Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Получение антигенов Actinobacillus pleuropneumoniae для инактивированных вакцин

п

оо

I

На правах рукописи

ФРОЛОВЦЕВА Анна Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕНОВ АСТШОВАСНХиЗ РЬЕ1ЛЮР№11МОМАЕ ДЛЯ ИНАКТИВИРОВАННЫХ ВАКЦИН

16.00.03 Ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией

и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2008

003168344

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный

центр охраны здоровья животных», г Владимир Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор Русалеев Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор ветеринарных наук, профессор Михалишин Валерий Васильевич, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г Владимир,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Селянинов Юрий Олегович, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» (ГНУ «ВНИИВВиМ», г Покров)

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский технологический институт биологической промышленности» (ГНУ «ВНИТИБП», г Щелково)

Защита диссертации состоится « » мая 2008г в 10 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220 015 01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу 600901, г Владимир, мкр Юрьевец, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат разослан « » апреля 2008г

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

ГМ Семенова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы В последние годы все больший интерес ветеринарных врачей вызывает актинобациллезная плевропневмония свиней Обусловлено это, с одной стороны, скудностью информации о данном заболевании, а с другой, практическим отсутствием средств и методов ее диагностики и специфической профилактики (Б Г Орлянкин и соавт , 2005, В С Русалеев и соавт, 2004)

Возбудитель актинобациллезной плевропневмонии свиней является первичным патогеном, вызывающим пневмонии у свиней (Б Г Орлянкин и соавт, 2005)

Актинобациллезная плевропневмония - инфекционное контагиозное заболевание свиней, характеризующееся септикотоксемией, геморрагической и гнойно-некротизирующей пневмонией, а также серозно-фибринозным плевритом, перикардитом и артритами (М А Сидоров и соавт, 1978, 1986, М F Aarestrup et al, 1999, С В Gutierrez et al, 1995, TN К Sebunya et al, 1983, J В Wards et al, 1998)

Возбудителем болезни являются бактерии семейства Pasteurellaceae, рода Actinobacillus, вида Actinobacillus pleuropneumomae (S Pohl et al, 1983)

Актинобациллезная плевропневмония свиней была впервые зарегистрирована в свиноводческих хозяйствах Великобритании, США, Швейцарии и Аргентины в 1957-1964 гг, а возбудитель болезни был выделен в 1963 году (Р R J Matthew et al, 1961, IH Pattison et al, 1957) В последующие десятилетия это заболевание было установлено в большинстве стран мира с развитым свиноводством (G Cristensen, 1981, С Pijoan, 1982, S Е Sanford et al, 1981)

Экономический ущерб от этой инфекции складывается из затрат от падежа и вынужденного убоя, снижения продуктивности животных, качества получаемой продукции, затрат, связанных с проведением профилактических и оздоровительных мероприятий Ежегодно страны Евросоюза тратят один

миллиард евро на проведение лечебно-профилактических мероприятий в борьбе с данным заболеванием (Т N К Sebunya et al, 1983, D J Taylor, 1999)

В настоящее время актинобациллезная плевропневмония свиней широко распространена в Канаде, США, Франции, Великобритании, Италии, Дании, Финляндии, Голландии, Японии, Греции, Австралии, а также в странах Южной Африки (G Cnstensen, 1981, A Hensel et al, 1995, С Pijoan, 1982, S E Sanford et al, 1981)

Актинобациллезная плевропневмония может встречаться в ассоциации с вирусными (РРСС, парвовирусная болезнь свиней и др ) и бактериальными (гемофилезный полисерозит, легочной пастереллез, сальмонеллез и др ) болезнями (J M A Pol et al, 1997, Т A Marsteller et al, 1999)

Заболеваемость свиней в стаде при актинобациллезной плевропневмонии может достигать от 15 до 90%, а летальность 40% в зависимости от формы течения болезни (R Nielsen, 1986)

Для специфической профилактики данного заболевания во многих странах мира разработаны и используются различные вакцинные препараты (С -W Liao et al, 2003)

В России возбудитель актинобациллезной плевропневмонии свиней впервые был выделен MA Сидоровым и ДИ Скородумовым в 1977 г (MA Сидоров и соавт, 1978, 1986) В настоящее время болезнь регистрируется в различных регионах страны Данная ситуация связана с множеством причин, одна из которых - недостаточный контроль за перемещением животных внутри страны и импорт свинопоголовья из-за рубежа, и это при том условии, что среди свиней возможно длительное бактерионосительство после переболевания

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что актинобацилезная плевропневмония свиней является одной из актуальных проблем ветеринарии

Цель и задачи исследований Целью данных исследований было выделение, идентификация и изучение основных биологических свойств изолятов A pleurорпеитотае, а также оценка возможности их использования для приготовления вакцин

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- выделить возбудителя болезни из патологического материала в хозяйствах, неблагополучных по актинобациллезной плевропневмонии свиней и провести его идентификацию,

- изучить биологические свойства полевых изолятов A pleuropneumomae,

определить серовариантную принадлежность изолятов A pleuropneumomae по капсульному антигену,

- определить способы и сроки хранения возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней в лабораторных условиях,

- подобрать питательную среду для культивирования бактерий A pleuropneumomae,

изучить динамику инактивации бактерий A pleuropneumomae формальдегидом, аминоэтилэтиленимином и бета-пропиолактоном,

изучить иммунобиологические свойства опытных образцов инактивированных вакцин против актинобациллезной плевропневмонии свиней

Научная новизна исследований Научная новизна работы состоит в том, что в результате проведенных исследований

выделены и идентифицированы полевые изоляты бактерий A pleuropneumomae,

- изучены биологические свойства изолятов A pleuropneumomae,

определена серовариантная принадлежность изолятов A pleuropneumomae по капсульному антигену,

- изучены способы и определены сроки хранения возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней,

подобрана питательная среда для культивирования бактерий A pleuropneumomae,

- изучена инактивация возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней с использованием формальдегида, аминоэтилэтиленимина и бета-пропиолактона,

- изучены иммунобиологические свойства опытных образцов инактивированных вакцин против актинобациллезной плевропневмонии

Практическая значимость исследований. Результаты исследований использованы при разработке следующих нормативных документов

- "Методические рекомендации по идентификации изолятов Actinobacillus pleuropneumomaé" (2007г ),

- "Методические рекомендации по серологическому типированию бактерий Actinobacillus pleuropneumomae в реакции преципитации в агаровом геле" (2007г ),

- "Методические рекомендации по хранению штаммов Actinobacillus pleuropneumomae" (2007г ),

- "Методические рекомендации по инактивации бактерий Actinobacillus pleuropneumomae формальдегидом" (2007г) Вышеперечисленные документы одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Материалы исследований использованы при оформлении паспортов на штаммы A pleuropneumomae "Ш-1", "К-2" и разработке НД на "Вакцину против актинобациллезной плевропневмонии свиней полиштаммовую инактивированную эмульсионную"

Основные положения, выносимые на защиту.

результаты выделения и идентификации полевых изолятов A pleuropneumomae,

- биологические свойства полевых изолятов A pleuropneumoniae,

- результаты серологического типирования изолятов A pleuropneumomae по капсульному антигену,

- способы сохранения возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней в лабораторных условиях,

- питательная среда для культивирования бактерий A pleuropneumomae,

- результаты инактивации бактерий A pleuropneumomae формальдегидом, аминоэтилэтиленимином и бета-пропиолактоном,

- иммунобиологические свойства опытных образцов инактивированных вакцин против актинобациллезной плевропневмонии в опытах на лабораторных животных и свиньях

Апробация результатов работы Материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах XV Московского международного ветеринарного конгресса по болезням мелких домашних животных (проблемы инфекционной патологии свиней, Москва, 2007г), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 20042007 гг

Публикация научных исследований По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в том числе одна работа в издании, рекомендованном ВАК РФ

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 листах компьютерного текста и включает следующие разделы введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который состоит из 203 источников, в том числе 64 работы отечественных авторов Работа иллюстрирована 19 таблицами и 16 рисунками В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Штаммы и изоляты микроорганизмов. В экспериментальной работе использовали референтные штаммы бактерий, полученные из Американской коллекции типовых культур (АТСС) Actmabacillus pleuropneumomae № 27088 (серовар 1), № 27089 (серовар 2), № 27090 (серовар 3), № 33377 (серовар 5), № 33590 (серовар 6), Staphylococcus aureus № 29213 и изоляты бактерий Actinobacillus pleuropneumomae "Ш-1", "К-2" и "К-1", выделенные из патологического материала от свиней в лаборатории микробиологии ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Подопытные животные В опытах использовали следующие виды и возрастные группы животных

- белые мыши, массой 16-18 г, для определения патогенных свойств и вирулентности возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней,

- морские свинки, массой 250-300 г , для определения патогенных свойств возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней,

- кролики, массой 2,5-3,0 кг, для оценки антигенных свойств опытных образцов инактивированных вакцин и получения специфических сывороток крови,

- поросята 30-35 дневного возраста, массой 7-8 кг, для оценки патогенных свойств A pleiiropneumomae,

- поросята 35-50 дневного возраста, массой 10-12 кг, для изучения антигенных и иммуногенных свойств опытных образцов инактивированных моновакцин

Питательные среды. Для культивирования бактерий A pleuropnenmomae использовали питательные среды бульон на основе триптического гидролизата мяса по Хоттингеру (ТГХ) с концентрацией аминного азота 125 мг% (ТГХ 1) и 250 мг% (ТГХ 2), бульон на основе панкреатического гидролизата казеина (ПГК) "Bacto Tryptone" фирмы "Difco", бульон на основе триптического гидролизата казеина (ТГК) "Tryptone-D" фирмы "Himedia", соево-казеиновый бульон (СКБ) на основе энзиматического гидролизата казеина и сои фирмы "Himedia", мясо-пептонный агар

В питательные среды для выращивания бактерий A pleitropneumomae вносили ростовые факторы в качестве V-фактора роста добавляли НАД х/ч (1% приготовленного 0,1%-го раствора) фирмы "AppliChem" или 10% дрожжевого экстракта (ДЭ), в качестве Х-фактора роста добавляли гемин х/ч (1% приготовленного 0,1%-го раствора) фирмы "Serva" или 10% эритроцитов крови лошади

В питательные среды также вносили сыворотку крови крупного рогатого скота (5% от объема среды) и 40%-й раствор глюкозы (0,3% от объема среды)

При хранении штаммов и изолятов в лиофилизированном состоянии использовали специальные среды

1 Сахарозо-желатозная среда (СЖС), содержащая 1,5-2% желатозы, 12% сахарозы, 17,5 г/лЫаС1,1,4 г/л№2НР04, 1,4 г/л К'аН2Р04

2 Среда на основе бактоказетона, содержащая 2% "Вайо ТгурЮпе" фирмы 'ЧМсо", 12% сахарозы, 1% глютамина, 17,5 г/л КаС1, 1,4 г/л Ма2НР04, 1,4 г/л ЫаН2Р04

Отбор проб патологического материала для бактериологического исследования на актинобациллезную плевропневмонию свиней.

Патологический материал для бактериологического исследования отбирали от вынужденно убитых и павших свиней, не подвергавшихся антибиотикотерапии Для бактериологического исследования отбирали пробы паренхиматозных органов - легкие на границе здоровой и пораженной ткани, селезенку, печень, средостенные и бронхиальные лимфатические узлы, миндалины, а также экссудат из перикардиальной, плевральной, перитонеальной полостей, кровь из сердца, слизь носовой полости и трахеи

Методы изучения биологических свойств микроорганизмов. Культурально-морфологические свойства бактерий изучали при выращивании на жидких, полужидких и плотных питательных средах с добавлением и без добавления факторов роста При культивировании бактерий в жидких и полужидких питательных средах отмечали интенсивность помутнения, образование и характер осадка При посеве микроорганизмов на плотные прозрачные питательные среды методом Дригальского отмечали время образования колоний, определяли форму, размер, поверхность, цвет, блеск и прозрачность, консистенцию и край колонии Гемолитические свойства бактерий определяли при посеве на кровяной агар с 10% дрожжевого экстракта

Степень диссоциации бактериальных культур исследовали пробой кипячения по Бернгофу Для изучения тинкториапьных свойств микроорганизмов из агаровых и бульонных культур готовили мазки и окрашивали по Граму Для выявления у бактерий капсулы, препараты

окрашивали по методу Бурри-Гинса Биохимические свойства определяли с использованием систем индикаторных бумажных для идентификации микроорганизмов и сред Гисса

Чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам определяли в соответствии с "Методическими указаниями по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных» (Б И Антонов, 1986)

Патогенные свойства актинобацилл изучали на свиньях и лабораторных животных

Определение концентрации микробных клеток. Концентрацию микробных клеток в бактериальных суспензиях определяли визуально по стандарту (эталону) мутности Концентрацию живых микробных клеток определяли методом титрования на плотной питательной среде и выражали в колониеобразующих единицах

Получение бактериальных антигенов, нормальных и специфических сывороток крови лабораторных животных. Капсульный антиген для постановки реакции преципитации (РП) и реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), а также для гипериммунизации кроликов получали по методике R Nielsen, Р J OConnor (1984) и R Nielsen и сотрудников (1997) Гипериммунные сыворотки крови кроликов готов или по методике R Nielsen и сотрудников (1997)

Определение серовариантной принадлежности изолятов бактерий А pleuropneumomae Для изучения серовариантной принадлежности выделенных изолятов А pleuropneumomae использовали РП в агаровом геле и РИГА

Хранение бактерий в лабораторных условиях. Хранение штаммов актинобацилл в лабораторных условиях осуществляли путем замораживания при температуре минус 40°С, лиофильного высушивания культур, методом субкультивирования на плотных, жидких и полужидких питательных средах В процессе хранения проводили количественную оценку выживаемости бактерий

Культивирование микроорганизмов. Подбор оптимальной питательной

среды для получения бактериальной массы А ркигорпеитотае осуществляли

методом периодического глубинного культивирования возбудителя в аппарате

"Фермус" В качестве расплодочного материала при глубинном периодическом

культивировании использовали бульонные суспензии микроорганизмов, взятые

в конце экспоненциальной - начале стационарной фазы роста, которые получали

в конических колбах на УВМТ-12-250 Определение оптимальных

концентраций ДЭ, гемина и сыворотки крови КРС в питательной среде

проводили в конических колбах на УВМТ-12-250

При изучении динамики роста, графически описывали кривые изменения

концентрации микробных клеток в процессе культивирования, а также

определяли фазы роста микроорганизмов и их продолжительность При

определении основных параметров роста микроорганизмов учитывали

удельную скорость роста, время удвоения концентрации живых микробных

клеток, максимальное накопление возбудителя в питательной среде, время

культивирования бактерий

Расчет показателя удельной скорости роста микроорганизмов (р, ч"1)

производили по формуле (С Дж Перт, 1978) ц= 2,3 (1« X, /1« Х0)Л, где

ц - удельная скорость роста микроорганизмов (ч'1),

Х0 и X, — начальная и конечная концентрация микробных клеток,

I - время культивирования микроорганизмов (ч)

Расчет времени удвоения концентрации микробных клеток ч) осуществляли по формуле (С Дж Перт, 1978) 1(1=1п2/ц, где ц - удельная скорость роста микроорганизмов (ч ')

Инактивация микроорганизмов Инактивацию бактерий А р1еигорпеитотае проводили с использованием формальдегида, аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ), бета-пропиолактона При инактивации АЭЭИ учитывали процентное содержание активнодействующего вещества (а д в) в водном растворе Инактивацию бактерий проводили в культуральной среде в конических колбах емкостью 250 мл при 37°С в режиме постоянного перемешивания со скоростью 60 об/мин

Для характеристики кинетических закономерностей гибели микроорганизмов производили расчет постоянной (константы) скорости инактивации (к) по формуле экспоненты (Д Мейнелл, Э Мейнелл, 1967) Xi / Х„= е1', где

к- константа скорости инактивации (ч'1), t - время инактивации (ч),

Х0- исходная концентрация живых микробных клеток (lg КОЕ/см3), Xi - остаточное количество живых микробных клеток (lg КОЕ/см3)

Полноту инактивации бактериальных суспензий проверяли высевом на

плотные питательные среды Посевы инкубировали при 37°С в течение 24-48

часов Результаты полноты инактивации оценивали по отсутствию роста

бактерий на чашках Петри с агаром

Приготовление опытных образцов инактивированных вакцин. Для

приготовления опытных образцов инактивированных эмульсионных вакцин

против актинобациллезной плевропневмонии свиней использовали очищенные

и концентрированные антигены в фосфатно-буферном растворе, а также

масляный адъювант "Montanide ISA-70" Образцы моновакцин с типом

эмульсии вода-масло готовили в соотношении 30 частей антигена и 70 частей

адъюванта Процесс эмульгирования при изготовлении опытных образцов

вакцины осуществляли на размельчителе тканей РТ-2 в течение 6 мин

Изучение антигенных свойств опытных образцов вакцин. Антигенные

свойства инактивированных эмульсионных моновакцин оценивали по уровню

антител в крови вакцинированных животных Опытными образцами

моновакцин иммунизировали кроликов и поросят У животных до вакцинации, а

также после вакцинации отбирали кровь для исследования сывороток в реакции

агглютинации Титр специфических антител выражали в логарифмах по

основанию два (log2)

Оценка нммуногенностн опытных образцов вакцин. Иммуногенные

свойства инактивированных эмульсионных моновакцин изучали в опытах на

поросятах методом контрольного заражения Животных иммунизировали

однократно внутримышечно в области шеи опытными образцами вакцин Через

21 сутки после вакцинации всех иммунизированных и контрольных животных заражали интраназально минимальной летальной дозой штамма А р1еигорпеитотае За животными наблюдали в течение 10 суток после заражения

Статистическая обработка результатов. При анализе и обработке результатов исследований были использованы статистические методы, описанные ИП Ашмариным, А А Воробьевым (1962), НА Плохинским (1970), Н Бейли (1962)

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Выделение и идентификация возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней Первым этапом нашей работы было исследование патологического материала от свиней, поступавшего из хозяйств различных регионов Российской Федерации, с целью выделения возбудителя актинобациллезной плевропневмонии

За период с 2004 по 2007 гг исследовано 316 проб патологического материала от свиней в возрасте от 12-20 суток до 4-5,5 месяцев из хозяйств Костромской, Белгородской, Московской, Самарской, Ярославской, Владимирской, Вологодской, Нижегородской, Калужской областей, Краснодарского края и Республик Коми, Мордовия, Татарстан

При бактериологическом исследовании возбудитель был выделен от свиней в свиноводческих комплексах ЗАО «Шувалово» Костромской области и «Кузнецовский» Московской области, а также в крестьянско-фермерском хозяйстве Попова Г С Калужской области

В данных хозяйствах регистрировали клиническое проявление актинобациллезной плевропневмонии и наличие характерных для болезни патологоанатомических изменений при вскрытии у поросят-отьемышей, а также у поросят в группах откорма У больных животных наблюдали различные формы течения актинобациллезной плевропневмонии с выраженным симптомокомплексом пневмонии и плеврита При патологоанатомическом вскрытии обнаруживали, в зависимости от стадии болезни, геморрагическую,

фибринозно-геморрагическую или гнойно-некротическую пневмонию, геморрагический лимфаденит средостенных и бронхиальных лимфатических узлов, экссудат темно-вишневого цвета в грудной полости, отложения фибрина на поверхности реберной и костальной плевры

Из проб органов и экссудата проводили посевы на сывороточно-дрожжевой агар с 1% гемина, 10% экстракта эритроцитов лошади и бацитрацином Чашки с посевами инкубировали при 37°С в течение 12-18 ч Возбудитель болезни формировал на данной питательной среде мелкие (0,5-2,0 мм) полупрозрачные матовые колонии с ровными краями, выпуклым центром и слизистой консистенции Из характерных для А ркигорпеитотае колоний делали мазки, которые окрашивали по Граму При микроскопии мазков обнаруживали грамотрицательные мелкие короткие палочки, коккобактерии и овоиды

Для идентификации актинобацилл определяли культуральные свойства путем пересева на плотные питательные среды На мясо-пептонном агаре с 10% дрожжевого экстракта А ркигорпеитотае росли в виде мелких, выпуклых, круглых, с ровными краями и слизистой консистенции колоний диаметром 0,51,5 мм На кровяном агаре с 10% дрожжевого экстракта наблюдался рост мелких полупрозрачных колоний диаметром 0,2-1,5 мм с ровными краями окруженных прозрачной зоной (3-гемолиза При посеве на мясо-пептонный агар и мясо-пептонный агар с 1% гемина рост бактерий А ркигорпеитотае отсутствовал

Бактерии, нуждающиеся для роста в У-факторе и обладающие р-гемолитической активностью идентифицировали как А ркигорпеитотае

При бактериологическом исследовании проб патологического материала от больных поросят, проведенном в ФГУ «ВНИИЗЖ» были выделены изоляты А ркигорпеитотае "Ш-1", "К-1" и "К-2"

Изучение биологических свойств изолятов А ркигорпеитотае. Культурально-морфологические свойства На плотных питательных средах с добавлением ДЭ, НАД через 12-18 ч культивирования при температуре 37°С актинобациллы формировали мелкие, полупрозрачные, округлой формы с

ровными краями и вязкой консистенции колонии в S-форме диаметром 0,2-1,0 мм ("Ш-1" и "К-2"), 0,2-1,5 мм ("К-1")

При использовании культуры штамма S aureus (в качестве баккормилки) на глюкозо-сывороточном агаре наблюдали феномен сателлитного роста бактерий A pleuropneumomae в виде полупрозрачных, круглых, с ровными краями и слизистой консистенции колоний от 0,1 до 0,5 мм в диаметре расположенных в зоне 0,5-1,0 см от баккормилки

При культивировании актинобацилл в жидких питательных средах с ДЭ рост бактерий наблюдали в виде равномерного помутнения среды с образованием белого осадка на дне, который легко разбивался при встряхивании На полужидком агаре с ДЭ рост A pleuropneumomae отмечали по всей длине укола в виде серо-белого стержня Культуры A pleuropneumomae были неподвижны

На средах, не содержащих V-фактор роста, равно как и на средах, содержащих только Х-фактор, рост изолятов A pleuropneumomae отсутствовал

При микроскопии мазков, приготовленных из агаровых и бульонных культур, окрашенных по Граму, возбудитель представлял собой грамотрицательные, мелкие короткие палочки, коккобактерии и овоиды, расположенные одиночно Клетки актинобацилл имели капсулу, которую выявляли при окраске мазков по Бурри-Гинсу

Биохимические свойства A pleuropneumomae. При изучении биохимических свойств A pleuropneumomae было отмечено, что все они обладали оксидазной, уреазной и бета-галактозидазной активностью, не продуцировали индол и сероводород, не утилизировали цитраты Бактерии A pleuropneumomae ферментировали сахарозу, маннозу, фруктозу с образованием кислоты без газа, были неактивны в отношении лизина, орнитина и аргинина, не ферментировали сорбит и инозит

Антибиотикочувствительность A pleuropneumomae. Исследуемые изоляты актинобацилл оказались чувствительными к большому спектру антибиотиков Выраженным антибактериальным действием на

А ркигорпеитотае обладали гентамицин, офлоксацин, энрофлоксацин, цефалексин, цефазолин, ампициллин, ванкомицин и фурадонин

Патогенностъ бактерий А р1еигорпеитопше На первом этапе работы было проведено экспериментальное заражение поросят изолятом "Ш-1" с целью выбора оптимального способа заражения Актинобациллезную плевропневмонию удалось воспроизвести при интравенозном, интраназальном и интратрахеальном способах заражения Установлено, что поросята наиболее восприимчивы к интраназальному заражению возбудителем болезни и минимальная летальная доза, вызывающая гибель всех животных в группе составила 1,0х109 мк Патогенность изолятов и штаммов А ркигорпеитотае оценивали при интраназальном заражении поросят минимальной летальной дозой Наблюдение за экспериментально зараженными животными показало, что все изоляты и штаммы, независимо от серовариантной принадлежности, вызывают однотипные клинические и патологоанатомические изменения, характерные для сверхострого и острого течения болезни

Эксперименты на лабораторных животных показали, что белые мыши и морские свинки не чувствительны к возбудителю болезни при интраназальном заражении При интраперитонеальном заражении гибель животных наблюдали в течение 1-2 суток после введения актинобацилл При этом было установлено, что морские свинки менее чувствительны к интраперитонеальному заражению актинобациллами, чем белые мыши

Вирулентность изолятов А ркигорпеитотае определяли в опытах на белых мышах при интраперитонеальном заражении Исследуемые изоляты различались между собой по величине летальной 50% дозы, и наибольшей вирулентностью обладал изолят "Ш-1" Значение ЛД50 изолята "Ш-1" для белых мышей составило 1,8х106±1,0х105 КОЕ

Определение серовариантной принадлежности изолятов А ркигорпеитотае по капсульному антигену. Для определения серовариантной принадлежности по капсульному антигену использовали референтные штаммы А ркигорпеитотае и изоляты "Ш-1", "К-1", "К-2"

При постановке реакции преципитации было установлено, что линия преципитации образуется между лунками с сывороткой на штамм № 27089 и антигеном на изолят "Ш-1", а также между лунками с сывороткой на штамм № 33590 и антигеном на изолят "К-2" Капсульный антиген изолята "К-1" не прореагировал ни с одной из испытуемых гипериммунных сывороток на референтные штаммы

При тестировании референтных штаммов в РИГА с гомологичными диагностикумами были отмечены титры антител от 1 40 до 1 80 При испытании полевых изолятов "Ш-1" был идентифицирован как второй серотип, так как реакция наблюдалась только с сывороткой на штамм 27089, и титр был равен 1 20 Изолят "К-2" был отнесен к шестому серотипу, так как прореагировал с сывороткой на штамм 33590, и титр составил 1 20

Результатом изучения биологических свойств изолятов А р1еигортитотае "Ш-1" и "К-2" явилось составление соответствующих паспортов и присвоение им статуса штаммов

Определение способов и сроков хранения бактерий А р1еигорпеитотае. При хранении микроорганизмов данного вида методом субкультивирования было установлено, что бактерии А р1еигорпеитотае погибали в течение 2-4 дней при температуре 25 и 37°С и в течение 1 недели при температуре 4-6°С вне зависимости от питательной среды, используемой для хранения

Наибольшей сохранностью штаммы А р1еигорпеитотае обладали при хранении в лиофилизированном и замороженном виде Концентрация живых микробных клеток в лиофилизированных пробах в течение всего срока наблюдения снижалась незначительно Так, через 6 месяцев хранения концентрация живых микробных клеток снизилась на 1,12±0,037 КОЕ/см3, а через 12 месяцев на 1,29±0,0163 ^ КОЕ/см3 В замороженном состоянии бактерии оставались жизнеспособными в течение всего срока наблюдения При этом концентрация живых микробных клеток снизилась примерно на 2,30±0,012 КОЕ/см3 На протяжении всего срока наблюдения, лиофилизированные и

замороженные культуры обладали характерными для штаммов бактерий А р1еигорпеитотае 27089, "К-2" и "Ш-1" биологическими свойствами Пробы на диссоциацию во всех случаях были отрицательными

Подбор условий культивирования бактерий А р1еигорпеитотае. Подбор питательной среды Процесс периодического глубинного культивирования осуществляли в аппарате "Фермус" с перемешиванием питательной среды при 700 об/мин и температуре 37°С в течение 12 часов

Для культивирования бактерий А ркигорпеитотае использовали следующие питательные среды бульон на основе триптического гидролизата мяса по Хоттингеру с концентрацией аминного азота 125 мг% и 250 мг% (ТГХ 1 и ТГХ 2), соево-казеиновый бульон (СКБ), бульоны на основе панкреатического и триптического гидролизата казеина (ПГК и ТГК)

В качестве У-фактора роста использовали свежеприготовленный дрожжевой экстракт в количестве 10% от общего объема В питательные среды дополнительно вносили 5% сыворотки крови КРС и 0,3% глюкозы в виде 40%-ного раствора

Анализ данных, представленных на рисунке 1 показал, что наиболее высокие показатели удельной скорости роста в период экспоненциальной фазы были при использовании питательных сред на основе ТГХ 1, ПГК, ТГК и ТГХ 2 - 1,043±0,045, 1,037±0,021, 1,031±0,012 и 1,019±0,024 ч1, а среднее время удвоения концентрации живых микробных клеток у таких культур составляло -0,66, 0,67, 0,67 и 0,68 ч, соответственно При культивировании штамма "Ш-1" на данных питательных средах экспоненциальную фазу роста наблюдали на протяжении 6 часов, а накопление возбудителя составляло - 10,02±0,07, 10,00±0,16,10,00±0,3 и 9,98±0,25 ^ КОЕ/см3

При культивировании штамма "Ш-1" на питательной среды СКБ отмечали незначительное снижение показателя удельной скорости роста (ц=0,978±0,1 ч"1) и увеличение времени удвоения микробных клеток ^=0,72 ч) При использовании СКБ накопление бактерий составляло 9,57±0,21 ^ КОЕ/см3, а

продолжительность экспоненциальной фазы роста находилась в пределах 6 часов.

п=3

Время (I), час

Рис. 1. Кривые роста бактерий А.ркигорпеитотае "Ш-1" на различных

питательных средах

Полученные данные указывают на то, что питательные среды, приготовленные на основе ТГХ, ПГК и ТГК являются наиболее перспективными для наработки бактериальной массы А.ркигорпеитотае. Учитывая тот факт, что штамм "Ш-1" имел одинаковые параметры роста на данных питательных средах, в дальнейшей работе нами использована питательная среда на основе ТГХ с концентрацией аминного азота 250 мг%.

Влияние процентного содержания дрожжевого экстракта на рост бактерий А.ркигорпеитотае. На данном этапе работы изучали динамику роста бактерий А.ркигорпеитотае в питательной среде ТГХ 2 с добавлением различного количества ДЭ - 2,5, 5, 10 и 20%. Контролем служила питательная среда без добавления указанного компонента.

Результаты исследований показали, что питательная среда, не содержащая ДЭ, рост бактерий не обеспечивает. К 4 часам культивирования общее количество бактерий в среде уменьшилось с 7,30±0,11 до 5,33±0,02 ^ КОЕ/см3. В среде содержащей 2,5 и 5% ДЭ время удвоения микробной биомассы

составляло 0,76 и 0,70 ч, а число генераций за 6 часов культивирования - 7,9 и 8,5 соответственно Удельная скорость роста актинобацилл в испытуемых питательных средах также была примерно одинаковой 0,911±0,06 и 0,983±0,08 ч"' За 6 часов культивирования общее количество бактерий в 1 мл среды увеличилось до 9,89±0,15 и 9,94±0,11 lg КОЕ/см3 соответственно

Было установлено, что в среде, содержащей 10 и 20% ДЭ, удельная скорость роста бактерий за 6 часов культивирования составляла 1,041±0,09 и 1,043±0,21 ч"1, а время удвоения биомассы 0,66 и 0,67 ч с числом генераций 9,0 и 8,9 соответственно Накопление возбудителя в питательных средах составило 10,05±0,04 и 9,94±0,10 lg КОЕ/см3 соответственно Фаза логарифмического роста в средах, содержащих 2,5, 5,10 и 20% ДЭ длилась до 6 часов

Таким образом, было установлено, что наличие ДЭ в питательной среде в качестве V-фактора роста, стимулирует рост бактерий A pleuropneumomae Оптимальное содержание ДЭ в среде составляет 10%

Влияние концентрации гемина на рост бактерий A pleuropneumomae. Для определения влияния концентрации гемина на динамику роста бактерий A pleuropneumomae проводили глубинное культивирование в питательной среде ТГХ 2 с добавлением указанного компонента в количестве 0,5, 1 и 2% от общего объема Контролем служила питательная среда, не содержащая гемин

Данные по изучению динамики роста бактерий A pleuropneumomae показали, что добавление в питательную среду гемина в концентрации 0,5, 1 и 2% не оказывало существенного влияния на рост возбудителя, о чем свидетельствуют параметры удельной скорости роста и времени удвоения живых микробных клеток Так, при добавлении в среду культивирования 0,5 и 1% гемина удельная скорость роста бактерий составила 0,785±0,013 ч"1 и 0,834±0,03 ч1 соответственно При этом экспоненциальный рост культур наблюдали в течение 6 часов Накопление возбудителя в питательных средах составляло 9,89±0,06, 9,86±0,08 lg КОЕ/см3, а время удвоения биомассы было одинаковым при использованных концентрациях гемина и составляло 0,70 ч

Таким образом, добавление в питательную среду гемина не оказывает стимулирующее действие на рост бактерий А ркигорпеитотае

Определение процентного содержания сыворотки крови крупного рогатого скота в питательной среде На следующем этапе работы изучали динамику роста бактерий А ркигорпеитотае в питательной среде с добавлением различного количества сыворотки крови КРС - 5, 10 и 20% Контролем служила питательная среда без добавления сыворотки крови КРС

Результаты исследований показали, что различия в росте бактерий в средах с содержанием 0, 5, 10 и 20% сыворотки крови КРС являются несущественными Значение удельной скорости роста составляло 0,990±0,02, 0,997±0,08, 0,978±0,09 и 0,990±0,13 ч"1 соответственно Продолжительность экспоненциального роста культур была в пределах 6 часов Накопление возбудителя в питательных средах составляло 9,89±0,06, 9,86±0,08, 9,98±0,05 и 9,84±0,0б КОЕ/см3, а время удвоения биомассы было одинаковым при использованных концентрациях сыворотки и составляло 0,70 ч За 6 часов культивирования произошло одинаковое число генераций - 8,6

Проведенные эксперименты показали, что культивирование актинобацилл в условиях непрерывного перемешивания и аэрирования с содержанием сыворотки крови КРС от 0% до 20% практически не оказывало влияния на показатели роста бактерий Следовательно, при глубинном культивировании А ркигорпеитотае наличие сыворотки крови КРС в ростовой среде не является обязательным

Инактивация бактерий А ркигорпеитотае.

Изучение инактивирующей активности формальдегида, аминоэтилэтиленимина и бета-пропиолактоиа на бактерии А ркигорпеитотае Эксперименты по изучению воздействия на микроорганизмы формальдегида, АЭЭИ и бета-пропиолактона проводили на модели штамма А ркигорпеитотае "Ш-Г' Так, при инактивации актинобацилл формальдегидом рост бактерий на агаре отсутствовал при концентрации препарата 0,5% и экспозиции 30 мин, а при 0,25% через 1 час после внесения

инактиванта, тогда как аналогичные концентрации АЭЭИ инактивировали актинобациллы через 1 и 3 часа, соответственно При воздействии бета-пропиолактона в концентрации 0,25% наблюдали отсутствие роста бактерий уже через 30 минут

Таким образом, проведенные исследования показали, что формальдегид, АЭЭИ и бета-пропиолактон обладают различной активностью при инактивации бактерий А р1еигорпеитотае

Инактивация формальдегидом. Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что гибель бактерий А р1еигорпеитотае при воздействии формальдегида (0,05%, 0,1%, 0,2% и 0,4%) идет с постоянной скоростью, то есть процесс гибели микроорганизмов подчиняется экспоненциальной зависимости

При этом показатель константы скорости инактивации (к) составил для 0,05% формальдегида к=3,43±0,31 ч"\ для 0,1% к=5,96±0,07 ч'\ для 0,2% к=11,59±2,24 ч"', для 0,4% к=22,77±2,12 ч"1

Таким образом, руководствуясь принципом щадящей инактивации и учитывая тот факт, что при использовании предельно низких концентраций формальдегида (0,05%), процесс инактивации бактерий за пределами эксперимента может быть не линейным, мы определили 0,1% формальдегида как оптимальную концентрацию для инактивации бактерий данного вида

Инактивация аминоэтилэтиленимином. При изучении процесса инактивации бактерий А р1еигорпеитотае аминоэтилэтиленимином, препарат использовали в концентрациях 0,25%, 0,5% и 1% по а д.в

Использование АЭЭИ в концентрациях 0,25% и 0,5% не обеспечивало гибели бактерий с постоянной скоростью, то есть процессы гибели не подчинялись экспоненциальной зависимости Кривые выживания микроорганизмов характеризовались линейностью лишь при воздействии 1% АЭЭИ, который и был принят нами за оптимальную концентрацию данного инактиванта Показатель константы скорости инактивации составил к=22,48±2,15 ч"1

Инактивация бета-прониолактоном. Инактивацию бактерий бета-пропиолактоном проводили в концентрациях 0,05%, 0,1% и 0,2%

В ходе проведенных исследований было установлено, что гибель бактерий А р1еигорпеитотае при воздействии указанных концентраций бета-пропиолактона идет с постоянной скоростью, а процесс гибели подчиняется экспоненциальной зависимости Показатель константы скорости инактивации (к) составил для 0,05% бета-пропиолактона к=5,74±0,3б ч"1, для 0,1 и 0,2% -к=22,31±2,32 ч'1 В дальнейших исследованиях при инактивации бактерий А ркигорпеитотае использовали бета-пропиолактон в концентрации 0,1%, которая была определена как оптимальная для бактерий данного вида

Изготовление опытных образцов инактнвированиых вакцин против актинобациллезной плевропневмонии свиней и изучение их антигенных и иммуногенных свойств

Определение антигенной активности инактивированных вакцин на лабораторных животных. Оценку антигенной активности актинобациллезных антигенов, полученных в результате воздействия на микроорганизмы формальдегидом, аминоэтилэтиленимином и бета-пропиолактоном изучали в составе опытных образцов эмульсионных моновакцин путем определения уровня антител в крови иммунизированных кроликов

Результаты исследований показали, что уровень накопления антител в крови иммунизированных животных зависит от количества введенного антигена и не зависит от инактиванта, использованного для изготовления соответствующего опытного образца моновакцины Так максимальный уровень антител в крови животных иммунизированных цельной вакциной наблюдался уже через 14 дней после вакцинации и составлял для образца №1 (формолвакцина) - 9,90±0,08 для образца № 2 и 3 (АЭЭИ и бета-пропиолактон в качестве инактиванта) - 9,61±0,31 и 9,60±0,13 \cig2, соответственно

Таким образом, бактерины А ркигорпеитотае в составе эмульсионных моновакцин, полученные с помощью таких инактивантов как формальдегид,

АЭЭИ и бета-пропиолактон обладали выраженными антигенными свойствами, а уровень образования и время максимального накопления специфических антител в крови иммунизированных кроликов зависел только от концентрации антигена

Изучение антигенных и илшуногенных свойств опытных образцов инактивированных противоактинобациллезных вакцин на свиньях. Антигенные и иммуногенные свойства опытных образцов инактивированных эмульсионных моновакцин изучали на поросятах 35-50 суточного возраста Результаты исследования антигенных свойств показали, что образцы вакцин вызывали выработку специфических антител в организме привитых животных, в то время как у контрольных животных титры антител оставались без изменений Следует отметить, что титры специфических антител не имели существенных различий среди групп животных, вакцинированных разными образцами вакцин Уровень антител в среднем составлял для образцов №1, 2 и 3 - 8,41 ±0,26, 8,53±0,15, 8,58±0,27 1о§2 соответственно.

При изучении иммуногенных свойств вакцин поросят через 21 день после иммунизации подвергали контрольному заражению Животных заражали интраназально минимальной смертельной дозой культуры А р\еигорпеитотае штамма "Ц1-1", величина, которой составляла 1,0х109 м к За животными наблюдали в течение 10 суток после заражения

Результаты опытов показали, что животные, иммунизированные образцами вакцин с концентрацией антигена 6,0 и 2,0 млрд м к в дозе были устойчивы к контрольному заражению У поросят данных групп в течение первых суток после заражения отмечали угнетение, плохое поедание корма и повышение температуры тела до 41- 41,5°С На 3 сутки общее клиническое состояние поросят данных групп нормализовалось

В группах животных, иммунизированных образцами вакцин с концентрацией антигена 0,7 и 0,2 млрд м к в дозе наблюдали угнетение, плохое поедание корма и повышение температуры тела до 41,5-42°С Спустя 1-2 суток наблюдали гибель поросят в группе №3 и №4 При вскрытии павших животных

регистрировали серозное и серозно-геморрагическое воспаление сердечных и диафрагмальных долей легкого Из проб легких павших поросят была выделена исходная культура штамма "Ш-1" Значение ИмД50 для вакцин, приготовленных с применением в качестве инактивантов формальдегида, бета-пропиолактона и АЭЭИ составляло 0,0417±0,0014 см3 (0,5±0,014)х109 мк, 0,05±0,0032 см3 (0,63±0,036)х109 мк, соответственно Контрольные животные погибали в первые сутки после заражения минимальной смертельной дозой возбудителя от сверхострой формы актинобациллезной плевропневмонии Диагноз был подтвержден результатами патологоанатомического вскрытия и бактериологического анализа

Таким образом, на основании проведенных исследований установлено, что опытные образцы вакцин, полученные с помощью формальдегида, бета-пропиолактона и аминоэтилэтиленимина в качестве инактивантов обладают высокой антигенной и иммуногенной активностью для свиней

4. ВЫВОДЫ

1 Выделены и идентифицированы полевые изоляты бактерий А ркигорпеитотае "Ш-1", "К-1", "К-2", изучены их биологические свойства

2 Определена серовариантная принадлежность изолятов А ркигорпеитотае по капсульному антигену Установлено, что изолят "Ш-1" принадлежит ко второму серовару, а изолят "К-2" к шестому серовару

3 Определены способы и сроки хранения штаммов бактерий А ркигорпеитотае Установлено, что хранение бактерий в замороженном виде при температуре -40°С не изменяет их биологических свойств в течение 6 месяцев, а в лиофильно-высушенном виде в течение 12 месяцев наблюдения

4 Подобрана оптимальная питательная среда для культивирования бактерий А ркигорпеитотае глубинным способом, состоящая из триптического гидролизата мяса по Хоттингеру с концентрацией аминного азота 250 мг% с добавлением 10% дрожжевого экстракта

5 Изучена динамика инактивации бактерий А ркигорпеитотае формальдегидом, аминоэтилэтиленимином и бета-пропиолактоном

Установлено, что формальдегид и бета-пропиолактон в концентрации 0,1%, а аминоэтилэтиленимин в концентрации 1% обеспечивают гибель актинобацилл при сохранении антигенных и иммуногенных свойств

6 Опытные образцы инактивированных эмульсионных моновакцин на основе штамма А р1еигорпеитотае "Ш-1" обладают выраженной антигенной активностью и индуцируют в организме вакцинированных поросят образование специфических антител

7 Экспериментально установлено, что образцы вакцин инактивированные формальдегидом, бета-пропиолактоном и аминоэтилэтиленимином обладали выраженными иммуногенными свойствами Для свиней значение ИмД50 вакцин, полученных при воздействии формальдегида и бета-пропиолактона, составляет 0,0417±0,0014 см3 (0,5±0,014)х109м к, а для вакцины, полученной при инактивации аминоэтилэтиленимином, - 0,05±0,0032 см3 (0,63±0,036)х109 м к

8 В опытах на свиньях установлено, что в прививном объеме всех образцов моновакцин против актинобациллезной плевропневмонии содержится 4 ИмД50

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты исследований использованы при разработке следующих нормативных документов

- "Методические рекомендации по идентификации изолятов АсПпоЬаыИия ркигорпеитотае" (2007 г),

- "Методические рекомендации по серологическому типированию бактерий АсШоЪаыИиз ркигорпеитотае в реакции преципитации в агаровом геле" (2007 г),

- "Методические рекомендации по хранению штаммов АсШоЬааИиэ ркигорпеитотае" (2007 г ),

- "Методические рекомендации по инактивации бактерий АсНпоЬасШиз ркигорпеитотае формальдегидом" (2007г)

Вышеперечисленные документы одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Штаммы A pleuropneumomae "LLI-1" (серовариант 2) и "К-2" (серовариант 6) заложены на хранение в музей штаммов ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Результаты научных исследований использованы при составлении НД на "Вакцину против актинобациллезной плевропневмонии свиней полиштаммовую инактивированную эмульсионную" СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Фроловцева, А.А. Условия и сроки хранения культур Acíinobacillus pleuropneumomae / А.А. Фроловцева, В С Русалеев, В М Гневашев, О В Прунтова, Г М Семенова // Науч основы обеспечения защиты жив-х от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний матер Междунар симпоз - Казань, 2005 - Ч 2 - С 354-359

2 Русалеев, В С Актинобациллезная плевропневмония свиней профилактика и меры борьбы /ВС Русалеев, Д А Бирюченков, А.А. Фроловцева // Свиноводство - 2007, №4 - С 28-29

3 Русалеев, В С Актинобациллезная плевропневмония свиней /ВС Русалеев, А.А. Фроловцева, Д А Бирюченков//Всерос вет конгр 15-й Моек междунар вет конгр. по болезням мелких домашних ж-ных Пробл инфекц патологии свиней матер секции - М , 2007 - С 38-39

4 Фроловцева, А.А. Бактериологическая диагностика актинобациллезной плевропневмонии свиней / А.А. Фроловцева, О В Прунтова, О И Ручнова, ДА Бирюченков,О В Бородина//Вет консультант -2007,№1 -С 15-17

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Тираж 90 экз , март 2008 г

Актуальность темы. В последние годы все больший интерес ветеринарных врачей вызывает актинобациллезная плевропневмония свиней. Обусловлено это, с одной стороны, скудностью информации о данном заболевании, а с другой, практическим отсутствием средств и методов ее диагностики и специфической профилактики (38, 50). Возбудитель актинобациллезной плевропневмонии свиней является первичным патогеном, вызывающим пневмонии у свиней (38).

Актинобациллезная плевропневмония — инфекционное контагиозное заболевание свиней, характеризующееся септикотоксемией, геморрагической и гнойно-некротизирующей пневмонией, а также серозно-фибринозным плевритом, перикардитом и артритами (1, 52, 54, 65, 68, 96, 151, 168, 180, 195).

Возбудителем болезни являются бактерии семейства Pasteurellaceae, рода Actinobacillus, вида Actinobacillus pleuropneumoniae (19).

Актинобациллезная плевропневмония свиней была впервые зарегистрирована' в свиноводческих хозяйствах Великобритании, США, Швейцарии и Аргентины в 1957-1964 гг., а возбудитель болезни был выделен в 1963 году (131, 163). В последующие десятилетия это заболевание было установлено в большинстве стран мира с развитым свиноводством (85, 165, 173).

Экономический ущерб от этой инфекции складывается из затрат от падежа и вынужденного убоя, снижения продуктивности животных, качества получаемой продукции, затрат, связанных с проведением профилактических и оздоровительных мероприятий. Ежегодно страны Евросоюза тратят один миллиард евро на проведение лечебно-профилактических мероприятий в борьбе с данным заболеванием (180, 192).

В настоящее время актинобациллезная плевропневмония свиней широко распространена в: Канаде, США, Франции, Великобритании, Италии,

Дании, Финляндии, Голландии, Японии, Греции, Австралии, а также в странах Южной Африки (34, 68, 85,165, 173).

Актинобациллезная плевропневмония может встречаться в ассоциации с вирусными (РРСС, парвовирусная болезнь свиней и др.) и бактериальными (гемофилезный полисерозит, легочной пастереллез, сальмонеллез и др.) болезнями (95, 130).

Заболеваемость свиней в стаде при актинобациллезной плевропневмонии может достигать от 15 до 90%, а летальность 40% в зависимости от формы течения болезни (151).

Для специфической профилактики s данного заболевания во многих странах мира разработаны и используются различные вакцинные препараты (156).

В России возбудитель актинобациллезной плевропневмонии свиней впервые был выделен М.А. Сидоровым и Д.И. Скородумовым в 1977 г. (151, 166). В настоящее время болезнь регистрируется в различных регионах страны. Данная ситуация связана с множеством причин, одна из которых -недостаточный контроль за перемещением животных внутри страны и импорт свинопоголовья из-за рубежа, и это при том условии, что среди свиней возможно длительное бактерионосительство после переболевания (125,127,129, 155).

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что актинобациллезная плевропневмония свиней является одной из актуальных проблем ветеринарии.

Цель и задачи исследований. Целью данных исследований было выделение, идентификация и изучение основных биологических свойств изолятов A.pleuropneumoniae, а также оценка возможности их использования для приготовления вакцин.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить 5 следующие задачи:

- выделить- возбудителя- болезни: из патологического материала в хозяйствах, неблагополучных?, по, актинобациллезной: плевропневмонии свиней й провести его, идентификацию;

- . изучить биологические свойства полевых изолятов А.р1ёигорпеитопще;

- определить' серовариантную: принадлежность • изолятов. А.р1еигорпеитотае по капсульному антигену;

- определить , способы и сроки- . хранения; возбудителя актинобациллезной плевропневмонии'свиней в лабораторных условиях;1

- подобрать питательную среду для культивирования бактерий ; А.рЫигорпеитотаеу

- • изучить- динамику инактивации бактерий А.р\еигорпеитотае формальдегидом, аминоэтилэтил енимином и бета-пропиолактоном;

- : изучить; . иммунобиологические свойства опытных образцов инактивированных вакцин -- против актинобациллезной , плевропневмонии свиней;; • ; • ;

Научная новизна исследований. Научная новизна работы состоит в

- I : ; том, что в результате проведенных исследований:

- ; выделены и идентифицированы полевые изоляты бактерий А.р1еигорпеитотае; ;

- изучены биологические свойства изолятов А:р1еигорпеитотае; ■ определена серовариантная принадлежность изолятов А.р1еигорпеитотае по ктсупьцому антигену;

- : изучены; способы; и | определены сроки хранения возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней; .

- ; подобрана питательная среда для культивирования: бактерий? А.р1еигорпеитопгае;

- . изучена инактивация возбудителя актинобациллезной плевропневмоний свинеи использованием формальдёгида, аминоэтилэтил енимина и бета-пропиолактона;

- изучены иммунобиологические свойства опытных образцов инактивированных вакцин против актинобациллезной плевропневмонии.

Практическая значимость исследований. Результаты исследований использованы при разработке следующих нормативных документов:

Методические рекомендации по идентификации изолятов Actinobacillus pleuropneumonias" (2007г.);

- "Методические рекомендации по серологическому типированию бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae в реакции преципитации в агаровом5 геле" (2007г.); .

- "Методические рекомендации по хранению штаммов Actinobacillus \ , pleuropneumoniae" (2007г.);

- "Методические рекомендации по инактивации бактерий Actinobacillus pleuropneumoniae формальдегидом" (2007г.);

Вышеперечисленные документы одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья I животных».

Материалы исследований использованы при оформлении1 паспортов на штаммы A.pleuropneumoniae "Ш-1", "К-2" и разработке НД на "Вакцину против актинобациллезной плевропневмонии свиней полиштаммовую инактивированную эмульсионную".

Основные положения, выносимые на защиту:

-результаты выделения и идентификации полевых изолятов A.pleuropneumoniae;

- биологические свойства полевых изолятов Apleuropneumoniae; -результаты серологического типирования изолятов

Apleuropneumoniae по капсульному антигену;

-способы сохранения возбудителя актинобациллезной-плевропневмонии свиней в лабораторных условиях;

- питательная среда для культивирования бактерий A.pleuropneumoniae;

-результаты инактивации бактерий A.pleuropneumoniae формальдегидом, аминоэтилэтиленимином и бета-пропиолактоном;

-иммунобиологические свойства опытных образцов инактивированных вакцин против актинобациллезной плевропневмонии в опытах на лабораторных животных и свиньях.

Апробация результатов работы. Материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах XV Московского международного ветеринарного конгресса по болезням мелких домашних животных (Москва, 2007г.),- а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр г охраны здоровья животных» в 2004-2007 гг.

Публикация научных, исследований. По теме диссертации опубликовано, 4 научные работы, в том числе одна работа в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно. В'выполнении»отдельных этапов работы принимали участие I доктор биологических наук О.В. Прунтова (разделы 2.3.1, 2.3.4), кандидат биологических наук О.В. Бородина (раздел 2.3.1), кандидат ветеринарных наук В.М. Гневашев (раздел 2.3.4), кандидат биологических наук Г.М. Семенова (раздел 2.3.4), 'кандидат ветеринарных наук О.И. Ручнова (раздел 213.1), ветеринарный врач Д:А. Бирюченков (разделы 2.3.1, 2.3.2.4), за что автор приносит им сердечную благодарность.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 листах компьютерного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы,

4. ВЫВОДЫ

1. Выделены и идентифицированы полевые изоляты бактерий А.р1еигорпеитотае "Ш-1", "К-1", "К-2", изучены их биологические свойства.

2. Определена серовариантная принадлежность изолятов А.р1еигорпеитотае по капсульному антигену. Установлено, что изолят "Ш-1" принадлежит ко второму серовару, а изолят "К-2" к шестому серовару.

3. Определены способы и сроки хранения штаммов бактерий А.р1еигорпеитотае. Установлено, что хранение бактерий в замороженном виде при температуре -40°С не изменяет их биологических свойств в течение

6 месяцев, а в лиофильно-высушенном виде в течение 12 месяцев наблюдения.

4. Подобрана оптимальная питательная среда для культивирования бактерий А.р1еигорпеитотае глубинным способом, состоящая из триптического гидролизата мяса по Хоттингеру с концентрацией аминного азота 250 мг% с добавлением 10% дрожжевого экстракта.

5. Изучена динамика инактивации бактерий А.р1еигорпёитотае формальдегидом,. аминоэтилэтиленимином и бета-пропиолактоном. Установлено, что формальдегид и бета-пропиолактон в концентрации 0.1%, а аминоэтилэтиленимин в концентрации 1% обеспечивают гибель актинобацилл при сохранении антигенных и иммуногенных свойств.

6. Опытные образцы инактивированных эмульсионных моновакцин на основе штамма > А.р1еигорпеитотае "Ш-1" обладают выраженной антигенной активностью и индуцируют в организме вакцинированных поросят образование специфических антител.

7. Экспериментально установлено, что образцы вакцин инактивированные формальдегидом, бета-пропиолактоном и аминоэтилэтиленимином обладали выраженными иммуногенными свойствами. Для свиней значение ИмД50 вакцин, полученных при воздействии формальдегида и бета-пропиолактона, составляет 0,0417±0,0014 см3 (0,5±0,014)х 109м.к., а для вакцины, полученной при инактивации аминоэтилэтиленимином, - 0,05±0,0032 см3 (0,63±0,036)х109 м.к.

8. В опытах на свиньях установлено, что в прививном объеме всех образцов моновакцин против актинобациллезной плевропневмонии содержится 4 ИмДзо.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты исследований использованы при разработке следующих нормативных документов:

Методические рекомендации по идентификации изолятов АсИпоЬасШш р1еигорпеитотае» (2007 г.);

- «Методические рекомендации по серологическому типированию бактерий АсИпоЬасШш р1еигорпеитотае в реакции преципитации в агаровом геле (2007 г.)»;

- «Методические рекомендации по хранению штаммов АсИпоЪасШиз р1еигорпеитотае» (2007 г.);

- «Методические рекомендации по инактивации бактерий АсИпоЬасШш р1еигорпеитотае формальдегидом» (2007г.).

Вышеперечисленные документы одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

В музей штаммов ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» заложены на хранение штаммы А.р1еигорпеитотае "Ш-1" (серовариант 2) и "К-2" (серовариант 6).

Результаты научных исследований использованы при составлении НД на «Вакцину против актинобациллезной плевропневмонии свиней полиштаммовую инактивированную эмульсионную».