).Типичным для органопатологии бактериального шока считается парез и стаз артериол, мелких артерий, набухание и фибриноидный некроз стенок. Присоединение внутрисосудистого свёртывания крови придаёт шоку необратимый характер и приводит к возникновению некрозов ткани. Дальнейшие изменения развиваются на указанном фоне. На 2-3 сутки начинается инфильтрация поражённых тканей мононуклеарными клетками, в основном лимфоцитами, при отсутствии или малом количестве нейгрофи-лов, эти клетки формируют своеобразный демаркационный вал. Позднее в поражённых тканях развиваются некротические очаги, подвергающиеся инкапсуляции. В зависимости от течения болезни и сроков гибели животного обнаруживается та или иная стадия патологического процесса.

Подтверждением вывода о ведущей роли токсинов в патогенезе акгиноба-щшлёзной плевропневмонии являются следующие результаты наших исследований. Установлено, что в периодической аэрируемой культуре возбудитель в первые три часа культивирования синтезирует термолабильные, чувствительные к трипсину гемолизин и экзотоксин (рис.2).

Динамика синтеза гемолизина и накопление растворимых антигенов в периодической культуре А.р1еигорпеитотае

Рис. 2.

2

а

Ь ™4 та Р о.

---------

" г ъ г- г

а Титр гемолизина

(¡од)

1

ПТитр растворимых антигенов Под)"

1 2 3 5 8

Возраст культуры (час.)

Динамика их накопления и инактивации в культуральной жидкости практически синхронная. Аэрозольная аппликация стерильной жидкости, содержащей гемолизин и экзотоксин, вызывает у морских свинок в лёгких изменения типичные для актинобациллёзной плевропневмонии. Исследование антигенных свойств гемолизинов , продуцируемых культурами различных сероваров, в реакции нейтрализации не показало их серовариантной специфичности. По нашему мнению 6-8-часовые агаровые и 3- часовые бульонные аэрируемые культуры в физиологическом отношении близки, поскольку находятся в начальной стадии логарифмического роста. Поэтому мы считаем, что на первом этапе развития изменений в лёгких определяющую роль играют гемолизин и экзотоксин. По нашему мнению, 6-8-часовые агаровые культуры возбудителя содержат некоторое количество в связанном виде гемолизина и экзотоксина, что определяет большую вирулентность молодых культур.

2.1.4. Патогенные свойства Н.рагаэшБ.

Исследовали чувствительность в возбудителю морских свинок, белых мышей, поросят-отьёмышей.

ДЦ5о культуры Н.рагавшБ штамм №1 для морских свинок при интрана-зальном заражении составила 354 млн.м.к., внутрибрюшинном - 594 млн.м.к., подкожном - 1,414 млрд.м.к.. При всех способах заражения с различной часто-

той обнаруживали развитие еерозно-фибринозного плеврита, перитонита, реже перикардита. После интраназальной инокуляции у 100% животных отмечали развитие катаральной пневмонии. У павших животных культуры возбудителя наиболее часто выделяли из поражённых серозных оболочек и реже - из паренхиматозных органов. ЛД50 культуры II.para.suis при внутрибрюшинном введении штамма серовара С составила Ю8'"м.к., А-108'80м.к., Д-10'-15м.к., В-108'93м.к.

Белые мыши, как и морские свинки были более чувствительны к внутри-брюшинному (ЛД50=1,414 млрд.м.к.) и ишраназальному (ЛД50=1,549 млрд.м.к.) способам заражения при устойчивости к подкожному введению культуры. Пато-логоанатомические изменения у мышей и морских свинок были однотипны.

С нашей точки зрения, морских свинок можно рассматривать как наиболее удобную модель для биопробы и изучения пато - и иммуногенеза инфекции, вызываемой Н.рагаБШБ.

В опытах на поросятах-отъёмьппах показано, что гемофилёзный полисерозит может быть воспроизведён при интраназальном, трахеальном, внутри-брюшшшым и внутривенном введении культуры П.рагазшя. Учитывая экологию возбудителя, можно констатировать, что естественными входными воротами инфекции являются дыхательные пути. При трахеальном заражении первые клинические симптомы в виде угнетения и повышения температуры тела отмечаются через 6-8 часов, позднее (20-24 часа) у абсолютного большинства животных развивается катаральная пневмония. В 75% случаев уже на этой стадии развивается серозно-фибринозный плеврит и в 50% случаев - перитонит, что свидетельствует о высоких инвазивных свойствах возбудителя. У животных, убитых через 24 часа после заражения, на фоне описанных патологоанатомических изменений культуры возбудителя были выделены в 100% случаев из лёгких и бронхиальных лимфатических узлов и в 25% случаев - из крови. В более поздние сроки существенных изменений в характере патологоанатомических изменений не наступало, за исключением резорбции экссудата из полостей и появления у отдельных животных симптомов поражения суставов конечностей и головного мозга. Гистологические исследования (выполнены д.в.н., профессором Шубиным В.А.) позволяют охарактеризовать изменения у экспериментально заражённых и естественно больных свиней как септико-токсический процесс с поражением серозных покровов, паренхиматозных органов, лимфатических узлов и центральной нервной системы.

Исследования показали, что типичные патоморфологические изменения могут вызвать как капсулообразующие, так и бескалсулыше формы возбудителя при большей вирулентности первых.

По нашим данным изменения в лёгких, плевре, перикарде и перитонеуме ассоциируются с локализацией в них возбудителя. Частота изоляции культур Н.рагаБшз из тканей и органов зависит от характера течения болезни и давности процесса (табл. 7, 8).

Табл.7

Диссеминация Н.рагаэшв и патологоанатомические изменения в организме свиней зараженных трахеально.

Группа животных Кол-во животных в группе Сроки исследования после заражения Наличие патологоанатомических изменений (%) Количество выделенных культур Н.рагазшэ (%).

легкие плевра трахея перикард бронхиальный л.у. мезент. л.у. пери-тонеум кровь сердца печень селезенка почки головной мозг

пневмония плеврт перикардит перитонит артрит

1 4 24 часа 100 75 25 50 - 100 75 50 25 100 - 25 25 50 - -

2 4 48-72 часа 100 50 25 25 - 100 50 100 10 100 - 25 25 - - -

3 5 5-13 суток 60 80 40 80 20 ео 40 20 40 40 - 20 - - - -

Табл.8

Диссеминация Н.рагаэШБ и патологоанатомические изменения у свиней павших с явлениями полисерозита в условиях хозяйства.

Кол-во 1сследо- Течение болезни Наличие патологоанатомических изменений (%) Результаты бактериологического исследования Выделено культур (%).

ванных кивотных пневмония плеврит перито нит перикардит артрит гоп. мозг легкие плевра перикард перито-неум средост. л.у. печень селезенки почки кровь суставы

21 острое 52,38 100 100 100 76,91 33,3 42,85 71,42 92,23 100 85,71 57,14 66,66 38,09 23,8 71,42

10 под-острое 80 100 100 100 0 0 40 10 30 20 10 0 0 0 0 0

При остром течении в результате экспериментального (трахеального) заражения через 48-72 часа из лёгких культуры возбудителя выделили в 100% случаев, плевры - 75%, пёрйтонсума и перикарда - 25%, бронхиальных лимфатических узлов -100%, селезёнки - 50%, крови - 25% случаев. При бактериологическом исследовании поросят, павших с картиной острого полисерозита, в естественных условиях культуры возбудителя выделили из лёгких у 42,85%, перикарда -92,2%, плевры -=71,42%, дечени - 57,14%, селезёнки - 66,66% животных. В более отдалённые сроки;после экспериментального заражения и от животных, павших в естественных условиях с картиной подострого полисерозита, возбудитель выделяли реже и преимущественно из плевры, лёгких, перикарда, перитонеума и средостенных лимфоузлов.

Анализ возрастной заболеваемости поросят гемофилёзным 'полисерозитом показал, что грк отхода приходится на возраст 35-60 дней. Появление отхода поросят явлениями; гемофилёзного полисерозита совпадает со снижением I и фа колостралы'шх антител к Н.рагазшэ (серовар Д), увеличением уровня колонизации возбудителя в респираторном тракте. Согласно полученным данным, Н.рагазшБ является достаточно: обычным компонентом нормальной микрофлоры слизистых дыхательных путей и на фоне описанных изменений, наряду с другими этиологическими агентами, участвует в возникновении пневмоний у поросят данной возрастной группы и в ряде случаев это сопровождается развитием септической стадии с поражением серозных оболочек, суставов и головного мозга.

2.1.5. Обоснование критериев отбора материала для бактериологического исследования на актинобациллёзную пневмонию и гемофилёз-ный полисерозит.

Гемофилёзный полисерозит. Данные о диссеминации возбудителя свидетельствуют о наибольшей частоте его выделения из поражённых серозных оболочек, серозно-фибринозного экссудата. Выделение чистой культуры возбудителя наиболее вероятно при исследовании пунктата из поражённых, суставов и перикарда. В замороженном патологическом материале Н.рагазшБ сохраняет жизнеспособность до;30 суток (режим хранения -18°С).

Актинобацйллёзная плевропневмония. Независимо от характера течения болезни возбудитель закономерно обнаруживается в поражённой ткани лёгких и регионарных лимфатических узлах, что определяет характер материала, отбираемого для' бактериологического исследования. В патологическом материале, заключённом в врдно-глицериновую смесь ( температура, хранения 4 - 6°С), возбудитель сохраняет жизнеспособность в течение 15 суток, в замороженном тканевом материале - до 45 суток.

2.1.6. Серологическая идентификация культур Н.рагавшв А.р1еигорпеитошае.

2.1.6.1. Методы и результаты серологической идентификации культур Н-рагавшз.

Использовали кроличьи гипериммунные сыворотки против типовых штаммов сероваров А, В, С, Д, Бакоса.

Дифференциация сероваров Н.рагаБшэ в пробирочной РА показала её малую специфичность. Более эффективной для указанной цели оказалась РСК с растворимыми антигенами.

Исследование в РСК с типовыми сыворотками 46 эпизоотических культур Н.рагазшз, выделенных при генерализованных серозитах, позволило 47,82% культур отнести к известным сероварам Бакоса. Штаммы серовара А составили 15,2%, В - 17,39%, С - 2,17%, Д-13,04%. В группе штаммов, выделенных из лёгких при пневмониях (18шт), культуры серовара А составили 16,6%, В - 11,1%, С - 5,56%, Д -33,3%, нетипируемые -33,3%. В числе культур, выделенных из носовой слизи клинически здоровых свиней (14 шт.), 35,7% отнесены к серовару А, 14,2% - к серовару Д, не удалось типировать 50% штаммов (табл.9).

Табл.9

Результаты серотипирования эпизоотических штаммов Н.рагазшз в РСК с иммунными сыворотками против референтных штаммов Вакоэ.

Происхождение Кол-во Серовариантная принадлежность штаммов. Положительная

штаммов штаммов А В С Д 11 н/тип реакция акрифла-

абс. | отн. абс. | от абс. | отн. абс. | ото. абс. отн. виновом тесте

Серозные оболочки, 46 7 15.2 8 17,4 1 2,17 6 13 24 52.2 16 34,78

головной мозг

Легкие

(пневмония) 18 3 16,7 2 11,1 1 5,56 6 33,3 6 33,3 10 55,56

Верхние дыхательные 14 5 35,7 2 14,3 7 50,00 9 64,29

пути

Всего: 78 15 19,2 10 12,8 2 2,56 14 18 37 47,4 35 44,87

- референтная культура серовара "Д" давала положительную акрифлавинозую пробу.

В целом по всей группе из 78 штаммов Н.рагаэшз было отнесено к серовару А - 19,23%, В - 12,82%, С - 2,56%, Д - 17,95%, нетипируемые культуры соста-

вили 47,44%.

Исследование иегипируемых культур в РСК с антисыворотками против изолятов этой же категории показало наличие ещё трёх серологических вариантов и часть культур осталась за пределами этих групп. Полученные данные позволяют заключить, что необходимо расширение числа сероваров на базе схемы Бакоса, либо требуется создание новой схемы серовариантной дифференциации с новыми типовыми штаммами.

Анализ серотиповой структуры культур, выделенных в пределах одного хозяйства показал ассоциацию с генерализованными серозитами свиней H.parasuis различной серовариантной принадлежности.

2.1,6.2. Методы и результаты серологической идентификации культур A.pleuropaeumoniae.

Для серовариантной дифференциации культур A.pleuropneumoniae испытывали РА пробирочную, РА с 2-МЭ, РА на стекле, РИГА, РИГА с 2-МЭ, РКА пробирочную па стекле, двухступенчатую РИФ. При внутривидовой дифференциации в различных серологических реакциях типовых культур A.pleuropneumoniae (серовары 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12) установлены перекрёстные реакции между сероварами 3,6 и 8, 2 и 3,1 и 2, 4 и 7. Исследование двухсторонних антигенных связей в большинстве случаев позволяет определить се-ровариаигаую принадлежность культур. Из группы ускоренных серологических реакций для серологической идентификации наиболее перспективна РКА с растворимыми антигенами.

При серологической идентификации 82 эпизоотических НАД—зависимых - культур бактерий, выделенных при фиб^Г&но-геморрагических пневмониях сви-; ней и классифицированных как A.pleuropneumoniae, отнесены к серовару 2 -: 12,9%, 3 -14,53%, 4 -8,53%, 6 -3,65%, бактериям «малой группы» -7,31%. Большую группу штаммов серологически идентифицировать не удалось. Культуры последней группы имели антигенное родство с сероварами 3,6,8,10, но при исследовании в перекрёстной РА с адсорбцией были не идентичны им.

2.1.7. Результаты изучения широты распространения сероваров A.pleuropneumoniae на основании серологических исследований.

Была предпринята попытка дать оценку циркуляции различных сероваров A.pleuropneumoniae в свиноводческих хозяйствах одной из областей центральной России по результатам серологических исследований. В РИГА исследовали 639 сывороток крови свиней из десяти хозяйств. Установлено преобладание антител к сероварам 1,4,6,3,2,12. При бактериологическом исследовании в данном регионе культур сероваров 1 и 12 не выделяли. Причины такой ситуации требу-

ют дальнейшего изучения. В сыворотках крови некоторых серопозитивиых свиней удалось выявить нейтрализующие антитела к гемолизинам А.р1еиго-рпеитошае, что свидетельствует о наличии определённого иммунитета к А.р1еигорпеитошае.

2.1.8. Разработка и апробация ускоренных серологических методов обнаружения антигенов А.р1еигорпеитошае в патологическом материале.

Для обнаружения антигенов А.р1еигорпеитошае непосредственно в тканевом материале были испытаны реакции коагглютинации (РКА) и двухступенчатой иммунофлуоресценции (РИФ).

Опыты показали, что РКА может быть использована для видовой и серо-типовой идентификации А.р1еигорпеитотае. Серотиповую специфичность результатов РКА удаётся повысить путём уменьшения дозы сыворотки для сенсибилизации носителя и использования в реакции растворимых капсульных антигенов. Более активные видовые диагностикумы удалось сконструировать при использовании поливалентных сывороток, полученных от кроликов, иммунизированных не моноантигенами а смесью антигенов А.р1еигорпеитошае различных сероваров (табл. 10).

Использование РКА как метода видовой идентификации потребовало выяснения межвидовых антигенных связей А.р1еигорпеитошае. Изучали антигенное родство данного вида бактерий с А.зшв, Л.Н^егехн, Р.тико«с1а (А,В,Д), Н-рагавшв (А,В,С,Д), В.ЬгопсЫхер11Са, Х.сЬокгахшх, 8лурЬнтщпит. Наиболее выраженное антигенное родство установлено с А.бшб и А.Нш:иегеяп, наличие которых в исследуемом материале может обусловить ложноположительные результаты РКА.

Серовариантную дифференциацию типовых культур А.р1еигорпеитошае проводили в РИФ с предельными разведениями ангасывороток первой ступени, обеспечивающими свечение клеток с гомологичными реагентами на четыре креста. Обнаружили перекрёстные реакции сероваров 1 и 2; 2, 3 и 6; 3, 2, 6 и 8; 4 и 7; 10 и 12. Таким образом, надёжной серовариантной дифференциации в ряде случаев добиться не удалось. Слабые перекрёстные реакции интенсивностью на два креста получены с культурами А.вшя, А.^шегези. Не отмечено перекрёстных реакций с Р.тиИоаёа (А,В,Д), Н.ратшэ (А,В,С,Д), Е.со11, З.сИокгахгш и 8.1урЫтигшт.

При изучении специфичности РКА как метода обнаружения антигенов возбудителя в органах и тканях исследовали супернатанты тканевых (лёгочных) гомогенатов клинически здоровых свиней, морских свинок и получили неспецифические замедленные положительные реакции.

Табл. 10

Активность моно- и поливалентных антительных диагностикумов A.pleuropneumoniae.

Антиген Активность исходных иммунных сывороток и дтагностикумов (log титра антител, диагностикумов)

(штамм) Моновалентные сыворотки и диагностикумы Видовые диагностикумы

РА РКА РКА на основе моновалентных иммунных сывороток на основе поливалентных иммунных сывороток

пробирочная пробирочная на стекле РА пробирочная РКА пробирочная РКА на стекле РА пробирочная РКА пробирочная РКА на стекле

1 1 or X I - X I - X I - * I а X I -

ССМ5869 7,30 0,58 7,67 0,58 ++++ 5,67 0,58 6,00 0,00 ++ 8,67 0,58 8,33 0,58 ++++

ССМ5870 8,00 1,00 10,00 0,00 ++++ 6,67 0,58 6,33 0,58 +++ 8,33 0,58 8,00 0,00 ++++

ССМ5871 9,67 0,58 9,33 0,58 ++++ 7,33 0,58 8,00 1,00 ++++ 9,33 0,58 9,00 0,00 ++++

М62 9,30 0,58 8,33 0,58 ++++ 6,33 0,58 5,67 0,58 ++++ 8,67 0,58 8,33 0,58 ++++

К17 7,67 0,58 7,33 0,58 ++++ 5,33 0,58 5,3 0,58 ++ 7,33 0,58 7,33 0,58 ++++

Femo 9,67 0,58 7,00 0,00 ++++ 7,33 0,58 7,00 0,00 ++++ 7,33 0,58 7,67 0,58 ++++

WF-83 8,30 0,58 8,67 0,58 ++++ 5,33 0,58 4,67 0,58 +++ 5,67 0,58 5,67 0,58 ++++

405 7,67 0,58 8,00 0,00 ++++ 5,00 0,00 4,67 0,58 ++ 6,67 0,58 6,33 0,58 ++++

407 8,30 0,58 8,00 0,00 ++++ 6,33 0,58 5,67 0,58 +++ 9,33 0,58 9,33 0,58 ++++

8329 7,67 0,58 9,67 0,58 ++++ 8,33 0,58 8,00 0,00 ++++ 10,30 0,58 9,67 0,58 ++++

202 7,67 0,58 8,00 0,00 ++++ 7,00 0,00 6,33 0,58 ++++ 8,00 0,00 7,67 0,58 ++++

Для устранения неспецифической аппотинации стафилококковые аитительные диагностикумы дополнительно обрабатывали нормальной кроличьей сывороткой, увеличивали концентрацию альбумина в диагностикуме, прогревали исследуемый материал при 100°С (10,60 мин.), 120°С (15 мин.). Эффективной оказалась термическая обработка материала. Необходимость прогревания исследуемого материала заставила рассмотреть влияние этого фактора на антигены возбудителя. Известно, что клетки А.р1еигорпешпошае содержат специфические термостабильные и - лабильные антигены (К.МШа1 е1 а1., 1987). Изучение этого вопроса показало, что по термостабильности антигенов культуры можно подразделить на группу термоустойчивых (сер.2, 3, 6, 8, 10) и термолабильных (сер.1, 7, штамм 202). У культур последней группы при кипячении (60 мин.) снижалась активность антигенов в серологических реакциях, особенно антигенов серовара 1 (шт.ССМ5869). Прогревание антигенов А.ркчгорпеитошае при 100°С в течении 10 минут на серологической активности антигенов возбудителя, кроме серовара 1 не сказывается.

Возможность выявления антигенов возбудителя в тканевом материале (лёгкие), при помощи РКА и РИФ первоначально изучали на морских свинках, белых мышах и свиньях, заражённых культурами А.р1еигорпеитошае, а также А.эшз и гемофильными бактериями «малой группы».

Результаты исследований показали совпадение данных бактериологии РИФ и РКА. Слабые положительные реакции были получены с тканевым материалом. содержащим А^шя.

При исследовании лёгочной ткани от 78 свиней с явлениями пневмонии из 29 материалов были выделены микоплазмы, из 15 -стафилококки или стрептококки, из 16 - Р.тиКос1с1а, из 2 - Р.тиНос1с1а и гемофильные бактерии «малой группы», из 7 - гемофильные бактерии «малой группы», из 9 - Б.сЬйепшия. При наличии в патологическом материале Р.тикошёа в двух случаях были получены позитивные результаты РКА с диагностикумом против штамма №202 («малая группа»), не подтверждённые данными бактериологии. В остальных случаях при исследовании материалов, содержащих указанные выше гетерологичные виды бактерий результаты РКА и РИФ были отрицательными. В девяти случаях изоляции культур «малой группы» данные бактериологических исследований, РКА и РИФ совпали.

Полученные данные позволяют оценить РКА и РИФ как достаточно специфические и чувствительные методы обнаружения антигенов А.р1еигорпештюшае. Преимуществом РКА является возможность исследования длительно хранившегося материала и выявления растворимых антигенов.

2.2. Разработка и испытание экспериментальных образцов инактиви-ровашгой вакцины против актинобациллёзной плевропневмонии свиней.

Возрастная заболеваемость свиней актинобациллёзной плевропневмонией диктует необходимость вакцинации просят-отьёмышей и проблема реакгоген-ности препарата актуальна. Исследование остаточной токсичности инактивиро-ванных цельноклеточных суспензий А.р1еигорпеитошае в тесте прироста массы мышей показало высокие её уровни. Из испытанных способов инактивации наиболее эффективным оказалась обработка формальдегидом (0,2%) с последующей выдержкой бактериальных взвесей при 4-6°С в течении 30-45 суток (табл.11). Различия сравниваемых показателей по этому препарату, а также инактивированных 0,1% формальдегида и тиомерсалом были достоверны, на уровне значимости от Р<0,01 - до Р<0,05 (в зависимости от сроков хранения). Полученные данные были учтены в технологии изготовления инактивированной эмульгированной вакцины. Испытание вакцины такого типа на 21,38 - 40-дневных поросятах и супоросных свиноматках показало её безвредность.

В качестве лабораторных моделей для испытания специфической активности инактивированной вакцины были испытаны морские свинки живой массой 200—250г и белые мыши живой массой 14-16г. Мышей вакцинировали подкожно, двукратно с интервалом 10 суток в дозе 0,2 10'°м.к. с последующим определением ЛД50 заражающей культуры на вакцинированных и контрольных животных («внутрибрюшшшая модель»). ЛД50 культуры, установленная на вакцинированных животных пятикратно превышала тот же показатель, полученный на контрольных животных.

Морских свинок вакцинировали однократно различными дозами вакцины с последующим интраназальном заражении гомологичной культурой в дозе МО'м.к. («лёгочная модель»). Подобный методический подход позволил определить ИМД50 вакцины. По нашему мнению, «лёгочная модель» предпочтительнее, поскольку этот метод соответствует естественным входным воротам возбудителя инфекции. С другой стороны, об эффективности иммунизации можно дополнительно судить по наличию поражений в лёгких, их массивности. Определённую информацию дают показатели серологического ответа - между объёмом поражённой лёгочной ткани и среднегрупповыми титрами антител (РСК) установлена функциональная обратная зависимость.

Исследовали влияние типа адыовапта на иммунологическую эффективность инактивированной вакцины. В качестве адъювантов использовали гидрат окиси алюминия и масляный адъювант на основе лёгкого минерального масла. Эмульгированной вакциной привили 315 поросят (полсектора) в неблагополучном по актинобациллёзной плевропневмонии хозяйстве, 317 свиней этого же

Табл. 11

Токсичность инактивированных бактериальных суспензий А.р1еигорпеитош'ае в зависимости от способа инактивации и длительности хранения.

Тип культуры № группы Способ инактивации Количество животных Токсичность препаратов в зависимости от длительности хранения при 4-6 (дни)

бактериаль- в группе 2 45 50

ных клеток Пало животных Разница средней исходной и конечной массы одного животного (г) Пало животных Разница средней исходной и конечной массы одного животного (г) Пало животных Разница средней исходной и конечной массы одного животного (г)

1 0,2% формальдегида 10 2 -0,9 1 -0,2 0 -0.2

Агаровая 2 0,1% формальдегида 10 3 -0,5 1 "0,3 1 -0,3

3 тиомерсал 1:5000 10 5 -1,7 4 -1,5 3 -1,3

4 0,2% формальдегида 10 3 -0,9 1 -0,6 0 -0,6

Бульонная 5 0,1% формальдегида 10 5 -1.7 3 -1,0 0 -0,7

6 тиомерсал 1:5000 10 7 -1,9 6 -1,1 2 -1,0

Контроль 7 - 10 - 0,7 - 0,5 - 1,2

Средний показатель по всем группам в зависимости от сроков хранения 60 4,17 -1,26 2,66 -0,78 1,00 -0,68

Средний показатель в зависимости от способа инактивации 0,2% формальдегида 0,1% формальдегида тиомерсал 1:5000 20 20 20 2,50 4,00 6,00 -0,90 -1,10 -1,80 1,00 2,00 5,00 -0,40 -0,62 -1,30 0,00 0,50 2,50 -0,40 -0,50 -1,15

сектора служили контролем. Гидроокись -алюминиевую вакцину ввели 647 поросятам, контролем служили 652 животных. Наблюдение за животными вели в течении 86 дней, заболевание свиней актинобациллёзнои плевропневмонией наблюдали во всех группах. Индекс и коэффициент эффективности эмульгированной вакцины в этом опыте составил соответственно 7,95 и 37/12%. Аналогичные показатели в группе свиней привитых ГОА вакциной были соответственно 3,12 и 67,98%, что свидетельствует о большей эффективности эмульгированной вакцины^табл.12).

При конструировании инакгивировшшой вакцины, исходя из полученных данных о накоплении в культуральной жидкости экзотоксина, гемолизина и кап-сулыюй субстанции, исследовали влияние растворимых антигенов бульонных культур на её иммуногенносгь. В опыте на мышах иммуногенность вакцины с включением в ее состав компонентов культуральной жидкости оказалась выше, чем вакцины на основе отмытых клеток. Следовательно, включение растворимых компонентов реакторных культур возбудителя в состав инактивированных вакцин необходимо. :

При отработке оптимальной схемы иммунизации свиней инактивирован-ной эмульгированной вакциной исследовали влияние кратности её введения на уровень иммунитета у свиней. В одном случае свиньям (8 голов) вводили Зсм3 вакцины однократно, в другом случае - дробно 1 и 2 см3 с интервалом 10 суток (8 голов). Свиней заразили через 20 дней после вакцинации интраназально в дозе 0,5-10'м.к. Установлено, что среди свиней, вакцинированных двукратно, летальных исходов не было. Из числа привитых однократно погибло 50% животных. Между животными этих групп также выявлена достоверная разница по высоте титров антител (РА). Исходя из полученных данных можно заключить, что результаты серологических реакций могут служить косвенным групповым показателем формирования иммунитета. • 1 ;

Исследовали влияние суммарной дозы антигена при двукратной (интервал - 15 суток) вакцинации свиней эмульгированной вакциной на состояние иммунитета. Установлено, что среди привитых различными дозами: вакцины свиней (16 голов) при контрольном интраназальном заражении 4-10'м.к. летальных исходов не было, в контроле погибло 50% животных. Среди животных, привитых вакциной в суммарных дозах 10,6,4 и 2 см3, объём поражённой лёгочной ткани в среднем по группам соответственно составил б,25±6,70, 5,94±8,01, 5,69±10,24, 10,50±8,57%. У контрольных свиней было поражено 25,1% лёгочной ткани. Различия в титрах комплемеотсвязывающих антител у вакцинированных животных перечисленных групп перед заражением были статистически не достоверны, также не достоверны различия по объёму поражённой лёгочной ткани. С учётом заболеваемости, количества летальных исходов й объёма поражённой лёгочной ткани мы считаем оптимальной дозу вакцины 4 см3 (4-1010), введённую'™ схеме 1+3 см3. ,

Табл.12

Иммунологическая эффективность формолгидроокисьалюминиевой и эмульгированной вакцин в условиях хозяйства, неблагополучного по актинобациллёзной плевропневмонии свиней

Тип вакцины Схема иммунизации Группы свиней Количество животных в группе Пало и вынуждено убито за период наблюдения (с момеита комплектации секторов на участке №3 до 106-дневного возраста)

всего в том числе с диагнозом актинобациллез ной плевропневмонии

количество в процентах к поголовью количество в процентах к поголовью

Змульги- двукратно, подкожно вакцинированные 315 18 3,71 7 2,22

рованная по 2 см 2 в возрасте 32 и 52 дня контрольные 317 61 19,24 56 17,66

Фор мол-гид роокись- двукратно, подкожно вакцинированные 647 103 15,91 21 3,24

алюминиевая по 2 см2 в возрасте 32 и 52 дня контрольные 652 145 22,23 66 10,12

Исследовали сроки формирования и длительность иммунитета у свиней, привитых однократно эмульгированной вакциной в дозе 5 см3 с контрольным интраназальным заражением через 10, 30 и 60 дней после иммунизации. Исходя из уровня защиты вакцинированных животных указанных групп и площади поражённой лёгочной ткани, близкие показатели состояния иммунитета имели свиньи через 10 и 30 дней со снижением к 60 дню после вакцинации. Между показателями защиты (%) и площади поражения лёгочной ткани выявлена обратная функциональная зависимость. Значительная заболеваемость свиней актинобациллёзной плевропневмонией в первый период откорма в неблагополучном хозяйстве, с учётом полученных данных, свидетельствует о необходимости ревакцинации свиней в период передачи на откорм.

Определение иммуногенности вакцины в опытах на белых мышах в процессе хранения при 4-6°С показало, что в интервале 1-11 месяцев ИМД50 препарата колебалась в пределах 109 И - 109,73 микробных клеток, что позволяет говорить о малом изменении активности препарата в указанные сроки.

С учётом результатов испытания различных типов инактивированных вакцин на лабораторных животных и свиньях была проведена апробация экспериментальных образцов вакцин против актинобациллёзной плевропневмонии свиней в производственных условиях.

Первоначально эмульгированная вакцина в сравнении с ГОА-вакциной

была испытана на безвредность и иммунологическую эффективность на ограниченном контингенте свиней различного возраста в хозяйстве, неблагополучном по актинобациллёзной плевропневмонии свиней. В последующем в этом же хозяйстве проводилась поголовная вакцинация животных по следующей схеме: внутримышечно свиноматкам за 20-25 дней до ожидаемого опороса в дозе 3 см3, аналогичную дозу вводили ремонтным свинкам, поросят вакцинировали в дозе 1 см3 в возрасте 35 - 40 дней и повторно в дозе 2 см3 в возрасте 45-50 дней. В период проведённых исследований вакцинации было подвергнуто 1677,4 тысячи свиней.

Исследования показали, что до начала вакцинации падёж свиней с диагнозом актинобациллёзной плевропневмонии составил 30,22% от общего количества павших животных, при частичной вакцинации поголовья -12,28%, при полной вакцинации - 8,89%. Между уровнем вакцинации и падёжом свиней от актинобациллёзной плевропневмонии установлена достаточно сильная обратная связь ( г= -0,71). Применение вакцины обеспечило снижение отхода свиней по причине актинобациллёзной плевропневмонии, в зависимости от анализируемого периода в 3 - 5 раз и увеличение живой массы поросят на 7,42 - 8,29 кг при передаче на откорм. Частота терапевтического вмешательства ветеринарного персонала в группах вакцинированных поросят была в 2,11 раза реже, чем среди не вакцинированных животных.

Выводы

1. Исследование таксономического положения эпизоотических штаммов НАД-зависимых бактерий, выделенных при пневмониях и генерализованных серозитах свиней методом нумерического анализа, позволило дифференцировать их по фенотипическим свойствам на кластеры, соответствующие видам Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis и таксону гемофильных бактерий «малая группа». Культуры кластера Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae имеют большее фенотипическое сходство с видами рода Actinobacillus (70%) и меньшее с представителями рода Haemophilus (63%). На уровне подобия 75% бактерий кластера «малая группа» выделяются в самостоятельный таксон.

2. Генетический анализ таксономического положения референтных и эпизоотических НАД-зависимых штаммов Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae и культур P.haemolytica - подобных бактерий (2-ой биовар A.pleuropneumoniae) показал, что они образуют генетическую общность с уровнем гомологии ДНК 70-98%. ДНК культур 2-го биовара и эпизоотических штаммов A.pleuropneumoniae имеют гомологию с ДНК A.suis - 33 - 38%, с ДНК H.parasuis и P.multocida - не более 9%, что свидетельствует о принадлежности эпизоотических и референтных штаммов к роду Actinobacillus, но не Haemophilus и Pasteurella. Референтный штамм J95 гемофильных бактерий таксона «С»

по результатам гибридизации ДНК к роду Haemophilus не относится.

3. Результаты изучения таксономического положения НАД—зависимых бактерий, выделенных при пневмониях и серозитах свиней, позволили определить в качестве основных дифференцирующих фенотипических признаков: НАД-зависимосгь, образование щелочной фосфатазы, уреазы, гемолизина, кислоты из ксилозы, машшта, манпозы. Для дифференциации культур НАД— независимого биовара A.pleuropneumoniae от сходных бактерий минимальный набор определяемых признаков включает продукцию индола, уреазы, утилизацию цитратов, наличие жгутиков. Для установления ферментативных свойств НАД-зависимых бактерий можно использовать дифференциально - диагностические среды в микрообъёмах и диагностический набор ПБДЭ Горьковского НИЭМ, что исключает использование чистого НАД или других его источников как факторов роста.

4. К A.pleuropneumoniae и H.parasuis чувствительны при внутрибрюшин-ном и интраназальном заражении морские спинки (живая масса 200-250 г) и белые мыши (живая масса 14-16 г), которые могут быть использованы для определения вирулентных свойств культур, изучения вопросов пато - и иммуногенеза при этих инфекциях.

5. Входными воротами возбудителя инфекции при гемофилёзном полисерозите являются органы дыхания. При экспериментальном (трахеальном) заражении свиней H.parasuis инкубационный период составляет 6-S часов. У заражённых свиней развивается катаральная пневмония и, в результате диссемина-ции возбудителя, генерализованные серозиты с одновременным поражением серозных оболочек грудной, брюшной полостей, пери - и эпикарда.

6. В естественных условиях H.parasuis вызывает у поросят-отьёмышей пневмонию, у части животных развивается септическая стадия с поражением серозных оболочек, суставов, головного мозга. У отдельных поросят встречается классическая форма болезни Глессера - генерализованные серозиты без макроскопически выраженной пневмонии. У экспериментально заражённых и естественно больных свиней наиболее часто удаётся изолировать H.parasuis из поражённых серозных оболочек.

7. Входными воротами возбудителя инфекции при актипобациллёзной плевропневмонии свиней являются органы дыхания. Инкубационный период при экспериментальном интраназальном заражении составляет 2-4 часа, контактном - до 3 суток, в естественных условиях - 2-8 суток. Диссеминация возбудителя в организме заражённых животных происходит на фоне имеющихся изменений в лёгких. Наиболее постоянно культуры возбудителя удаётся изолировать от экспериментально заражённых и естественно больных животных из поражённой ткани лёгких и регионарных лимфатических узлов.

8. Культуры A.pleuropneumoniae на начальной стадии логарифмического роста синтезируют термолабильные гемолизин и экзотоксин, которые опреде-

ляют повышенную вирулентность молодых (6-8- часовых) культур возбудителя и играют существенную роль в развитии патологических изменений в лёгких заражённых животных.

9. Макроскопически сходные изменения в лёгких свиней могут вызвать А.р1еиторпеитошае, гемофильные бактерии «малой группы» и А.эшэ , поэтому решающее значение в диагностике актинобациллёзной плевропневмонии имеют результаты бактериологического исследования.

10. При серологической идентификации эпизоотических культур Н.рагавшя установлено наличие сероваров А, В, С, Д, Бакоса, а также выявлены четыре серологические группы штаммов, не укладывающиеся в известную схему Бакоса, которая не охватывает всего антигенного многообразия вида.

11. Серологическая идентификация эпизоотических культур А.р1еиго-рпеигпошае, выделенных от свиней в хозяйствах Российской Федерации, выявила наличие сероваров 2, 3, 4, 6 и группы петипируемых штаммов. Исследования в РИГА сывороток крови свиней из различных хозяйств показало доминирование антител к сероварам 1, 2,4, 6,12.

12. На основании проведённых исследований разработана и используется в практике схема лабораторной диагностики актинобациллёзной (гемофилёзной) плевропневмонии и гемофидёзного полисерозита свиней, включающая: правила взятия материала для бактериологического исследования, методы выделения и идентификации культур возбудителя по биологическим свойствам. Также разработаны и рекомендованы методы видовой и серовариантной идентификации культур А.р1еигорпеитошае и обнаружения антигенов этого вида бактерий в патологическом материале при помощи реакции коагглютинации.

; 13. Разработана и предложена технология изготовления, контроля и использования вакцины против гемофилёзной (актинобациллёзной) плевропневмонии свиней, что нашло отражение в соответствующих нормативных документах: «Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против гемофилёзной плевропневмонии свиней», «Вакцина против гемофилёзной плевропневмонии свиней эмульгированная. Технические условия ТУ 10-09-53-90», «Наставление по применению вакцины против гемофилёзной плевропневмонии свиней эмульгированной», утверждённых ГУВ ГК Совмина СССР по продовольствию и закупкам 11.07,1990г.

14. Инактивированные вакцины из клеток А.р1еигорпешпошае обладают значительной остаточной токсичностью. Эффективное снижение токсичности . готовых препаратов достигается инактивацией бактериальных суспензий 0,2% формальдегида с последующим выдерживанием до употребления при 4-6°С в течение 45 суток.

15. В качестве лабораторных моделей при оценке иммуногенности инакти-вировашшх акгинобациллёзных вакцин мигуг быть использованы белые мыши - подкожная двукратная иммунизация с последующим внутрибрюшинном зара-

жением различными дозами вирулентной культуры, или морские свинки в варианте подкожной вакцинации с последующим интраназальном заражением.

16. Максимальной иммуногенностью для свиней обладают инакгивиро-ванные эмульгированные вакцины из клеток А.р1еигорпеитошае с включением в их состав растворимых антигенов, накапливающихся в реакторных культурах в процессе роста.

17. В опытах прямого заражения и при испытании эффективности иммунизации в условиях неблагополучного хозяйства установлено, что разработанная инактивированная вакцина не защищает полностью иммунизированных свиней от заражения, но обеспечивает более лёгкое течение болезни, в частности снижается отход в 3-5 раз, частота терапевтического вмешательства снижается в 2,11 раза, увеличивается живая масса поросят при передаче на откорм на 7,42 -8,29 кг, что позволяет рассматривать вакцинацию как экономически целесообразный составной компонент комплекса лечебно-профилактических мероприятий по борьбе с актинобациллёзной плевропневмонией свиней.

Практические предложения.

1. Временные методические указания по лабораторной диагностике гемо-филёзного полисерозита поросят. Рекомендованы МСХ СССР 17.01.1978г. № 116-18.

2. Временные методические указания по лабораторной диагностике гемо-филёзной плевропневмонии свиней. Утверждены ГУВ МСХ СССР 16.04.1981г.

3. Методические указания по диагностике гемофилёзов свиней. Утверждены ГУВ МСХ СССР 2.11.1985г. № 115-6а.

4. Методические указания на изготовление и применение коагглютини-рующего антительного диагностикума для экспресс - идентификации Гемофи-люс плевропневмоние и индикации возбудителя в патологическом материале. Утверждены отделением ветеринарии РАСХН 16.02.1993г.

5. Временная инструкция о мероприятиях по борьбе с гемофилёзами свиней. Утверждена ГУВ МСХ СССР 2.11.1985г. № 115-6а.

6. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против гемофилёзной плевропневмонии свиней. Утверждена ГУВ МСХ СССР 11.07.1990г.

7. Вакцина против гемофилёзной плевропневмонии свиней эмульгированная. Технические условия ТУ 10-09-53-90. Утверждены ГУВ МСХ СССР 11.07.1990г.

8. Наставление по применению вакцины против гемофилёзной плевропневмонии свиней. Утверждено ГУВ МСХ СССР 11.07.1990г.

Список опубликованных работ.

1. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Тарасенок Н.И. и др. - Инфекционный полисерозит поросят // Свиноводство, 1976 №11,35-36.

2. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Гумбатов Ю.К. - Патогенность возбудителя гемофилёзного полисерозита для лабораторных животных и поросят // Труды ВИЭВ, 1977, Т.45,50-54.

3. Скородумов Д.И., Гумбатов Ю.К. - Выделение возбудителя гемофилёзного полисерозита и изучение некоторых его свойств // Бюл. ВИЭВ, 1977, вып.21,14-17.

4. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Гумбатов Ю.К. - Роль бактерий рода Гемофилюс в инфекционной патологии животных // Ветеринария, 1978, №5,102108.

5. Временные методические указания по лабораторной диагностике гемофилёзного полисерозита свиней (ГУВ МСХ СССР. 17.10.1978) / Сидоров МЛ., Скородумов Д.И.

6. Шубин В.А., Сидоров М.А., Андрыишин..., Скородумов Д.И. - Патомор-фологическис изменения у больных полисерозитом поросят // Труды ВИЭВ, 1978, т.47,135-141.

7. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Шубин В.А., Тарасенок Н.И., Гумбатов Ю.М. - Экспериментальный гемофилёзный полисерозит поросят // Труды ВИЭВ, 1979, т.49,90-95.

8. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Тарасенок Н.И., Гумбатов Ю.К. - Им-муиогенпость вакцины против гемофилёзного полисерозита поросят // Доклады ВАСХНИЛ, 1980, №8,30.

9. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Гумбатов Ю.К., Тарасенок Н.И. - Серологические варианты гемофильных бактерий выделенных от свиней // Ветеринария, 1980, №4,66-67.

10. Скородумов Д.И., Сидоров М.А. - Характеристика гемолитических гемофильных бактерий выделенных от больных пневмонией свиней // Труды ВИЭВ, 1980, т.52.,13-18.

11. Шубин В.А., Сидоров М.А., Скородумов Д.И. - Динамика изменений в лёгких поросят при экспериментальном инфекционном полисерозите // Сборник «Патоморфология, патогенез и диагностика болезней с\х животных». Научные труды ВАСХНИЛ, Москва.1980,128-131.

12. Сидоров М.А.. Скородумов Д.И. - Свойства Гемофилюс плевропневмо-ние выделенных от больных свиней // Ветеринария, 1981, №1,45-47.

13. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Лаврентьев Н.И., Мицаев Ш.Ш., Романова ЛЯ., Юдин А.И. - Диагностика гемофилёзной плевропневмонии свиней //Ветеринария, 1981, №12,66-68.

14. Временные методические указания по лабораторной диагностике гемофилёзной плевропневмонии свиней (ГУВ МСХ СССР.1981 / Сидоров М.А., Скородумов Д.И.).

15. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Палов B.C., Гущин В.Н., Седов В.А. -Вакцина против гемофилёзной плевропневмонии свиней, способ её изготовле-

ния и способ профилактики гемофилёзиой плевропневмонии свиней. Авт. свидетельство на изобретение № 907899 от 21.10.81г.

16. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Тарасенок Н.И., Шубин В.А. - Способ приготовления вакцины против гемофилёзного полисерозита поросят. Авт. свидетельство на изобретение № 957472 от 07.05.1982г.

П.Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Гущин В.А. - Не допускайте заболевания свиней гемофилёзами // Газета - плакат МСХ СССР, Москва, Колос, 1982, №7.

18.Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Лаврентьев Н.И. - Специфическая профилактика гемофилёзиой плевропневмонии свиней // Сборник «Ветеринарные проблемы в промышленном свиноводстве», Киев, 1983, 97-98.

19. Лаврентьев Н.И., Скородумов Д.И., Романова Л.Я., Финенко Р.Ф. -Применение РА в диагностике гемофилёзиой плевропневмонии свиней // Сборник научных трудов «Инфекционные болезни с\х животных», Омск, 1983.

20. Скородумов Д.И., Гумбатов Ю.К., - Потребность бактерий рода Гемо-филюс в ростовых факторах. // Бюллетень ВИЭВ, 1983, вып.45, 6-9.

21.Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Лаврентьев Н.И. - Гемофилёзная плевропневмонии свиней // Свиноводство, 1984, №4,14-15.

22. Временная инструкция о мероприятиях но борьбе с заболеваниями свиней гемофилёзами (ГУВ МСХ СССР 2.11.1985) / Сидоров М.А., Скородумов Д.И.

23. Методические указания по диагностике гемофилёзов свиней (ГУВ МСХ СССР 2.11.1985) / Сидоров М.А., Скородумов Д.И.

24. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Логинов И.А., Лаврентьев Н.И. - Профилактика гемофилёзиой плевропневмонии свиней // Ветеринария, 1985, №12, 37-38.

25. Шубин В.А., Татришвили И.П., Сидоров М.А., Скородумов Д.И. - Па-томорфологические изменения при гемофилёзиой плевропневмонии поросят // Ветеринария, 1985, № 11, 40-43.

26. Сидоров М.А., Скородумов Д.И. - Гемофилёзы животных. Агропромиз-дат.М.1986, 173 стр.

27. Сидоров М.А., Мицаев Ш.Ш., Скородумов Д.И. - Патогепность H.pleuropneumoniae для животных // Ветеринария, 1989, № 11, 39-41.

28. Вакцина против гемофилёзиой плевропневмонии свиней эмульгированная. Технические условия ТУ 10-09059-90 (ГУВ МСХ СССР 11.07.1990) / Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Логинов И.А., Субботин В.В., Мохина Т.Н.

29. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против гемофилёзиой плевропневмонии свиней эмульгированной (ГУВ МСХ СССР 11.07.1990) / Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Логинов И.А., Субботин В.В.

30. Наставление по применению вакцины против гемофилёзиой плевропневмонии свиней эмульгированной (ГУВ МСХ СССР, 11.07.1990) / Сидоров

М.А.. Скородумов Д.И., Логинов И.А. Субботин В.В.

31. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Столяренко В.Т., Субботин В,В- -Специфическая профилактика гемофилёзного полисерозита поросят // ВАСХНИЛ, НТЦ. Научно-технической информационный сборник. Москва, 1991, вып.9.

32. Сидоров М.А., Лаврентьев Н.И., Субботин В.В., Логинов И.А., Скородумов Д.И. - Эффективность вакцинации против гемофилёзной плевропневмонии свиней// Ветеринария, 1991, №4,25-27.

33. Скородумов Д.И., Бурлаков В.А., Костенко Т.С. - Таксономия бактерий семейства Раз1еигеЦасеае И Методические указания. Москва, 1991.

34. Скородумов Д.И., Сидоров М.А., Пруссак-Глотов В.Э. - Возбудители фибринозно-геморрагической плевропневмонии свиней // Ветеринария, 1992, №6,21-24.

35. Фомин Б.А., Коромыслов Г.Ф., Артюшин С.К., Скородумов Д.И., Сидоров М.А. - Гомология ДНК Н.р1еигорпеитошае и некоторых видов бактерий семейства РазгеигеПасгас // Ветеринария, 1992, № 6,28-30.

36. Скородумов Д.И., Сидоров М.А., Блему Ж. - Методические указания на изготовление и применение коагглютинирующего диагностикума для экспресс -идентификации Гемофшпос плевропневмонии и индикации возбудителя в патологическом материале // Отделение ветеринарии РАСХН. 13.02.1993.

37. Скородумов Д.И. - Свойства гемолизинов возбудителя актипобациллёз-ной плевропневмонии свиней // Сборник научных трудов «Актуальные вопросы инфекционных и инвазионных болезней животных». Москва, 1995, 50-52.

38. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б. - Определитель зоопато-генных бактерий (справочная книга) М., Колос, 1995, 315 стр.

39. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Блему Ж. - Применение реакции ко-агглютинации для идентификации возбудителя актинобациллёзной плевропневмонии свиней // Материалы Всероссийской научной конференции «Инфекционные болезни молодняка с/х животных». М., 1996,47-49.

40. Скородумов Д.И., - Критерии дифференциации гемофильных бактерий патогенных для свиней // Сборник научных трудов «Актуальные вопросы инфекционных и инвазионных болезней животных», Москва, 1996, 106-109.

41. Скородумов Д.И. - Патогенные свойства культур возбудителя гемофилёзной плевропневмонии свиней // Сборник научных трудов «Актуальные вопросы инфекционных и инвазионных болезней животных», Москва, 1996, 104106.