Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка и применение иммуноферментного анализа для выявления противоящурных антител в сыворотках крови животных

од

У 2 ДЕК 199?

На правах рукописи УДК 619:616.98:578.835.2:616-078.33

ДУДНИКОВА Екатерина Константинов на

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРОТИВОЯЩУРНЫХ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ ЖИВОТНЫХ

16.00.03 "Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 1997

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ) Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ - ШАЖКО Жорж Антонович, доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

- РАХМАНОВ Анатолий Михайлович, доктор ветеринарных наук, профессор (ВНИИЗЖ, г. Владимир)

- КУРИННОВ Виктор Васильевич, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник (ВНИИВВиМ, Покров).

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ, г. Москва).

Защита состоится "о£гЭ " декабря 1997 г. в И часов на заседании диссертационного совета Д 120. 60. 01. при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных по адресу: 600900, г. Владимир, п/о Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных.

Автореферат разослан "

м» ноября 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета -

Мищенко В.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ящур - высококонтагиозное остро протекающее заболевание сельскохозяйственных и диких парнокопытных животных вирусной этиологии, возбудитель которого характеризуется широким антигенным спек. тром [Brooksby J.B., 1982;Mowat G.N., 1987;Maan J.A. e.a., 1989]. ,

Прямые и непрямые потери, связанные с затратами на ликвидацию эпизоотии, а также, как следствие эмбарго на торговлю, могут нанести значительный ущерб стране, экономика которой зависит от экспорта сельскохозяйственных продуктов [Рахманов A.M. и соавт., 1992; Курченко Ф.П. и соавт., 1992]. Так, экономический ущерб ликвидации в СССР в 1964-1966 гг. последствий эпизооти-ии, вызванной вирусом ящура А22, был оценен около 600 млн. долларов США [Бойко A.A., Кругликов Б.А., 1994].

При сопрсмсштм уроннс pinnirnin трипшортпмх срсдстп и иитснсишгости экономических и культурных контактов между странами в мире нет района, не подвергающегося риску заноса вируса ящура и возникновения эпизоотии.

В связи с этим ликвидация ящура в одной стране не может служить надежной гарантией ее благополучия. Учитывая это, до настоящего времени проблема ящура остается актуальной для стран как свободных от данного заболевания, так и тех, где болезнь присутствует. Появление ящура в ранее благополучных странах у животных, подвергавшихся систематической вакцинации [Petzhold SA., e.a., 1980; Silber R., 1980; Srinivasan VA., e.a., 1983], снова привлекло внимание ученых к проблемам лабораторной диагностики этого заболевания.

Разработка более эффективных методов лабораторной диагностики ящура, которые должны быть высокочувствительными и специфичными является актуальной задачей ветеринарной науки в настоящее время,tjc многие вопросы зависят от качества иммунодиагностикумов, применяемых для выявления и идентификации вируса и антигенов, а также при определении типовой специфичности про-тивоящурных антител у переболевших и вакцинированных животных.

Для лабораторной диагностики ящура принята следующая схема: подтверждение клинического диагноза, определение типовой принадлежности вируса, выяснение источника возбудителя инфекции, изучение антигенного спектра эпизоотического штамма, оценка возможности его применения в качестве производственного по иммунобиологическим и технологическим критериям. При этом

г

применяют традиционные серологические (РСК, РДП, МФА, РПГА, РН) [Собко А.И. и соавг., 1973; Черняев ЮА., 1975; Битер Дж.Е, 1988; Кременчугская С.Р., 1989; Forrest С.Е, 1966; Cowan КМ., 1971; Wagner G.G.,e.a., 1971] и биологические методы (выделение вируса на лабораторньи тест-систем ах) [Коляков Я.Е., 1989].

На специфичность серологических реакций (например, РСК) могут влиять различные соотношения инфекционных и неинфекционных вирионов, пустые капсиды и тканевые белки в исследуемом материале; для выполнения РН необходимы особые ветеринарно-санитарные условия; метод РДП оказался недостаточно чувствительными, а методами МФА и РПГА невозможно дифференцировать типы возбудителя и его варианты.

Разработка иммунохимического метода - ИФА, для которого характерна высокая чувствительность, простота постановки, точность измерений результатов и быстрота получения ответа [Hamblin С., 1983; Westbyry НА., 1988; Шажко ЖА. и соавт., 1988] открыла перспективы устранения многих технических проблем лабораторной диагностики ящура и повышения ее стандартизации и достоверности. Кроме того по специфичности ИФА при выявлении антигенов вируса яшура коррелирует с другими иммунохимическими методами, а по чувствительности превосходит их в несколько раз [Hamblin С., 1986,1987; Ferris N.P. е.а., 1990].

Указанные преимущества, а также более высокая производительность данного метода способствовали выбору для изучения возможности использования в качестве метода выявления антител к вирусу ящура как при ретроспективной диагностике ящура, так и для оценки состояния гуморального иммунитета.

Цели и задачи исследований. Основной целью нашей работы являлось совершенствование схемы выявления вирусспецифических антител при ретроспективной диагностике ящура и изучении противоящурного иммунитета с использованием ИФА, позволяющего проводить массовые исследования.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- получить наборы специфических иммунореагентов для выявления с помощью ИФА постинфекционных и поствакцинальных антител к вирусу ящура;

- оценить чувствительность и специфичность различных вариантов ИФА при выявлении противоящурных антител в сыворотках крови животных;

- выбрать вариант ИФА, коррелирующий с РН при выявлении противоящурных антител и изучении противоящурного иммунитета;

- провести сравнительное изучение эффективности выявления противоящурных антител в ИФА и РН у животных с различным иммунным статусом;

- на основе ИФА разработать научно-методические рекомендации, регламентирующие все этапы выявления противоящурных антител в сыворотках крови животных разных видов.

Научная новизна. Определены оптимальные варианты постановки ИФА для выявления противоящурных антител. Уточнены параметры получения антительных препаратов для выявления противоящурных антител с помощью ИФА. Установлена прямая коррелятивная зависимость между показателями титров противоящурных антител в сыворотках крови вакцинированных и переболевших животных при исследовании в ИФА и РН. Изучена диагностическая ценность ИФА в сравнении с РН, применяемой при лабораторной серодиагностике ящура. Показан различный спектр образования антител к пирусспецифическим структурным, неструктурным, и также оелким-прсдшествениикам у вакцинированных и переболевших ящуром животных.

Практическая значимость. Результаты, полученные при выполнении диссертации, позволили разработать и внедрить в лабораторную диагностику "Временное наставление по выявлению противоящурных антител иммунофер-ментным методом", утвержденное ГУВ ГАПК СССР, и "Методику выявления противоящурных антител в непрямом жидкофазном блокирующем сэндвич варианте иммуноферментного анализа", утвержденную директором ВНИИЗЖ.

Предложенные наставления по постановке ИФА использованы ВНИИЗЖ при проведении ХШ-Х1У фаз стандартизации методов выявления противоящурных антител, проводившихся ФАО/МЭБ под руководством Всемирной справочной лаборатории МЭБ по ящуру (Великобритания, Пербрайт)

Основные -положения выносимые на защиту. Экспериментальные исследования по оценке препаратов вируса ящура с различной степенью очистки и схемы получения иммунных сывороток с целью выбора оптимальных иммуно-реагентов для постановки ИФА.

Разработка, оценка и внедрение в практику иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу ящура.

Результаты сравнения ИФА и РН при ретроспективной диагностике ящура, определении иммунного статуса у животных и оценки эффективности вакцинации.

Характеристика спектра антител на структурные и неструктурные белки вируса ящура у переболевших и вакцинированных животных.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ВНИИЗЖ (ВНИЯИ) в 1990-1996 г.г., на научно-теоретической конференции молодых ученых ВНИЯИ "Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии" (Суздаль, 1990), на международной конференции "К новой стратегии борьбы с ящуром" (Владимир, 1991), на научной конференции "Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии" (Покров, 1992), на сессии Рабочей Группы Европейской комиссии по контролю ящура (Вена, 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах, иллюстрирована 25 таблицами, 9 схемами и 9 рисунками. Список используемой литературы включает 233 источника, из которых 147 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 .МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирус. В работе использовали вирус ящура Аг2-№550, 0|№194, С|№564, Азия|№48 из коллекции ВНИЯИ. Вирус был адаптирован к организму новорожденных крольчат, мышат, а также к перевиваемым производственным сублиниям клеток ВНК-21/2-17,Ш-Я8-2, ПСГК-30 и к первично трипсинизированной линии клеток свиной почки (СП).

Культуры клеток. В работе были использованы монослойные и суспензионные культуры перевиваемых линий клеток ПСГК-30, ВНК-21/2-17 и 1В-113-2, а также культуры первичнотрипсинизированнькклеток почки поросят (СП).

Препараты антител. Иммуноглобулины для постановки ИФА и получения конъюгатов выделяли из иммунных сывороток кроликов и морских свинок методом трехкратного осаждения сульфатом аммония с последующим диализом

против ФБР. Концентрацию белка в растворах определяли спектрофотометриче-ским методом.

Животные. В качестве доноров иммунных сывороток использовали морских свинок массой 450-500 г и кроликов массой 2,5-3 кг.

Реакция нейтрализации (РН). Постановку РН на культуре клеток и на мышатах осуществляли в соответствии с ГОСТ 25384-82 "Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики ящура". Микромодификацию РН - (РМН) ставили на культуре клеток IB-RS-2 с использованием двукратных разведений сывороток крови и 100 ТЦДю гомологичного вируса в культуральных микропланшетах в соответствии с "Методикой определения антитител против вирусов ящура и везикулярных болезней в реакции нейтрализации на микропанелях", утвержденной директором ВНИИЗЖ от 29.01.199бг.

Иммупоферментпый анализ (ИФА). В работе испытывали непрямой, непрямой сэндвич, а также жидкофазные блокирующие прямой и непрямой сэндвич варианты ИФА, оптимальные условия постановки которых определяли экспериментально.

Получение VIA-аптигепа. За основу технологии получения VIA-антигена были взяты рекомендации Alonso A.F. (1975) и Текерлекова П. и соавт. (1987). Дополнительно проводили последовательную хроматографию препаратов VIA-антигена на трех колонках с BrCN-сефарозой, конъюгированной с негативной сывороткой КРС, очищенным 146S компонентом вируса ящура и антителами кроликов против IgG КРС.

Выделение аирио/шой РНК, трансляция in vitro РНК вируса ящура. РНК вируса ящура получали из высокоочищенной вирусной суспензии фенольно-детсргентным методом [Перевозчикова НА и соавт., 1986]. Выполнение последующих этапов проводили в соответствии с опубликованными методиками Boyd CD. (1984), OffiverC.L. (1984) и с отмывкой иммунопреципитатов по Anda-sonH.G. (1983); TeberM. (1989); Berger H.G. (1990).

Получение антиидиотипических антител. Антиидиотипические антитела получали в соответствии с опубликованными методиками Garmendia А.Е, et al. (1989); BaxtB. et.al. (1989).

Сыворотки. В модельных опытах использовали сыворотки полученные из проб крови крупного рогатого скота, отобранные до заражения и через 21 день после заражения вирусом ящура Аи№550, С>1№194, С|№564, АзиЯ1№48, с известными титрами вируснейтрализующих антител, а также референтные положительные и отрицательные сыворотки крупного рогатого скота, полученные из. Всемирной справочной лаборатории МЭБ по ящуру (Великобритания). Кроме того, для выявления специфических антител использовали сыворотки крови различных видов сельскохозяйственных животных (крупного рогатого скота, яков, овец, свиней), экспериментально зараженных вирусом ящура'или вакцинированных против него экспериментальными и производственными сериями вакцины ВНИЯИ.

Для изучения динамики формирования гуморального иммунитета у сельскохозяйственных животных нами были использованы пробы крови крупного рогатого скота и овец в динамике на 3,7,10,14,21,28,31 и 50 дни после заражения вирусом ящура типов А и О.

Статистический анализ данных.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили методами, изложенными вруководсгееАшмаринаИ.П.(1975) с использованием программы, составленной нами для работы в системе (ШАБЕ или на програмируемом микрокалькуляторе "Электроника МК-56". Расчет критерия знаков проводили с использованием таблиц по математической статистике [Мюллер П. и соавт., 1982].

2.2.РЕЗУЛЫАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1.Попучепие специфических иммунареагептов

Важным моментом при создании системы улавливающих и детекторных антител, используемых в ИФА, является получение тилоспецифических сывороток.

Нами были испытаны схемы одно-, двух- и трехкратной иммунизации животных, эффективность которых зависила от многих факторов, в том числе от природы, чистоты и активности иммунизирующего антигена. В качестве последнего использовали инактивированные препараты 1465 компонента вируса ящура в смеси с масляным адъювантом типа неполного адъюванта Фрейнда (НАФ). Морским свинкам препарат вводили в дозе по 20-30 мкг при двукратной схеме

иммунизации и 70-80 мкг при однократной, а кроликам как при однократной, так и двух-трехкратной - не менее чем по 100 мкг. При однократной иммунизации животных обескровливали спустя 21 день. Двукратную иммунизацию морских свинок проводили с 21-дневным интервалом и тотальным обескровливанием через 10 дней после последней иммунизации. При двукратной иммунизации кроликов препараты 146S компонента вируса ящура первый раз вводили в масляном адъюванте ВНИЯИ (ВНИИЗЖ) типа НАФ, а через 21 день - с сапонином в концентрации 0,5 мг/мл.

При трехкратной иммунизации кроликов препараты I46S компонента вводили дважды с интервалом в 7 дней с НАФ, а спустя 14 дней после второй -третью иммунизацию - без адыованта. При оценке эффективности различных схем иммунизации животных использовали препараты I46S антигена вируса ящура типов А, О, С п Азия-1.

Специфическую активность кроличьих сывороток определяли с помощью непрямого варианта ИФА. Для этого в предварительных опытах экспериментально определяли оптимальную дозу антигена для сенсибилизации лунок поли-стирольных планшетов. В качестве антигена использовали инактивированный I46S компонент вируса ящура типов А, О, С и Азия-I, из которого готовили ряд разведений с концентрацией вирусспецифического белка в диапазоне от 0,5 до 10 мкг/мл. При этом было установлено, что по мере увеличения концентрации сенсибилизирующего антигена от 0,5 до 2 мкг/мл чувствительность метода возрастала, о чем свидетельствовало повышение титра выявляемых антител. Затем в диапазоне 2-5 мкг/мл она сохранялась на достигнутом уровне, а фон не превышал ОД оптических единиц (o.e.). При дальнейшем увеличении концентрации антигена от 5 до 10 мкг/мл чувствительность метода не изменялась, а интенсивность фоновой реакции усиливалась до 1,2 o.e. Основываясь на этих данных, оптимальной для сенсибилизации панелей нами была признана концентрация антигенов от 2 до 5 мкг/мл, которую использовали как рабочую во всех последующих опытах, поскольку она обеспечивала значение оптической плотности (ОП) от 1 до 1,5 o.e. и не вызывала перекрестных реакций с антителами гетерологичных типов.

Об эффективности использования схем гипериммунизации кроликов судили по результатам сравнения активности и специфичности групповых сывороток. Трехкратная схема иммунизации обеспечивала максимальные значения тит-

ров антител. Однако относительный прирост титров антител при сравнении одпо-и двукратной иммунизации составил 2log:, тогда как при сравнении двух- и трехкратных иммунизаций относительный прирост титров составил только 1,25 log:. Было показано, что с увеличением кратности иммунизаций возрастала интенсивность перекрестных реакций с гетерологичными антигенами. Так, при однократной иммунизации средняя разница активности в реакции между гомо- и гетерологичными иммунореагентами составила 2 log:, а при двукратной - 0,75 log:, т.е. типовая специфичность полученной сыворотки резко снижалась, было замечено, что с увеличением кратности иммунизаций усиливалась фоновая окраска реакции.

Для оценки специфичности и активности сывороток морских свинок, полученных по разным схемам иммунизации, также использовали непрямой вариант ИФА. При этом было установлено, что сыворотки, полученные по схеме однократной иммунизации, уступали по активности сывороткам второй схемы, однако эта активность оказалась вполне достаточной для их использования в качестве исходного сырья, на основе которого можно получить типоспецифические иммуноглобулины, пригодные в качестве детекторных антител. Так, из сывороток морских свинок с активностью 9,32 log: и 8,32 log: в ИФА были получены иммуноглобулины с титрами специфических антител 10,32 log: и 9,65 log2. Как и в опытах на кроликах, сыворотки морских свинок, привитых однократно, характеризовались более высокой типовой специфичностью (средняя разница титров антител с гетеро- и гомологичным антигенами в непрямом варианте ИФА при однократной иммунизации составила 3 log:, тогда как при двукратной только 1 log2).

Таким образом, для получения улавливающих антител для последующих опытов была избрана схема двукратной иммунизации кроликов, а для получения типоспецифичных детекторных igG морских свинок - схема однократного введения антигена.

Следующим этапом нашей работы была оценка препаратов вируса ящура для использования их й жидкофазном блокирующем сэндвич варианте ИФА. В сравнительном аспекте были оценены препараты культурального (IB-RS-2, ВНК-21) вируса ящура разных типов с различной степенью очистки (от 33 до 99,9%), в том числе 100-кратныеПЭГ-концетраты и очищенный 146S антиген.

Было установлено, что использование вируса ящура, очищенного методом дифференциального ультрацеитрифугирования, не давало преимуществ в специфичности и чувствительности ИФА по сравнению с инакгивированным вирусом, концентрированным в 100 раз путем осаждения ПЭГ. Этот метод отличался простотой и доступностью. Полученные тагам способом препараты антигена, по основным параметрам качества не отличались от коммерческих диагностикумов антигенов по ТУ 46-20-429-79. Учитывая это, в основных опытах мы использовали при постановке жидкофазных блокирующих сэндвич вариантов коммерческие антигены, изготовляемые производственной базой нашего института.

2.2.2. Оптимизация условий постановки ИФА

При выборе нерастворимого носителя, используемого и качестве твердой фазы, были проведены сравнительные исследования пригодности 96- луночных планшетов из полистирола, выпускаемых разными изготовителями, в том числе фирмами "Ленмедполимер" (Россия), "Дайнатек" (Швейцария) и "Нанк" (Дания). При соблюдении одинаковых условий постановки реакции были получены результаты, свидетельствующие, что наименьшей сорбционной емкостью обладают планшеты фирмы "Ленмедполимер". Это в свою очередь приводит к снижению чувствительности реакции, в 2-4 раза по сравнению с результатами использования планшетов фирм "Дайнатек" и "Нанк" имеющих большую сорб-ционную активность.

В результате проведенных исследований определены оптимальные параметры постановки ИФА при использовании его в ретроспективной диагностике ящура. Установлено, что время, необходимое для адсорбции иммунореагентов на поверхности полистирола, должно составлять 16-18 часов при 4°С. Для всех последующих стадий ИФА достаточно надежной является инкубация в течение 1 часа при 37°С. Оптимальной буферной системой для иммобилизации антител и инактивированного антигена на планшете оказался 0,05М. карбонатно-бикарбонатный буферный раствор (рН 9,6). На всех остальных стадиях ИФА вполне приемлем 0,02М фосфатный буфер (рН 7,6). В качестве блокирующих растворов во всех случаях, когда не используются конъюгаты против ^С крупного рогатого скота, высокоэффективными и экономически выгодными являются 10% раствор нормальной сыворотки КРС или 5% раствор сухого обезжиренного мо-

лока. Сенсибилизированные антителами планшеты могут храниться практически без потери активности в течение 6 месяцев при 4°С.

2.2.3. Сравнительное изучение различных вариантов И<РЛ для обнаружения ■противоящурпых антител

Одним из наиболее перспективных направлении пракшческого применения ИФА, согласно данным современной литературы, является область массовых исследований сывороток крови на наличие специфических антител, например при ретроспективной диагностике ящура и, особенно, при изучении динамики формирования гуморального иммунитета, а также оценке иммунного фона.

Исходя из вышесказанного, перед нами была поставлена задача оценить возможность использования наиболее распостраненных вариантов ИФА для выявления противоящурпых антител в сыворотках крови сельскохозяйственных животных э сравнении страдициош1ымсеролоп1чсх.-к1мтестом-РН. С этой целью было проведено сравнительное изучение следующих вариантов ИФА: непрямой вариант; непрямой сэндвич вариант; жидкофазный блокирующий прямой сэндвич; жидкофазный блокирующий непрямой сэндвич вариант. Апробацию названных вариантов ИФА проводили при исследовании сывороток животных, переболевших ящуром подтипов А22 и Оь и сывороток разных видов животных в разные сроки после введения экспериментальной серии протнвоящурной вакцины подтипа А22, любезно предоставленных Поляковым О.Н. (табл. I и 2).

Таблица 1

Результаты выявления противоящурпых антител в сыворотках крови ящурных реконвалесцентов различными вариантами ИФА и РН

(п=20-25)

Вирус ящура Исследуемые сыворотки Тит ЭЫ антител (10g2) на 7 день послс заражения

РН Варианты ИФА

жидкофазный блокирующий сэндвич непрямой сэндвич непрямой

прямой непрямой

Ага крупного рогатого скота овец 6,35±0,51 5,35±0,37 7,3±0,38 6,2±0,12 7,35±0,34 6,15+0,34 8,50±0,37 8,04±0,1б 11,15±0,12 9,55±0,34

О, крупного рогатого скота овец 7,35±0,34 6,65±0,38 8,15±0,23 7,25+0,43 8,35±0,15 7,35+0,27 9,57±0,34 9,04±0,12 10, t±0,22 10,5+0,12

»

Таблица 2

Результаты выявления противоящурных антител в сыворотках крови поствакцинальных животных различными вариантами ИФА и РН

<п=50-100)

Титры антител (1о§з)

Варианты ИФА

Исследуемые сыворотки РН жидкофазный блокирующий сэндвич непрямой сэндвич непрямой

прямой непрямой

Через 30 дней после крупного рогатого скота овец б,9±0,54 5,11± 0.27 8,5+0,2 6,3±0,13 8,55+0,42 6,29±0,17 10,7±0,72 7,15±0,41 11,5±0,8б 9,15±0,21

вакцинации свиней 5,76±0,22 7,50±0,2б 7,60±0,14 10,9±0,27 11,1±0,66

Через 180 диен после крупного рогатого скота овец б,04±0,38 3,94±0,41 б,45±0,41 5,33±0,27 6,64±0,21 5,3±0,41 8,31±0,32 5,95±0,62 9,55±0,16 7,75±0,34

вакцинации свиней 4,85 ±0,41 б,57±0,34 6,51±0,38 9,04±0,37 10,3±0,12

Средн. по группам 5,5±0,37 6.78+0,28 6,8±0,24 9,06+0.45 9,89+0,39

Проведенные нами исследования показали, что наибольшей чувствительностью обладает непрямой вариант ИФА, близким к нему по этому параметру оказался непрямой сэндвич вариант. Как видно из представленных в таблицах данных, титры исследуемых сывороток в первом случае были выше на 3-4 порядка, во втором - на 2-3 порядка, чем титры тех же сывороток в жидкофазных блокирующих прямом и непрямом сэндвич вариантах ИФА. Однако, последние давали значения титров противоящурных антител, фактически не отличающиеся от результатов, полученных в РН. Так как РН является общепринятым объективным методом определения вируснеитрализующих антител, для последующих исследований нами были избраны жидкофазные блокирующие сэндвич варианты ИФА, которые дают наиболее воспроизводимые результаты и принципиально не отличаются по своей природе от РН.

Поскольку результаты исследования сывороток и жпдкофазных блокирующих прямом н непрямом вариантах ИФА практически не отличались между собой, в дальнейшем, ,с целью стандартизации процедуры постановки (использование коммерческих антивидовых конъюгатов), мы применяли жидко-фазный блокирующий непрямой сэндвич вариант.

Изучение возможности использования указанного варианта ИФА в качестве альтернативного метода количественного определения протпвоящурных антител у вакцинируемых и переболевших животных в комплексе с РН или взамен последней было основной целью наших дальнейших исследований.

2.2.4. Изучение коррелятивной jaaucuMocmu .иемсОу результатами аыияле-ния-противоящурных антител с помощью ИФА и I'll

Для достижения поставленной цели было необходимо изучить коррелятивную зависимость результатов жидкофазного блокирующего непрямого сэндвич варианта ИФА и РИ при изучении динамики накопления протпвоящурных антител в сыворотках крови разных видов сельскохозяйственных животных после вакцинации и переболевания ящуром.

В исследованиях по изучению динамики постинфскшюннмх антител нами были проведены модельные опыты с сыворотками крови КРС и овец, переболевших ящуром типов А и О. Животных заражали интрадермолингвально 10% суспензией афтозного вируса с титром инфекционности 104 ИД>а/0,2 мл. Исследование сывороток с целью определения сроков появления и последующей динамики накопления противоящурных антител осуществляли ИФА и РН с использованием культуры клеток.

Перед заражением у всех животных была отобрана сыворотка, которую проверяли на наличие специфических антител в ИФА и РН, при этом титр сыворотки в ИФА < 3,0 log:; в РН<1,0 log:.

В результате проведенных исследований было установлено, что вирусспе-цифические антитела у отдельных животных удается обнаружить, начиная с 3-4 дней, а у остальных с 5-7 дней после заражения животных, как с помощью ИФА, гаки РН. При этом титры сывороток в ИФА всегда были выше в среднем на 2log:.

В последующие дни титры закономерно попытались и достигали максимального уровня па 30 день.

В следующей серии опытов, проведенных с целью оценки специфичности результате» ИФЛ и определения возможности использования последнего для выявления гстерологичных антител, п динамике исследовали сыворотки крови КРС, зараженного подтипами вируса ящура, отличающимися от производственных. В частности, по типу А использовали сыворотки животных, зараженных вирусом ящура штаммов А Иранский/87, А№2. А:о№102, а по типу О - ящуром эпизоотического штамма Хз 1615/89.

Проведенный статистический анализ данных свидетельствует о прямой коррелятивной зависимости между результатами исследования сывороток в жидкофазиом блокирующем сэндвич варианте И ФА и РН с использованием культуры клеток. 'Гак, коэффициент парной корреляции (R) по сывороткам КРС для вируса ящура А;: составил 0,99; для А№2 - 0,97; для A;ojV9102 - 0.95; для А Иранский/87 - 0,98; для 0№1615 - 0,87. По сывороткам овец для вируса ящура А:: он составил 0.98. а для Oi - 0.87.

Полученные данные свидетельствуют о возможности выявления антител к гетерологичным подтипам вируса ящура в ИФЛ с диагностикумами только на производственные штаммы (А;;№550 и ОиЧ°194). Однако титры антител, выявляемых с помощью гетерологичных иммунодиагностикумов. оказались, как и ожидалось, значительно ниже, чем в опытах с использованием гомологичных диагностик-умов, что достаточно хорошо согласовывалась с данными об антигенном родстве между использованными эпизоотическими и производственными штаммами вируса. Так показатели родства вируса А:: №550 с использованными штаммами в опытах, составляли: 18%, 24% и 33%. Родство между вирусом штаммов Oi№194 и 1615/59-73%[ШажкоЖ. А. 1992].

Дальнейшее испытание данного варианта ИФА было проведено в сравнении с реакцией микронеитрализации (РМН) при изучении динамики накопления антител в сыворотках крови КРС, свиней и овец, привитых противоящурной концентрированной вакциной.

В этой серии опытов КРС, свиней и овец прививали в условиях института универсальной противоящурной вакциной, разработанной в лаборатории инак-

тивированных вакцин ВНИИЗЖ [Дудннков А.И. п соавт., 1992, 1995; Михали-шин В.В. и соавт., 1995] и представляющей собой эмульсию типа "вода в масле" из очищенного концентрированного и ннактнвированного вируса ящура А::Мг550. При количественном контроле на свиньях было установлено, что в прививном объеме (1мл) вакцина содержала более 333 PDjo. Для иммунизации использовали молодняк КРС в возрасте 6-7 месяцев, а свиней и овец - в возрасте 3 месяца. КРС и овцам вакцину вводили подкожно, а свиньям - внутримышечно в дозе 1мл. Кровь для исследовании отбирали до вакцинации и на 7,14,21 и 28 дни после вакцинации.

РМН ставили в культуральных микропланшетах фирмы "Costar" на культуре клеток 1B-RS-2 с использованием двукратных разведений сыворотки крови против 100 ТЦД50гомологичного вируса.

До вакцинации в сыворотке крови КРС, свиней и овец титр антител к вирусу ящура Аг: был меньше 2 log2. В ответ на введение вакцины наблюдалось резкое нарастание титров антител в первые 7-14 дней после прививки с определенным увеличением титров в последующие 2 недели. Так, в РМН титры антител на 7-14 дни составляли 6-8 logi, а на 21-28 дни - 6-10 log:.

В ИФА величина титров противоящурных антител на 7-14 дни соответствовала 7-12 log:, а на 21-28 дни после вакцинации - ll-131og:. Статистический анализ представленных данных свидетельствует о тесной корреляции результатов обоих методов выявления противоящурных антител (R> 0,85). Это дает основание для вывода о возможности применения жидкофазного блокирующего непрямого сэндвич варианта ИФА для выявления и количественной оценки динамики накопления вируснейтрализующих антител в сыворотках крови различных видов животных как альтернативного РН и РМН с использованием культуры клеток.

2.2.5. Изучение эффективности-профилактической вакцинации сельскохозяйственных животных тгротив ящура

Основной целью опытов этой серии была дальнейшая апробация жидкофазного блокирующего непрямого сэндвич варианта ИФА в сравнении с общепринятым вариантом РН на белых мышатах при исследовании сывороток различных

видов сельскохозяйственных поствакцинальных животных. Работа проводилась совместно с Поляковым О.П. В опытах использовали 240 голов КРС, 1200 овец, 1500 свиней и 40 яков, от которых было исследовано параллельно в ИФА и РН более 400 проб сывороток крови, отобранных в период с 3-го дня до 2-х лет после вакцинации. Часть животных подвергали контрольному заражению гомологичным вирусом в дозе IÛ4 ИДя> через б, 12 и 24 месяца.

На рис.1 представлены в сравнительном аспекте результаты исследования в ИФА и РН сывороток разных видов животных, из которых видно, что титры поствакцинальных сывороток в ИФА выше в среднем на 2 log2. До вакцинации титры всех сывороток как в ИФА, так и в РН были меньше 3 logj, что подтверждает отрицательный иммунный фон у животных до начала опыта. При исследовании с гетерологичными антигенами титры сывороток в ИФА в поствакцинальный период не превышали 3,55±0,28 log:.

Статистически]') анализ получепных результатов с определением парной корреляции проводили на компьютере IBM PC/AT. Установлено, что коэффициент парной корреляции (R) между титрами сывороток в ИФА и РН через 1 и 6 месяцев после вакцинации КРС, как и в ранее проведенных опытах с использованием РН на культуре клеток, лежал в диапазоне от 0,94 до 0,85; свиней - от 0,89 до 0,862; овец - от 0,875 до 0,68, а яков - через I и 9 месяце» - от 0,92 до 0,89 соотвст-ст аенно.

Таким образом, по всем видам животных показана высокая степень парной корреляции результатов титрования индивидуальных проб сывороток в жидко-фазном блокирующем непрямом сэндвич варианте ИФА и в РН на белых мышатах.

Дополнительные данные, свидетельствующие о возможности объективной оценки напряженности поствакцинального иммунитета против ящура с помощью разработанного варианта ИФА были получены в опыте по контролю иммуногенной активности вакцины из вируса ящура Ал Ирак фирмы "Байер АГ". В опыте использовали 12 голов КРС 10-12 месячного возраста, из которых 5 было привито в дозе 0,5 мл, 5 - в дозе 2 мл и 2 - оставлены в качестве контроля. До вакцинации и перед контрольным заражением от всех животных исследовали сыворотку крови в РМН и ИФА. Контрольное заражение провели через 36 суток после вакцинации гомологичным вирусом в дозе 10J ИД5о/0,2 мл. Учет результа-

КРУПНЫЙ РОГАТЫЙ скот

титры антител в сыворотках (1о^)

ОВЦЫ

титры аитител в сыворотках (^2)

Э 30 90 9мес. 7 60 6мое. 2года дни после вакцинации

СВИНЬИ

титры антител в сыворотках (1о§г)

3 30 90 2года

7 60 6 мес. дни после вакцинации

ЯКИ

титры антител в сыворотках (^2)

12 " / /

10 У- / /V /

8

6 / /

' / I

Л ' /А

4

2

0 /| ^^тя

30 90 9мес. 7 60 бмес. 2года дни после вакцинации

3 7 30 9 мес. дни после вакцинации

■титры в РН □титры в ИФА

Рис. 1. Результаты исследования в жидкофазном блокирующем сэндвич варианте ИФА и РН сывороток крови крупного рогатого скота, свиней, овец и яков в различные сроки после иммунизации универсальной концентрат вакциной против вируса ящура А22 1

tod заражения проводили в течение 8 дней. При этом было установлено, что генерализованной форме заболевания противостояли все животные с титрами антител в РМН выше 1:16, а в ИФА выше 1:32. Коэффициент парной корреляции результатов сравниваемых методов оценки напряженности иммунитета составил 0,97.

Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что данный вариант может быть использован как альтернативный к РН для количественной оценки вкрушяпртвуюших антител против вируса ящура при проверке иммунитета животных, а также эффективности вакцинации.

2.2.6. Изучение возможности -применения ИФА для выявления антител к ViA-антигену и неструктурным белкам вируса с целью ретроспективной диагностики ящура

Дальнейшей целью нашей работы было изучение возможности применения разработанной нами иммуноферментной тест-системы для выявления антител к VLA-антигену или неструктурным белкам с целью оценки напряженности иммунитета. Вирус ящура, содержащий нуклеиновую кислоту и белки, представляет собой сложную систему антигенов. Степень этой сложности определяется количеством вирусспецифических белков - структурных, неструктурных, а также их предшественников. Вирус ящура отличается высокой иммуногенностью и большая часть его белков способна вызвать антительный ответ.

Для проведения исследований первоначально нами были получены препараты VLA-антигена из вируссодержащих материалов. В модельных опытах нами было установлено, что препарат, полученный только фракционированием на DEAE-сефадексе (фирмы "Pharmacia", Швеция), в непрямом варианте ИФА обладает высокой активностью, но недостаточно специфичен при исследовании сывороток КРС, поскольку выражено реагирует не только с сыворотками ре-конвалесцентов, но и с сыворотками поствакцинальных животных и даже сыворотками здоровых животных, хотя и в существенно меньших титрах. Наблюдаемая неспецифическая реакция этого антигена с отрицательными сыворотками

КРС была обусловлена неспецифической сорбцией на планшет и последующим взаимодействием нормальных белков последних с антивидовым конъюгатом.

Дополнительная последовательная хроматографическая очистка этого антигена на трех колонках с BrCN-сефарозой, конъюгированной с негативной сывороткой КРС, очищенным 146S компонентом вируса ящура А 22 и антителами кроликов против IgG КРС, позволила освободиться от неспецифической реакции. Выделенный таким способом препарат использовали в дальнейшем для изучения динамики накопления постинфекционных антител к VIA-антнгену в сыворотках крови КРС, зараженного вирусом ящура А22 в непрямом варианте ИФА с целью определения минимально необходимого срока взятия крови от животных при ретроспективной диагностике ящура.

При исследовании в ИФА сывороток КРС, переболевшего ящуром уже на 8 день после заражения титры VlA-антител достигали 7,0 log2. На 14-30 дни они составляли 9,09±0,18 - 9,2l±0,21 Iog;.

Поскольку получение препаратов VIA-антигена из вируссодержащих материалов сопряжено с наработкой больших количеств вируса и некоторыми методическими трудностями, нами были проведены исследования по изучению возможности их замены на антиидиотипические антитела (АИАт), которые явились бы аналогом антигена неструктурного белка ЗС вируса ящура. С этой целью нами были получены кроличьи АИАт, направленные против антител к неструктурному белку ЗС и проведены исследования по их практическому использованию в качестве иммунодиагностических реагентов, которые могли бы заменить в ИФА VIA-антиген и неструктурный белок ЗС.

В результате проведенных исследований установлено, что АИАт, адсорбированные на твердой фазе в качестве антигеиа, давали положительную реакцию в ИФА с антителами к неструктурным белкам в сыворотках крови КРС, переболевшего ящуром и вакцинированного концентрированной вакциной. Титры антител к названным белкам у них достигали значения 9,52±0,22 - 9,75±0,12 Iog2, тогда как в сыворотках животных, вакцинированных традиционной вакциной, только - 3,75 log2. Сыворотки от здоровых животных подобных антител не содержали. ,

Достоинства испытанных диагностикумов, во-первых, заключаются в том, что использование АИАт вместо антигенов позволяет существенно снизить неспецифические фоновые реакции, а во-вторых, исключает необходимость применения синтетических (полученных микробиологическим и химическим синтезом) антигенов, которые но всегда доступны в необходимых для постановки реакции количествах в связи со сложностью их приготовления.

Учитывая сложность антительного ответа при ящуре, нами был проведен анализ спектра антител, накапливающихся в сыворотках переболевших и вакцинированных животных, с использованием метода иммунопреципитации продуктов трансляции in vitro вирусспецифических белков. В результате установлено, что в сыворотках крови КРС, переболевшего ящуром и вакцинированного концентрированной вакциной, отмечается одинаковый спектр антител более, чем к 20 вирусспецифическим структурным и неструктурным белкам, а также белкам предшественникам. В то же иремя в сыворотке крови КРС, привитого традиционной противоящурной вакциной (3-7 PDjo), спектр антител был в 2 раза меньше за счет отсутствия антител к белкам предшественникам и большинству неструктурных белков.

Уровень антител к неструктурным белкам находился в прямой зависимости от прямых и косвенных показателей напряженности иммунитета. Поскольку напряженность противоящурного иммунитета лежит в диапазоне от абсолютного иммунитета до полной незащищенности к заражению вирусом в зависимости от количества и качества антигена и адъювантов, кратности прививок, а также срока после вакцинации, дифференциация переболевших и вакцинированных животных по титру антител к различным белкам без идентификации их направленности (специфичности) не может считаться надежным диагностическим тестом.

2.2.7. Стандартизация ИФЛ в рамках Международного -проекта 0АО/МЭБ (фаза XIU-XIV)

В связи с присвоением ВНИИЗЖ статуса Региональной справочной лаборатории МЭБ по ящуру для стран Восточной Европы, Закавказья и Центральной Азии, мы приняли участие в выполнении Международного проекта

4 t 20

(Пербрайт, Великобритания) под руководством Donaldson A.I. В работе, помимо ВНИИЗЖ, приняли участие лаборатории 27 стран мира.

Целью XIII-XIV фаз данного проекта являлась стандартизация процедуры постановки жидкофазного блокирующего сэндвич варианта (ЖБСВ) ИФА для обнаружения антител к вирусу ящура в сыворотках крови животных, и изучение возможности данного теста для ретроспективной диагностики ящура и изучения состояния гуморального иммунитета. Для этого нами было исследовано 59 анонимных, полученных из BCJ1, сывороток крови крупного рогатого скота с разным иммунным статусом (переболевание, гипериммунизация, вакцинация).

Анализ полученных нами результатов показал, что при оценке 31 негативной сыворотки от интактных животных ложноположительных результатов не было, как при использовании набора производства ВНИИЗЖ,так и набора ВСЯ. В то же оремя средний показатель достоверности по 27 другим лабораториям составил только 96%, поскольку почти половина лабораторий получила ложнопо-ложительные результаты по 1 - 7 пробам. При исследовании сывороток вакцинированных животных с набором ВНИИЗЖ на 14 и 21 дни после вакцинации нами выявлено 93% ложительных проб, а с набором ВСЛ-100%.

В другой серии опытов нами исследованы референтные и зашифрованные сыворотки, полученных институтом из ВСЛ, включая позитивные пробы высокой и слабой активности в отношении вируса ящура 3 типов (А, О и С). Как свидетельствуют данные, суммированные в таблице 3, в этих опытах нами были получены результаты, фактически полностью совпадающие с данными ВСЛ.

В "открытых" опытах, проведенных в нашем институте совместно с представителем ВСЛ Armstrong R.M., на модели сывороток крупного рогатого скота, содержащих убывающие концентрации антител к вирусу ящура типов А, О и С, были получены дополнительные данные о сопоставимой чувствительности и специфичности вариантов ИФА с использованием антигенов ВСЛ и ВНИИЗЖ (табл. 4).

ТаблицаЗ

Результаты исследования сывороток крови КРС, присланных ВСЛ, на наличие антител к вирусу ящура типов А, О и С _(п=3)

№№ и характеристики Титры по Титры антител при исследовании в ИФА

исследуемых паспорту набором ВН11ПЗЖ набором ВСЛ

сывороток ВСЛ (1а) Ап№550 Оы\Ь194 С|№564/72 АзАШег СьВРБ ОУоз.иез

1. положит.(+) 3,34±0,13 3,31±0,00 <1,5 <1,5 2,8±0,18 <1,5 <1,5

2. положит.(+) 2,78±0,12 2,3±0,18 <1,5 <1,5 2,6±0,17 <1.5 <1,5

р 3. полжит.(+) А и 2,22±0,|3 1,81 ±0,00 <1,5 <1,5 2,1 ±0,00 <1,5 <1,5

Е 4. положит.(+) 1,77±0,1 1,5±и,ои <1,5 <1,5 1,5±0,00 <1,5 <1,5

Ф 5. отрнцат.(-) <1,5 <1.5 <1,5 <1,5 <1,5 <1,5 <1,5

Е 6. положит.(+) 2,28±0,06 <1,5 3,01 ±0,00 <1,5 <1,5 з.з±о,оо <1,5

Р 7. положит.(+) 2,47±0,13 <1,5 2,8±0,18 <1,5 <1,5 2,910,18 <1,5

Е 8. положит.(+) О1 1,93±0,14 <1,5 1,91±0,17 <1,5 <1,5 2,2±0,17 <1,5

Н У. положит.(+) 1,53±0,15 <1,5 <1,5 <1.5 <1,5 <1,5 <1,5

Т 10. отрицат.(-) <1,5 <1,5 <1,5 <1.5 <1,5 <1,5 <1.5

н 11. положит.(+) 2,34±0,13 <1,5 <1,5 3,01 ±0,00 <1,5 <1,5 3,3±0,00

ы 12. положит.(+) 2,36±0,15 <1,5 <1,5 2,51 ±0.17 <1,5 <1,5 2,31±0,18

Е 13. положит.(+) С1 2,04±0,|7 <1,5 <1,5 <1.5 <1,5 <1,5 2,2±0,17

14. положит.(+) 1,53±0,15 <1,5 <1,5 <1,5 <1,5 <1,5 ' <1,5

15. отрицат.(-) <1.5 <1.5 <1,5 <1,5 <1,5 <1.5 <1,5

И 16. Гипериммунная типов А24+О т.А 3,33 т.О 3,01 3,31 ±0,00 3,2+0,17 3,31±0,00 3,01±0,00

с т.С 2,89 2,71+0,00 2,91±0,17

п 17. Реконвал. через 4 т. А <1,5 <1,5 <1,5

ы т дня после заражения т.О т.О <1,5 т.С <1,5 3,01±0,00 3,2±0,00 3,11+0,17 3,2±0,17

У 18. Реконвал. через 7 т.А 2,14 1,91 ±0,17 2,б±0,17

Е М дней после заражения т.Ам т.О 1,75 т.С 2,01 <1,5 <1,5 1,5±0,00 1,5±0,00

Ы Е 19. Реконвал. через 14 дней после заражения т.С т.А <1,5 т.О <1,5 т.С 2,36 '<1,5 1,6±0,17 <1,5 <1,5 2,0±0,17 1,7±0,17

Таблица 4.

Результаты исследования сывороток в жидкофазном блокирующем непрямом сэндвич варианте ИФА. •. |

Средние титры активности сыворо-

Тип №№ и характеристики сывороток ток

вируса с антигеном

- ВСЛ ВНИИЗЖ

1 .реконвалесцентная 1:2043 1:1400

2.реконвал. в разведении 1:50 1:355 1:512

А 3. реконвал. в разведении 1:100 1:128 1:178

4. реконвал. в разведении 1:150 1:90 1:64

5.нормальная сыворотка <1:16 <1:16

1 .реконвалесцентная 1:1400 1:1024

2.реконвал. в разведении 1:50 1:355 1:355

О 3. реконвал. в разведении 1:100 1:178 1:90

4. реконвал. в разведении 1:150 1:90 1:64

5.нормальная сыворотка <1:16 <1:16

1 .реконвалесцентная 1:708 1:355

2.рскопвал. в разведении 1:50 1:90 1:90

С 3. реконвал. в разведении 1:100 1:45 1:22

4. реконвал. в разведении 1:150 1:22 1:16

5.нормалыгая сыворотка <1:16 <1:16

Как видно из данных таблицы 4, жидкофазный блокирующий непрямой сэндвич вариант ИФА с использованием антигенов производства ВНИИЗЖ практически не уступает по чувствительности ИФА с использованием антигенов ВСЛ и может применяться при исследовании сывороток крови животных с целью обнаружения противоящурных антител.

Таким образом, набор для ЖБСВ ИФА производства ВНИИЗЖ является высокоспецифичным, соответствует требованиям ВСЛ и может применяться в зонах, благополучных по ящуру, и при возникновении заболевания в эпизоотических очагах.

З.ВЫВОДЫ

1. Разработана, оптимизирована и внедрена в практику иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу ящура с целью ретроспективной диагностики ящура, определения иммунного статуса у переболевших и вакцинированных животных, оценки напряженности иммунитета и эффективности вакцинации.

2. Определены требования к основным компонентам иммуноферментной тест-системы и способы стандартизации последней при выявлении, количествен-

ном определении и идентификации антигенной специфичности противоящурных антител.

3. Показано, что максимальной чувствительностью и специфичностью обладает иммуноглобулиновая фракция G, выделенная из сывороток крови кроликов, двукратно привитых препаратом инактивированного 146S антигена вируса ящура. Максимальную типовую и субтиповую специфичность ИФА обеспечивают детекторные антитела, выделенные из сыворотки крови морских свинок, привитых однократно аналогичным антигеном.

4. Обоснована возможность применения в ИФА в качестве эталонных антигенов вместо I46S компонента вируса ящура коммерческих препаратов по ТУ 4620-429-79, изготовляемых ВНИИЗЖ на основе инактивированного амино-этилэтилснимином (АЭЭИ) вируса ящура, очищенного с использованием повер-хостно-актииных веществ и органических растворителей и сконцентрированного ПЭГ- 6000.

5. При изучении четырех вариантов ИФА для выявления противоящурных антител показано, что жидкофазный блокирующий сэндвич вариант дает наиболее воспроизводимые результаты, отличается универсальностью при исследовании сывороток крови от разных видов животных, достоверно (р<0,05) превосходит по чувствительности РН (р<0,05) и сопоставим с нею по специфичности.

6. Статистический анализ полученных результатов показал, что существует прямая коррелятивная зависимость между показателями титров противоящурных антител в сыворотках крови вакцинированных и переболевших ящуром животных при исследовании в жидкофазном блокирующем сэндвич варианте ИФА и РН. Коэффициент парной корреляции результатов сравниваемых методов косвенной оценки напряженности иммунитета был в пределах 0,9. Показатели титров антител в сыворотке крови вакцинированных КРС, свиней и овец, установленные в ИФА и РМН, уже на 7-14 дни были значимыми, достоверными в пределах от 6 до 12 iogi и закономерно отражали напряженность иммунитета.

7. Методами ИФА и иммунопреципитации продуктов трансляции in vitro вирусспецифических белков показана сложность иммунного ответа животных при вакцинации и переболевании ящуром, который характеризуется широким спектром синтезируемых антител к вирусспецифическим структурным, неструктурным белкам, а также к белкам предшественникам. Соотношение между этими

антителами зависит от качества иммунизирующих препаратов и интенсивносп клинических проявлений ящура и характеризует состояние противоящурног иммунитета.

8. Разработанный вариант ИФА по специфичности сопоставим с аналогии ным вариантом выявления противоящурных антител, рекомендованным Всемир ной справочной лабораторией (Пербрайт, Великобритания), а по чувствнтеш ности, особенно в опытах с ранними постинфекционными сыворотками КРС имеет определенные преимущества перед ним.

9.Результаты проведенных исследований послужили экспериментальным обоснс ванием для разработки "Временного наставления", регламентирующего испощ зование иммуноферментного анализа при выявлении, количественном титров, нии и идентификации типовой специфичности противоящурных антител, с п< ложитсльными результатами прошедшего межииститутскнс комиссионные >и пыгания и утвержденного ГУВГАПКСССР1.10.89.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

"Временное наставление по выявлению противоящурных антител иммуж

ферментным методом", утвержденное ГУВ ГАПК СССР от 1.10.89. и "Методик выявления противоящурных антител в непрямом жидкофазном блокирующе сэндвич варианте иммуноферментного анализа", утвержденная директоро ВНИИЗЖ Гусевым A.A. от 20.07.96., могут быть использованы в научш исследовательских и вирусологических лабораториях для выявления антител вирусу ящура с целью ретроспективной диагностики ящура и определения иг мунного статуса у переболевших и вакцинированных животных.

5.СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1.Дудникова Е.К., Камалова Н.Е., Шажко Ж.А. Сравнительное изучен! различных вариантов ИФМ для обнаружения противоящурных антител в сыв' ротках крови животных II Акт. вопр. вет. вирусол.: Тез. докл. н.-теоретич. кон( молодых ученых. - Владимир. - 1990. - С.32 - 33.

2. Поляков О.Н., Дудников А.И., Жучкова Л.Г., Дудникова Е.К., Белеков Т., Изучение динамики иммунитета у КРС, овец, яков и свиней при введении ун: версальной противоящурной вакцины II Мат. ссмин. спец. стран - членов СЭ

"Разработка и использование новых адъювантов для биотехнологических целей". - Владимир. - 1990. - С. 33 - 35.

3.Дудникова Е.К., Шажко Ж.А., Камалова Н.Е., Поляков О.Н. Сравнительное изучение жидкофазного блокирующего "сандвич" варианта ИФМ и реакции нейтрализации при выявлении поствакцинальных противоящурных антител II К новой стратегии борьбы с ящуром: Мат. междун. конф. - Владимир. - 1991. -С. 153 -154.

4. Дудникова Е.К., Дрыгин В.В., Дудников Л. А., Шажко Ж.А. Использование VIA-антигена из культурального вируса ящура в ИФМ // Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: Мат. науч. конф. ВНИИВВиМ. - Покров. - 1992. - Ч. 1. -С. 186- 187.

5 .Дрыгин В.В., Аминев А.Г., Дудникова Е.К., Аянот П.К.. Безбородоаа C.B., Перевозчикова H.A. Клонирование и экспрессия в Е. coli гена РНК - полимеразы вируса ящура А550 // Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: Мат. науч. конф. ВНИИВВиМ. - Покров. - 1992. - Ч. 1. - С. 177 - 178.

6. Дрыгин В.В., Щербаков A.B., Дудников Л. А., Дудникова Е.К. Оптимизация условий выделения РНК-полимеразы вируса ящура Агг II Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: Мат науч. конф. ВНИИВВиМ. - Покров. - 1992. - Ч. 1. ■С. 175-176.

l.Gusev A.A., Drygin V.V., Dudnikov L.A., Dudnikova E.K., Scerbakov A.V. Postinfection and postvaccinal immunity against FMD // Europ. Commiss. Control "MD. Vieena, Austria, 19-22 Sept. - 1995. - Rome. - 1995. - P. 120 - 121.

8. Дудникова E.K., Мудрак H. С., Дудников С.А., Дрыгин В.В., Шажко Ж.А. Стандартизация ИФА с целыо обнаружения противоящурных антител в рамках Международного проекта МЭБ (фаза XIV) // Мат. Междун. науч. - практич. конф., [освященной 100 - летию открытия вируса ящура. - Владимир. - 1997. - С. 45,

Отпечатано на полиграфической базе отдела патентных исследований и на-чной информации ВНИИЗЖ А

Тираж 100 экз.